KR101589511B1 - 치쿤구니야 바이러스 단백질의 공통 서열, 이를 인코딩하는 핵산 분자, 조성물 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

치쿤구니야 바이러스 단백질의 공통 서열, 이를 인코딩하는 핵산 분자, 조성물 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

공통 CHIKV E1 단백질, 공통 CHIKV E2 단백질, 공통 CHIKV 캡시드 단백질, 또는 그의 단편 및 상동물, 및 이들을 인코딩하는 핵산 분자가 개시되어 있다. CHIKV E1 공통 단백질, CHIKV E2 공통 단백질, CHIKV E3 공통 단백질, 또는 그의 단편 및 상동물을 포함하는 공통 CHIKV Env 단백질, 및 이들을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 개시되어 있다. CHIKV 공통 단백질을 포함하는 조성물 및 재조합 백신, 및 이들을 사용하는 방법이 개시되어 있다.

Description

치쿤구니야 바이러스 단백질의 공통 서열, 이를 인코딩하는 핵산 분자, 조성물 및 이를 이용하는 방법{Consensus Sequences of Chikungunya Viral Proteins, Nucleic Acid Molecules Encoding the Same, and Compositions and Methods for Using the Same}
본 발명은 치쿤구니야 바이러스(Chickungunya Viruses)에 대항하여 개체를 예방적으로 및/또는 치료요법적으로 면역시키는 백신 및 방법에 관한 것이다.
본 출원은 미국 가특허출원 61/042,661에 대해 우선권을 주장하며, 이는 참고문헌으로 첨부된다.
면역요법(Immunotherapy)은 바람직한 치료요법적 효과를 부여하기 위하여 개인의 면역 반응을 조절하는 것을 지칭한다. 면역치료제(Immunotherapeutics)는 개체에 투여되었을 때, 원하지 않는 면역 반응과 연계된 증상을 궁극적으로 감소시키거나 또는 원하는 면역 반응을 증가시켜 증상을 궁극적으로 경감시키는데 충분하도록 개체의 면역계를 조절하는 조성물을 지칭한다. 일부 경우에 있어서, 면역요법은 백신접종 프로토콜의 일부분으로, 개체에 백신을 투여하여, 개체를 이뮤노겐에 노출시켜, 개체는 이 이뮤노겐에 대항하여 면역 반응을 일으키며, 면역치료요법은 특정 상태, 감염 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 바람직한 면역 반응을 증가시키거나 및/또는 면역 반응의 일부(세포성 부분 또는 체액성 부분)를 선택적으로 강화시킨다.
백신 프로토콜은 강화된 면역 반응을 유도하기 위하여 개인의 면역 반응을 조절하는 물질을 운반시켜 개선될 수 있다. 개체에 백신을 투여하여, 개체를 이뮤노겐에 노출시킴으로써, 개체는 이 이뮤노겐에 대항하여 면역 반응을 일으키는 일부 백신 접종 프로토콜의 경우, 특정 상태, 감염 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 바람직한 면역 반응을 증가시키거나 또는 선택적으로 면역 반응의 일부(세포성 부분 또는 체액성 부분)를 강화시키는 물질이 제공된다.
백신은 알레르겐, 병원체 항원, 또는 인간 질환과 관련된 세포에 연관된 항원과 같은 표적 항원에 대항하여 개체에 면역성을 부여하는데 유용하다. 인간 질환에 관련된 세포에 연관된 항원에는 암 연관 종양 항원, 자가면역 질환 관련된 세포에 연관된 항원들이 포함된다.
이와 같은 백신을 고안함에 있어서, 백신접종을 받은 개체의 세포에서 표적 항원을 생산하는 백신이 세포성 부분의 면역을 유도하는데 효과적이다. 특히, 약동화 생백신, 비독성 벡터를 이용하는 재조합 백신 및 DNA 백신은 각각 백신접종을 받은 개체의 세포에서 항원 생산을 이끌어, 세포성 부분 면역이 유도된다. 다른 한편, 죽은 또는 비활성화된 백신 및 단백질만을 포함하는 서브-유닛 백신은 효과적인 체액성 반응은 유도하지만, 양호한 세포성 반응을 유도하지 못한다.
병원체 감염에 대항하여 보호를 제공하고, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위하여 효과적인 면역 매개 요법을 제공하는데 세포성 면역 반응이 종종 필요하다. 따라서, 약독화 생백신, 비독성 벡터들을 이용하는 재조합 백신 및 DNA 백신과 같은, 백신접종을 받은 개체의 세포내에서 표적항원을 생산하는 백신이 흔히 바람직하다.
치쿤구니야 바이러스(CHIKV)는 열대 아프리카 및 아시아가 원산인 알파 바이러스로써, 이 지역에서 이 바이러스는 아데스(Aedes)[1] 속의 감염된 모기에 물려 인간에게 감염된다. CHIKV에 의한 질환인, 치쿤구니야 열(fever)은 1952-1953년 동안 동아프리카 지역에서 유행병으로 처음으로 확인되었다[2]. CHIKV가 인간에 감염되면, 열, 두통, 발진, 불안, 메스꺼움, 구토, 근육통, 심각한 관절통 및 때때로 급격한 사지 허약과 같은 신경학적 현시가 나타난다. 또한, 치명적인 출혈성 병태가 연관된다. 다른 증상에는 근육통 및 안후 안와골 통증(retro-orbital pain)이 포함된다. 치쿤구니야 질환이 치명적인 경우는 드물지만, 심각한 병적 상태와 유관하다. 치쿤구니야 병은 대략 1-2주의 잠복기를 가진다. "치쿤구니야"란 어휘는 이 질환과 관련하여 심각한 관절 통증을 겪은 환자의 뒤틀린 자세를 일컫는 지역 방언으로부터 유래된 것으로 보인다 [1-3].
치쿤구니야는 갑작스런 소모성 질환을 일으킬 수 있는 유행성 잠재력을 가지고 있기 때문에, 개발도상국에서는 잠재적인 위협이 되며, 지속적인 확인으로 인하여 선진국 및 새로 나타나는 풍토성 충돌 지역내 군사적 배치로 인하여 군인들에게위협이 상당할 것이다. CHIKV 감염은 피고용인이 감염되면 무기력한 증상으로 인하여, 유행 지역에서 장기 결근으로 이어져 지역 산업이 영향을 받기 때문에 심각한 경제적 타격을 준다. 이와 같은 경제적 영향은 수주 또는 수개월간 일을 할 수 없는 개별 가족 구성원에게 가장 심하다. 새로운 CHIKV 발병을 통제 또는 억제하는데 있어서, 쇠약하게 하는 감염 후유증, 특이적인 항-바이러스 치료의 부재 및 이 질환을 예방할 수 있는 현재 이용가능한 백신의 부재가 주요 방해요인이다.
CHIKV는 감염된 모기에 물려서 전파된다. CHIKV 감염된 개체에서 먹이를 먹을 경우, 모기도 감염된다. 원숭이 및 가능한 다른 야생 동물도 감염될 수 있지만, 이들이 CHIKV의 저장기로서의 역할에 대해서는 아직 사례가 없다. 감염된 모기는 이들이 다른 인간을 물 경우, 바이러스가 그 인간에게 전파될 수 있다. 가정 용기에서 번식하며, 낮시간에 공격적으로 무는, 인간을 주는 대상으로 하는 아데스 아집프티(Aedes aegypti)(황열모기)가 인간에게 CHIKV을 옮기는 주요 전파경로다. 아데스 알보픽투수(Aedes albopictus))(아시아 호랑이 모기) 또한 아시아에서 인간에게 전염시키는데 주요 역할을 할 수 있으며, 아프리카내 숲에 거주하는 다양한 모기종이 이 바이러스에 감염된 것이 밝혀졌다 [11-17]. CHIK 열 유행병은 인간-모기-인간 전염에 의해 지속되기 때문에, 전염 사이클은 뎅기 및 도시형 황열의 전염 사이클과 유사하다. 최근에 인도양의 몇군데 섬들과 인도에서 최근 CHIKV 열의 상당한 발병이 보고되었다 [4-7].
2004년 후반 이후, 치쿤구니야 바이러스는 세계 다양한 지역, 주로 인도양 섬에서 주로 대대적으로 재출현되었다. 겨울 동안 낮은 전염율과 남반구의 여름이 도래한 2006년 초, La Reunion Island에서 폭발적으로 발병되었다. 대략 266,000명의 주민 (인구는 770,000명)이 CHIKV에 감염된 것으로 보고되었으며, 288명의 사망증명서에 주요 사망 원인으로 CHIKV이 지적되었다[10,12]. 임산부의 자궁내 감염 및 수직 감염에 대한 증거도 있다[12,13,17]. 서열 분석에서 이 바이러스의 지역적 군생 혈통이 존재하는 것으로 나타났다. 부분적 E1 서열에 근거하여 계통 발생학적 분석에서 CHIKV의 경우 세 가지 별개의 계통학적 군이 존재하는 것으로 나타났다: 서아프리카 분리체, 아시아 분리체 및 동부, 중앙 및 남부아프리카 분리체[15,17].
2006년, CHIK 열이 알려진 발병 지역으로부터 유럽, 캐나다 및 카리비안(Martinique) 그리고 남아메라카(French Guyana)으로 되돌아가는 여행자들에게서 보고되기도 하였다[5-9]. 2005-2006년 사이에, CDC(USA)는 CHIKV 열이 유행한 것으로 알려진 지역으로부터 미국에 도착한 여행자들중에서 CHIK 열중 12명이 혈청학적으로 그리고 바이러스적으로 CHIKV 열로 진단받았다 [10].
이와 같은 감염은 공중위생 붕괴의 원인이 되며, 전세계적으로 연구원들의 주목을 받았다. 중요한 것은, 치쿤구니야 바이러스 감염의 대부분은 수주 또는 수개월내에 완전하게 해결된다. 그러나, 수년간 만성 관절 문제가 지속되는 CHIKV 유도된 관절통의 경우가 기록되기도 하였다. 오랜 시간 뒤, 감염이 해결된다는 사실은 면역계가 이와 같은 감염을 궁극적으로 조절하기 위해 모일 수 있다는 것을 뒷받침한다. 더욱이, 이와 같은 제거(clearance) 표현형은 T 세포 반응을 위한 제거에 역할을 뒷받침한다. 치쿤구니야에 대항하는 백신, 가령, 포르말린 치사된 백신, Tween 에테르 비활성화된 바이러스 백신 및 약독화 생백신을 개발하려는 시도들이 어느 정도 성공적이었지만, 다양한 이유로 중단되었다 [3]. 더욱이, 이들 모든 백신은 유용한 세포성 면역성을 유도하지 못하고, 단지 혈청학적 반응만을 만든 것으로 보고되었다.
인도양 및 La Reunion islands에서 최근 유행병 빈도에서, 이 바이러스를 운반하는 새로운 벡터가 있을 것이라고 제안되었는데, 그 이유는 이 지역에서는 아데스 아집프티(Aedes aegypti)가 발견되지 않았기 때문이다. 사실, 아시아 호랑이 모기의 친척인, 아데스 알보픽투스(Aedes albopictus)는 CHIK 바이러스 유행의 잠재성에 대해 세계 보건기구에서 우려하고 있는 주범일 수도 있다.
따라서, CHIKV를 조절하는 방법을 개발하기 위하여 조치를 취해야만 한다. 불행하게도, 현재 치쿤구니야 바이러스에 대해 특이적인 치료는 없으며, 현재 이용가능한 백신도 없다. 최근 연구에서, 아데스 알보픽투스(Aedes albopictus)의 CHIKV 감염성의 심각한 증가에 대해 직접적인 원인이 외피 E1-A226V 돌연변이라고 설명되었다. 이와 같은 발견으로 인하여, 전형적인 곤충 벡터가 없는 지역에서 어떻게 이와 같은 돌연변이 바이러스가 유행병의 원인이 되었는지에 대해 그럴듯하게 설명되었다 [18]. 치쿤구니야에 대해 특이적인 백신도 또는 특이적인 항-바이러스 치료도 없다. 약독화 생백신 시도가 2000년에 실시되었지만, 이 프로젝트의 자금 지원이 중단되었고, 현재 이용가능한 백신은 없다. 그러나, 기존 백신과 연관된 심각한 부작용의 경우가 문서화되어있고, 따라서, 새로운 백신 전략이 개발되어야만 한다 [3,5].
2005-2007년의 실제 치쿤구니야 발병 정도는 CHIKV에 대항하는 안전하고 효과적인 백신의 필요성을 강조한다[6]. 개체를 CHIKV 감염으로부터 보호하기 위한 백신 필요성은 여전히 남아있다. CHIKV 감염된 개체를 치료하는데 효과적인 치료법의 개발도 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 CHIKV 단백질 E1 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 E2 또는 그의 면역성 단편의 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 캡시드 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3에 대한 공통서열 또는 그의 상동 서열, 또는 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3 각각에 대항하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 아미노산 서열을 인코딩하는 그의 면역원성 공통 단편 또는 상동 서열을 포함하는 키메라 유전자를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 E1 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 E2 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 캡시드 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3에 대한 공통서열 또는 그의 상동 서열, 또는 CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3 각각에 대항하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 아미노산 서열을 인코딩하는 그의 면역원성 공통 단편 또는 상동 서열을 포함하는 키메라 유전자를 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CHIKV 단백질 E1 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, CHIKV에 대항하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CHIKV 단백질 E2 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, CHIKV에 대항하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CHIKV 단백질 캡시드 또는 그의 면역성 공통 단편에 대한 공통서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, CHIKV에 대항하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3에 대한 공통서열 또는 그의 상동 서열, 또는 CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3 각각에 대항하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 아미노산 서열을 인코딩하는 그의 면역원성 공통 단편 또는 상동 서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, CHIKV에 대항하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CHIKV 단백질 캡시드, CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2에 대한 공통서열, 또는 그의 면역성 공통 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 CHIKV 단백질 E1, CHIKV 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3 에 대한 공통서열 또는 그의 상동 서열, 또는 단백질 E2 및 CHIKV 단백질 E3 각각에 대항하여 면역 반응을 유도하는 면역원성 아미노산 서열을 인코딩하는 그의 면역원성 공통 단편 또는 상동 서열을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신, 및 그와 같은 재조합 백신을 개체에 투여하는 것을 포함하는, CHIKV에 대항하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
도 1: (a) IgE 선도 CHIKV 융합 유전자를 pVax1 벡터내로 클로닝하기 위한 전략의 개략도이다. (b) CHIKV 플라스미드 (외피 E1, E2 및 캡시드)의 선형 특이적 밴드를 나타내는 아가로즈 겔 사진으로, 라인 4에서는 Kpn1 및 Not1으로 이중 절단(double digestion)시켜, 차례로 1403bp, 1355bp 및 869bp 크기의 밴드가 생성된 것을 보여준다.
도 2: CHIKV 제작물의 특징. (a) 합성된 제작물의 S35-라벨된 실험실내 해독을 보여준다. 항원 CHIKV-E1, CHIKV-E2 및 CHIKV-캡시드가 해독되었고, 특이적 E1, E2 및 캡시드 항체를 각각 이용하여 면역 침전시키고, 12% SDS-겔상에 얹고, 방사능분석이 실시되었다. 항원들은 이들의 예상 분자량으로 이동되고, 이의 발현이 확인되었다. (b) BHK-21 세포에서 CHIKV-E1 및 CHIKV-캡시드 제작물의 웨스턴 블랏 분석이다. 전이감염 2일 후, 전이감염된 세포 용해물이 준비되었고, 다클론성 CHIKV-E1 항혈청으로 면역 블랏되었으며, 마우스에서 52kDa E1 단백질의 경우 52kDa이, 캡시드 단백질의 경우 36kDa이 발현되었음이 나타났다.
도 3: 항체 ELISA. (a), (b) 및 (c) C57BL/6 마우스에게 2주 간격으로 2회 25㎍의 pVax1 벡터 또는 CHIKV 플라스미드로 면역접종시키고, 1주일 후에 죽였다. 혈청이 수거되었고, CHIKV-E1, CHIKV-E2 또는 CHIKV-캡시드에 대해 전체 IgG 생산에 대한 분석을 하였다. 혈청은 2㎍/ml의 각 CHIKV 펩타이드로 피복된 96-웰 플레이트상에서 37℃, 1시간 동안 항온처리되었고, 항-마우스 IgG-HRP를 이용하여 항체가 감지되었다. 값은 중복 웰의 평균(±S.D.)을 나타낸다.
도 4: ELISpot에 의해 측정된 외피 E1에 대한 인터페론-γ 반응. C57BL/6 마우스에게 2주 간격으로 2회 25mg의 pVax1 벡터 또는 pCHIKV-E1으로 면역주사하고, 1주일 후에 죽였다. (a) 비장세포를 수거하고, R10 (네가티브 대조군) 또는 10mg/ml의 네 가지 펩타이드 풀(pool)(E1 단백질 길이로 연장되고, 9개 아미노산에 의해 오버랩되는 15-mer 펩타이드로 구성됨)중 하나 존재하에 밤새 배양되었다. CHIKV-E1에 대한 반응은 누적된 집단(stacked group) 평균 반응으로 나타났다. (b) 비장세포를 수거하고, R10 (네가티브 대조군) 또는 10mg/ml의 18개 펩타이드 풀(pool)(매트릭스 E1 단백질 길이로 연장되고, 9개 아미노산에 의해 오버랩되는 15-mer 펩타이드로 구성됨)중 하나 존재하에 하룻밤 동안 배양되었다. 스팟 형성 단위(SFU)는 자동 ELISpot 판독기로 정량화되고, 미가공 수치는 100만 비장세포에 대한 SFU로 정상화시켰다. 값은 삼중 웰의 평균을 나타낸다.
도 5: ELISpot에 의해 측정된 CHIKV 외피 E2에 대한 인터페론 γ 반응이다. C57BL/6 마우스에게 2주 간격으로 2회 25 mg의 pVax1 벡터 또는pCHIKV-E2으로 면역주사하고, 1주일 후에 죽인다. (a) 비장세포를 수거하고, R10 (네가티브 대조군) 또는 10mg/ml의 네 가지 펩타이드 풀(pool)(E2 단백질 길이로 연장되고, 9개 아미노산에 의해 오버랩되는 15-mer 펩타이드로 구성됨)중 하나 존재하에 밤새 배양되었다. CHIKV-E2에 대한 반응은 누적된 집단(stacked group) 평균 반응으로 나타났다. (b) 비장세포를 수거하고, R10 (네가티브 대조군) 또는 10mg/ml의 18개 펩타이드 풀(pool)(매트릭스 E2 단백질 길이로 연장되고, 9개 아미노산에 의해 오버랩되는 15-mer 펩타이드로 구성됨)중 하나 존재하에 밤새 배양되었다. 스폿 형성 단위(SFU)는 자동 ELISpot 판독기로 정량화되고, 미가공 수치는 100만 비장세포에 대한 SFU로 정상화시켰다. 값은 삼중 웰의 평균을 나타낸다.
도 6: ELISpot에 의해 측정된 CHIKV 캡시드에 대한 인터페론 γ 반응이다. C57BL/6 마우스에게 2주 간격으로 2회 25 mg의 pVax1 벡터 또는pCHIKV-캡시드로 면역주사하고, 1주일 후에 죽인다. (a) 비장세포를 수거하고, R10 (네가티브 대조군) 또는 10mg/ml의 네 가지 펩타이드 풀(pool)(캡시드 단백질 길이로 연장되고, 9개 아미노산에 의해 오버랩되는 15-mer 펩타이드로 구성됨)중 하나 존재하에 밤새 배양되었다. CHIKV-E2에 대한 반응은 누적된 집단(stacked group) 평균 반응으로 나타났다. (b) 비장세포를 수거하고, R10 (네가티브 대조군) 또는 10mg/ml의 18개 펩타이드 풀(pool)(매트릭스 캡시드 단백질 길이로 연장되고, 9개 아미노산에 의해 오버랩되는 15-mer 펩타이드로 구성됨)중 하나 존재하에 밤새 배양되었다. 스폿 형성 단위(SFU)는 자동 ELISpot 판독기로 정량화되고, 미가공 수치는 100만 비장세포에 대한 SFU로 정상화시켰다. 값은 삼중 웰의 평균을 나타낸다.
도 7은 실시예 2에서 설명된 분석을 이용하여 측정된, 치쿤구니야 바이러스에 대하여 환자 및 건강한 개인(실험 당한적 없는)의 중화 항체 역가를 나타내는 그래프다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 명세서에 기재된 바와 같이, "면역성 공통 단편"이란, 상응하는 고유한 서열이 사용될 때에 발생하지 않는 2개 이상의 CHIKV 균주에 대한 교차보호를 부여하는데 충분한 공통서열을 포함하는 공통 CHIKV 단백질의 단편을 의미한다. 단편은 일반적으로 10 이상의 아미노산 길이이다. CHIKV E1의 일부 바람직한 길이는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195, 적어도 200, 적어도 205, 적어도 210 적어도 215, 적어도 220, 적어도 225, 적어도 230, 적어도 235, 적어도 240, 적어도 245, 적어도 250, 적어도 255, 적어도 260, 적어도 265, 적어도 270, 적어도 275, 적어도 280, 적어도 285, 적어도 290, 적어도 295, 적어도 300, 적어도 305, 적어도 310, 적어도 315, 적어도 320, 적어도 325, 적어도 330, 적어도 335, 적어도 340, 적어도 345, 적어도 350, 적어도 355, 적어도 360, 적어도 365, 적어도 370, 적어도 375, 적어도 380, 적어도 385, 적어도 390, 적어도 395, 적어도 400, 적어도 405, 적어도 410, 적어도 415, 적어도 420, 적어도 425, 또는 적어도 430이다. CHIKV E1의 일부 바람직한 길이는 15 이하, 20 이하, 25 이하, 30 이하, 35 이하, 40 이하, 45 이하, 50 이하, 55 이하, 60 이하, 65 이하, 70 이하, 75 이하, 80 이하, 85 이하, 90 이하, 95 이하, 100 이하, 105 이하, 110 이하, 115 이하, 120 이하, 125 이하, 130 이하, 135 이하, 140 이하, 145 이하, 150 이하, 155 이하, 160 이하, 165 이하, 170 이하, 175 이하, 180 이하, 185 이하, 190 이하, 195 이하, 200 이하, 205 이하, 210 이하, 215 이하, 220 이하, 225 이하, 230 이하, 235 이하, 240 이하, 245 이하, 250 이하, 255 이하, 260 이하, 265 이하, 270 이하, 275 이하, 280 이하, 285 이하, 290 이하, 295 이하, 300 이하, 305 이하, 310 이하, 315 이하, 320 이하, 325 이하, 330 이하, 335 이하, 340 이하, 345 이하, 350 이하, 355 이하, 360 이하, 365 이하, 370 이하, 375 이하, 380 이하, 385 이하, 390 이하, 395 이하, 400 이하, 415 이하, 420 이하, 425 이하, 430 이하, 또는 435 이하이다. CHIKV E2의 일부 바람직한 길이는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195, 적어도 200, 적어도 205, 적어도 210 적어도 215, 적어도 220, 적어도 225, 적어도 230, 적어도 235, 적어도 240, 적어도 245, 적어도 250, 적어도 255, 적어도 260, 적어도 265, 적어도 270, 적어도 275, 적어도 280, 적어도 285, 적어도 290, 적어도 295, 적어도 300, 적어도 305, 적어도 310, 적어도 315, 적어도 320, 적어도 325, 적어도 330, 적어도 335, 적어도 340, 적어도 345, 적어도 350, 적어도 355, 적어도 360, 적어도 365, 적어도 370, 적어도 375, 적어도 380, 적어도 385, 적어도 390, 적어도 395, 적어도 400, 적어도 405, 적어도 410, 적어도 415, 또는 적어도 420이다. CHIKV E2의 일부 바람직한 길이는 15 이하, 20 이하, 25 이하, 30 이하, 35 이하, 40 이하, 45 이하, 50 이하, 55 이하, 60 이하, 65 이하, 70 이하, 75 이하, 80 이하, 85 이하, 90 이하, 95 이하, 100 이하, 105 이하, 110 이하, 115 이하, 120 이하, 125 이하, 130 이하, 135 이하, 140 이하, 145 이하, 150 이하, 155 이하, 160 이하, 165 이하, 170 이하, 175 이하, 180 이하, 185 이하, 190 이하, 195 이하, 200 이하, 205 이하, 210 이하, 215 이하, 220 이하, 225 이하, 230 이하, 235 이하, 240 이하, 245 이하, 250 이하, 255 이하, 260 이하, 265 이하, 270 이하, 275 이하, 280 이하, 285 이하, 290 이하, 295 이하, 300 이하, 305 이하, 310 이하, 315 이하, 320 이하, 325 이하, 330 이하, 335 이하, 340 이하, 345 이하, 350 이하, 355 이하, 360 이하, 365 이하, 370 이하, 375 이하, 380 이하, 385 이하, 390 이하, 395 이하, 400 이하, 415 이하, 422 이하이다. CHIKV 캡시드의 일부 바람직한 길이는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195, 적어도 200, 적어도 205, 적어도 210 적어도 215, 적어도 220, 적어도 225, 적어도 230, 적어도 235, 적어도 240, 적어도 245, 적어도 250 또는 적어도 255이다. CHIKV 캡시드의 일부 바람직한 길이는 15 이하, 20 이하, 25 이하, 30 이하, 35 이하, 40 이하, 45 이하, 50 이하, 55 이하, 60 이하, 65 이하, 70 이하, 75 이하, 80 이하, 85 이하, 90 이하, 95 이하, 100 이하, 105 이하, 110 이하, 115 이하, 120 이하, 125 이하, 130 이하, 135 이하, 140 이하, 145 이하, 150 이하, 155 이하, 160 이하, 165 이하, 170 이하, 175 이하, 180 이하, 185 이하, 190 이하, 195 이하, 200 이하, 205 이하, 210 이하, 215 이하, 220 이하, 225 이하, 230 이하, 235 이하, 240 이하, 245 이하, 250 이하, 255 이하 또는 260 이하이다. 본 단락에서 사용된 바와 같이, 바람직한 단편 크기에 대한 참조는 적어도와 미만 사이의 범위의 변경을 언급하기 위한 것이고, 그와 같은 범위는 20 내지 400, 20 내지 30, 40 내지 100 등과 같은 크기의 범위를 제공하기 위해 "미만" 크기로 나타낸 어떤 수에 대한 "적어도" 크기로서 나타낸 어떤 수일 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, “유전적 제작물(genetic construct)”는 표적 단백질 또는 면역 조절 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 코딩 서열은 프로모터 및 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 조절 요소들에 실시가능하도록 링크된 개시 및 종료 시그날을 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, “발현가능한 형태(expressible form)”는 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 코딩 서열에 실시가능하도록 링크되어, 개체의 세포내에 존재할 경우 코딩 서열이 발현되는, 필수 조절 서열이 포함된 유전자 제작물을 말한다.
여기에서 사용된 바와 같이, “엄한 혼성화 조건(stringent hybridization condition)” 또는 “엄한 조건(stringent condition)”은 핵산 분자가 다른 서열이 아닌, 다른 또 다른 핵산 분자에 하이브리드될 수 있는 조건을 지칭한다. 엄한 조건은 서열 의존적이나 상이한 환경에 따라 달라질 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 일반적으로, 엄한 조건은 지정된 이온 강도, pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮은 온도로 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보적 프로브의 50%가 표적 서열에 평형상태로 하이브리드되는 온도(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도에서)를 말한다. 표적 서열은 일반적으로 Tm에서 과량 존재하기 때문에, 프로브의 50%가 평형상태로 점령된다. 일반적으로 엄한 조건에서 염 농도는 pH 7.0 내지 8.3에서, 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 일반적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온(또는 다른 염)이며, 온도는 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드(가령, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃이며, 더 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드의 경우 적어도 60℃가 되는 조건이다. 엄한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제를 추가하여 얻을 수도 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, “상동한(homologous)”은 두 개 핵산 서열 또는 두 개 아미노산 서열 사이에 서열 상동성을 지칭한다. 면역성 기능을 보유하는데 충분할 정도로 상동한 두 개 핵산 서열 또는 두 개 아미노산 서열은 “상동”하다. 뉴클레오티드 및 아미노산의 서열 상동성은 FASTA, BLAST 및 Gapped BLAST (Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389, 전문이 참고문헌으로 통합됨) 그리고 PAUP* 4.0b10 소프트웨어(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 이용하여 결정될 수 있다. “유사성 비율(Percentage of similarity)”은 PAUP* 4.0b10 소프트웨어(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 이용하여 계산된다. 공통 서열(consensus sequence)의 평균 유사성은 계통학적 트리상에 모든 서열과 비교하여 계산된다. 간략하게 설명하면, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 알고리즘은 서열 유사성을 결정하는데 적절하다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410, 전문을 참고문헌으로 첨부한다). BLAST 분석을 실행하는 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 문제의 서열에서 데이터베이스 서열에 있는 동일한 길이의 단어와 나란하게 배열하였을 때, 일치되거나 또는 어느 정도의 포지티브-값의 역치 수치 T를 가지는 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써, 높은 수치의 서열 쌍(HSPs)를 확인하는 것이다. T는 이웃한 단어 점수 역치(score threshold)를 말한다(Altschul et al., supra). 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 연구자들이 이를 포함하는 HSPs이 찾는 작업을 시작하기 위한 씨드로 작용한다. 단어 히트는 누적된 배열 점수가 증가되는 한, 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 각 방향으로 단어 히트의 연장은 다음 경우에 중단된다: 1) 누적 배열 점수가 최대 수득 치로부터 X 만큼 떨어질 때; 2) 하나 또는 그 이상의 네가티브-점수 잔류 배열의 누적으로 인하여, 누적 점수가 0 또는 그 이하로 내려갈 때, 또는 3) 서열의 어느 한 쪽의 단부에 도달될 때. Blast 알고리즘 변수 W, T, 및 X는 배열의 감응성 및 속도를 결정한다. Blast 프로그램은 디폴트로, 단어 길이(W) 11, BLOSUM62 점수 매트릭스(Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919, 이는 참고문헌으로 전문 첨부됨), 50개 배열, 기대치(expectation:E) 10, M=5, N=4, 그리고 양 가닥의 비교를 이용한다. BLAST 알고리즘(Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787, 전문이 참고문헌으로 통합됨) 그리고 Gapped BLAST으로 두 서열간에 통계학적 유사성 분석을 실행한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 측정은 적어도의 합 확률(P(N))으로, 두 개 핵산간에 매치가 우연히 일어날 확률을 제공한다. 예를 들면, 핵산은, 테스트 핵산을 다른 핵산과 비교할 때 적어도 합 확률은 약 1 미만, 바람직하게는 0.1 미만, 좀더 바람직하게는 약 0.01 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 핵산은 다른 핵산에 유사한 것으로 간주된다.
일부 구체예에서, 개체를 면역시키는데 이용될 수 있는 CHIKV의 DNA 백신이 제공된다. 이 백신은 생체내에서 체액 및 세포 면역원성을 유도한다.
일부 구체예에 따르면, 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)에 대항하여 교차 반응성 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 가진 이뮤노겐을 개발하기 위하여, CHIKV 바이러스성 외피 E1, E2 및 코어 단백질 캡시드에 대항하여 공통 제작물을 기획하였다. 이와 같은 제작물을 위하여, 1952년과 2006년 사이에, 인간에서 감염 및 사망의 원인이 된 분리된 치쿤구니야 바이러스에서 21개 서열이 선택되었다. 각 유전자에 대해 선택된 DNA 서열은 S27 종족(제 1 분리체)과 샘플링 편중을 피하기 위하La Reunion Island 발병 분리체를 포함한 다양한 나라에서 얻은 종족에서 구하였다. DNA 서열들이 배열되었고, 서열 합성을 위하여 각 위치에서 가장 공통적인 뉴클레오티드가 선택되었다. 유추된 아미노산 서열이 이용되고, 배열 갭을 도입시켜, 리딩 프레임이 유지되면서 코돈간에 도입되었다. 공통 서열 생성후, IgE 선도(leader) 서열이 N-말단에 첨가되어, 발현 및 분비가 강화되었고, 제작물은 코돈 최적화에 의해 최적화되었으며, 기존의 Kozak 서열은 더 강력한 서열(GCCGCCACC)로 대체되었다(도 1a). 분석 및 발현 증명을 위하여 E1 및 캡시드의 C-말단에 His 태그가 첨가되었다. 분석, 발현 및 면역원성 연구를 위하여 기존 기술에서 설명된 것과 같이 박테리아에서 이와 같은 제작물이 생산되었고, 정제되었다 [21]. 도 1b는 외피 E1, E2 및 캡시드 DNA를 인코딩하는 제작물의 아가로즈 겔 전기영동을 설명한다.
또 다른 구체예에 따르면, CHIKV 바이러스성 외피 E1, E2 및 E3 각각에 대한 키메라 공통 제작물을 기획하였다. 이들 제작물의 경우, 각 E1, E2 및 E3의 공통 서열이 생성되었으며, 각 공통 서열은 서로 링크되며, 바람직하게는 프로테아제 절단 부위를 인코딩하는 서열과 링크된다. 또한, 발현 및 분비를 강화시키기 위하여 N-말단에 IgE 선도 서열이 첨가되었다.
바람직한 구체예에서, 제작물은 IgE 선도 서열에 링크된 CHIKV 코딩 서열을 포함한다. 그러나, 일구 구체예에서, CHIKV 코딩 서열은 IgE 선도 서열에 링크되지 않지만, 상이한 선도 서열에 임의로 링크될 수 있다.
SEQ ID NO:1는 IgE 선도 서열에 링크된 공통 CHIKV-E1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:2는 IgE 선도 서열에 링크된 공통 CHIKV-E2 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:3는 IgE 선도 서열에 링크된 공통 CHIKV-캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:4는 SEQ ID NO:1에 해당하지만 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열이 없는 공통 CHIKV-E1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:5는 SEQ ID NO:2에 해당하지만 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열이 없는 공통 CHIKV-E2 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:6는 SEQ ID NO:13에 해당하지만 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열이 없는 공통 CHIKV-캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:7는 IgE 선도 서열을 갖는 공통 CHIKV-E1 단백질인 SEQ ID NO:1에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:8는 IgE 선도 서열을 갖는 공통 CHIKV-E2 단백질인 SEQ ID NO:2에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:9는 IgE 선도 서열을 갖는 공통 CHIKV-캡시드 단백질인 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:10는 IgE 선도 서열이 없는 공통 CHIKV-E1 단백질인 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:11는 IgE 선도 서열이 없는 공통 CHIKV-E2 단백질인 SEQ ID NO:5에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:12는 IgE 선도 서열이 없는 공통 CHIKV-캡시드 단백질인 SEQ ID NO:6에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:13는 코작(Kozak) 서열-IgE 선도 서열-CHIKV-E3 코딩 서열-분열 부위-CHIKV-E2 코딩 서열-분열 부위-CHIKV-E1 코딩 서열-정지 신호-정지 신호인 공통 Env을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:14는 IgE 선도 서열-CHIKV-E3-분열 부위-CHIKV-E2-분열 부위-CHIKV-E1 코딩 서열인 공통 Env 단백질 서열인 SEQ ID NO:13에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:15는 SEQ ID NO:13에 해당하지만 IgE 선도 서열, 즉 CHIKV-E3 코딩 서열-분열 부위-CHIKV-E2 코딩 서열-분열 부위-CHIKV-E1 코딩 서열-정지 신호-정지 신호가 없는 공통 Env을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:16는 IgE 선도 서열, 즉 CHIKV-E3-분열 부위-CHIKV-E2-분열 부위-CHIKV-E1 코딩 서열이 없는 공통 Env 단백질 서열인 SEQ ID NO:15에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 의미한다.
SEQ ID NO:17는 IgE 선도 서열의 아미노산 서열을 의미한다.
GCCGCCACC는 바람직한 코작(Kozak) 서열을 의미한다.
공통 단백질을 인코딩하는 핵산이 개체의 세포에 의해 취입(taken up)되면, 공통 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세포에서 발현되고, 단백질들은 개체로 운반된다. 본 발명의 측면은 플라스미드상에서 공통 단백질의 코딩 서열을 운반하는 방법을 제공하고; 또는 재조합 백신의 일부로써 그리고 약동화 백신의 일부로써.
본 발명의 일부 측면에 따르면, 병원체 또는 비정상적, 질병 관련된 세포에 대항하여 예방적으로 및/또는 치료요법적으로 개체를 면역시키는 조성물 및 방법들이 제공된다. 백신은 임의 타입의 백신, 예를 들면, 약독화 생백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 것이다.
일부 구체예에서, 백신은 하나, 두 개 또는 세 개의 공통 단백질을 모두 포함한다. 일부 구체예에서, 백신은 동일한 핵산 분자상에 두 개의 공통 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 백신은 두 가지 상이한 핵산 분자상에 두 개의 공통 단백질의 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 백신은 동일한 핵산 분자상에 세 개의 공통 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 백신은 세 개의 공통 단백질의 코딩 서열을 포함하는데, 이때 두 개에 대한 코딩 서열은 동일한 핵산 분자상에 있고, 세 번째 단백질에 대한 코딩 서열은 제 2 핵산 분자상에 있다. 예를 들면, 한 개 핵산 분자는 E1 및 E2에 대한 코딩 서열을 포함하고, 캡시드에 대한 코딩 서열을 포함하거나; 또는 한 개 핵산 분자는 E1 및 캡시드에 대한 코딩 서열을 포함하고, E2에 대한 코딩 서열을 포함하거나 또는 한 개 핵산 분자는 E2 및 캡시드에 대한 코딩 서열을 포함하고, E1에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 세 개의 공통 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는데, 이때 세 가지 상이한 핵산 분자가 있으며, 각각은 상이한 코딩 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, IgE 선도를 포함하는 공통 E1을 포함하는 코딩 서열은 SEQ ID NO:1이다. 일부 구체예에서, IgE 선도없이, 공통 E1에 대한 코딩 서열은 SEQ ID NO:4이다. 일부 구체예에서, IgE1 선도가 있는 공통 E1 단백질의 서열은 SEQ ID NO:7 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, 공통 E1 단백질은 SEQ ID NO:10 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, IgE 선도가 있는 공통 E1 단백질은 SEQ ID NO:7에 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성이다. 일부 구체예에서, IgE 선도가 없는 공통 E1 단백질은 SEQ ID NO:10에 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성이다. 일부 구체예에서, IgE 선도를 포함하는 공통 E2을 포함하는 코딩 서열은 SEQ ID NO:2이다. 일부 구체예에서, IgE 선도없이, 공통 E2에 대한 코딩 서열은 SEQ ID NO:5이다. 일부 구체예에서, IgE2 선도가 있는 공통 E2 단백질의 서열은 SEQ ID NO:8 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, 공통 E2 단백질은 SEQ ID NO:11 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, IgE 선도가 있는 공통 E2 단백질은 SEQ ID NO:7에 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성이다. 일부 구체예에서, IgE 선도가 없는 공통 E2 단백질은 SEQ ID NO:11에 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성이다. 일부 구체예에서, IgE 선도를 포함하는 공통 캡시드를 포함하는 코딩 서열은 SEQ ID NO:3이다. 일부 구체예에서, IgE 선도없이, 공통 E1에 대한 코딩 서열은 SEQ ID NO:6이다. 일부 구체예에서, IgE1 선도가 있는 공통 E1 단백질의 서열은 SEQ ID NO:9 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, 공통 E1 단백질은 SEQ ID NO:12 또는 이의 단편이다. 일부 구체예에서, IgE 선도가 있는 공통 E1 단백질은 SEQ ID NO:9에 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성이다. 일부 구체예에서, IgE 선도가 없는 공통 E1 단백질은 SEQ ID NO:12에 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성이다.
다중 유전자는 단일 핵산 분자 또는 다중 핵산 분자상에 있을 수 있다. 예를 들면, 한 개 핵산 분자는 E1 및 E2에 대한 코딩 서열을 포함하고, 캡시드에 대한 코딩 서열을 포함하며; 또는 한 개 핵산 분자는 E1 및 캡시드에 대한 코딩 서열을 포함하고, E2에 대한 코딩 서열을 포함하거나 또는 한 개 핵산 분자는 E2 및 캡시드에 대한 코딩 서열을 포함하고 E1에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 백신은 세 개의 공통 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는데, 세 가지 상이한 핵산 분자가 있으며, 각각은 상이한 코딩 서열을 포함한다. 백신은 E1, E2 및 캡시드에 대한 두 개 또는 그 이상의 공통 서열의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 백신은 단일 키메라 유전자로써 서로 링크된 E1, E2 및 E3을 포함하는 공통 CHIKV Env를 포함한다. 일부 구체예에서, 개별 공통 서열이 프로테아제 절단 부위를 인코딩하는 서열과 함께 서로 링크되어있다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 E1, E2 및 E3의 각 단편을 포함하여, 개체에서 키메라 유전자의 발현으로 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응이 일어난다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:13 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:13에 적어도 85% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:13에 적어도 90% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:13에 적어도 95% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:13에 적어도 98% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:13에 적어도 99% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:15 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:15에 적어도 85% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:15에 적어도 90% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:15에 적어도 95% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:15에 적어도 98% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 SEQ ID NO:15에 적어도 99% 상동성을 가진 핵산 서열 또는 개체에서 단백질의 발현으로 인하여 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 일으키는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 백신은 서로 링크된 E1, E2 및 E3의 공통 아미노산 서열을 인코딩하는 공통 CHIKV Env를 포함한다. 일부 구체예에서, 개별 공통 서열이 프로테아제 절단 부위를 인코딩하는 서열과 함께 서로 링크되어있다. 일부 구체예에서, 키메라 유전자는 E1, E2 및 E3의 각 단편을 인코딩하며, 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 면역원성이며, 개체에서 E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14에 적어도 85% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14에 적어도 90% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14에 적어도 95% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14에 적어도 98% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14에 적어도 99% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:16에 적어도 85% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:16에 적어도 90% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:16에 적어도 95% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:16에 적어도 98% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 공통 단백질 CHIKV Env는 SEQ ID NO:14에 적어도 99% 상동성을 가진 아미노산 서열 또는 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 면역원성이며, E1, E2 및 E3 각각에 대항하여 면역반응을 유도하는데 충분한 서열을 포함하는 이의 단편을 포함한다.
핵산 분자는 DNA 주사(DNA 백신접종으로 지칭되기도 함), 재조합 아데노바이러스와 같은 재조합 벡터, 재조합 백시니아 바이러스와 같은 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스를 포함한 몇 가지 잘 알려진 기술중 임의의 것에 의해 운반될 수 있다.
DNA 백신은 U.S. 특허 Nos. 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 5,676,594, 및 여기에 언급된 우선권 출원에서 설명되고 있으며, 각 문헌은 참고문헌으로 첨부된다. 이들 출원에서 설명된 운반 프로토콜에 추가하여, DNA를 운반하는 대안 방법들이 U.S. 특허 Nos. 4,945,050 및 5,036,006에서 설명되어 있으며, 이들은 참고문헌으로 통합된다.
투여 경로에는 근육내, 비강내, 복막내, 피내, 피하내, 정맥, 동맥 및 안구 및 경구 뿐만 아니라 국소, 경피, 흡입 또는 좌약 또는 세척(lavage)에 의한 질, 직장, 요도, 볼 및 설하 조직과 점막 조직이 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 투여 경로에는 점막 조직, 근육내, 복막내, 피내 그리고 피하 주사가 포함된다. 유전자 제작물은 전통적인 주사기, 바늘없는 주사 장치 또는 미세사출유전자총("microprojectile bombardment gene guns")이 포함되나 이로 한정되지 않는 수단에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 투여 경로는 유전자 제작물을 운반하기 위한 전자천공(electroporation) 이용과 관련되며, U.S. 특허 Nos. 5,273,525, 5,439,440, 5,702,359, 5,810,762, 5,993,434, 6,014,584, 6,055,453, 6,068,650, 6,110,161, 6,120,493, 6,135,990, 6,181,964, 6,216,034, 6,233,482, 6,241,701, 6,347,247, 6,418,341, 6,451,002, 6,516,223, 6,567,694, 6,569,149, 6,610,044, 6,654,636, 6,678,556, 6,697,669, 6,763,264, 6,778,853, 6,865,416, 6,939,862 and 6,958,060에서 설명되며, 이들 각각은 참고문헌으로 첨부된다.
전자천공 장치의 예와 DNA 백신의 운반을 실행하는 적절한 전자천공 방법은 U.S. 특허 No. 7,245,963 (Draghia-Akli, et al.,) U.S. 특허 공개. 2005/0052630(Smith, et al.,)에서 설명되며, 이 내용은 참고문헌으로 첨부된다. 또한, DNA 백신의 운반을 실행하는 전기천공 장치 및 실행 방법에 대해서 공동-계류 및 공동-소유의 U.S. 특허 출원 No. 11/874072,[(2007년 10월 17일 출원됨, 2007, U.S. 가출원 Nos. 60/852,149(2006년 10월 17일자 출원) 및 60/978,982,(2007년 10월 10일자 출원)을 USC 35조항에 따른 우선권 주장을 하며, 이들 내용 전부를 참고문헌으로 첨부함)]에서 설명된 것이 바람직하다.
다음은 전기천공 기술을 이용하는 구체예의 예시이며, 상기에서 논의된 특허 참고문헌에서 더 자세하게 논의되어 있다: 전기천공 장치는 사용자에 의해 입력된 미리설정된 전류에 유사한 정전류를 생산하는 에터지 펄스를 포유류의 원하는 조직으로 운반하도록 설정된다. 전기천공장치는 전기천공 구성요소 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 하나 또는 그 이상의 다양한 요소를 포함하거나 결합되어 있다: 대조군러(controller), 전류파형 발생기(current waveform generator), 임피던스 테스터(impedance tester), 파형 로거(logger), 입력 요소(input element), 상태 보고 요소(status reporting element), 통신 포터(communication port), 메모리 구성요소(memory component), 파워 소스(power source) 및 파워 스위치(power switch). 전기천공 구성요소는 전기천공장치의 하나의 요소로 기능을 할 수 있고, 다른 요소들은 전기천공 구성요소와 통하는 별도 요소(또는 구성요소)이다. 일부 구체예에서, 전기천공 구성요소는 전기천공 장치에서 하나 이상의 요소로 기능을 할 수 있고, 여전히 전기천공 구성요소와 분리된 다른 요소와 통할 수 있다. 백신 운반을 위하여 전기천공 기술의 사용은 전자기계 또는 기계 장치의 부분으로 기존의 전기 천공 장치의 요소로 한정되지 않는데, 그 이유는 요소들이 한 장치로 기능을 하거나 또는 서로 통하면서 별도의 요소로 기능을 할 수 있기 때문이다. 전기천공 구성요소는 원하는 조직내에서 정전류를 생산하는 펄스 에너지를 운반할 수 있고, 여기에는 피이드백 기전이 포함된다. 전극 어셈블리에는 공간적으로 배열된 다수의 전극을 가진 전극 배열이 포함되며, 전극 어셈블리는 전기천공 구성요소로부터 펄스 에너지를 수용하고, 이를 전극을 통하여 원하는 조직으로 운반한다. 다중 전극의 적어도 하나는 펄스 에너지 운반시에 중립이며, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 전기천공 구성요소에 전달한다. 피이드백 기전은 측정된 임피던스를 수용하고, 전기천공 구성요소에 의해 운반된 펄스 에너지를 조정하여 정전류를 유지시킨다.
일부 구체예에서, 다수 전극은 분산된 패턴으로 펄스 에너지를 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 다수 전극은 예정된 시퀀스하에 전극의 조절을 통하여 분산된 패턴으로 펄스 에너지를 운반할 수 있고, 사용자가 전기천공 구성요소에 예정된 시퀀스를 입력시킨다. 일부 구체예에서, 예정된 시퀀스는 차례로 운반되는 다수의 펄스를 포함하는데, 이때, 다수의 펄스에서 각 펄스는 임피던스를 측정하는 한 개의 중립 전극과 함께 적어도 두 개의 활성 전극에 의해 운반되며, 그 다음 펄스는 적어도 두 개의 활성 전극중 상이한 전극과 임피던스를 측정하는 한 개의 중립 전극에 의해 전달된다.
일부 구체예에서, 피이드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해 실행된다. 바람직하게는, 피이드백 기전은 아날로그 닫힌 루프 회로에 의해 실행된다. 바람직하게는, 이와 같은 피이드백은 매 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs에서 일어나지만, 바람직하게는 실시간(real-time) 피이드백 또는 동시적(instantaneous) (가령, 반응 시간을 결정하는 기술에 의해 측정되었을 때 실질적으로 동시)으로 일어난다. 일부 구체예에서, 중립 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피이드백 기전에 전달하고, 피이드백 기전은 임피던스에 반응하고, 그리고 펄스 에너지를 조정하여 미리설정된 전류에 유사한 값으로 정전류를 유지시킨다. 일부 구체예에서, 피이드백 기전은 펄스 에너지 운반 동안 지속적으로 그리고 동시적으로 정전류를 유지시킨다.
세포에 의해 취입된 경우, 유전자 제작물은 염색체외 분자로 기능을 하도록 세포내에 유지될 수 있다. DNA는 세포에 일과적으로 플라스미드의 형태로 도입될 수도 있다. 대안으로, RNA가 세포로 투여될 수도 있다. 또한, 센트로머(centromere), 텔로머(telomere) 및 복제 원점을 포함하는 선형 미니 염색체로 유전자 제작물을 제공하는 것도 고려될 수 있다. 유전자 제작물은 약독화 생유기체내 유전자 물질의 일부를 구성하거나 또는 개체로 투여되는 재조합 미생물 백터로 구성될 수 있다. 유전자 제작물은 재조합 바이러스성 백신의 게놈의 일부가 될 수 있고, 이때 유전자 물질은 염색체외(extrachromosomal)로 유지된다. 유전자 제작물에는 핵산 분자의 유전자 발현에 필수적인 조절 요소들이 포함된다. 이와 같은 조절요소들에는 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 그리고 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 또한, 표적 단백질 또는 면역 조절 단백질을 인코딩하는 서열의 유전자 발현을 위하여 종종 인핸서가 요구된다. 이와 같은 요소들은 원하는 단백질을 인코딩하는 서열에 작업가능하도록 반드시 링크되어야 하고, 그리고 조절 요소들은 이것들이 투여되는 개체에서 반드시 작용가능해야 한다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로 원하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분으로 간주된다. 그러나, 이들 요소들은 유전자 제작물이 투여되는 개체에서 반드시 기능을 해야만 한다. 개시 및 종료 코돈은 코딩 서열과 같은 프레임에 있어야 한다.
이용되는 프로모터와 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포내에서 기능을 해야만 한다.
본 발명을 실행하는데 유용한 프로모터의 예, 특히 인간에 대한 유전자 백신을 생산하는데 유용한 프로모터에는 시미안 바이러스(Simian Virus 40)(SV40), 마우스 유선 종양 바이러스(Mouse Mammary Tumor Virus) (MMTV) 프로모터, 인간 면역 결힙 바이러스(MV) 가령, BIV Long Terminal Repeat (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스(Moloney virus), ALV, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)(CMV) 가령, CMV 이미디에이트 얼리(immediate early) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus) (EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus) (RSV) 뿐만 아니라 인간의 악틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오닌과 같은 인간 유전자에서 얻은 프로모터가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
본 발명을 실행하는데 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예, 특히, 인간을 위한 유전적 백신을 생산하는데 유용한 폴리아데닐화 시그날은 SV40 폴리아데닐화 시그날, 소 생장 호르몬 폴리아데닐화 (bgh-PolyA) 시그날 그리고 LTR 폴리아데닐화 시그날을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날이라고도 하는 pCEP4 플라스미드내에 있는 SV40 폴리아데닐화 시그날(Invitrogen, San Diego Calif.)이 이용된다.
DNA 발현에 요구되는 조절 요소들에 추가하여, DNA 분자에는 다른 요소들이 포함될 수도 있다. 인핸서는 다음의 군에서 선택되나 이로 한정되지 않는다: 인간 악틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 CMV, RSV 및 EBV와 같은 바이러스성 인핸서.
유전자 제작물은 제작물을 염색체외적으로 유지시키고, 세포안에서 제작물의 다중 복사체를 생산하기 위하여, 포유류 기원의 복제 원점이 제공될 수 있다. 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4(Invitrogen (San Diego, Calif.))에는 입스타인 바 바이러스의 복제 원점 및 통합없이 많은 에피좀 복제를 만드는 핵 항원 EBNA-1 코딩 부분이 포함된다.
면역주사 실시와 관련된 일부 바람직한 구체예에서, 운반되는 핵산 분자에는 공통 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드와 추가적으로 표적 단백질에 대항하여 면역 반응을 더 강화시키는 단백질에 대한 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 이와 같은 유전자의 예로는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유도된 생장 인자(PDGF), TNF, GM-CSF, 상피 생장 인자(EGF), 시그날 서열이 결손되고, IgE로부터 시그날 펩타이드가 선택적으로 포함된 IL-15를 포함한, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-28와 같은 기타 사이토킨 및 림포킨을 인코딩하는 것들이다.
이와 같은 방법에 이용되는 조성물에는 U.S. 공개 No. 20030176378에 대응되는 U.S. 시리즈 No. 10/139,423(참고문헌으로 통합됨)에서 설명된 것과 같이, 다음의 단백질 또는 이와 같은 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 하나 이상이 더 포함될 수 있다: 주요 조직적합 복합체 항원(Major Histocompatibility Complex antigen)-MHC 클래스 I 또는 II 항원 포함; 사멸 도메인 수용체 가령, Apo-1, Fas, TNFR-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, 및 DR6를 포함하나 이로 한정되지 않음; 사멸 시그날, 가령, 사멸 도메인 수용체와 상호작용하는 단백질, FADD, FAP-1, TRADD, RIP, FLICE, 및 RAIDD을 포함하나 이로 한정되지 않음; 또는 사멸 도메인 수용체에 결합하여, 아팝토시스를 개시하는 리간드를 포함하는 사멸 시그날 가령, FAS-L 및 TNF을 포함하나 이로 한정되지 않음; 그리고 사멸 도메인 수용체와 상호작용하는 중개물질, 가령, FADD, MORT1, 및 MyD88을 포함하나 이로 한정되지 않음; 곤충 및 뱀 독, 슈도모나스(Psuedomoneus) 엔도톡신과 같은 세균성 엔도톡신, 단일 쇄 톡신을 포함하는 리친 및 겔로닌과 같은 이중 쇄 리보좀 비활성화 단백질을 포함하나 이로 한정되지 않는 세포를 죽이는 단백질을 포함하는 톡신.
본 방법에 사용된 조성물은, 참고로 본 명세서에 통합된 U.S. 공개 No. 20070041941에 대응하는 U.S. 시리즈 No. 10/560,650에 나타나 있는 바와 같이 하기 단백질 및/또는 그와 같은 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: IL-15 단백질 서열에 링크된 IgE 신호 펩타이드를 포함하는 융합 단백질과 같은 IL-15 단백질 서열에 링크된 비(non)-IL-15 신호 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 IL-15, CD40L, TRAIL; TRAILrecDRC5, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, F461811 또는 MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, CD30, CD153 (CD30L), Fos, c-jun, Sp-1, Ap1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK, SAP K, SAP1, JNK2, JNK1B2, JNK1B1, JNK2B2, JNK2B1, JNK1A2, JNK2A1, JNK3A1, JNK3A2, NF-카파-B2, p49 스플라이스(splice) 형태, NF-카파-B2, p100 스플라이스 형태, NF-카파-B2, p105 스플라이스 형태, NF-카파-B 50K 사슬 전구체, NFkB p50, 인간 IL-1.알파., 인간 IL-2, 인간 IL-4, 뮤린 IL-4, 인간 IL-5, 인간 IL-10, 인간 IL-15, 인간 IL-18, 인간 TNF-.알파., 인간 TNF-.베타., 인간 인터류킨 12, MadCAM-1, NGF IL-7, VEGF, TNF-R, Fas, CD40L, IL-4, CSF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, LFA-3, ICAM-3, ICAM-2, ICAM-1, PECAM, P150.95, Mac-1, LFA-1, CD34, RANTES, IL-8, MIP-1.알파., E-셀렉톤, CD2, MCP-1, L-셀렉톤, P-셀렉톤, FLT, Apo-1, Fas, TNFR-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 (TRAIL), DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, ICE, VLA-1, 및 CD86 (B7.2).
본 발명에 사용된 조성물은, 참고로 본 명세서에 통합된 U.S. 공개 No. 20070104686에 대응하는 U.S. 시리즈 No. 10/560,653에 나타나 있는 바와 같이 하기 단백질 및/또는 그와 같은 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, 및 TAP2.
어떠한 이유로든 유전자 제작물을 수용하는 세포들을 제거하는 것이 바람직한 경우, 세포 파괴를 위한 표적으로 작용할 수 있는 추가적인 요소들이 첨가될 수 있다. 발현가능한 형태의 허피스 티미딘 키나제(tk) 유전자가 유전자 제작물에 포함될 수 있다. 약물 강시클로비어(gangcyclovir)는 개체에 투여되어, 이 약물이 tk를 생산하는 임의 세포를 선택적으로 죽이게 되고, 따라서, 유전자 제작물을 가진 세포를 선택적으로 파괴시키는 수단이 제공된다.
단백질 생산을 최대화시키기 위하여, 제작물이 투여되는 세포에서 유전자 발현에 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 더욱이, 세포에서 가장 효과적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 당업자는 세포에서 기능을 하는 DNA 제작물을 만들 수 있다.
일부 구체예에서, IgE 시그날 펩타이드에 링크되고, 여기에서 설명된 면역 조절 단백질의 코딩 서열을 만들기 위한, 유전자 제작물이 제공될 수 있다.
본 발명의 한 방법에서 핵산 분자는 근육내, 비강내, 복막내, 피하내, 피내 또는 국소적으로 또는 흡입, 질, 직장, 요도, 볼 및 설하를 포함한 군에서 선택된 점막 조직으로 세척(lavage)의해 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 또는 유전적 백신 실행 물질의 투여와 함께 세포로 운반된다. 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서는 U.S. 특허 Nos. 5,593,972 및 5,962,428에서 설명되고 있으며, 이들 특허 문서는 참고문헌으로 첨부된다. 유전적 백신 실행 물질은 U.S. 특허 No.5,739,118에서 설명되며, 이 특허는 참고문헌으로 첨부된다. 핵산 분자와 함께 투여되는 공동 물질은 핵산 분자와 함께 혼합물로 투여되거나 별도로 핵산 분자 투여와 동시에, 핵산 분자 투여 전 또는 투여후에 투여될 수 있다. 또한, 전이감염 물질 및/또는 복제 물질 및/또는 염증 물질로 기능을 하며, 그리고 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서와 함께 투여될 수 있는 기타 물질에는 생장 인자, 사이토킨 및 림포킨, 예를 들면, 알파-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유도된 생장 인자(PDGF), TNF, 상피 생장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-15 뿐만 아니라 섬유아세포 생장 인자, 표면 활성 물질, 가령, 면역-자극 복합체(ISCOMS), 모노포스포릴 리피드 A(WL)를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌과 같은 소낭이 포함되며, 그리고 히알루론산이 유전자 제작물와 함께 투여되는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 운반/취입을 강화시키기 위하여 폴리(락티드-코-락티드)(PLG)와 함께 연합되어 제공된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 1 ng 내지 약 2000 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에는 약 5 ng 내지 약 1000 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물에는 약 10 ng 내지 약 800 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물에는 약 0.1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물에는 약 1 내지 약 350 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물에는 약 25 내지 약 250 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물에는 약 100 내지 약 200 ㎍의 DNA를 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제조된다. 약제학적 조성물이 주사용 약제학적 조성물인 경우, 조성물은 멸균되고, 발열물질이 없어야 하며, 과립자가 없어야 한다. 등장액 제제가 바람직하게 이용된다. 일반적으로 등장성(isotonicity)을 위한 첨가제에는 염화 나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토즈가 포함된다. 일부 경우에, 인산염 완충된 염과 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부 구체예에서, 혈관 수축제가 제제에 포함된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 치쿤구니야 바이러스에 대항하여 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 백신은 약독화 생백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다.
핵산 분자(들)은 플라스미드 DNA, 재조합 벡터의 핵산 분자 또는 약독화 백신에 제공되는 유전자 물질의 일부분으로 제공될 수 있다. 대안으로, 일부 구체예에서, 공통 단백질은 이를 인코딩하는 핵산 분자에 추가된 단백질로 운반되거나 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자 대신하여 운반될 수 있다.
유전자 제작물은 유전자 발현에 필요한 조절 요소들에 실시가능하도록 링크된 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 가능한 형을 포함하는 하나의 제작물, 그리고 면역 조절 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 가능한 형을 포함하는 하나의 제작물을 포함하는 유전자 복합 제작물이 제공된다. 유전자 복합 제작물을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자가 살아있는 세포로 운반되면, DNA 또는 RNA 분자가 발현되고, 표적 단백질 및 하나 또는 그 이상의 면역 조절 단백질이 발현된다. 표적 단백질에 대항하여 강화된 면역 반응이 생긴다.
유전자 백신을 개선시키기 위하여, 면역조절 단백질을 코딩하는 발현 가능한 형태의 서열을 이용하는 것에 추가하여, 본 발명은 항원을 인코딩하는 외부 유전자를 운반시키는 재조합 벡터를 이용하는 개선된 약독화 생백신 및 개선된 백신에 관계된다. 약독화 생백신 및 외부 항원을 운반하는데 재조합 벡터를 이용하는 실시예들은 U.S. 특허 Nos.: 4,722,848; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; 5,482,713에서 제공되며, 이들 특허 문헌은 참고문헌으로 각각 첨부된다. 공통 단백질 또는 이의 면역원성 공통 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 제작물이 제공되는데, 이때, 뉴클레오티드 서열은 발현을 실시하도록 백신내에서 기능을 할 수 있는 조절 서열에 실시가능하도록 링크된다. 본 발명에 따른 개량된 백신을 만들기 위하여, 유전자 제작물은 약독화 생백신 및 재조합 백신에 결합된다.
본 발명은 개체를 면역시키는 개선된 방법을 제공하는데, 이 방법은 개체의 세포로 DNA 백신, 약독화 생백신 그리고 재조합 백신을 포함하는 백신 조성물의 일부분으로써 유전자 제작물을 운반하는 단계를 포함한다. 유전자 제작물이 발현되도록 백신 내에서 기능을 할 수 있는 조절 서열에 실시가능하도록 링크되어 있는 공통 단백질 또는 이의 면역원성 공통 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 백신은 상이한 종에 대항하여 교차 보호를 일으킨다.
실시예
실시예 1
여기에서 DNA 백신 전략을 이용하여 CHIKV에 대한 백신 기획을 위한 신규한 공통에 기초한 방법 정보를 제시한다. 백신 카세트는 몇 가지 수정이 가해진 CHIKV 캡시드 및 외피 특이적 공통 서열에 기초하여 기획되었다. 캡시드, 외피 E1 및 E1의 발현은 T7-결합된 전사/해독 및 면역블랏 분석을 이용하여 평가되었다. 개조된(Adaptive) 정전류 전기 천공 기술(constant-current electroporation technique)을 이용하여 CHIK-캡시드, E1 및 E2의 코딩 플라스미드의 근육 주사를 통하여 C57BL/6 마우스에게 면역주사하였다. 에피토프 메핑을 포함하는 세포성 면역 반응 분석에 의하면, 이와 같은 제작물의 전기천공으로 강력한 그리고 광범위한 세포성 면역이 유도된다. 또한, 항체 ELISA에서, 이와 같은 합성 이뮤노겐은 고유 항원을 인지할 수 있는 고역가 항체를 유도할 수 있다는 것이 설명된다. 이와 같은 데이터들은 잠재적인 백신 칵테일에 공통 CHIKV 항원의 용도에 대한 추가 연구를 지원한다.
본 연구에서, 코돈 최적화, RNA 최적화, Kozak 서열 추가 및 치환된 면역글로블린 E 선도 서열을 포함하는 몇 가지 수정이 포함된 캡시드 (Cap), 외피 (E1) 그리고 외피 (E2) 특이적 공통 서열에 기초한 백신 카세트를 기획하였다. 백신 카세트는 DNA 백신 벡터 pVax1 안의 특정 위치로 도입되었다. 특이적인 제한 효소 처리를 이용한 삽입체와 T7 프로모터의 프라이머로 서열화에 의해 백신 제작물이 점검되었다. 실험실내 발현 및 생체내 웨스턴 블랏 분석이 이용되어 최종 제작물은 효과적으로 발현되었다. 이것으로, 바이러스성 제작물은 정확하게 발현되었음이 확인되었고, 추가적인 면역원성 연구를 위하여 처리되었다.
최근에, DNA 백신 운반을 위한 EP의 이용에 많은 관심이 있었다. 작은 동물 및 사람이 아닌 영장류에서 IM 면역주사 +EP에 대한 연구에서, 세포 및 특히 항체 반응의 증가가 일관적으로 보고되었다[20-22].
재료 및 방법
세포 및 동물:
ATCC에서 구한 BHK-21 세포주를 생장시키고, 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM 배지에 유지시켰다. 포유류 플라스미드 발현 벡터, pVax1는 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. 3 내지 4주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Jackson laboratories, Indianapolis, IN)가 이러한 실험에 이용되었으며, 세 가지 실험군(n4)으로 나뉘었다. 국립 보건원(National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA)) 및 펜실바니아대학 동물 관리 및 이용 위원회(Philadelphia, PA, USA) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 지침에 따라 모든 동물은 온도 조절되고, 광-주기 설비에 수용되었다.
CHIKV DNA 제작물 및 합성:
CHIKV 코어 및 외피 유전자들은 합성된 프라이머 합성에 의해 그리고, 모든 CHIKV 바이러스에 대한 NCBI 데이터베이스로부터 수집된 공통 가닥의 예측 서열을 이용하여 DNA-PCR 증폭에 의해 기획되었다. 발현을 위하여 공통 서열은 코돈 및 RNA 최적화(GeneArt, Regensburg, Germany)를 포함하여 최적화되었으며, 그리고 pVax1 발현 벡터 (Invitrogen)내로 삽입되었다.
실험실내 및 생체내 발현:
제작물 발현은 pVax1 기본 골격에 T7 프로모터의 이용 및 S35-메티오닌 CHIKV 유전자를 포함하는 T7 기초한 전사/해독 시스템(Promega, Madison, WI)을 이용하여 확인되었다. 합성된 단백질은 항-E1, 항-E2 또는 항-Cap 항체를 이용하여 면역 침전되었다. 면역침전된 단백질을 12% NuPage SDS-PAGE 겔(Invitrogen, CA)상에 전기영동시키고, 연속하여 고정시키고, 건조시켰다. 자가방사능사진을 찍어, 결합된 S35-라벨된 유전자 산물을 감지하였다. 생체내 발현을 위하여, 퓨진(Fugene) 형질감염 방법(Roche, NJ)을 이용하여 BHK-21 세포(1×106) 세포에 CHIKV 제작물을 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간 뒤, 단백질(50㎍)를 SDSPAGE(12%)상에서 분취하여, PVDF 막 Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 면역블랏 분석은 마우스에서 생성된 특정 항혈청으로 실행하였고, 발현된 단백질은 ECL 감지 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 이용하여 양고추냉이 과산화효소 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG로 볼 수 있었다[19].
면역주사 및 전기 천공
표준 프로토콜을 이용하여, 동물에 플라스미드 DNA로 프라임(prime)시켰다[20]. 4마리 마우스 군에 두 차례 pCHIKV 유전자 (25㎍)로, 2주 간격으로 2회 내지 3회 면역주사하였고, 최종 면역주사후 1주일 뒤에 마우스를 희생시켰다. 모든 면역주사는 생체내 전기천공(EP)에 의해 총 100㎕ 양으로 사두근으로 투여되었다 (VGX Pharmaceuticals Inc, Blue Bell, PA). 동물은 최종 면역주사후 7일째 희생시켰고, 면역학적 분석을 위하여 혈청 및 비장이 수거되었다. 대조군 및 면역주사를 맞은 마우스에서 각각 두 번째 및 세 번째 면역주사후 1주일 뒤에 채혈하였다. 모든 실험에서 구형파(Square-wave) 펄스가 이용되었고, 실험실에서 고안하고 테스트된 정전류 EKD로 운반되었다.[20-22]. 마우스 실험에서 세 개 전극 배열(3-EA)이 이용되었다. 3-EA는 세 개의 26-가우지 고형 스테인레스 강 전극이 이등변 삼각형 형태로 구성되는데, 두 개의 장변 길이는 0.5mm이며, 짧은 변의 길이는 0.3mm이며, 이들 변들은 비-전도성 플라스틱으로 묶여있다. 마우스 실험을 위한 특이적인 EP 조건들은 정전류, 0.1Amps, 세 가지 펄스, 52 msec/pulse, 펄스간 4 초가 이용되었다. 플라스미드 투여/EP를 위한 이벤트의 순서는 다음과 같다: 핸들 소켓에 일회용 전극 어셈블리를 두고, 핸들에 있는 시작 버튼을 누르고, 동물 실험 군 번호를 입력하고, 인슐린 주사기를 이용하여 50ml의 DNA 제작물(25mg 총 DNA) 플라스미드를 주사하고, 주사 부위 주변에 바늘을 바로 두고, 핸들상에 시작 버튼을 누르고, 4초를 헤아린 뒤, 펄스가 운반될 것이다. 전기천공후 5초 뒤에, 근육으로부터 배열을 서서히 제거한다. 모든 전극들은 모든 처리 동안 근육안으로 완전하게 삽입된다[21, 22]. 모든 DNA는 엔도톡신 없는 Qiagen 컬럼을 이용하여 만들었다. 모든 동물들은 펜실바니아 대학내 온도 조절된, 주기적으로 광이 제공되는 설비에 수용되었고, 국립보건원 및 펜실바니아 대학의 지침에 따라 동물들을 돌보았다.
세포성 반응: ELISPOT 분석
ELISPOT 분석은 기존에 설명된 것과 같이 실시되었다[23]. 간략하게 설명하면, ELISpot 96-웰 플레이트(Millipore)는 항-마우스 IFN-γ 캡쳐 Ab로 피복시키고, 4℃에서 24시간 동안 항온처리되었다(R & D Systems). 다음 날, 플레이트를 세척하고, 2시간 동안 1% BSA로 차단시켰다. 면역주사를 맞은 마우스로부터 취한 200,000개 비장세포를 각 웰에 첨가하였고, RPMI 1640 (네가티브 대조군), Con A (포지티브 대조군), 또는 특정 펩타이드 Ags (10㎍/ml; Invitrogen) 존재하에 37℃, 5% CO2에서 자극받았다. 펩타이드 풀(pools)은 11개 아미노산이 겹쳐지는 15-mer 펩타이드로 구성된다. 자극 24시간 후, 세포를 세척시키고, 바이오티닐화된 항-마우스 IFN-γ Ab (R & D Systems)으로 4℃에서 24시간 동안 항온처리시켰다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타아비딘-알칼리 포스포타제(R & D Systems)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리시켰다. 플레이트를 세척하고, 5-브로모-4-클로로-3′-인돌일포스페이트 p-톨루이딘 염 및 니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(크로모겐 발색 시약; R & D Systems)를 각 웰에 첨가시켰다. 그 다음 플레이트를 증류수로 헹구고, 실온에서 건조시켰다. 자동 ELISPOT 판독기(CTL Limited)를 이용하여 스팟의 수를 헤아렸다[21-23].
체액성 면역 반응: 항체 ELISA
각 DNA 프라이밍 주사 및 백신접종에 대한 체액성 면역 반응 후의 항체 수준이 CHIKV DNA 제작물에서 결정되었다. 간략하게 설명하면, 96-웰 고-결합 폴리스티렌 플레이트(Corning, NY)에 PBS로 희석시킨 합성된 특이적 펩타이드(2㎍/ml)를 4℃에 밤새 피복시켰다. 다음 날, 플레이트는 PBST (PBS, 0.05% Tween 20), 로 세척시키고, 1시간 동안 3% BSA/PBST로 차단시키고, 37℃에서 1시간 동안 면역주사를 맞은 마우스와 고유 마우스에서 취한 혈청으로 1:100 희석액으로 항온처리하였다. 1:5,000 희석비로 염소 항-마우스 IgG-HRP (Research Diagnostics, NJ)를 이용하여 결합된 IgG가 감지되었다. 결합된 효소는 크로모겐 기질 용액 TMB (R & D Systems)을 첨가하고, Biotek EL312e Bio-Kinetics 판독기, 450 nm에서 감지되었다. 모든 혈청은 이중으로 테스트되었다[22].
결과
공통 제작물 발현:
다중 기술을 이용하여, 세 가지 CHIKV 공통 제작물의 발현이 증명되었다. 생산된 단백질을 눈으로 확인하기 위하여, 실험실내 S35-라벨된 실험실내 T7-결합된 전사 및 해독 분석이 실시되었다. 해독 산물은 His 태그 항체를 이용하여 면역 침전되었고, 겔 분석이 실시되었다. SDS-PAGE 및 방사능 분석에서, 각 제작물(외피 E1, E2 및 캡시드)는 이론적으로 예측된 분자량까지 이동되었음이 확인되었다(도 2a). 그 다음, 생체내 포유류 세포에서 이들 제작물의 발현을 검사하였다. BHK-21 세포내로 형질감염후, 3일 뒤에 단백질을 추출하고, 웨스턴 블랏 분석에서 특이적 다클론성 항체를 이용하여 발현을 탐지하였다. (도 2b). 외피 E1 제작물 형질감염된 세포에서, 특정 항체로 면역 블랏팅하였을 때 캡시드 제작물 감염된 세포상에서 52-kDa 단백질과 36-kDa 단백질이 관찰되었다.
체액 면역원성
치명적 CHIKV 바이러스로부터 보호하기 위하여 공통 이뮤노겐의 강도는 면역계의 세포성 면역반응에 있다고 가정하였다. 더욱이, 교차 반응성이 있지만, 비-중화 항체는 심각한 질병에 대항하여 어느 정도의 보호를 제공할 수 있다. 제작물이 항체 반응을 유도할 수 있는지를 확인하기 위하여, ELISA에 의한 항체 반응에 대해 DNA 면역접종을 테스트한 후 수득된 혈청으로부터 항체 역가를 결정하기 위하여 CHIKV-면역 주사된 마우스 혈청에서 항체 ELISA를 실시하였다. 외피 E1으로 면역주사를 맞은 마우스의 혈청내 항-E1 특이적 IgG 항체는 벡터 대조군으로 면역주사를 맞은 마우스의 혈청내에 있는 것보다 훨씬 높았다(도 3a). 유사하게, 외피 E2 및 캡시드 제작물로 각각 면역주사를 맞은 마우스 혈청내 항-E2 특이적인 IgG 항체와 캡시드 특이적인 IgG 항체는 벡터 대조군으로 면역주사를 맞은 마우스의 혈청에서보다 상당히 더 높았다(도 3b, 3c). 이와 같은 결과들은 플라스미드 운반의 대안 수단, 특히 전기천공이 DNA 백신 이뮤노겐에 반응하여 항체 생산을 증가시킨다는 것을 더욱 뒷받침한다.
세포 면역원성
CD8+CTL 반응을 유도하는 E1, E2 및 캡시드 제작물의 능력은 IFN-γ ELISpot 분석에 의해 측정되었다. 공통 외피 제작물 E1, E2 뿐만 아니라 캡시드 백신은 세 가지 면역주사후에 C57BL/6 마우스에서 강력한 IFN-γ 반응을 유도할 수 있었다(도 4a, 5a, 6a). 외피 E1에 의해 유도된 세포 면역 반응의 분자 특징을 위하여, 전체 외피 E1으로 뻗어있는 펩타이드 라이브러리에 대하여 ELISpot 분석이 실시되었다. E1 단백질의 잔기 1-435에 걸쳐진 펩타이드와 E2 단백질의 1-423에 걸쳐진 펩타이드, 이들 사이에 9개 아미노산 오버랩이 있는 74개 15-mer 펩타이드가 이용되었다. 외피는 E1 단백질에서 주요 에피토프 HSMTNAVTI(SEQ ID NO:18) (도 4b)와 E2 단백질에서 IILYYYELY(SEQ ID NO:19) (도 5b)를 유도하였다. 유사하게, 캡시드 단백질의 경우, 전체 캡시드 단백질에 걸쳐있는 펩타이드 라이브러리에 대해 ELIspot 분석을 실행하였다. 캡시드 단백질의 잔기 1-261에 결쳐있고, 펩타이드간 9개 아미노산 오버랩이 있는 46개 15-mer 펩타이드가 이용되었다. 캡시드 제작물(도 5b)에 의해 주요 에피토프 ACLVGDKVM(SEQ ID NO:20)가 유도되었다. 흥미로운 것은 제작물 CHIKV-E1에 의해 유도된 주요 에피토프는 226A-V 돌연변이를 가지고 있으며, 이는 제작물이 새로 출현된 돌연변이 바이러스에 대항하여 효과적으로 면역반응을 유도한다는 것을 제시하는 것이다. 이와 같은 발견으로 세포 선별과정에서 면역 반응은 바이러스의 진화를 추진시킬 수 있다는 것도 제시된다.
고찰
C57BL/6 마우스에서 유도된 면역 반응 평가에서, 제작물들은 상당한 면역원성이며, IFN-γ 반응 및 증식에서 T 세포 면역 반응을 유도한다는 것을 보여주었다. 본 연구에서 ELISpot 데이터로부터 IFN-γ 반응 정도는 수득된 스팟 수에 기초하여 광범위하였다. 비록 다른 알파 바이러스에서 외피 단백질 및 캡시드는 면역원성인 것으로 알려져있지만, 치쿤구니야 외피 및 캡시드 단백질의 면역원성에 대해서는 거의 아는게 없다. 상이한 부분의 외피 E1 및 캡시드로부터 매트릭스 펩타이드 풀(pool)에 의해 비장세포로부터 IFN-γ 생산 유도에서 E1 및 캡시드 단백질에서 각각 T 세포 우성 에피토프 HSMTNAVTI 및 ACLVGDKVM이 확인되었다. 백신접종된 마우스에서 전체 IgG 수준은 백신접종안된 대조군과 비교하였을 때, 증가되었으며, 이는 강력한 체액성 면역 반응이 유도되었음을 암시한다. 광범위한 치쿤구니야 바이러스 도전에 대항하여 보호를 유도하기 위한 이와 같은 백신들의 능력에 추가하여, 유도된 항체 반응 타입의 추가 분석을 위한 후속 연구가 현재 진행중이다.
이와 같은 연구는 이들 제작물들이 백신 후보물질로이 될 수 있는 지에 대해 제시한다. 그럼에도 불구하고, 이와 같은 연구는 용도에 효과적인 발현 뿐만 아니라 백신 제작물의 근육내 주사에 이어 마우스에 천기천공한 뒤 면역원성을 설명하는데 제한적이기 때문에 사람이 아닌 영장류 모델을 포함한 더 많은 모델에서 제작물의 면역원성의 면밀한 연구가 중요하다. 설명된 합성된 카세트 제작물은 치쿤구니야 바이러스의 면역생물학을 조사하는데 편리한 도구다.
실시예 2
임상적 인간 CHIKV 감염의 신속한 진단을 제공하고, 민감한 척추동물 숙주의 사전임상적 혈청감시에 이용하기 위하여, 중화 항체 역가를 측정하는 분석이 기획되었다.
CHIKV는 RT-PCR에 의해 확인되었다. RNA는 QIAamp 바이러스성 RNA 미니 키트를 이용하여 환자의 혈청으로부터 추출되었다. 원 스텝(one-step) RT-PCR 테스트는 Quiagen One step RT PCR 키트를 이용하여 실행되었다. 증폭 산물은 바이러스성 외피 단백질 E2를 코드하는 유전자내 305bp다. 세포가 관찰될 때, CHIKV는 거품성 세포변성 효과(foamy Cytopathic effect (CPE))를 일으키고, 이때 세포 주변은 감염후(pi) 24-48시간에 볼 수 있다.
미이크로중화 분석(microneutralization assay)은 다음과 같이 기획된다. 중화 테스트는 항원 및 항체 반응에 기초된다. 공지의 바이러스 역가를 저해하는 환자 혈청에서 CHIKV 바이러스에 대해 상동성 항체가 존재하는 것이 관찰된다. 혈청은 연속적으로 희석되고(일반적으로 1:10 내지 1:640), 혈청내 항체가 바이러스를 저해시키는데 충분한 시간 및 조건하에 CHIKV와 항온배양시켰다. 항온처리후, 혈청내 항체에 의해 바이러스가 중화되지 않는 경우, 세포가 바이러스 감염되는 조건하에 허용성 세포에 혼합물이 첨가되었다. 바이러스성 전파를 저해시키는 혈청의 최대 희석물을 항체 역가로 기록된다. 세포에서 바이러스 전파의 척도로 CPE (세포변성 효과)가 이용될 수 있다.
CHIKV 중화 테스트는 환자 시료를 이용하여 실시되었다. 도 7은 사전-면역주사를 맞은 그리고 DNA 면역주사를 맞은 마우스 혈청의 중화 항체 역가를 나타내는 그래프다. E1, E2, 캡시드, E1+E2, 또는 벡터 pVax를 인코딩하는 제작물로 마우스에 면역주사하였다. 혈청은 연속 희석하고(1:10 내지 1:640), 37℃에서 90분간 CHIKV (100TCID50)으로 항온처리되었다. 항온처리후, 96웰 편형한 바닥 플레이트내 Vero 세포(15,000 세포/웰)에 혼합물이 첨가되었고, 5% CO2 대기, 37℃에서 5일간 항온처리되었다. CPE(세포변성 효과)가 나타나지 않는 최대 역가를 중화 항체 역가로 기록하였다.
참조문헌
하기 참조문헌은 참고로 본 명세서에 통합된다.
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Karrupiah, Muthumani <120> CONSENSUS SEQUENCES OF CHIKUNGUNYA VIRAL PROTEINS, NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING THE SAME AND COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING THE SAME <130> 133172.3102 <140> PCT/US09/839656 <141> 2009-04-06 <150> 61/042661 <151> 2008-04-04 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHIKV E1 consensus <400> 1 atggactgga cctggatcct gtttctggtc gctgctgcca cccgggtgca cagctacgag 60 cacgtgaccg tgatccccaa caccgtgggc gtgccctaca agaccctggt gaacaggccc 120 ggctacagcc ccatggtgct ggaaatggaa ctgctgtccg tgaccctgga acccaccctg 180 agcctggact acatcacctg cgagtacaag acagtgatcc ccagccccta cgtgaagtgc 240 tgcggcaccg ccgagtgcaa ggacaagaac ctgcccgact acagctgcaa ggtgttcacc 300 ggcgtgtacc ccttcatgtg gggcggagcc tactgcttct gcgacgccga gaacacccag 360 ctgtccgagg cccacgtgga gaagagcgag agctgcaaga ccgagttcgc cagcgcctac 420 cgggcccaca cagccagcgc cagcgccaag ctgcgggtgc tgtaccaggg caacaacatc 480 accgtgaccg cctacgccaa cggcgaccac gccgtgacag tgaaggacgc 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Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly 485 490 495 Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala 500 505 510 Lys Ala Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp 515 520 525 Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val His Ser Tyr Glu His 530 535 540 Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys Thr Leu Val 545 550 555 560 Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu Leu Leu Ser 565 570 575 Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr 580 585 590 Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly Thr Ala Glu 595 600 605 Cys Lys Asp Lys Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val Phe Thr Gly 610 615 620 Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ala Glu 625 630 635 640 Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu Ser Cys Lys 645 650 655 Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser Ala Ser Ala 660 665 670 Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val Thr Ala Tyr 675 680 685 Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys Phe Ile Val 690 695 700 Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys Ile Val Val 705 710 715 720 Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe Gly Ala Gly 725 730 735 Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro Glu Ser Lys 740 745 750 Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro Ala Val Gly 755 760 765 Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe Lys Tyr Trp 770 775 780 Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro Phe Gly Cys 785 790 795 800 Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala Val Gly Asn 805 810 815 Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe Thr Arg Val Val 820 825 830 Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro Ala Cys Thr 835 840 845 His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr Ala Ala Ser 850 855 860 Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala Val Thr Ile 865 870 875 880 Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu Gln Ile Ser 885 890 895 Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln Val Cys Ser 900 905 910 Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile 915 920 925 Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln Asp Ile Ser 930 935 940 Ala Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly Val Gly Leu 945 950 955 960 Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu Cys Val Ser 965 970 975 Phe Ser Arg His 980 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 dominant epitope <400> 18 His Ser Met Thr Asn Ala Val Thr Ile 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2 dominant epitope <400> 19 Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACLVGDKVM <400> 20 Ala Cys Leu Val Gly Asp Lys Val Met 1 5

Claims (26)

  1. CHIKV E1 공통(consensus) 단백질, CHIKV E2 공통 단백질, 및 CHIKV E3 공통 단백질을 포함하는 공통 CHIKV Env를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
    상기 핵산 서열은 CHIKV Env 공통 단백질을 인코딩하며 SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:15의 핵산 서열을 포함하는 것인,
    DNA 플라스미드.
  2. 제1항의 DNA 플라스미드를 포함하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드가 CHIKV E1 공통 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가 포함하며, 여기서 상기 CHIKV E1 공통 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드가 CHIKV E2 공통 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가 포함하며, 여기서 상기 CHIKV E2 공통 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드가 CHIKV 캡시드 공통 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 추가 포함하며, 여기서 상기 CHIKV 캡시드 공통 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:6을 포함하는 것인 조성물.
  7. 삭제
  8. 제2항에 있어서, 상기 DNA 플라스미드가 IgE 선도(leader) 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제2항의 조성물을 포함하며, 개체에서 CHIKV에 대항하여 면역 반응을 유도하기 위한 주사용 약제학적 조성물.
  10. 제1항의 DNA 플라스미드를 포함하는, 개체에서 CHIKV에 대항하여 면역 반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 전기천공법을 사용하여 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
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