KR20220140025A - 인간 파밀로마 바이러스용 개선된 백신 및 이것을 사용하는 방법 - Google Patents

인간 파밀로마 바이러스용 개선된 백신 및 이것을 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

개선된 항-HPV 면역원 및 이것을 인코딩하는 핵산 분자가 개시되어 있다. 개시된 면역원은 공통 HPV6 E6E7, HPV11 E6E7, HPV16 E6E7, HPV18 E6E7, HPV31 E6E7, HPV33 E6E7, HPV39 E6E7, HPV45 E6E7, HPV52 E6E7, 및 HPV58 E6E7을 갖는 것들을 포함한다. 약제학적 조성물, DNA 플라스미드를 포함하는 재조합 백신 및 약독화 생백신이 개시되고, 또한 HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 개시된다.

Description

인간 파밀로마 바이러스용 개선된 백신 및 이것을 사용하는 방법{IMPROVED VACCINES FOR HUMAN PAPILLOMA VIRUS AND METHODS FOR USING THE SAME}
본 발명은 개선된 인간 파필로마 바이러스 (papillomavirus) (HPV) 백신, 면역반응을 유도하는 개선된 방법, 및 개체를 HPV에 대해서 예방적 및/또는 치료학적으로 면역화시키는 개선된 방법에 관한 것이다.
파필로마 바이러스는 7개의 조기 유전자 (early genes) 및 2개의 후기 유전자 (late genes)까지로 이루어진 작은 DNA 바이러스이다. 일반적으로, 파필로마 바이러스 조기 유전자는 E1-E7로 지정되며, 파필로마 바이러스 후기 유전자는 L1 및 L2로 지정된다. 몇 가지의 동물 종이 파필로마 바이러스 패밀리의 구성원에 의해서 감염될 수 있다.
인간 파필로마 바이러스 (HPV) 감염은 통상적이며, 성행위에 의해서 전파될 수 있다. HPV는 DNA 서열 상동성을 기초로 하여 56 개 또는 그 이상의 타입으로 구분된다. 상피 이형성증 및 그 밖의 다른 병변을 야기하는 HPV 타입 16 및 18은 종종 암, 특히 경부, 질, 외음부 및 도관 (canal)의 제자리 및 침습성 암의 증가한 위험과 연관된다. 세계적으로 88%에 가까운 자궁경부암들이 HPV 서브타입들 16, 18, 45, 31, 33, 52 및 58의 결과이다. 또한, 다양한 연구들은 재발성 호흡기 유두종증의 대부분의 발생들에서 HPV6 및 HPV11의 존재를 드러냈다. 비록 이들의 생식기 무사마귀들과의 연관이 알려져 있고 적은 비율의 자궁경부암 사례들에서만 발견되었지만, HPV6 및 HPV11은 낮은 기수의 자궁경부 병변들의 모든 사례들의 2.6-5.2%에서 확인되었다. 또한, HPV6 및 HPV11는 이제 2기 및 3기 자궁경부 상피내 전암병변 및 경증 자궁경부 이형상피증을 포함하는 자궁경부암의 전구체들로 이제 간주되는 낮은 기수의 편평 상피내 병변들의 약 20%와 연관되어 있다. 점점 많은 연구들에서 두 혈청형들과 생식기 무사마귀들, 재발성 호흡기 유두종증, 폐암종, 편도암종, 후두암종, 및 두부와 경부의 양성 신생물들 및 이형상피증의 다른 악성 전환들을 포함하는 다양한 형태들의 이비인후과 발병들의 연관이 드러나고 있다. 본 연구의 발견들은 HPV6 및 HPV11에 대한 공통 서열 DNA 백신들의 사용을 강조하고 미래의 전망을 밝힌다.
DNA 백신은 생약독화 바이러스 및 재조합 단백질-기본 백신과 같은 더 전통적인 백신접종 방법에 비해서 다수 개념적 이점을 갖는다. DNA 백신은 안전하고, 안정하며, 쉽게 생산되고, 인간에게서 잘 허용되는데, 전임상 실험은 플라스미드 통합의 증거를 거의 나타내지 않는다 [Martin, T., 등, Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., 등, Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. 또한, DNA 백신은 백신의 효능이 벡터에 대한 기존의 항체 역가에 의해서 영향을 받지 않는다는 사실로 인하여 반복 투여하는데 꽤 적합하다 [Chattergoon, M., J. Boyer, 및 D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines 및 immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. 그러나, DNA 백신의 임상적 적용에 관한 한가지 주된 장애는 더 큰 동물에게 이동시키는 경우에 플랫폼 면역원성 (platforms immunogenicity)에 있어서의 감소였다 [Liu, M.A. 및 J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. 코돈 최적화, RNA 최적화 및 면역글로불린 리더 (leader) 서열의 부가와 같은 DNA 백신 면역원의 조작에 있어서의 최근의 기술적 진보는 DNA 백신의 발현 및 면역원성을 개선시켰으며 [Andre, S., 등, Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., 등, Multiple effects of codon usage optimization on expression 및 immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., 등, Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., 등, Codon optimization 및 mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], 뿐만 아니라 전기천공과 같은 플라스미드 송달 시스템에서 있어서의 기술이 최근에 개발되었다 [Hirao, L.A., 등, Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery 및 potency in pigs 및 rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., 등, Effect of plasmid DNA vaccine design 및 in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., 등, In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, 및 infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]. 또한, 연구들은 공통 면역원의 사용이 천연 항원 단독에 비해서 세포성 면역반응의 폭을 증가시킬 수 있음을 시사하였다 [Yan., J., 등, Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., 등, Reconstruction 및 function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14].
HPV 감염, 특히 폐, 편도, 및 후두의 자궁경부암 및/또는 암종으로 되는 감염을 예방 및 치료하는 개선된 백신 및 방법에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 측면은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV39, HPV45, HPV52, 및 HPV58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 하나의 측면은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함하는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다: 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 핵산 서열 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열. 일부 구현예에서, HPV E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호:10을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 5' 말단에서의 선도 서열이 없다.
본 발명의 또 하나의 측면에서, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함하는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다: 서열번호:1; 서열번호:3; 서열번호:5; 서열번호:7; 서열번호:17; 서열번호:19; 서열번호:21; 서열번호:23; 서열번호:1에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:3에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:5에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:7에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:1의 단편; 서열번호:3의 단편; 서열번호:5의 단편; 서열번호:7의 단편; 서열번호:17의 단편; 서열번호:19의 단편; 서열번호:21의 단편; 서열번호:23의 단편; 서열번호:1에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:3에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:5에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:7에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열. 일부 구현예에서, HPV E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 서열번호:9를 갖는 5' 말단에서의 선도 서열이 없다.
제공된 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드일 수 있다.
추가의 측면에서, 개시된 뉴클레오타이드 서열을; 바람직하게는 다중 항원과 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, HPV의 1 초과의 하위유형에 대항하여 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하는 방법이 있고, 이 방법은 상기 개체에게, 제공된 뉴클레오타이드 서열 중 1 이상을 투여하는 것을 포함하고; 바람직하게는, 상기 조성물은 1 초과의 항원을 갖는다. 상기 방법은 바람직하게는, 전기천공에 의해, 제공된 뉴클레오타이드 서열을 개체에게 도입하는 단계를 포함한다.
도 1. E6 및 E7 정렬들의 인접 결합 평가에 근거한 계통수들(각각 A 및 B). 별표들은 각 트리에서 공통 서열들의 위치를 나타낸다.
도 2. p6E6E7 및 p11E6E7의 생체 내 발현. 유전자 산물들을 용해된 형질감염 293-T 세포들로부터 단리하고, SDS-PAGE 겔을 걸고, 방사선 사진촬영을 이용해서 검출하였다. HPV 6 및 HPV 11 E6/E7 단백질들은 모두 각각 약 32kDa이다(A). 인간 횡문근육종(RD) 세포들도 p6E6E7 및 p11E6E7로 형질감염시키고, 이후에 면역형광 염색 후 고정하였다. FITC 형광으로 p6E6E7 및 p11E6E7의 발현을 확인하였다(B). DAPI 형광으로 Hoescht 염색 결과 핵들의 편재를 확인하였다.
도 3. IFN-γ ELISpot 분석들은 C57BL/6 마우스들에서 p6E6E7(A) 및 p11E6E7(B)에 의한 강력한 세포 매개 반응들의 유도를 나타낸다. 분석들은 3회의 2주 1회 면역접종들 후 각각의 해당 군의 마우스들(1군 당 5마리 마우스들)에서 단리된 비장세포들로 수행하였다. 각각의 면역접종은 구축물 당 20㎍으로 구성되었다. 콤보군의 마우스들은 구축물 당 20㎍의 p6E6E7 및 p11E6E7을 둘 다, 면역접종 당 총 40㎍의 DNA를 수여받았다. DNA는 IM 주사 후 전기천공으로 투여하였다(*은 p < 0.0001 을 나타내며; †는 p = 0.0001 을 나타낸다).
도 4. 우성 에피토프들을 분석하기 위해 개별 펩티드들을 이용해서 추가적인 IFN-γ ELISpot 분석들을 수행하였다. 백신접종한 마우스들 및 음성 대조군에서 단리한 비장세포들을 전체 HPV 6 E6/E7 융합 단백질(A) 또는 HPV 11 E6/E7 융합 단백질(B)에 걸친 겹치는 펩티드들로 자극하였다.
도 5. 세포내 시토카인 염색으로 분석되는 항원-특이적 T-세포들에 의한 시토카인 생산. p6E6E7(A) 및 p11E6E7(B)로 백신접종한 마우스들에서 단리한 비장세포들을 표면 마커 및 세포내 염색 전에 4시간 동안 R10 성장 배지, PMA, 또는 공통 유전자 펩티드들로 자극하였다. 상기의 점 그래프들은 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α를 생산하는 총 CD4+ 또는 CD8+ 세포들의 배경 차감 백분율들에서의 차이들을 나타낸다. 음성 대조군의 평균이 0이었으므로, 별표들을 갖는 그래프들에 대한 P-값들은 결정할 수 없었다.
도 6. IgE 선도 서열 (IgEL), 내단백분해 절단 부위, 및 부위들을 보여주기 위해 주석을 단 HPV31 E6/E7 (서열번호:18)에 대한 아미노산 서열을 나타내고 상기 E6 및 E7 도메인은 발현 및 면역원성을 향상시키도록 돌연변이되었다.
도 7. IgE 선도 서열 (IgEL), 내단백분해 절단 부위, 및 부위들을 보여주기 위해 주석을 단 HPV52 E6/E7 (서열번호:20)에 대한 아미노산 서열을 나타내고 상기 E6 및 E7 도메인은 발현 및 면역원성을 향상시키도록 돌연변이되었다.
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 기술하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 상기 문맥이 달리 명확히 언급하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에서 수치 범위의 설명을 위해, 동일한 정밀도로 이들 사이에 있는 각각의 수들이 명백하게 고려된다. 예를 들면, 6-9의 범위의 경우, 6과 9 외에도 수 7 및 8이 고려되며, 범위 6.0-7.0의 경우, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, 및 7.0이 명백하게 고려된다.
a. 아쥬반트
본원에서 사용된 바와 같이 "아쥬반트"는, 이하 기술된 DNA 플라스미드 및 인코딩 핵산 서열에 의해 인코딩된 하나 이상의 항원의 항원성을 향상시키기 위해 본원에 기재된 DNA 플라스미드 백신에 부가된 임의의 분자를 의미할 수 있다.
b. 항체
"항체"는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체, 또는 단편, Fab, F(ab')2, Fd를 포함하는 이의 단편 또는 유도체, 및 단일 사슬 항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 이작용성 항체 및 그것의 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 포유동물의 혈청 샘플로부터 분리된 항체, 폴리클로날 항체, 친화성 정제된 항체, 또는 원하는 에피토프 또는 이들로부터 유래된 서열에 대해 충분한 결합 특이성을 나타내는 이들의 혼합물일 수 있다.
c. 항원
"항원"은 HPV E6 또는 HPV E7 도메인, 및 바람직하게는 이들 사이에 엔도단백분해 절단 부위를 갖는 E6 및 E7 융합을 갖는 단백질을 지칭한다. 항원은 서열번호: 2 (하위유형 6), 4 (하위유형 11), 6 (하위유형 33), 8 (하위유형 58), 18 (하위유형 31), 20 (하위유형 52), 22 (하위유형 16), 및 24 (하위유형 18); 본원에 제시된 길이의 이의 단편, 변이체, 즉 본원에 제시된 바와 같은 서열번호:2, 4, 6, 8, 18, 20, 22, 및 24에 상동인 서열을 갖는 단백질, 본원에 제시된 길이를 갖는 변이체의 단편, 및 이들의 조합을 포함한다. 항원은 서열번호: 10의 IgE 선도 서열을 가질 수 있거나 또는 대안적으로 N-말단으로부터 제거된 상기 서열을 가질 수 있다. 항원은 다른 단백질 유래의 것과 같은 신호 펩타이드를 임의로 포함할 수 있다.
d. 코딩 서열
본원에서 사용된 바와 같이 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은 섹션 c에서 제시된 바와 같은 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 지칭하는 것을 의미할 수 있다. 상기 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체나 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소들에게 작동가능하게 연결된 개시 및 종료 신호를 더 포함할 수 있다. 상기 코딩 서열은 신호 펩타이드, 예를 들면, 서열번호: 9와 같은 IgE 선도 서열을 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다.
e. 보체
핵산을 의미하기 위해 본원에서 사용된 바와 같이 "보체" 또는 "상보적"은, 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이에서 왓슨-크릭 (예를 들면, A-T/U 및 C-G) 또는 휴그스틴 염기 짝짓기를 의미할 수 있다.
f. 단편
"단편"은 항원에 대하여 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 항원의 단편은, 각 경우에 신호 펩타이드 및/또는 위치 1의 메티오닌을 갖거나 또는 이들 없이, N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산이 누락된 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 임의의 이종의 신호 펩타이드가 부가된 것을 제외하고, 특정한 전장 항원의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있다. 단편은, 바람직하게는, 항원에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동인 폴리펩타이드의 단편을 포함하고, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 항원의 단편에 연결될 수 있다.
항원을 인코딩하는 핵산 서열의 단편은, 각 경우에 신호 펩타이드 및/또는 위치 1의 메티오닌을 인코딩하는 서열을 갖거나 또는 이들 없이, 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 누락된 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 특정한 전장 코딩 서열의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 퍼센트를 포함할 수 있다. 단편은, 바람직하게는, 항원에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함하고, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 부가적으로 임의로 포함한다. 단편은 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드와 같은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 코딩 서열의 단편에 연결될 수 있다.
g. 동일한
2 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 본원에서 사용된 바와 같이 "동일한" 또는 "동일성"은, 상기 서열들이 명시된 영역에 대해 명시된 백분율의 동일한 잔기들을 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 상기 백분율은 상기 두 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 대해 상기 두 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 생성하고, 명시된 영역에서 일치된 위치의 수를 위치의 총 수로 나누고, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 생성함으로써 계산될 수 있다. 상기 두 서열이 상이한 길이이거나 상기 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생산하고 명시된 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 말단들이 상기 계산의 분모에 포함되고 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수작업으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
h. 면역 반응
본원에서 사용된 바와 같이 "면역 반응"은, 상기 제공된 DNA 플라스미드 백신을 통한 하나 이상의 항원의 도입에 대해 반응한, 숙주의 면역계, 예를 들면, 포유동물의 면역계의 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.
i. 핵산
본원에서 사용된 바와 같이 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는, 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 규정한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체는 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 또는 이중가닥 및 단일가닥 서열 모두의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA, RNA, 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
j. 작동가능하게 연결된
본원에서 사용된 바와 같이 "작동가능하게 연결된"은, 유전자의 발현이 그것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어하에 있는 것을 의미할 수 있다. 프로모터는 그의 제어하에 있는 유전자의 5' (업스트림) 또는 3' (다운스트림)에 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 간의 거리는 프로모터 및 상기 프로모터가 유래된 유전자에서 상기 프로모터가 제어하는 유전자 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 이 거리에서의 변화가 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다. .
k. 프로모터
본원에서 사용된 바와 같이 "프로모터"는, 세포에서 핵산의 발현을 제공하거나, 활성화하거나 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래의 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 더 향상시키고/거나 공간 발현 및/또는 일시적 발현을 변화시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 억제인자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기와 관련하여, 또는 발현이 일어나는 발달 단계와 관련하여, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제와 같은 외부 자극에 대해 반응하여 유전자 성분의 발현을 항시적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
l. 엄격한 혼성화 조건
본원에서 사용된 바와 같이 "엄격한 혼성화 조건"은, 핵산의 복합 혼합물 내에서와 같이, 제 1 핵산 서열 (예를 들면, 프로브)이 제 2 핵산 서열 (예를 들면, 표적)에 혼성화할 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점 (Tm)보다 약 5-10℃ 낮도록 선택될 수 있다. 상기 Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도(규정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에)일 수 있다(표적 서열은 Tm에서 과량으로 존재하므로, 프로브의 50%가 평형 상태에서 점유됨). 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0 M 나트륨 이온 미만, 예컨대 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브 (예를 들면, 약 10-50 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브 (예를 들면, 약 50개 초과의 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 60℃인 조건일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호가 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 배양, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 배양, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS에서 세척.
m. 실질적으로 상보적
본원에서 사용된 바와 같이 "실질적으로 상보적"은, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해 제1 서열이 제 2 서열의 보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것, 또는 상기 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다는 것을 의미할 수 있다.
n. 실질적으로 동일한
본원에서 사용된 바와 같이 "실질적으로 동일한"은, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해, 또는 만약 제 1 서열이 제 2 서열의 보체에 실질적으로 상보적이면, 핵산에 대해 제 1 및 제 2 서열이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
o. 변이체
핵산과 관련하여 본원에 사용된 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 보체 또는 이의 일부; (iii) 참조된 핵산에 실질적으로 동일한 핵산 또는 이의 보체; 또는 (iv) 참조된 핵산에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산, 이의 보체, 또는 이에 실질적으로 동일한 서열을 의미할 수 있다.
"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산은 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 변이체는 또한 적어도 하나 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성 (예를 들면, 전하를 띠는 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 전형적으로 사소한 변화를 수반하는 것으로서 본 기술분야에서 인식된다. 이들 사소한 변화는 본 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려함으로써, 부분적으로 확인될 수 있다(Kyte 등, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)). 아미노산의 소수성 지수는 그의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 소수성 지수의 아미노산들이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있음이 본 기술분야에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 소수성 지수를 갖는 아미노산들이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 야기할 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩타이드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 상기 펩타이드의 최대 국소 평균 친수성의 계산을 가능하게 하며, 이는 항원성 및 면역원성과 상관관계가 있는 것으로 보고된 유용한 수단이다 (본원에 참고로 전체가 편입된 미국 특허 제4,554,101호). 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 본 기술분야에서 이해되는 바와 같이 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성을 보유하는 펩타이드를 야기할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산을 이용하여 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값은 모두 상기 아미노산의 특정한 측쇄에 의해 영향을 받는다. 상기 관찰과 일치하게도, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은, 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이, 아미노산의 상대적 유사성, 및 특히 상기 아미노산의 측쇄에 좌우되는 것으로 이해된다.
p. 벡터
본원에서 사용된 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.
면역원에 의해서 유도된 세포성 면역반응을 증진시키는 다중-상 전략 (multi-phase strategy)으로부터 발생하는 개선된 백신이 기술되어 있다. 변형된 공통 서열이 생성되었다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 고효율 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함하는 유전자 변형이 또한 기술된다. 신규 구조물은 상응하는 코돈 최적화 면역원보다 더 강하고 더 광범한 세포성 면역반응을 야기하도록 고안되었다.
개선된 HPV 백신은 그에 대한 항-HPV가 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 만드는 에피토프를 갖는 단백질을 코드화한 유전자 구조물 및 단백질을 기초로 한다. 따라서, 백신은 치료학적 또는 예방적 면역반응을 유도할 수 있다. 일부의 구체예에서, 면역원을 송달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 일부의 구체예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 DNA 백신, 하나 또는 그 이상의 재조합 백신, 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 조성물, 하나 또는 그 이상의 약독화 백신 및 하나 또는 그 이상의 사멸 백신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합물을 포함한다.
일부의 구체예에 따르면, 백신을 개체에게 송달하여 개체의 면역 시스템의 활성을 변조시키고, 이에 의해서 HPV에 대한 면역반응을 증진시킨다. 단백질을 코드화한 핵산 분자가 개체의 세포에 의해서 흡수되면, 뉴클레오타이드 서열이 세포 내에서 발현되며, 이에 의해서 단백질이 개체에게 송달된다. 재조합 백신의 일부분으로서, 및 약독화 백신의 일부분으로서, 벡터의 분리된 단백질 또는 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상에 단백질의 코드화 서열을 송달하는 방법이 제공된다.
HPV에 대해서 개체를 예방적으로 및/또는 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.
면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 송달하는 조성물은 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 조성물은 면역원을 코드화한 플라스미드, 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백신, 본 발명의 단백질을 코드화하고/하거나 본 발명의 단백질을 포함하는 생약독화 병원체; 본 발명의 단백질을 포함하는 사멸 병원체; 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 리포좀 또는 서브유니트 백신과 같은 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 조성물을 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 측면은 하기: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV39, HPV45, HPV52, 및 HPV58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서 본 조성물은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52, 및 HPV58을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 본 조성물은 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52, 및 HPV58을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 본 조성물은 HPV6, HPV11, HPV16, 및 HPV18을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 본 조성물은 HPV16, HPV31, 및 HPV52을 포함할 수 있다.
또 하나의 측면은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함하는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다: 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 핵산 서열 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:26을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 핵산 서열 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 핵산 서열 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
본 발명의 또 하나의 측면에서, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함하는 1 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다: 서열번호:1; 서열번호:3; 서열번호:5; 서열번호:7; 서열번호:17; 서열번호:19; 서열번호:21; 서열번호:23; 서열번호:1에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:3에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:5에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:7에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:1의 단편; 서열번호:3의 단편; 서열번호:5의 단편; 서열번호:7의 단편; 서열번호:17의 단편; 서열번호:19의 단편; 서열번호:21의 단편; 서열번호:23의 단편; 서열번호:1에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:3에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:5에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:7에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:5; 서열번호:7; 서열번호:17; 서열번호:19; 서열번호:21; 서열번호:23; 서열번호:5에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:7에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:5의 단편; 서열번호:7의 단편; 서열번호:17의 단편; 서열번호:19의 단편; 서열번호:21의 단편; 서열번호:23의 단편; 서열번호:5에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:7에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:1; 서열번호:3; 서열번호:21; 서열번호:23; 서열번호:1에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:3에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:1의 단편; 서열번호:3의 단편; 서열번호:21의 단편; 서열번호:23의 단편; 서열번호:1에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:3에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:23에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV E6-E7 융합 항원을 포함한다: 서열번호:17; 서열번호:19; 서열번호:21; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:17의 단편; 서열번호:19의 단편; 서열번호:21의 단편; 서열번호:17에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 서열번호:19에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열; 및 서열번호:21에 대해 적어도 95% 상동인 핵산 서열.
일부 구현예에서 본원에서 기재된 뉴클레오타이드 서열은 선도 서열이 없다. HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV39, HPV45, HPV52, 및 HPV58을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 선도 서열이 없다. 특히, 서열번호:2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:20을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:22를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:24를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호:25를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HPV E6-E7 융합 항원은 5' 말단에서 선도 서열이 없고, 그 예는 서열번호10을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 특히, 뉴클레오타이드 서열 서열번호:1; 서열번호:3; 서열번호:5; 서열번호:7; 서열번호:17; 서열번호:19; 서열번호:21; 서열번호:23을 포함하는 HPV E6-E7 융합 항원은 5' 말단에서 선도 서열이 없고, 그 예는 뉴클레오타이드 서열 서열번호9이다.
일부 구현예에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 제공된 뉴클레오타이드 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동일 수 있고; 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%; 또는 98% 또는 99%이다.
제공된 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드, 바이러스 벡터, 지질 벡터, 나노입자; 바람직하게는 플라스미드를 포함하는 다양한 공지된 벡터 또는 전달 시스템 중 하나에 포함될 수 있다.
추가의 측면에서, 개시된 뉴클레오타이드 서열을; 바람직하게는 다중 항원과 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, HPV의 1 초과의 하위유형에 대항하여 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하는 방법이 있고, 이 방법은 상기 개체에게, 제공된 뉴클레오타이드 서열 중 1 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고; 바람직하게는, 상기 조성물은 1 초과의 항원을 갖는다. 본 방법은 바람직하게는, 제공된 뉴클레오타이드 서열을 개체에게 전기천공에 의해 도입하는 단계를 포함한다.
서열번호:1은 HPV 6 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:1은 서열번호:1의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:2는 HPV 6 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:2는 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:2, 또는 서열번호:2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:2의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:2의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:2의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:2에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:2의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:1의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:1의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:2에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편은 786 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 830 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 856 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 865 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:2의 단편은 252 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 266 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 275 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 278 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:3은 HPV 11 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:3은 서열번호:3의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:4은 HPV 11 E6 및 E7 단백질 의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:4은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:4, 또는 서열번호:4를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:4의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:4의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:4의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:4에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:4의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:3의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:3의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:4에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편은 786 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 830 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 856 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 865 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:4의 단편은 252 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 266 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 275 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 278 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:5는 HPV 33 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:5는 서열번호:5의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:6은 HPV 33 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:6은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:6, 또는 서열번호:6을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:6의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:6의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:6의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:6에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:6의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:5의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:5의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:6에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편은 746 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 787 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 812 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 820 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:6의 단편은 235 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 248 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 256 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 259 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다. 서열번호:7은 HPV 58 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:7은 서열번호:7의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:8은 HPV 58 E6 및 E7 단백질 의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:8은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:8, 또는 서열번호:8을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:8의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:8의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:8의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:8에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:8의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:7의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:7의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:8에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:7의 단편은 752 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 794 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 819 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 827 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:7의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:7의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:8의 단편은 235 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 249 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 257 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 260 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:17은 HPV 31 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:17은 서열번호:17의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:18은 HPV 31 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:18은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:18, 또는 서열번호:18를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:18의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:18의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:18의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:18에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:18의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:17의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:17의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:18에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:17의 단편은 713 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 752 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 776 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 784 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:17의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:17의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:18의 단편은 236 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 249 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 257 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 259 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:19은 HPV 52 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:19은 서열번호:19의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:20은 HPV 52 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:20은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:20, 또는 서열번호:20를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:20의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:20의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:20의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:20에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:20의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:19의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:19의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:20에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:19의 단편은 713 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 752 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 776 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 784 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:19의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:19의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:20의 단편은 236 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 249 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 257 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 259 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:21은 HPV16 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:21은 서열번호:21의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:22은 HPV16 E6 및 E7 단백의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다 질. 서열번호:22은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:22, 또는 서열번호:22를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:22의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:22의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:22의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:22에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:22의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:21의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:21의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:22에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:21의 단편은 736 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 777 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 802 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 810 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:21의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:21의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:22의 단편은 238 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 251 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 259 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 261 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:23은 HPV18 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:23은 서열번호:23의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:24은 HPV18 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:24은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:24, 또는 서열번호:24를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
서열번호:24의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 사용하거나 사용하지 않고 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하지 않고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호:24의 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 서열번호:24의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은, 바람직하게는, 서열번호:24에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 서열번호:24의 단편을 포함하고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.
핵산 서열 서열번호:23의 단편은, 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 사용하거나 사용하지 않고 5' 및/또는 3' 말단으로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락시키는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은, 부가된 임의의 이종의 신호 펩타이드를 제외하고 전장 코딩 서열 서열번호:23의 길이의 60% 또는 그 초과, 65% 또는 그 초과, 70% 또는 그 초과, 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 91% 또는 그 초과, 92% 또는 그 초과, 93% 또는 그 초과, 94% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 퍼센트를 포함할 수 있다. 상기 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호:24에 대해 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과 또는 99% 또는 그 초과 상동인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N 말단 메티오닌 또는 이종의 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 추가로 임의로 포함한다. 단편은 N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들면 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호:23의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 705 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 744 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 767 또는 그 초과의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 775 또는 그 초과의 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 서열번호:23의 단편 예컨대 본원에서 제시된 것들은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:23의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:24의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 234 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 247 또는 그 초과의 아미노산; 일부 구현예에서, 255 또는 그 초과의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 257 또는 그 초과의 아미노산.
서열번호:25는 HPV45 E6 및 E7 단백질 의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:25는 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
서열번호:26은 HPV39 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:26은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 조성물이 있다: 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 서열번호:8; 서열번호:18; 서열번호:20; 서열번호:22; 서열번호:24; 서열번호:25; 또는 서열번호:26; 또는 적어도 95% 상동성을 갖는 그것의 단편; 또는 이들의 조합. 일부 구현예에서, 본 조성물은 서열번호:2; 서열번호:4; 서열번호:6, 서열번호:8; 서열번호:18; 서열번호:20; 서열번호:22; 및 서열번호:24 를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 서열번호:6, 서열번호:8; 서열번호:18; 서열번호:20; 서열번호:22; 및 서열번호:24 를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 서열번호:2; 서열번호:4; 서열번호:22; 및 서열번호:24. 일부 구현예에서, 본 조성물은 서열번호:18; 서열번호:20; 및 서열번호:22를 포함한다.
아미노산 서열은 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 95% 상동성을 갖는 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 98% 상동성을 갖는 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 아미노산 서열 중 임의의 하나와 적어도 99% 상동성을 갖는 단편일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 면역원에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법은 개체에게 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 투여하는 것을 포함한다: HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 16 E6 및 E7, HPV 18 E6 및 E7, HPV 31 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 52 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, HPV 45 E6 및 E7, 및 HPV 39 E6 및 E7, 그것의 작용성 단편, 및 그것의 발현성 코딩 서열. 바람직하게는, 면역원은 공통 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52, 및 HPV58이다. 바람직하게는, 면역원은 공통 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52, 및 HPV58이다. 바람직하게는, 면역원은 공통 HPV6, HPV11, HPV16, 및 HPV18이다. 바람직하게는, 면역원은 공통 HPV16, HPV31, 및 HPV52이다.
일부 구현예는 단리된 핵산 분자를 포함하고, 이 분자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 인코딩한다: HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 16 E6 및 E7, HPV 18 E6 및 E7, HPV 31 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 52 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, HPV 45 E6 및 E7, 및 HPV 39 E6 및 E7, 및 그것의 단편. 일부 구현예는 재조합 백신을 포함하고, 이 백신은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 인코딩한다: HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 16 E6 및 E7, HPV 18 E6 및 E7, HPV 31 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 52 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, HPV 45 E6 및 E7, 및 HPV 39 E6 및 E7, 및 그것의 단편. 일부 구현예는 서브유닛 백신을 포함하고, 이 백신은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다: HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 16 E6 및 E7, HPV 18 E6 및 E7, HPV 31 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 52 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, HPV 45 E6 및 E7, 및 HPV 39 E6 및 E7, 및 그것의 단편. 일부 구현예은 약독화 생백신 및/또는 사멸 백신을 포함하고, 이 백신은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다: HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 16 E6 및 E7, HPV 18 E6 및 E7, HPV 31 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 52 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, HPV 45 E6 및 E7, 및 HPV 39 E6 및 E7.
HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 있고, 이 방법은 상기 개체에게 본원에서 제공된 핵산 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 또한, 핵산 서열을 개체에게 전기천공에 의해 도입하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 있고, 이 방법은 상기 개체에게 본원에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 또한, 아미노산 서열을 개체에게 전기천구에 의해 도입하는 것을 포함한다.
일 측면에서, 본원의 백신은 두경부암의 형태, 및 이비인후과 질환의 다른 형태와 연관되는 것으로 주로 발견된 HPV 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는 것이고, 특히 백신은 HPV 6 E6 및 E7 및 HPV 11 E6 및 E7, 및 바람직하게는 둘 모두를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 본원의 백신은 미국의 환자 및 더 상세하게는 아시아의 환자의 자궁경부암의 형태와 연관되는 것으로 주로 발견된 HPV 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는 것이고, 특히 백신은 HPV 33 E6 및 E7 및 HPV 58 E6 및 E7, 및 바람직하게는 둘 모두를 포함한다.
전암성 병변을 포함하여 자궁경부암과 연관되는 것으로 발견된, 하기를 포함하는 HPV 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는데 유용한 바람직한 조합이 있다: HPV 하위유형 16, 18, 31, 33, 52, 58, 6, 11, 39, 및 45 또는 HPV 하위유형 16, 18, 31, 33, 52, 58, 6, 및 11. 이러한 자궁경부암에 대한 다른 하위조합은 하기를 포함한다:
16 및 18; 16, 18, 및 6; 16, 18, 및 11; 16, 18, 및 31; 16, 18, 및 33; 16, 18, 및 52; 16, 18, 및 58; 16, 18, 6, 및 11; 16, 18, 6, 및 31; 16, 18, 6, 및 33; 16, 18, 6, 및 52, 16, 18, 6, 및 58; 16, 18, 11 및 31; 16, 18, 11 및 33, 16, 18, 11 및 52; 16, 18, 11 및 58; 16, 18, 31 및 33; 16, 18, 31 및 52; 16, 18, 31 및 58; 16, 18, 33 및 52; 16, 18, 33 및 58; 16, 18, 52 및 58;
6, 11, 및 16; 6, 11, 및 18; 6, 11, 및 31; 6, 11, 및 33; 6, 11, 및 52; 6, 11, 및 58; 6, 11, 16, 및 31; 6, 11, 16, 및 33; 6, 11, 16, 및 52; 6, 11, 16, 및 58; 6, 11, 18, 및 31; 6, 11, 18, 및 33; 6, 11, 18, 및 52; 6, 11, 18, 및 58; 6, 11, 31, 및 33; 6, 11, 31, 및 52; 6, 11, 31, 및 58; 6, 11, 33, 및 52; 6, 11, 33, 및 58; 6, 11, 52, 및 58;
6, 16, 및 31; 6, 16, 및 33; 6, 16, 및 52; 6, 16, 및 58; 6, 16, 31 및 33; 6, 16, 31 및 52; 6, 16, 31 및 58; 6, 16, 33 및 52; 6, 16, 33 및 58; 6, 16, 52 및 58;
6, 18 및 31; 6, 18 및 33; 6, 18 및 52; 6, 18 및 58; 6, 18, 31 및 33; 6, 18, 31 및 52; 6, 18, 31 및 58; 6, 18, 33 및 52; 6, 18, 33 및 58;
6, 31 및 33; 6, 31 및 52; 6, 31 및 58; 6, 31, 33 및 52; 6, 31, 33 및 58;
6, 33, 및 52; 6, 33, 및 58; 6, 33, 52 및 58;
6, 52 및 58;
11, 31 및 33; 11, 31 및 52; 11, 31 및 58; 11, 31, 33 및 52; 11, 31, 33 및 58; 11, 31, 52 및 58;
11, 31 및 52; 11, 31 및 58; 11, 31, 52 및 58;
11, 52, 및 58;
16, 31 및 33; 16, 31, 및 52; 16, 31, 및 58; 16, 31, 33, 및 52; 16, 31, 52, 및 58;
16, 33, 및 52; 16, 33, 및 58; 16, 33, 52 및 58;
18, 31, 및 33; 18, 31, 및 52; 18, 31, 및 58; 18, 31, 33 및 52; 18, 31, 33 및 58;
31, 33 및 52; 31, 33 및 58; 31, 33, 52 및 58; 및
31, 52, 및 58.
개선된 백신은 그에 대한 항-HPV 면역반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 만드는 에피토프를 갖는 단백질을 코드화한 유전자 구조물 및 단백질을 포함한다. 따라서, 백신은 치료학적 또는 예방적 면역반응을 유도하도록 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 면역원을 송달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 일부의 구체예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 DNA 백신, 하나 또는 그 이상의 재조합 백신, 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 조성물, 하나 또는 그 이상의 약독화 백신 및 하나 또는 그 이상의 사멸 백신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합물을 포함한다.
본 발명의 관점은 재조합 백신의 일부분으로서, 및 약독화 백신의 일부분으로서, 벡터의 분리된 단백질 또는 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상에 단백질의 코드화 서열을 송달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부의 관점에 따르면, 개체를 예방적으로 및/또는 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.
DNA 백신은 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 5,676,594호, 및 여기에 인용된 선행 출원에 기술되어 있다. 이들 출원에 기술된 송달 프로토콜 이외에도, DNA를 송달하는 대체 방법은 모두 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제4,945,050 및 5,036,006호에 기술되어 있다.
본 발명은 개선된 생약독화 백신, 개선된 사멸 백신, 및 항원을 코드화한 외래 유전자를 송달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 개선된 백신뿐만 아니라 서브유니트 및 당단백 백신에 관한 것이다. 생약독화 백신, 외래 유전자를 송달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 것, 서브유니트 백신 및 당단백 백신의 예는 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529호에 기술되어 있다.
세포에 의해서 흡수되면, 유전자 구조물(들)은 세포 내에 기능적 염색체외 분자로 존재할 수 있고/있거나 세포 내의 염색체 DNA 내에 통합될 수 있다. DNA는 세포 내에 도입될 수 있으며, 여기에서 이것은 플라스미드 또는 플라스미드들의 형태의 별개의 유전자 물질로서 존재한다. 대신으로, 염색체 내로 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포 내로 도입될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입시키는 경우에는, 염색체 내로의 DNA 통합을 촉진시키는 시약이 첨가될 수 있다. 통합을 촉진시키는데 유용한 DNA 서열이 또한 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 대신으로, RNA가 세포에 투여될 수 있다. 또한, 동원체 (centromere), 말단소체 (telomeres) 및 복제 기점을 포함하는 선형 미니염색체로서 유전자 구조물을 제공하는 것도 고려된다. 유전자 구조물은 세포 내에서 생존하는 약독화된 생미생물 또는 재조합 미생물 벡터 내에 유전자 물질의 일부분으로서 잔류할 수 있다. 유전자 구조물은 유전자 물질이 세포의 염색체에 통합하거나 염색체외에 잔류하는 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부분일 수 있다. 유전자 구조물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기의 요소에는 다음이 포함된다: 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날. 또한, 인핸서 (enhancers)는 종종, 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코드화한 서열의 유전자 발현을 위해서 필요하다. 이들 요소는 원하는 단백질을 코드화한 서열에 작동가능하게 연결되며, 조절 요소는 이들이 투여되는 개체에게서 작동가능한 것이 필요하다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로, 원하는 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열의 일부분인 것으로 간주된다. 그러나, 이들 요소는 유전자 구조물이 투여되는 개체에게서 기능성인 것이 필요하다. 개시 및 정지 코돈은 코드화 서열과 함께 골격 내에 존재하여야 한다.
사용된 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 반드시 기능성이어야 한다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에 유용한 프로모터의 예로는 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40), 마우스 유선종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, BIV 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍 바이러스 (MV), 몰로니 (Moloney) 바이러스, ALV, CMV 즉시 초기 프로모터 (immediate early promoter)와 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV), 로우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus; RSV)로부터의 프로모터뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날로 불리는, pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, San Diego CA) 내에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 사용된다.
DNA 발현에 필요한 조절 요소 이외에도, 다른 요소가 또한 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 이러한 추가의 요소는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 CMV, RSV 및 EBV로부터 유래하는 것과 같은 바이러스 인핸서를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 그룹으로부터 선택될 수 있다.
유전자 구조물에는 구조물을 염색체외적으로 유지시키고, 세포 내에서 구조물의 다수의 카피를 생산시키기 위해서 복제의 포유동물 기점이 제공될 수 있다. Invitrogen (San Diego, CA)으로부터의 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4는 복제의 엡스타인 바르 바이러스 기점 및 통합이 없이 높은 카피의 에피좀성 복제를 제공하는 핵 항원 EBNA-1 코드화 부분을 함유한다.
면역화 적용과 관련된 일부의 바람직한 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 추가로, 이러한 표적 단백질에 대한 면역반응을 더 증진시키는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)이 유도된다. 이러한 유전자의 예는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86, 및 결실된 시그날 서열을 갖는 IL-15를 포함하며, 임의로 IgE로부터의 시그날 펩타이드를 포함하는 IL-15와 같은 다른 사이토킨 및 림포킨을 코드화한 것이다. 유용할 수 있는 다른 유전자에는 다음을 코드화한 것이 포함된다: MCP-1, MIP-lα, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관성장인자, IL-7, 신경성장인자, 혈관내피성장인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능적 단편.
어떤 이유로든 유전자 구조물을 수용하는 세포를 제거하는 것이 바람직하다면, 세포 파괴에 대한 표적으로 작용하는 추가의 요소가 첨가될 수 있다. 발현가능한 형태의 헤르페스 티미딘 키나제 (tk) 유전자가 유전자 구조물 내에 포함될 수 있다. 약물 간사이클로비르가 개체에 투여될 수 있으며, 이 약물은 tk를 생산하는 모든 세포의 선택적 사멸을 야기할 수 있으며, 따라서 유전자 구조물에 의한 세포의 선택적 파괴를 위한 수단을 제공할 수 있다.
단백질 생산을 최대화시키기 위해서, 구조물이 투여되는 세포 내에서의 유전자 발현에 매우 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 더구나, 세포 내에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가는 세포 내에서 기능성인 DNA 구조물을 생산할 수 있다.
일부의 구체예에서는, 본 발명에 기술된 단백질에 대한 코드화 서열이 IgE 시그날 펩타이드에 연결된 유전자 구조물이 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 본 발명에 기술된 단백질은 IgE 시그날 펩타이드에 연결된다.
단백질이 사용되는 일부의 구체예에서, 예를 들어, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여 본 발명의 단백질을 생산하고 분리시킬 수 있다. 단백질이 사용되는 일부의 구체예에서, 예를 들어, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여. 잘 알려진 발현 시스템에서 사용하기 위한 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터 내로 본 발명의 단백질을 코드화한 DNA 분자를 삽입할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)이 이. 콜라이 내에서 단백질의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)는 예를 들어, 효모의 사카로마이세스 세레비지아에 (S. cerevisiae) 스트레인 내에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 MAXBAC™ 완전 바큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, Calif.)은 예를 들어, 곤충 세포에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)은 예를 들어, 차이니즈 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포와 같은 포유동물 세포에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 이들 상업적 발현 벡터 및 시스템 또는 그 밖의 것을 사용하여 일상적인 기술 및 쉽게 이용할 수 있는 출발물질에 의해서 단백질을 생산할 수 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989); 이것은 본 발명에 참고로 포함된다]. 따라서, 바람직한 단백질은 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에서 제조될 수 있어서 광범한 스펙트럼의 단백질의 가공된 형태를 제공할 수 있다.
본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 그 밖의 다른 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터 및 시스템을 사용할 수 있거나, 잘 알려진 방법 및 쉽게 이용할 수 있는 출발물질을 사용하여 벡터를 생산할 수 있다. 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날, 및 바람직하게는 인핸서와 같은 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 시스템은 다양한 숙주에 관해서 본 기술분야에서 쉽게 이용할 수 있으며, 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]. 유전자 구조물은 구조물이 형질감염되는 세포주 내에서 기능성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질 코드화 서열을 포함한다. 구성적 프로모터의 예로는 사이토메갈로바이러스 또는 SV40로부터의 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 예로는 마우스 유방 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 쉽게 이용할 수 있는 출발물질로부터 본 발명의 단백질을 코드화한 DNA로 세포를 형질감염시키는데 유용한 유전자 구조물을 쉽게 생산할 수 있다. 단백질을 코드화한 DNA를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 허용되는 숙주를 형질전환시킨 다음에, 이것을 외래 DNA의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양 및 유지시킨다.
생산된 단백질은 세포를 용해시키거나 본 기술분야의 전문가에게 공지되고 적절한 배양 배지로부터 분리시킴으로써 배양물로부터 회수된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여, 이러한 발현시스템을 사용하여 생산된 단백질을 분리시킬 수 있다. 상술한 바와 같은 특정의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 공급원으로부터 단백질을 정제하는 방법이 재조합 DNA 방법에 의해서 생산된 단백질을 정제하는데 동등하게 적용될 수 있다.
재조합 기술에 의해서 단백질을 생산하는 이외에도, 자동화된 펩타이드 합성기를 또한 사용하여 분리되고 본질적으로 순수한 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 기술은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 치환을 갖는 유도체가 DNA-코드화된 단백질 생산 시에 제공되지 않는 경우에 유용하다.
핵산 분자는 DNA 주사 (또한, DNA 백신접종으로도 불림), 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아와 같은 재조합 벡터를 포함하는 몇 가지 잘 알려진 기술 중의 어떤 것을 사용하여서도 송달될 수 있다.
투여의 경로에는 근육내, 비내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 경구뿐만 아니라 국소적으로, 경피적으로, 흡입 또는 좌제에 의해서, 또는 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직에 대한 세척에 의한 것과 같은 점막 조직이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 투여의 경로에는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사가 포함된다. 유전자 구조물은 전기천공 방법 및 장치, 전통적인 시린지, 무침 주사장치, 또는 "마이크로프로젝틸 봄바드먼트 곤건즈 (microprojectile bombardment gone guns)"를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 수단에 의해서 투여될 수 있다.
DNA 백신의 송달을 용이하게 하는데 바람직한 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호 (Draghia-Akli, 등), 미국 특허공개 제2005/0052630호 (Smith, 등) (이들의 내용은 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다)에 기술된 것을 포함한다. 또한, 35 USC 119(e)에 따라 2006년 10월 17일자 미국 임시출원 제60/852,149호 및 2007년 10월 10일자 제60/978,982호를 우선권으로 주장하는, 2007년 10월 17일에 출원된 공동 계류 중이고 공동-소유된 미국 특허출원 제11/874072호 (이들은 모두 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다)에 제시된 DNA 백신의 송달을 용이하게 하는 전기천공 장치 및 전기천공 방법이 바람직하다.
다음은 전기천공 기술을 사용한 구체예의 예이며, 상기 검토된 특허문헌에서 더 상세하게 거론된다: 전기천공 장치를 포유동물의 원하는 조직에 사용자에 의해서 미리 설정된 전류 입력과 유사한 정전류를 생성하는 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 송달하도록 배열될 수 있다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 성분은 다음을 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소 중의 하나 또는 그 이상을 포함하고 통합할 수 있다: 조절기, 전류 파형 생성기, 임피던스 (impedance) 시험기, 파형 로거 (logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 성분, 동력원 및 동력 스위치. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 요소로서 작용할 수 있으며, 다른 요소들은 전기천공 성분과 연결되는 별개의 요소 (또는 성분)이다. 일부의 구체예에서, 전기천공 성분은 전기천공 성분과는 별개의 전기천공 장치의 또 다른 요소와 연결될 수 있는 전기천공 장치의 하나 이상의 요소로서 작용할 수 있다. 요소들은 하나의 장치로서 또는 또 다른 것과 연결되는 별개의 요소로서 작용할 수 있기 때문에, 개선된 HPV 백신을 송달하기 위한 전기천공 기술의 사용은 하나의 전기기계 또는 기계 장치의 일부분으로 존재하는 전기천공 장치의 요소에 의해서 제한되지 않는다. 전기천공 성분은 원하는 조직에서 정전류를 발생시키는 에너지의 펄스를 송달할 수 있으며, 피드백 기전을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간적 배열로 다수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함하며, 여기에서 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 수용하고, 이것을 전극을 통해서 원하는 조직에 송달한다. 다수의 전극 중의 적어도 하나는 에너지의 펄스의 송달 중에 중성이며, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 임피던스를 전기천공 성분에 전달한다. 피드백 기전은 측정된 임피던스를 수용할 수 있으며, 전기천공 성분에 의해서 송달된 에너지의 펄스를 조정하여 정전류를 유지시킬 수 있다.
일부의 구체예에서, 다수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 송달할 수 있다. 일부의 구체예에서, 다수의 전극은 프로그래밍된 순서로 전극의 제어 하에서 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 송달할 수 있으며, 프로그래밍된 순서는 전기천공 성분에 대한 사용자에 의한 입력이다. 일부의 구체예에서, 프로그래밍된 순서는 순서대로 송달된 다수의 펄스를 포함하며, 여기에서 다수의 펄스 중의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해서 송달되며, 다수의 펄스 중의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중의 다른 하나에 의해서 송달된다.
일부의 구체예에서, 피드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 피드백 기전은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 이 피드백은 매 50 ㎲, 20 ㎲, 10 ㎲ 또는 1 ㎲마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다 (즉, 응답시간을 측정하기 위해서 이용할 수 있는 기술에 의해서 측정되는 것으로서 실질적으로 순간적이다). 일부의 구체예에서, 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피드백 기전에 전달하며, 피드백 기전은 임피던스에 응답하여 정전류가 미리 설정된 전류와 유사한 값으로 유지되도록 에너지의 펄스를 조정한다. 일부의 구체예에서, 피드백 기전은 에너지의 펄스의 송달 중에 정전류를 연속적으로 및 순간적으로 유지시킨다.
일부의 구체예에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제의 투여와 함께 세포에 송달된다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972 및 5,962,428호 및 1994년 1월 26일에 출원된 국제출원 제PCT/US94/00899호에 기술되어 있다. 유전자 백신 촉진제는 본 발명에 참고로 포함된 1994년 4월 1일자 미국 특허출원 제021,579호에 기술되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 공동-약제는 핵산 분자와의 혼합물로 투여될 수 있거나, 별도로 핵산 분자의 투여와 동시에, 또는 그 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 형질감염제 및/또는 복제성 약제 및/또는 염증성 성분으로 작용할 수 있으며, GVF와 공동-투여될 수 있는 다른 약제에는 성장인자, 사이토킨 및 림포킨, 예를 들어, a-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), TNF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-15뿐만 아니라 섬유아세포 성장인자, 표면활성제, 예를 들어, 면역-자극성 컴플렉스 (ISCOMS), 프로인드 (Freunds) 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A (WL)를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포체가 포함되며, 히알우론산이 또한 유전자 구조물과 함께 투여될 수 있다. 일부의 구체예에서는, 면역조절성 단백질이 GVF로 사용될 수 있다. 일부의 구체예에서, 핵산 분자는 송달/흡수를 증진시키기 위해서 PLG와 함께 제공된다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 1 나노그램 내지 약 2000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 함유한다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 사용될 투여의 모드에 따라 제제화된다. 약제학적 조성물이 주사용 약제학적 조성물인 경우에, 이들은 멸균되고, 발열성 물질을 함유하지 않으며, 미립자를 함유하지 않는다. 등장성 제제가 바람직하게 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제에는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함될 수 있다. 일부의 경우에, 포스페이트 완충된 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부의 구체예에서는, 혈관수축제가 제제에 첨가된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 면역반응을 유도하는 방법이 제공된다. 백신은 단백질 기본, 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 일부의 구체예에서, 점막 면역반응을 유도하는 방법을 포함하는, 개체에게서 면역원에 대한 면역반응을 유도하는 방법은 개체에게 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능적 단편 또는 그의 발현가능한 코드화 서열 중의 하나 또는 그 이상을 본 발명의 단백질을 코드화한 분리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 코드화한 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질의 서브유니트 백신 및/또는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신을 함께 투여하는 것을 포함한다. CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능적 단편 중의 하나 또는 그 이상은 면역원을 코드화한 분리된 핵산 분자; 및/또는 면역원을 코드화한 재조합 백신 및/또는 면역원을 포함하는 서브유니트 백신 및/또는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부의 구체예에서는, CTACK, TECK, MEC 및 그의 기능적 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 코드화한 분리된 핵산 분자가 개체에게 투여된다.
본 발명은 이하의 실시예에서 더 설명된다. 이 실시예는 본 발명의 구체예를 나타내지만 단지 설명을 목적으로 제시된 것으로 이해되어야 한다. 상기한 검토 및 이 실시예로부터, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있으며, 그의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명이 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명에 나타내고 기술된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 특허청구의 범위의 범위 내에 포함시키고자 한다.
본 발명 전체에 걸쳐서 인용된 미국 특허, 미국 특허출원 및 참고문헌은 각각 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다.
실시예
본 발명을 하기 실시예에서 더 예시한다. 이 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예들을 나타내지만 단지 예로서 제공되는 것임이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이 실시예로부터, 당분야 숙련자는 본 발명의 본질적 특징들을 확인할 수 있고, 이들의 정수 및 범위에서 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도들 및 조건들에 맞도록 그 다양한 변화들 및 개질들을 만들 수 있다. 따라서 본원에 나타내고 기재한 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 개질들은 상기 기재로부터 당분야 숙련자들에게 자명할 것이다. 이러한 개질들도 첨부되는 특허청구범위들의 범위 내에 속하는 것이다.
실시예 1
E6/E7 융합 단백질을 인코딩하는 신규 조작된 HPV-16 DNA 백신
면역원은 다단백질로서 발현되도록 설계되어 왔으며, 이로써 E6 및 E7 서열이 단백분해 절단 부위에 의해 분리된다. 상기 다단백질은 또한 IgE 선도 서열을 이용하여 발현된다. 상기 다단백질 설계는 p53 결합 및 분해에 중요한 E6 서열에서의 결실 또는 돌연변이 및 E7 단백질 상에서의 리보솜 결합 부위에서의 돌연변이를 포함한다.
다단백질 (서열번호:22)을 인코딩하는 HPV16 E6/E7의 코딩 서열(서열번호: 21)을 벡터 pVAX 내로 삽입하여 발현 플라스미드를 생성하였다. 상기 발현 플라스미드는 카나마이신 저항성 유전자 (Kan) 및 플라스미드 복제 기점 (pUC ori)을 포함하는 pVAX 골격을 이용하여 소 성장 호르몬 3' 말단 및 폴리-아데닐화 신호 (bGHpA)와 함께 CMV 프로모터 (PCMV)에 의해 유도된, 최적화된 인간 파밀로마 바이러스 16-6&7 항원 (HPV16 E6&7)을 발현한다.
HPV18 E6/E7 백신 설계 및 발현
인간 파밀로마 바이러스 (HPV) 바이러스 단백질 18 E6&7에 대한 최적화된 공통 서열을 제조하였다. 상기 서열은 높은 수준의 발현을 위해 설계된다. 이 서열은 우리의 유전적 면역화 기술에서 유용하다. 상기 공통 서열을 이용하여 수행된 실험 결과들은 긍정적이었다. 상기 플라스미드 컨스트럭트는 공통 HPV 18-6&7의 핵산 서열 (서열번호: 23)을 포함한다. 상기 플라스미드 내로 혼입된 공통 HPV 18-6&7의 핵산 서열은 상기 공통 HPV 18-6&7의 코딩 서열에 연결된 IgE 리더 펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함한다.
카나마이신 저항성 유전자 (Kan) 및 플라스미드 복제 기점 (pUC ori)을 포함하는 pVAX 골격을 이용하여 소 성장 호르몬 3' 말단 및 폴리-아데닐화 신호 (bGHpA)와 함께 CMV 프로모터 (PCMV)에 의해 유도된 최적화된 인간 파밀로마 바이러스 18-6&7 항원 (HPVI8 E6&7) (서열번호:24)을 발현하는 발현 플라스미드 pGX3002를 생성하였다.
HPV6 및 HPV11 E6/E7 백신 설계 및 발현
HPV6 및 11 E6/E7 공통-기반 융합 면역원들의 구축
HPV 타입 6 또는 11 E6 및 E7 유전자 서열들을 GeneBank에서 수집하고, 다중 정렬을 수행한 후 공통 E6 및 E7 뉴클레오티드 서열들을 수득하였다. 각각 HPV 6 E6 또는 E7 단백질들의 공통 서열은 각각 98 또는 20 서열들로부터 생성된 반면, HPV 11 E6 또는 E7 단백질들의 공통 서열은 76 또는 13 서열들로부터 생성되었다. 계통학적 연구에 적용된 다중 정렬 절차에는 Clustal X(2.0 버전)의 적용이 포함되었다. 도 1a 및 b에 나타낸 바와 같이, E6 및 E7 단백질들에서 동일한 타입에 속하는 HPV 균주들 간에 약 0-2%의 서열 편차가 있었다. 그러나 HPV 6 및 11 간 유전적 거리들은 E6 단백질에서 19.3%까지 그리고 E7 단백질에서 16.3%일 수 있었다. 계통학적 분석들의 이러한 결과들에 근거하여, 2개의 유형 특이적 E6/E7 공통 DNA 백신들을 개발하였다.
공통 E6/E7 융합 서열을 생성한 후 몇몇 개질들을 수행하였다(도 1C). 발현을 촉진하기 위해 고효율 리더 서열을 시작 코돈의 상류에 프레임에 맞게 융합시켰다. 전술된 바와 같이 코돈 및 RNA 최적화도 수행하였다(J. Yan 등, Cellular immunity induced by a novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion consensus protein in mice 및 rhesus macaques, Vaccine. 26 (2008) 5210-5215; 및 J. Yan 등, Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen, Vaccine. 27 (2009) 431-440). 적절한 단백질 폴딩 및 더 우수한 CTL 처리를 위해 내단백분해 절단 부위를 E6 및 E7 단백질 사이에 도입하였다. 엔지니어링된 두 합성 6E6E7 유전자 및 11E6E7 유전자들은 840bp 길이였다. 서열 확인된 합성 유전자들을 추가 연구를 위해 각각 BamHI 및 XhoI 부위들에서 pVAX 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 공통 뉴클레오티드 서열들을 번역하여 공통 아미노산 서열들을 수득하였다.
HPV 6 및 11 공통 E6 및 E7 서열들을 수득한 뒤, 전술된 바와 같이 코돈 최적화 및 RNA 최적화를 수행하였다(J. Yan 등, Vaccine. 26 (2008) 5210-5215; 및 J. Yan 등, Induction, Vaccine. 27 (2009) 431-440). HPV 타입 6 또는 11 공통 E6/E7 융합 단백질(6E6E7 또는 11E6E7)을 인코딩하는 융합 유전자들을 합성하고 서열을 확인하였다. 합성한 6E6E7 또는 11E6E7을 BamHI 및 XhoI으로 소화시키고, 사이토메갈로바이러스 전초기 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 pVAX(Invitrogen) 내로 클로닝하고, 이들 구축물들을 p6E6E7 또는 p11E6E7로 명명하였다.
293-T 세포들을 6웰 플레이트들에서 배양하고 FuGENE6 형질감염 시약(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 이용해서 pVAX, p6E6E7, 또는 p11E6E7로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포들을 개질된 RIPA 세포 용해 완충액으로 용해시키고, 세포 용해액을 수집하였다. 항-HA 단일클론 항체(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 웨스턴 블롯 분석들을 수행하고, ECLTM 웨스턴 블롯 분석 시스템(Amersham, Piscataway, NJ)을 이용해서 홀스래디쉬 페록시다아제-접합 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)로 가시화하였다.
인간 횡문근육종 세포들(RD 세포들)을 이용하여 간접 면역형광 분석들을 수행하여 p6E6E7 및 p11E6E7의 발현을 확인하였다. 챔버 슬라이드들에서 배양한 RD 세포들을 Turbofectin 8.0(Origene, Rockville, MD)을 이용해서 pVAX, p6E6E7, 또는 p11E6E7로 형질감염시켰다. 이후, 세포들을 PFA로 고정하고 PBS 중 0.1% Triton-X로 투과성으로 만들었다. 세포들을 일차 및 이차 항체들과 함께 1-2회 인큐베이션하였고, 인큐베이션들 간에 글리신 및 BSA가 보강된 PBS로 세척하였다. 사용한 일차 및 이차 항체들은 각각 단일클론 마우스 항-HA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 FITC-접합 항-마우스 IgG(Abcam, Cambridge, MA)였다. Hoechst 염색도 수행하여 세포 핵들을 확인하고 RD 세포들의 위치를 파악하였다. 모든 인큐베이션들을 완료한 후, 세포들을 플루오로마운트-G(Southern Biotech, Birmingham, AL)로 고정된 유리 슬라이드로 실장하였다. 표본들을 공초점 현미경(CDB Microscopy Core, University of Pennsylvania Cell 및 Developmental Biology, Philadelphia, PA)을 이용하여 보고 이미지를 얻었다.
HPV 31, 33, 39, 45, 52 및 58 E6E7 항원
HPV 유형 31, 33, 39, 45, 52, 및 58 E6 및 E7 유전자 서열을, 개별적으로, GeneBank로부터 수집하였고, 다중 정렬(유형31 - 서열번호: 18; 유형33 - 서열번호: 6; 유형52 - 서열번호: 20; 및 유형58 - 서열번호:8)을 수행한 후 공통 E6 및 E7 뉴클레오타이드 서열을 수득하였다. 계통발생적 연구에서 적용된 상기 다중 정렬 절차는 Clustal X (버전 2.0)의 적용을 포함하였다. 계통발생 분석 결과에 기초하여, 본 발명자들은 유형-특이적 E6/E7 공통 DNA 백신을 개발하였다.
공통 E6/E7 융합 서열을 생성한 후 몇 가지 변형을 수행하였다. 발현을 촉진하기 위해 고효율적인 선도 서열을 시작 코돈의 업스트림에 틀에 맞춰 융합시켰다. 상기 코돈 및 RNA 최적화를 또한 종래에 기재된 대로 수행하였다 (J. Yan, 등, Cellular immunity induced by a novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion consensus protein in mice and rhesus macaques, Vaccine. 26 (2008) 5210-5215; 및 J. Yan, 등, Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen, Vaccine. 27 (2009) 431-440). 적절한 단백질 접힘 및 더 우수한 CTL 가공을 위해 엔도단백분해 절단 부위를 E6 및 E7 단백질 사이에 도입하였다. 서열 확인된 합성 유전자들을 추가 연구를 위해 각각 BamHI 및 XhoI 부위에서 pVAX 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 공통 뉴클레오타이드 서열을 번역함으로써 공통 아미노산 서열을 수득하였다.
카나마이신 저항성 유전자 (Kan) 및 플라스미드 복제 기점 (pUC ori)을 포함하는 pVAX 골격을 이용하여 소 성장 호르몬 3' 말단 및 폴리-아데닐화 신호 (bGHpA)와 함께 CMV 프로모터 (PCMV)에 의해 유도된, 최적화된 인간 파밀로마 바이러스 31, 33, 52, 및 58-E6&7 항원을 (HPV31 E6&7 - 서열번호:17, HPV33 E6&7 - 서열번호:5, HPV52 E6&7 - 서열번호:19, 및 HPV58 E6&7 - 서열번호:7)을 발현하는 발현 플라스미드를 생성하였다. 마찬가지로, 최적화된 인간 파밀로마 바이러스 39 및 45 E6&E7 항원 (서열번호:26을 인코딩하는 HPV39 E6&E7 서열; 및 서열번호:25를 인코딩하는 HPV45 E6&E7 서열) 삽입물을 포함하는 발현 플라스미드를 생성한다.
실시예 2
마우스들 및 처리군들의 백신접종들
6 내지 8주령의 자성 C57BL/6 마우스들을 이 실험에 사용하였다. 마우스들은 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 입수하였다. 마우스들을 국립보건원(National Institutes of Health) 및 펜실베니아 대학 동물 케어 및 사용 위원회(IACUC)의 정책들을 준수하여 펜실베니아 대학(Philadelphia, PA)의 대학교 실험 동물 자원실에서 수용하고 유지하였다. 이 실험들에 사용한 마우스들을 4개 면역접종군들로 나누었다. 마우스들에 p6E6E7, p11E6E7, 또는 두 구축물들을 모두 그리고 음성 대조군 pVAX군을 면역접종하였다.
DNA 백신접종 및 전기천공
각각의 마우스는 14일 간격들로 각각의 DNA 플라스미드 20㎍의 3회 용량들을 수여받았다. p6E6E7 및 p11E6E7를 모두 수여받는 군의 마우스들은 백신접종 당 두 플라스미드들을 20㎍씩 총 40㎍의 DNA를 수여받았다. DNA 구축물들을 우측 사두근들의 근육내 주사 후 CELLECTRA™ 전기천공기(Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)에 의해 생성되는 방형파 펄스들을 통해 투여하였다. 전기천공기는 1초씩 지연 분리된 간격으로 52ms/펄스에서 0.2Amps의 2회 전기 펄스들을 전달하도록 구성되었다. 전기천공 절차를 전술된 바와 같이 수행하였다[12,13].
IFN-γ ELISpot 분석
치료군 및 대조군들의 마우스들을 모두 3번째 면역접종 1주 후에 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장들을 수확하여 10% FBS 및 항생제들(R10)을 포함하는 RPMI-1640 배지로 옮겼다. Stomacher(Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY)를 이용하여 비장들을 분쇄한 뒤 세포 여과기를 통해 옮기고 ACK 용해 완충액 중에 현탁하였다. 적혈구들을 제거한 후, 비장세포들을 단리하고 R10 배지 중에 현탁하였다. 고단백질 IP 96-웰 Multiscreen™ 플레이트들(Millipore, Bedford, MA)을 단일클론 마우스 IFN-γ 포획 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 사전 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 1 X PBS로 3회 세척한 후, 플레이트들을 상온에서 2시간 동안 1 x PBS 중 1% BSA 및 5% 수크로오스로 차단하였다. R10 배지 중 단리된 비장세포들을 계수하고, 웰 당 2 x 105개 세포들로 3개씩의 웰들에 추가하였다. HPV6 및 HPV11에 대한 공통 E6/E7 서열에 걸친 2개 세트들의 펩티드들을 DMSO(GenScript USA, Piscataway, NJ) 중에 재구성하였다. 펩티드들은 15개 아미노산 서열들을 포함하였고, 그 중 8개 잔기들이 각각의 순차적 펩티드와 겹쳤다. HPV6 및 11에 대한 펩티드들을 각각 DMSO 중 2㎍/mL의 농도인 2개 풀들-E6을 위한 1개 풀 및 E7을 위한 또 다른 풀-로 나누었다. 양성 및 음성 대조군으로 사용될 웰들에는 각각 펩티드들 대신에 Concavalin A(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 R10 배양 배지를 넣었다. 이어서 플레이트들을 5% CO2 분위기 인큐베이터에 넣었다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 후, 웰들을 1 x PBS로 세척하였다. 바이오틴화 항-마우스 IFN-γ 검출 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 각 웰에 첨가한 뒤 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트들을 세척하고, Streptavidin-AP 및 BCIP/NBT Plus(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 R&D Systems에서 제공하는 발색 프로토콜에 따라 처리하였다. 웰들을 하룻밤 동안 대기 건조하고, 웰들 내부의 스팟들을 ImmunoSpot®3 및 ImmunoSpot®4 소프트웨어(Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)를 이용하여 ELISpot 플레이트 리더 시스템으로 스캐닝하고 계수하였다. 보고된 스팟 형성 세포 계수값들을 산술을 이용해서 1 x 106개 비장세포들 당의 스팟 형성 단위들을 나타내도록 변환하였다.
감도 및 T-세포 활성을 나타내는 능력에 근거하여, IFN-γ ELISpot 분석들을 이용해서 HPV 6 또는 11 E6 및 E7 펩티드들로의 자극에 반응하는 항원-특이적 IFN-감마 분비 세포들의 수를 결정하였다.
도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, p6E6E7로 백신접종한 마우스들에 있어서 SFU/106개 비장세포들의 평균 개수는 1442.8인 반면 p11E6E7로 백신접종한 마우스들에 있어서 SFU/106개 비장세포들의 평균 수는 2845로, 모두 음성 대조군보다 훨씬 더 높았다. 따라서 p6E6E7 및 p11E6E7은 모두 마우스들에서 강력한 타입-특이적 E6 및 E7-특이적 면역 반응을 일으키는데 효과적이었다.
흥미롭게도 교차반응성 세포 면역 반응들도 p6E6E7 또는 p11E6E7을 이용한 백신접종으로 유도되었다. HPV 6 E6/E7 펩티드들에 대해 p11E6E7 면역접종 마우스들에서의 SFU/106개 비장세포들의 추가 빈도는 552.8 SFU/106개 비장세포들이었고, p6E6E7 면역접종 마우스들에서의 HPV 11 E6/E7-특이적 면역 반응들은 888.3 SFU/106개 비장세포들이었다. HPV 6 또는 11의 E6 단백질들은 약 80%의 동일성을 공유하는 반면 HPV6 또는 11의 E7 단백질들은 약 84%의 동일성을 공유하였다. HPV 6 또는 11 E6 및 E7 항원들 간에는 일부 공유된 면역 에피토프들이 존재할 수 있다. IFN-감마 ELISpot 분석에서 관찰된 교차반응성은 HPV 6 및 11 E6 및 E7 항원들 간에 공유된 면역 에피토프들이 존재함을 나타내었다.
p6E6E7 및 p11E6E7 모두를 수여받은 마우스들(콤보군)의 비장세포들도 이들 두 구축물들을 함께 백신접종할 때 임의의 면역 간섭이 존재하는지를 조사하기 위해 상기 ELISpot 분석들을 수행하였다(도 3a 및 b). 콤보군은 HPV6 E6 및 E7 펩티드들에 대해 평균 1670 SFU/106개 비장세포들을 나타내었다(σ = 55.7, p < 0.001). HPV11 E6 및 E7 펩티드들에 대해서는 동일한 군의 비장세포들에서 2010 SFU/106개 비장세포들을 나타내었다(σ = 247.8, p = 0.002). 데이터는 두 구축물들을 이용한 동시적 백신접종이 HPV6 및 HPV11에 대해 통계적으로 유의미한 E6 및 E7-특이적 세포 반응을 일으킬 수 있으며, 이들 반응들이 서로를 간섭하지 않음을 제시한다.
에피토프 맵핑
E6/E7 공통 항원들 내의 면역 우성 펩티드들을 결정하기 위해, 에피토프 맵핑 연구들을 수행하여 펩티드 풀들 내에서 우성 에피토프들을 결정하였다(도 4a 및 4b). 연구들은 앞서 언급된 IFN-γ ELISpot 분석과 유사하게 수행하였다. 풀들 대신에 개별 펩티드들을 사용하여 비장세포들을 자극하였다.
이 단일 펩티드 분석에서 사용된 각각의 펩티드는 HPV6 또는 HPV11의 E6 및 E7 항원들의 부분적으로 겹치는 단편을 나타내었다. 맵핑 데이터는 펩티드 7(TAEIYSYAYKQLKVL) 서열 목록 번호 11이 HPV6 E6 및 E7 면역원들에 대한 우성 에피토프임을 나타내었다(도 4a). TAEIYSYAYKQLKVL 서열 목록 번호 11은 NIH BIMAS에서 이용 가능해진 HLA 결합 예측 소프트웨어에 의해 제한된 H2-Kb인 것으로 확인된 8, 9, 10-머 아미노산 에피토프들을 포함하였다. HPV11 E6 및 E7-특이적 T-세포 면역 반응을 추가 설명하기 위해(도 4b). HPV11 E6 및 E7의 겹치는 단편들로 펩티드 분석을 또한 수행하였다. 에피토프 맵핑은 HPV 11 E6 및 E7 항원들에 대한 우성 에피토프들이 펩티드들 7(TAEIYAYAYKNLKVV) 서열 목록 번호 12 및 27(HCYEQLEDSSEDEVD) 서열 목록 번호 13임을 나타내었다. HPV6 에피토프 맵핑 분석에서의 펩티드 7과 마찬가지로, BIMAS HLA-결합 예측 소프트웨어에서는 TAEIYAYAYKNLKVV 서열 목록 번호 12가 H2-Kb 제한 에피토프임을 확인하였다. 또 다른 HLA-결합 펩티드 데이터베이스인 면역 에피토프 데이터베이스 및 NIH NIAID에서 제공하는 분석 자원으로 HCYEQLEDSSEDEVD 서열 목록 번호 13이 H2-Kb 제한 에피토프임을 확인하였다. 3개의 면역 서브우성 펩티드들 번호 6(FCKNALTTAEIYSYA) 서열 목록 번호 14, 9(LFRGGYPYAACACCL) 서열 목록 번호 15, 및 13(YAGYATTVEEETKQD) 서열 목록 번호 16이 이 에피토프 맵핑 연구를 통해 확인되었다.
세포내 시토카인 염색
IFN-γ ELISpot 분석들로 나타내는 높은 면역 반응의 견지에서, p6E6E7 및 p11E6E7에 의해 유도되는 세포 반응의 보다 전체적인 개요를 제공하기 위해 세포내 시토카인 염색 분석들을 수행하였다. 백신접종 및 접종하지 않은 마우스 군들로부터 비장세포들을 단리하고, 37℃, 5% CO2 환경에서 4시간 동안 HPV6 및 HPV11의 E6 및 E7 영역들에 걸친 펩티드들로 자극하였다. 세포들을 각각 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 R10 세포 배지에 넣어서 양성 및 음성 대조군들로 분석에서 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포들을 먼저 ViViD 염료(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색하여 살아 있는 세포들과 죽은 세포들을 구분한 뒤 모든 세포들을 하기 표면 마커 항체들로 염색하였다: APC-Cy7 햄스터 항-마우스 CD3e, PerCP-Cy5.5 래트 항-마우스 CD4, 및 APC 래트 항-마우스 CD8a(BD Biosciences, San Diego, CA). 이어서 세포들을 Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용해서 고정하였다. 제작자의 프로토콜에 따라 고정 후, 세포들을 하기 세포내 마커 항체들로 염색하였다: Alexa Fluor 700 래트 항-마우스 IFN-γ, PE-Cy7 래트 항-마우스 TNF Clone, 및 PE 래트 항-마우스 IL-2(BD Biosciences, San Diego, CA). 염색 후, 세포들을 2% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 용액으로 고정하였다. 제조된 세포들을 BD FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)가 장착된 LSR II 유세포 측정기를 이용해서 입수하였다. 입수한 데이터를 최신 버전의 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)를 이용해서 분석하였다. CD4+ 및 CD8+ 사건들을 다음 순서의 관문들을 이용해서 단리하였다: FSC-A vs FSC-H로부터 단일선, FSC-A vs SSC-A로부터 모든 비장세포들, ViViD 염료(Pacific Blue) vs SSC-A로부터 살아있는 세포들, CD3(APC-Cy7) vs SSC-A로부터 CD3+ 세포들, 및 CD4(PerCP-Cy5.5: 양성-CD4+, 음성-CD8+) vs SSC-A로부터 CD4+ 또는 CD8+. 마지막 두 모집단들을 Alexa Fluor 700, PE-Cy7, 및 PE에 대해 관문화하여 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α 생산에서의 변화들을 각각 관찰하였다.
세포내 시토카인 염색 데이터를 CD4+ 및 CD8+ 세포 반응들로 구분할 수 있도록 세포들을 관문화하였다. HPV6 E6 및 E7-특이적 펩티드들로 자극할 때, p6E6E7로 백신접종한 마우스들은 각각 평균들 0.163%(σ = 0.09), 0.003%(σ = 0.07), 및 0.188%(σ = 0.20)의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 생산하는 총 CD4+ 세포들을 나타내었다(도 5a). 동일한 군의 마우스들은 각각 평균들 3.323%(σ = 1.39), 0.838%(σ = 0.32), 및 1.172%(σ = 1.81)의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 생산하는 총 CD8+ 세포들을 가졌다. HPV11 E6 및 E7 항원들과 함께 인큐베이션 후 p11E6E7로 백신접종된 마우스들로부터의 비장세포들을 이용하여 동일한 세포내 시토카인 데이터를 수집하였다(도 5b). p11E6E7 백신접종 마우스들의 모든 CD4+ 세포들 가운데 평균 0.051%(σ = 0.04)가 IFN-γ를 생산하였고, 0.068%(σ = 0.09)가 TNF-α를 생산하였고, 0.026%(σ = 0.037)가 IL-2를 생산하였다. 또한, p11E6E7 백신접종 마우스들에서 모든 CD8+ 세포들의 평균 4.52%(σ = 2.53), 2.08%(σ = 1.56), 및 0.21%(σ = 0.22)가 각각 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생산하였다. 몇 개 패널들을 예외로 하고, 처리군 대 대응 미처리군에서의 시토카인 생산 세포들의 백분율은 신뢰도 수준 89% 이상으로 통계적 유의성을 가졌다. CD4+ 세포들 대 CD8+ T-세포들의 시토카인 생산 크기 관찰로부터, p6E6E7 및 p11E6E7에 의해 야기되는 면역 반응들이 모든 모델들에서 이들의 세포 제거와 연관되는 CD8+ 림프구들을 유도하는 쪽으로 크게 편향된다고 결론지을 수 있다.
통계적 분석
스튜던트 t 검정들을 수행하여 이 연구에서 생성한 모든 정량적 데이터의 통계적 유의성을 분석하였다. 달리 나타내지 않으면, p-값들을 계산하여 다양한 신뢰도 수준들에서 통계적 유의성을 결정하였다.
이 연구는 DNA 백신들이 다른 유명한 그리고 전통적인 백신 플랫폼들을 이용하는 실험들에서 확인되는 면역원성 수준을 획득할 수 있다는 강력한 증거를 나타내었다. 다른 유사한 E6 및 E7-특이적 HPV DNA 백신 연구들에서 측정되는 높은 수준의 세포 반응들은 예방적인 및 치료적인 항종양 유효성을 시사하는 데이터와 연관되었다. 대부분의 HPV-관련 연구 및 질병 시험 모델들은 자궁경부암에 초점을 맞추고 있다. HPV6 및 HPV11은 다른 HPV 혈청형들만큼 자궁경부암에 관련되어 있지 않으므로, p6E6E7 및 p11E6E7의 치료적 유효성은 통상적인 HPV 질병 시험 모델들을 이용해서는 완전히 평가할 수 없다. 적절한 질병 시험 모델들을 이용할 수 있게 될 때 p6E6E7 및 p11E6E7의 예방적 및 치료적 잠재력을 결정하는 것이 통찰력있을 것이다. 따라서 ELISpot 분석들 및 세포내 시토카인 염색으로 정량한 높은 수준들의 IFN-γ 및 시토카인 생산을 살펴봄으로써 p6E6E7 및 p11E6E7의 면역원성 유효성을 추론할 수 있을 뿐이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 수준들은 크기가 매우 큰 것으로 확인되었고 상당한 수준들의 세포 면역 반응들을 일으킬 전망을 보여준다. HPV-관련 암들은 일반적으로 다중 혈청형들의 동시적 감염에 이차적인 것이므로, 바이러스의 상이한 혈청형들을 표적으로 하는 백신들의 조합 타당성을 더 살펴볼 필요성이 매우 높다. 두 플라스미드들의 동시적 백신접종 효과들을 추가 분석하기 위해 T-세포 역학들 및 백신 경쟁을 살피는 추가 연구가 타당하다.
세포내 시토카인 염색은 p6E6E7 및 p11E6E7을 이용한 백신접종이 상당한 백분율의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 생산 T-세포들을 일으킬 수 있음을 나타내었다. 면역계에서 현재 알려진 기능에 따르면, IFN-γ는 역사적으로 세포 면역 반응들의 계측으로 사용되었다. 일부 중요 역할들에는 선천성 및 적응 면역성을 조정하고 자극하는 능력이 포함된다. 또한, IFN-γ의 주요 생산자들이 T-세포들이라는 것이 널리 받아들여져서, IFN-γ 생산을 항원들에 대한 노출 후 주어진 백신의 세포성 면역원성을 측정하는 허용 가능한 모드가 되게 한다. TNF-α는 면역계 조절에 관여하는 또 다른 시토카인이다. 아폽토시스를 유도하고 종양 증식을 조절하는 그 알려진 능력은 이것이 백신접종 후 면역 반응들을 분석할 때 고려할 중요 파라미터가 되게끔 한다. TNF-α 생산은 HPV6 및 HPV11의 잠재적 종양 증식 특성들에 따라 추가 관심의 대상이 될 수 있다. IL-2는 면역계에서 T-세포들의 증식과 분화에 중추적 역할을 담당하는 것으로 관찰되어온 또 다른 신호전달 분자이다. 공통적으로 IL-2는 종종 특정 면역 반응의 크기 및 질에 대한 추가 관점을 얻기 위해 다른 시토카인들과 함께 검사된다. 상기에 따라, p6E6E7을 이용한 백신접종 후 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 생산하는 CD4+ 및 CD8+ 세포들의 상당한 백분율들은 백신이 강력한 면역 반응을 유도하는데 성공적이었음을 제시한다. IL-2 분비 CD4+ 세포들은 예외로 하고, p11E6E7로 백신접종한 마우스들로부터 단리된 세포들에 대해서도 동일한 경향성이 나타난다. 또한, CD8+ 세포들이 백신접종한 마우스들에서 면역 반응들을 강력히 유도함-두 플라스미드들의 항종양 유효성 평가에 중요한 특성임-을 관찰하는 것을 주목할만 하다.
실시예 3
마우스 및 치료 그룹 예방접종
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스가 사용될 수 있다. 마우스는 잭슨 연구소 (Bar Harbor, ME)로부터 수득될 수 있다. 마우스는 면역화를 위해 4개의 그룹으로 분류될 수 있다. 마우스는 하기 조합 중 하나로 면역화될 수 있다: a) HPV16E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV18E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV6E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV11E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV31E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV33E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV52E6E7을 인코딩하는 플라스미드, 및 HPV58E6E7 을 인코딩하는 플라스미드; b) HPV16E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV18E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV31E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV33E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV52E6E7을 인코딩하는 플라스미드, 및 HPV58E6E7 을 인코딩하는 플라스미드; c) HPV16E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV18E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV31E6E7을 인코딩하는 플라스미드, 및 HPV33E6E7 을 인코딩하는 플라스미드; d) HPV16E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV18E6E7을 인코딩하는 플라스미드, HPV6E6E7을 인코딩하는 플라스미드, 및 HPV11E6E7을 인코딩하는 플라스미드; 및 pVAX 그룹은 음성 대조군으로 제공되었다.
DNA 예방접종 및 전기천공
각 마우스에게 총 14일 간격으로 20μg의 각 DNA 플라스미드의 3개의 용량을 투여한다. 상기 DNA 컨스트럭트를 오른쪽 대퇴사두근의 근육내 주사를 통해 투여한 다음, CELLECTRA 전기천공기 (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)에 의해 방형파(square-wave)를 생성하였다. 상기 전기천공기는 1초 지연 간격으로 떨어져 있는 52ms/펄스로 0.2Amps에서 2개의 전기 펄스를 전달하도록 구성된다. 전기천공 절차는 Inovio 제약사의 허가로 CELLECTRA 정보에서와 같이, 종래 기술된 대로 수행하였다.
IFN-γ ELISpot 검정
치료 및 대조군 그룹 내의 마우스들을 3차 면역화한 후 1주째에 희생시킨다. 각 마우스로부터 비장을 수확하고 10% FBS 및 항생제 (R10)를 갖는 RPMI-1640 배지로 옮긴다. 스토마커 (Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY)를 이용하여, 비장을 분쇄한 후, 세포 여과기를 통해 이동시키고 ACK 용해 버퍼에 현탁한다. 적혈구를 제거한 후, 비장세포를 분리하여 R10 배지에 현탁한다. 고-단백질 IP 96-웰 멀티스크린 플레이트 (Millipore, Bedford, MA)를 모노클로날 마우스 IFN-γ 포획 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 미리 코팅하여 4℃에서 밤새 배양한다. 1 X PBS로 3회 세척한 후, 상기 플레이트를 주위 온도에서 2시간 동안 1 x PBS 중의 1% BSA 및 5% 수크로오스로 블로킹한다. R10 배지 내의 분리된 비장세포를 계수하고 웰당 2 x 105 세포로 3개의 웰에 부가한다. 각 HPV 플라스미드에 대한 공통 E6/E7 서열을 포함하는 2세트의 펩타이드를 DMSO(GenScript USA, Piscataway, NJ)에서 재구성한다. 상기 펩타이드는 15개의 아미노산 서열을 함유하였고, 이들 중 8개의 잔기들은 각각의 순차적인 펩타이드와 중첩되었다. 각각의 HPV 플라스미드에 대한 펩타이드를 DMSO에서 2μg/mL의 농도에서 2개의 풀(E6에 대한 하나의 풀 및 E7에 대한 또 하나의 풀)로 나누었다. 양성 및 음성 대조군에 대해 준비된 웰들은 펩타이드 대신에 각각 콘카발린 A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 R10 배양 배지를 받는다. 이후, 플레이트들을 5% CO2 대기 배양기에 둔다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 웰들을 1 x PBS로 세정한다. 바이오티닐화된 항-마우스 IFN-γ 검출 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 각 웰에 부가한 다음, 4℃에서 밤새 배양한다. 이후, 상기 플레이트를 세정하고 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT Plus (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 R&D 시스템에 의해 제공된 발색 현상 프로토콜에 따라 처리한다. 상기 웰을 밤새 공기 건조시키고 웰 안의 스팟을 스캐닝하고 ImmunoSpot®3 및 ImmunoSpot®4 소프트웨어 (Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)를 이용하여 ELISpot 플레이트 리더 시스템에 의해 계수한다. 보고된 스팟-형성 세포수를 산수를 이용하여 1 x 106 비장세포 당 스팟-형성 단위를 나타내도록 변환한다.
T-세포 활성을 설명하는 이들의 민감도 및 능력을 고려할 때, IFN-γ ELISpot 검정을 사용하여 HPV 6 또는 11 E6 및 E7 펩타이드를 이용한 자극에 반응한 항원-특이적 IFN-감마 분비 세포의 수를 결정한다.
실시예 4 VGX-3100 1상으로부터의 인간 결과
(HPV16 E6E7 및 HPV18 E6E7의 조합)
이전에 치료된 CIN 2/3을 갖는 환자들
CELLECTRA® 정전류 EP 디바이스를 이용한 VGX-3100 조합 DNA 백신의 IM 전달.
그 전체가 본원에 편입된, 문헌[Bagarazzi 등 Sci Transl Med 4, 155ra138 (2012)]을 참조한다.
Figure pat00001
항체 반응:
15/18 (83%)에서 고역가를 갖는 4개의 모든 항원에 대한 항체 및 모두에서의 웨스턴 블랏 확인은 9개월까지 지속된다.
HPV16,18 E6, E7에 대한 항원-특이적 세포성 반응:
- IFN-γ ELISpot (>50 SFU/106 PBMC)에 의한 14/18 (78%) POS
-1 Ag에 대해 > 2500 SFU/106 PBMC까지, 모든 4 항원에 대해 > 5,670 SFU/106 PBMC까지 w /용량을 증가시킨다.
-5명의 대상은 4개의 모든 항원에 반응하였다.
-반응은 일차 시리즈 후 9개월까지 지속된다.
-4번째 용량은 T 세포 반응을 > 2 년까지 증강시킨다.
-HLA DR+ / CD38+ CD8+ T 세포는 세포 사멸을 위해 그란자임 B / 페르포린을 방출한다.
<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA Weiner, David B Yan, Jian <120> IMPROVED VACCINES FOR HUMAN PAPILLOMA VIRUS AND METHODS FOR USING THE SAME <130> UPVG0025 WO3 <150> 61777198 <151> 2013-03-12 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV6 E6E7 DNA sequence <400> 1 ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60 cgggtgcaca gcgaaagcgc caatgccagc accagcgcta caaccatcga ccagctgtgc 120 aagaccttca acctgagcat gcacaccctg cagatcaact gcgtgttctg caagaacgcc 180 ctgaccaccg ccgagatcta cagctacgcc tacaagcagc tgaaggtgct gttcagaggc 240 ggctacccct atgccgcctg cgcctgctgc ctggaatttc acggcaagat caaccagtac 300 cggcacttcg actacgccgg ctacgccacc accgtggaag aggaaacaaa gcaggacatc 360 ctggacgtgc tgatccggtg ctacctgtgc cacaagcccc tgtgcgaggt ggaaaaagtg 420 aagcacatcc tgaccaaggc ccggttcatc aagctgaact gcacctggaa gggccggtgc 480 ctgcactgct ggaccacctg tatggaagat atgctgccca gaggccggaa gcggcggagc 540 catggcagac acgtgaccct 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Asp Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu 115 120 125 Cys Glu Val Glu Lys Val Lys His Ile Leu Thr Lys Ala Arg Phe Ile 130 135 140 Lys Leu Asn Cys Thr Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr 145 150 155 160 Cys Met Glu Asp Met Leu Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly 165 170 175 Arg His Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp 180 185 190 Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser Ser Glu Asp 195 200 205 Glu Val Asp Glu Val Asp Gly Gln Asp Ser Gln Pro Leu Lys Gln His 210 215 220 Phe Gln Ile Val Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu 225 230 235 240 Val Val Gln Cys Thr Glu Thr Asp Ile Arg Glu Val Gln Gln Leu Leu 245 250 255 Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Thr Tyr 260 265 270 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 275 280 <210> 3 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV11 E6E7 DNA sequence <400> 3 ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60 agagtgcaca gcgagagcaa ggatgccagc accagcgcca ccagcatcga ccagctgtgc 120 aagaccttca acctgagcct gcacaccctg cagatccagt gcgtgttctg ccggaacgcc 180 ctgaccaccg ccgagatcta cgcctacgcc tacaagaacc tgaaggtcgt gtggcgggac 240 aacttcccct tcgccgcctg cgcctgctgc ctggaactgc agggcaagat caaccagtac 300 cggcacttca actacgccgc ttacgccccc accgtggaag aggaaacaaa cgaggacatc 360 ctgaaggtgc tgatccggtg ctacctgtgc cacaagcccc tgtgcgagat cgagaagctg 420 aagcacatcc tgggcaaggc ccggttcatc aagctgaaca accagtggaa gggccggtgc 480 ctgcactgct ggaccacctg tatggaagat ctgctgccca gaggccggaa gcggagaagc 540 cacggcagac tggtcaccct gaaggacatc gtgctggacc tgcagccccc cgatcctgtg 600 ggcctgcact gttacgagca gctggaagat agcagcgagg acgaggtgga caaagtggac 660 aagcaggacg cccagcccct gacccagcac taccagatcc tgacctgctg ctgcggctgc 720 gacagcaacg tgcggctggt ggtggaatgc accgacggcg acatccggca gctccaggat 780 ctgctgctgg gcaccctgaa catcgtgtgc cccatctgcg cccccaagcc ctacccctac 840 gacgtgcccg actacgcctg atgactcgag ctc 873 <210> 4 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV11 E6E7 protein sequence <400> 4 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Glu Ser Lys Asp Ala Ser Thr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Gln 20 25 30 Leu Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Leu His Thr Leu Gln Ile Gln Cys 35 40 45 Val Phe Cys Arg Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Ala 50 55 60 Tyr Lys Asn Leu Lys Val Val Trp Arg Asp Asn Phe Pro Phe Ala Ala 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Leu Glu Leu Gln Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His 85 90 95 Phe Asn Tyr Ala Ala Tyr Ala Pro Thr Val Glu Glu Glu Thr Asn Glu 100 105 110 Asp Ile Leu Lys Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu 115 120 125 Cys Glu Ile Glu Lys Leu Lys His Ile Leu Gly Lys Ala Arg Phe Ile 130 135 140 Lys Leu Asn Asn Gln Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr 145 150 155 160 Cys Met Glu Asp Leu Leu Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly 165 170 175 Arg Leu Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp 180 185 190 Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Glu Asp Ser Ser Glu Asp 195 200 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gagaagccgg 480 cggagagaga cagccctgcg gggcagaaag cggcggagca gaggccacaa gcccaccctg 540 aaagaatacg tgctggacct gtaccccgag cccaccgacc tgtacggcta cggccagctg 600 agcgacagca gcgacgagga cgagggcctg gacagacctg atggacaggc ccagcccgcc 660 accgccgact actacatcgt gacctgctgc cacacctgta acaccaccgt gcggctgtgc 720 gtgaacagca ccgccagcga cctgcggaca atccagcagc tcctgatggg caccgtgaac 780 atcgtgtgcc ctacctgcgc ccagctgtga ctcgagacgc gtgagctc 828 <210> 6 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV33 E6E7 protein sequence <400> 6 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Gln Asp Thr Glu Glu Ser Gly Arg Thr Leu His Asp Leu 20 25 30 Cys Gln Ala Leu Glu Thr Thr Ile His Asn Ile Glu Leu Gln Cys Val 35 40 45 Glu Cys Lys Lys Pro Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Ala Asp Leu 50 55 60 Thr Val Val Tyr Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Ile Cys Lys Leu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser 85 90 95 Val Tyr Gly Asn Thr Leu Glu Gln Thr Val Lys Lys Pro Leu Asn Glu 100 105 110 Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Lys Arg His Val 115 120 125 Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Ser Gly Arg Trp Ala Gly Arg 130 135 140 Cys Ala Ala Cys Trp Arg Ser Arg Arg Arg Glu Thr Ala Leu Arg Gly 145 150 155 160 Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly His Lys Pro Thr Leu Lys Glu Tyr Val 165 170 175 Leu Asp Leu Tyr Pro Glu Pro Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Gly Leu Asp Arg Pro Asp Gly Gln 195 200 205 Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asp Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys His Thr 210 215 220 Cys Asn Thr Thr Val Arg Leu Cys Val Asn Ser Thr Ala Ser Asp Leu 225 230 235 240 Arg Thr Ile Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Val Asn Ile Val Cys Pro 245 250 255 Thr Cys Ala Gln Leu 260 <210> 7 <211> 835 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV58 E6E7 DNA sequence <400> 7 ggtaccgttt aaacggatcc gccaccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg 60 ctgctacccg ggtgcacagc ttccaggatg ccgaggaaag cggccggacc ctgcacgatc 120 tgtgccaggc cctggaaacc agcgtgcacg agatcgagct gaagtgcgtg gaatgcaaga 180 aaaccctgca gcggagcgag gtgtacgacg ccgacctgcg gatcgtgtac cgggacggca 240 accccttcgc cgtgtgcaaa gtgtgcctgc ggctgctgag caagatcagc gagtaccggc 300 actacaacta cagcctgtac ggcgacaccc tggaacagac cctgaagaag tgcctgaacg 360 agatcctgat ccggtgcatc atctgccagc ggcccctgaa gcggcacgtg gacctgaaca 420 agcggttcca caacatcagc ggccggtgga ccggcagatg cgccgtgtgt tggaggccca 480 ggcggagaca gacccaggtg cgcggcagaa agcggcggag cagaggcaac aaccccaccc 540 tgagagagta catcctggac ctgcaccccg agcccaccga cctgtttggc tacggccagc 600 tgtgcgacag cagcgacgag gacgagatcg gcctggacgg ccctgatgga caggcccagc 660 ccgccaccgc caactactac atcgtgacct gctgctacac ctgtggcacc accgtgcggc 720 tgtgcatcaa cagcaccacc accgacgtgc gcaccctgca gcagctcctg atgggcacct 780 gtaccatcgt gtgccccagc tgcgcccagc agtgactcga ggcggccgcg agctc 835 <210> 8 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV58 E6E7 protein sequence <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Gln Asp Ala Glu Glu Ser Gly Arg Thr Leu His Asp Leu 20 25 30 Cys Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu Ile Glu Leu Lys Cys Val 35 40 45 Glu Cys Lys Lys Thr Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Ala Asp Leu 50 55 60 Arg Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys Val Cys 65 70 75 80 Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser 85 90 95 Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gln Thr Leu Lys Lys Cys Leu Asn Glu 100 105 110 Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Lys Arg His Val 115 120 125 Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg 130 135 140 Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg Arg Gln Thr Gln Val Arg Gly 145 150 155 160 Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly Asn Asn Pro Thr Leu Arg Glu Tyr Ile 165 170 175 Leu Asp Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Gly Tyr Gly Gln Leu 180 185 190 Cys Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Ile Gly Leu Asp Gly Pro Asp Gly 195 200 205 Gln Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys Tyr 210 215 220 Thr Cys Gly Thr Thr Val Arg Leu Cys Ile Asn Ser Thr Thr Thr Asp 225 230 235 240 Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr Ile Val Cys 245 250 255 Pro Ser Cys Ala Gln Gln 260 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE Leader DNA sequence <400> 9 atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagc 54 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE leader protein <400> 10 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV6 peptide 7 <400> 11 Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Gln Leu Lys Val Leu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV11 peptide 7 <400> 12 Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Ala Tyr Lys Asn Leu Lys Val Val 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV11 peptide 27 <400> 13 His Cys Tyr Glu Gln Leu Glu Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Asp 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV subdominant peptide 6 <400> 14 Phe Cys Lys Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV subdominant peptide 9 <400> 15 Leu Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Leu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV subdominant peptide 13 <400> 16 Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln Asp 1 5 10 15 <210> 17 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGX3005 insert HPV31 E6/E7 DNA sequence <400> 17 atggactgga catggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctagagtgca ttcattcaaa 60 aaccccgccg agtctgggag aaaactgcac gagctgagct ccgcactgga gatcccctac 120 gatgaactga ggctgaactg cgtgtattgt aaaggacagc tgactgagac cgaagtgctg 180 gacactgatc tgaccattgt ctaccgagac gatacacctt atggcgtgtg cactaaatgt 240 ctgcgcttct actcaaaggt gagcgagttt agatggtaca ggtatagcgt ctatggcacc 300 acactggaaa aactgacaaa caaggggatc tgcgacctgc tgatcaggtg cattacttgt 360 cagcgccctc tgcagcgaca cctggataag aagaagcggt tccataatat cggcgggcgg 420 tggaccggga gatgcatcgt gtgctggcgg agaccacgga cagagactca ggtccgaggg 480 cggaaaaggc gctctagagg agaaacccca acactgcagg actacgtgct ggatctgcag 540 cccgaggcca cagacctgca tggatatggc cagctgcccg actctagtga tgaggaagac 600 gtgatcgata gtcccgccgg ccaggctaag cctgatacct ccaactacaa tattgtcaca 660 ttttgctgtc agtgcgaatc cactctgagg ctgtgcgtgc agtctaccca ggtcgacatc 720 cgcattctgc aggaactgct gatgggatct ttcggaatcg tgtgccctaa ttgctccacc 780 agactgtgat aa 792 <210> 18 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pGX3005 insert HPV31 E6/E7 protein sequence <400> 18 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Lys Asn Pro Ala Glu Ser Gly Arg Lys Leu His Glu Leu 20 25 30 Ser Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr Asp Glu Leu Arg Leu Asn Cys Val 35 40 45 Tyr Cys Lys Gly Gln Leu Thr Glu Thr Glu Val Leu Asp Thr Asp Leu 50 55 60 Thr Ile Val Tyr Arg Asp Asp Thr Pro Tyr Gly Val Cys Thr Lys Cys 65 70 75 80 Leu Arg Phe Tyr Ser Lys Val Ser Glu Phe Arg Trp Tyr Arg Tyr Ser 85 90 95 Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Lys Gly Ile Cys Asp 100 105 110 Leu Leu Ile Arg Cys Ile Thr Cys Gln Arg Pro Leu Gln Arg His Leu 115 120 125 Asp Lys Lys Lys Arg Phe His Asn Ile Gly Gly Arg Trp Thr Gly Arg 130 135 140 Cys Ile Val Cys Trp Arg Arg Pro Arg Thr Glu Thr Gln Val Arg Gly 145 150 155 160 Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly Glu Thr Pro Thr Leu Gln Asp Tyr Val 165 170 175 Leu Asp Leu Gln Pro Glu Ala Thr Asp Leu His Gly Tyr Gly Gln Leu 180 185 190 Pro Asp Ser Ser Asp Glu Glu Asp Val Ile Asp Ser Pro Ala Gly Gln 195 200 205 Ala Lys Pro Asp Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln 210 215 220 Cys Glu Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr Gln Val Asp Ile 225 230 235 240 Arg Ile Leu Gln Glu Leu Leu Met Gly Ser Phe Gly Ile Val Cys Pro 245 250 255 Asn Cys Ser Thr Arg Leu 260 <210> 19 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGX3007 insert HPV52 E6/E7 DNA sequence <400> 19 atggactgga cctggattct gttcctggtg gctgctgcta cacgggtgca ttcatttgaa 60 gaccctgcta catctggacg aactctgcac gagctgtgcg aagtgctgga ggaatctgtc 120 catgagatca ggctgcagtg cgtgcagtgt aagaaagagc tgcagcggag agaagtgtac 180 aagaccgacc tgcggattgt ctacagagat aacaatccct atggagtgtg catcatgtgc 240 ctgcggttcc tgtctaaaat tagtgaatac agacactacc agtattccct gtatggcaag 300 acactggagg aacgagtgcg gaaaccactg tctgagatca ccattcgctg catcatttgt 360 cagacacccc tggaacgaca cgtcaacgca aacaagcggt tccataacat catgggaagg 420 tggactggcc gctgcagtga gtgttggaga ccaaggcctg tgacccaggt ccgcggacga 480 aaacggcgga gccggggcga caaggcaacc atcaaagact acattctgga tctgcagcct 540 gagaccacag atctgcatgg ctatgggcag ctgggggaca gctccgatga ggaagacaca 600 gatggggtgg acagaccaga tggacaggcc gaacaggcta caagcaatta ctatatcgtc 660 acttattgcc actcatgtga cagcactctg aggctgtgca ttcattccac tgctaccgat 720 ctgcgcacac tgcagcagat gctgctggga acactgcagg tggtctgtcc aggatgtgcc 780 cgactgtgat aa 792 <210> 20 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pGX3007 insert HPV52 E6/E7 protein sequence <400> 20 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Glu Asp Pro Ala Thr Ser Gly Arg Thr Leu His Glu Leu 20 25 30 Cys Glu Val Leu Glu Glu Ser Val His Glu Ile Arg Leu Gln Cys Val 35 40 45 Gln Cys Lys Lys Glu Leu Gln Arg Arg Glu Val Tyr Lys Thr Asp Leu 50 55 60 Arg Ile Val Tyr Arg Asp Asn Asn Pro Tyr Gly Val Cys Ile Met Cys 65 70 75 80 Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Gln Tyr Ser 85 90 95 Leu Tyr Gly Lys Thr Leu Glu Glu Arg Val Arg Lys Pro Leu Ser Glu 100 105 110 Ile Thr Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Thr Pro Leu Glu Arg His Val 115 120 125 Asn Ala Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Met Gly Arg Trp Thr Gly Arg 130 135 140 Cys Ser Glu Cys Trp Arg Pro Arg Pro Val Thr Gln Val Arg Gly Arg 145 150 155 160 Lys Arg Arg Ser Arg Gly Asp Lys Ala Thr Ile Lys Asp Tyr Ile Leu 165 170 175 Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu His Gly Tyr Gly Gln Leu Gly 180 185 190 Asp Ser Ser Asp Glu Glu Asp Thr Asp Gly Val Asp Arg Pro Asp Gly 195 200 205 Gln Ala Glu Gln Ala Thr Ser Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Tyr Cys His 210 215 220 Ser Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Ile His Ser Thr Ala Thr Asp 225 230 235 240 Leu Arg Thr Leu Gln Gln Met Leu Leu Gly Thr Leu Gln Val Val Cys 245 250 255 Pro Gly Cys Ala Arg Leu 260 <210> 21 <211> 818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV genotype 16 E6-E7 DNA sequence <400> 21 gaattcgcca ccatggactg gacctggatc ctgttcctgg tggccgccgc cacacgggtg 60 cacagcttcc aggaccccca ggagagcggc agaaagctgc ctcagctgtg taccgagctg 120 cagaccacca tccacgacat catcctggag tgtgtgtact gtaagcagca gctgctgagg 180 agagaggtgt acgaccggga cctgtgtatc gtgtacaggg acggcaatcc ctacgccgtg 240 tgtgacaagt gcctgaagtt ctacagcaag atcagcgagt accggcacta ctgctacagc 300 ctgtacggca ccaccctgga gcagcagtac aacaagcccc tgtgtgacct gctgatccgg 360 tgtatcaact gccagaagcc cctgcagaga cacctggaca agaagcagcg gttccacaac 420 atcaggggca gatggaccgg cagatgtatg agctgctgcc ggagcagcag aaccagaagg 480 gagacccagc tgagaggccg gaagagaaga agccacggcg atacccccac cctgcacgag 540 tacatgctgg acctgcagcc tgagaccacc gatctgtacg gctacggcca gctgaatgac 600 agcagcgagg aggaggatga gatcgacggc cctgccggcc aggccgagcc cgacagagcc 660 cactacaaca tcgtgacctt ttgctgtaag tgtgacagca ccctgagact gtgcgtgcag 720 agcacccacg tggacatcag aaccctggag gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 780 tgtcccatct gctcccagaa accctgatga gcggccgc 818 <210> 22 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV genotype 16 E6-E7 protein sequence <400> 22 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Gln Asp Pro Gln Glu Ser Gly Arg Lys Leu Pro Gln Leu 20 25 30 Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val 35 40 45 Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Arg Asp Leu 50 55 60 Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys 65 70 75 80 Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser 85 90 95 Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp 100 105 110 Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Gln Arg His Leu 115 120 125 Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg 130 135 140 Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 155 160 Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu 165 170 175 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly 180 185 190 Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala 195 200 205 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 210 215 220 Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val 225 230 235 240 Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 245 250 255 Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 260 <210> 23 <211> 837 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV genotype 18 E6-E7 DNA sequence <400> 23 atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagcgccaga 60 ttcgaggacc ccaccaggag cggctacaag ctgcccgatc tgtgtaccga gctgaacacc 120 agcctgcagg acatcgagat cacctgtgtg tactgtaaga ccgtgctgga gctgaccgag 180 gtgttcgaga aggacctgtt cgtggtgtac agggacagca tcccccacgc cgcctgccac 240 aagtgtatcg acttctacag ccggatccgg gagctgagac actacagcga cagcgtgtac 300 ggcgataccc tggagaagct gaccaacacc ggcctgtaca acctgctgat ccggtgcctg 360 agatgccaga agcccctgct gagacacctg aacgagaagc ggcggttcca caacatcgcc 420 ggccactaca gaggccagtg ccacagctgc tgtaacaggg ccaggcagga gagactgcag 480 cggagaagag agacccaggt gaggggcagg aagagaagaa gccacggccc caaggccacc 540 ctgcaggata tcgtgctgca cctggagccc cagaatgaga tccccgtgga tctgctgggc 600 cacggccagc tgtccgacag cgaggaggag aacgacgaga tcgacggcgt gaatcaccag 660 cacctgcctg ccagaagagc cgagcctcag aggcacacca tgctgtgtat gtgctgtaag 720 tgtgaggccc ggatcgaact ggtggtggag agcagcgccg acgacctgag agccttccag 780 cagctgttcc tgaacaccct gagcttcgtg tgtccttggt gtgccagcca gcagtga 837 <210> 24 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV genotype 18 E6-E7 protein sequence <400> 24 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Ser Gly Tyr Lys Leu Pro 20 25 30 Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr 35 40 45 Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Lys 50 55 60 Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His 65 70 75 80 Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser 85 90 95 Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu 100 105 110 Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Leu Arg 115 120 125 His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg 130 135 140 Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln 145 150 155 160 Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly 165 170 175 Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn 180 185 190 Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gly His Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu 195 200 205 Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala 210 215 220 Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys 225 230 235 240 Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu 245 250 255 Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro 260 265 270 Trp Cys Ala Ser Gln Gln 275

Claims (11)

  1. 서열번호:18을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및,
    서열번호:18의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 상기 단편은 서열번호:10의 IgE 선도 서열이 없는 것인, 서열
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된, HPV31 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, HPV에 대항하여 면역 반응을 유도하는, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    서열번호:17; 및
    서열번호:17의 단편으로서, 상기 단편은 서열번호:10의 IgE 선도 서열이 없는 서열번호:18의 단편을 인코딩하는 것인, 단편
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, HPV31 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 HPV31 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 서열번호:9를 갖는 5' 말단에서의 선도 서열이 없는 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드인, 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드인, 조성물.
  6. 청구항 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, HPV의 적어도 하나의 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는, 약제학적 조성물.
  7. 청구항 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, HPV의 적어도 하나의 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는, 약제학적 조성물.
  8. 청구항 1의 조성물을 포함하여, HPV의 적어도 하나의 하위유형에 대항하여 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하는, 약제학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 조성물은 전기천공에 의해 상기 개체에게 도입되도록 제형화된 것인, 약제학적 조성물.
  10. 청구항 2의 조성물을 포함하여, HPV의 적어도 하나의 하위유형에 대항하여 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하는, 약제학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 전기천공에 의해 상기 개체에게 도입되도록 제형화된 것인, 약제학적 조성물.
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