CN102154325B

CN102154325B - 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途

Info

Publication number: CN102154325B
Application number: CN 201110000052
Authority: CN
Inventors: 楼觉人; 姜自军; 蔡蓓蓓; 仝光杰; 徐绎函
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: Shanghai to biotech Co., Ltd.
Priority date: 2011-01-01
Filing date: 2011-01-01
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2031-01-01
Also published as: CN102154325A

Abstract

本发明涉及针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途。具体地，本发明提供一种优化的适合毕赤酵母表达的人乳头瘤状病毒的主要衣壳蛋白L1(HPVL1)的编码序列，以及高效生产HPV L1的方法。优化后的主要衣壳蛋白L1基因非常适合酵母表达，具有高表达、高稳定的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得HPV L1蛋白以及自组装的病毒样颗粒。本发明还提供了含HPV的病毒样颗粒的疫苗组合物。

Description

针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途

技术领域

本发明涉及了基因工程和疫苗学领域。具体地，本发明涉及针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途。更具体地，本发明涉及优化的适合毕赤酵母表达的人乳头瘤状病毒的主要衣壳蛋白L1的编码序列，以及高效生产主要衣壳蛋白的方法。本发明还涉及由主要衣壳蛋白自组装形成的HPV的病毒样颗粒(HPVVLP)以及含HPV VLP的疫苗组合物。

背景技术

宫颈癌的发病率在最常见的妇女癌症中，尤其是发展中国家，排居第二。自从1983-1984年间发现HPV病毒感染与宫颈癌发生的相关性后，至今已经分离到了至少118种人乳头瘤状病毒，且现已被证实在肛生殖系统癌症中由HPV感染所诱发的癌症占3.7％。

在已被分离出的一百多种HPV病毒亚型中，已发现有15种具有诱导生殖系统癌症的发生因而被归为高危性HPV病毒亚型(例如HPV16，18，31，33，52和58)，其中HPV16和HPV18两种亚型在全世界占所有由HPV感染诱发宫颈癌的70％。继HPV16和HPV18之后，HPV52和HPV58在亚洲和非洲的具高患病率，占全世界宫颈癌发病率的2-3％。

目前的研究资料表明，在中国，宫颈癌的发生率居高不下，是对目前妇女健康威胁性最高的问题之一，尤其是在中国的农村地区。

中国地区的人乳头瘤状病毒的流行病学研究发现，中国地区HPV58病毒的检出率是仅次于HPV16病毒。

当然，人乳头瘤状病毒的患病率在整体人群中呈现病毒亚型特异性分布。在山西，广东和辽宁等地区，虽然HPV病毒型呈现不同分布特征，但是在这些地区中最常见的HPV病毒感染亚型为HPV16，其次分别为HPV58和HPV52。

在最近一项大规模中国妇女HPV病毒亚型分布数据分析表明，整体上HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亚型)在侵入性子宫颈癌(ICC)为82.7％，在高度鳞状上皮内病变(HSIL)中为88.5％和在低度鳞状上皮内病变(LSIL)为69.3％。在侵入性子宫颈癌ICC中，HPV16为最常见亚型，HPV18居于HPV16之后。在ICC病例中，居于HPV16、HPV18之后的为HPV58，HPV52和HPV31。

自HPV病原体被确认后，科学家们开始进行大量研究并发现，将HPV病毒样颗粒(VLPs)中的主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2构建进痘病毒内，两种蛋白表达后能自主组装成病毒样颗粒，其形态和免疫原性都与天然病毒颗粒相似。基于该发现，一些实验室和公司研制了含有HPVL1和/或L2及VLPs的单价或多价疫苗，并且发现：与L2相比，L1疫苗具有更强的抗原性和免疫原性。

含不同亚型或混合型HPV的VLPs/L1蛋白预防性疫苗已相继被成功研制并开始在临床实验上使用。其中美国默克公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的四价疫苗，英国的葛兰素史克公司研究出了含有HPV16和HPV18的两价疫苗，临床结果表明两种疫苗的安全性和有效性都较好。

虽然某些HPV亚型的VLPs/L1的制备已经成功，然而，对于某些亚型VLP的制备却极其困难。例如，出于某种未知的原因，迄今为止，本领域尚没有成功地工业化生产HPV52和HPV58亚型的L1蛋白/VLP的报道。

至今还没有人体对具有不同基因型的各HPV病毒亚型之间存在交叉反应的报道，因此针对某一病毒亚型的特异性疫苗通常只能使得接种者对该特定病毒亚型有预防效果。为使易感人群或患者具有针对抗一种以上病毒亚型(尤其是多种高危HPV)的预防免疫功能或治疗效果，则需对该人群联合施用针对几种相应的不同病毒亚型疫苗。因此，研制同时针对几种不同HPV亚型且适合在多种不同HPV亚型流行地域内使用的预防混合疫苗，将使接种的对象获得针对几种不同高危HPV病毒亚型的免疫力，从而预防和降低宫颈癌的发病率以及治疗宫颈癌患者的有效治疗。

就目前的HPV疫苗的生产工艺而言，大多采用大肠杆菌或酿酒酵母作为工程菌进行生产。其中，大肠杆菌的表达的L1蛋白没有被正确折叠和修饰，以包涵体的形式表达，因此要组装成病毒样颗粒L1蛋白需要经过变性和复性的过程，纯化工艺复杂。同时体外组装的病毒样颗粒的免疫原性低于真核表达并自主组装的病毒样颗粒。

用酿酒酵母生产HPV的VLP也存在一些明显的缺点。例如，在酿酒酵母中，外源的HPVL1基因存在于质粒中，而非染色体上，因此在培养或发酵生产过程中易发生质粒丢失。酿酒酵母易导致过度糖基化，从而导致所生产的VLP在某些个体中产生不利的过敏反应。酿酒酵母无法采用高密度发酵，另外培养基等原因导致发酵成本高，这些都造成生产成本居高不下。

因此，本领域迫切需要开发新的高效、简便、低成本地制备HPV的L1蛋白或VLP的方法，尤其是制备HPV52和HPV58的L1蛋白或VLP的方法，以便能够开发针对这些特定亚型的疫苗。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效表达和生产人乳头瘤状病毒HPV52的主要衣壳蛋白L1(HPV52L1)以及病毒样颗粒(HPV52VLP)的方法。

本发明的目的就是提供一种高效表达和生产人乳头瘤状病毒HPV58的主要衣壳蛋白L1(HPV58L1)以及病毒样颗粒(HPV58VLP)的方法。

本发明的另一目的是提供相应的编码序列、载体、宿主细胞以及表达和纯化的工艺。

在本发明的第一方面，提供了一种编码人乳头瘤状病毒的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列选自下组：

(a)编码人乳头瘤状病毒52的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的主要衣壳蛋白L1编码区与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有≥95％相同性，较佳地≥98％相同性，更佳地≥99％相同性；和

(b)编码人乳头瘤状病毒58的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的主要衣壳蛋白L1编码区与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列有≥95％相同性，较佳地≥98％相同性，更佳地≥99％相同性。

在另一优选例中，该编码人乳头瘤状病毒52的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，该编码人乳头瘤状病毒58的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

此外，本发明还提供了(c)编码人乳头瘤状病毒16的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的主要衣壳蛋白L1编码区与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列有≥95％相同性，较佳地≥98％相同性，更佳地≥99％相同性；和

(d)编码人乳头瘤状病毒18的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的主要衣壳蛋白L1编码区与SEQ ID NO：11所示核苷酸序列有≥95％相同性，较佳地≥98％相同性，更佳地≥99％相同性。

在另一优选例中，该编码人乳头瘤状病毒16的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在另一优选例中，该编码人乳头瘤状病毒18的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

在本发明的第二方面，提供了含有一种表达载体，它含有本发明第一方面中所述的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第二方面中所述的表达载体或者基因组中整合有本发明第一方面中所述的人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1的编码序列。

在另一优选例中，所述宿主细胞是通过转入本发明第二方面中所述的表达载体或第一方面中所述的核苷酸序列并经同源重组而形成的，从而在基因组或染色体中整合有人乳头瘤状病毒HPV(尤其是HPV52和/或HPV58)的主要衣壳蛋白L1的编码序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。

在本发明的第四方面，提供了一种生产人乳头瘤状病毒HPV(尤其是HPV52和/或HPV58)的主要衣壳蛋白L1的方法，它包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养本发明第三方面中所述的宿主细胞，从而表达人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1，其中所述的宿主细胞是毕赤酵母；

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的人乳头瘤状病毒HPV主要衣壳蛋白L1或由人乳头瘤状病毒HPV主要衣壳蛋白L1构成的病毒样颗粒

在另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1的编码序列。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。

在本发明的第五方面，提供了一种人乳头瘤状病毒HPV(尤其是HPV52和/或HPV58)的病毒样颗粒(VLP)，所述的病毒样颗粒是由重组表达的主要衣壳蛋白L1自组装构成。

在另一优选例中，所述的HPV52主要衣壳蛋白L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述的HPV58主要衣壳蛋白L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的HPV16主要衣壳蛋白L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述的HPV18主要衣壳蛋白L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

在另一优选例中，所述的主要衣壳蛋白L1是在毕赤酵母中重组表达的。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明第五方面中所述的人乳头瘤状病毒HPV的病毒样颗粒(VLP)和药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的病毒样颗粒包括HPV52VLP和/或HPV58VLP。

在另一优选例中，所述的药物组合物是疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物是单价疫苗或多价疫苗。

在另一优选例中，所述的多价疫苗含有HPV16、HPV18、HPV52和HPV58的病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述的多价疫苗是含有HPV16、HPV18、HPV52和HPV58的病毒样颗粒的四价疫苗。

在本发明的第七方面，提供了本发明第五方面中所述的人乳头瘤状病毒52的病毒样颗粒(VLP)的用途，它被用于制备预防和/或治疗宫颈癌的疫苗组合物；或用于制备预防人乳头瘤状病毒52感染的疫苗组合物。

此外，还提供了本发明第五方面中所述的人乳头瘤状病毒58的病毒样颗粒(VLP)的用途，它被用于制备预防和/或治疗宫颈癌的疫苗组合物；或用于制备预防人乳头瘤状病毒58感染的疫苗组合物。

在本发明的第八方面，提供了一种预防人乳头瘤状病毒HPV52感染的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用免疫有效量的本发明第五方面中所述的人乳头瘤状病毒HPV52的病毒样颗粒(VLP)或含所述VLP的疫苗组合物。

此外，还提供了一种预防人乳头瘤状病毒HPV58感染的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用免疫有效量的本发明第五方面中所述的人乳头瘤状病毒HPV58的病毒样颗粒(VLP)或含所述VLP的疫苗组合物。

此外，还提供了一种预防人乳头瘤状病毒感染的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用免疫有效量的本发明第五方面中所述的人乳头瘤状病毒HPV52、HPV58、HPV16、和HPV18的病毒样颗粒(VLP)或含所述VLP的多价疫苗组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了扩增HPV16L1，HPV18L1，HPV52L1和HPV58L1基因序列的结果。其中，Marker为分子量标准。

图2显示了pPIC3.5K质粒的图谱，其中Ampicillin为氨苄青霉素抗性基因，Kanamycin为卡那霉素抗性基因。

图3显示了酶切鉴定正确构建子的琼脂糖电泳分析结果。其中，各泳道如下：1：pPIC3.5K质粒；2：分子量标准；3：HPV16；4：HPV18；5：HPV52；6：HPV16。

图4显示了不同优化方法优化后的HPV52L1基因和天然HPV52L1基因在毕赤酵母中表达情况比较结果。其中，各泳道如下：

1：阴性酵母破菌上清；M：蛋白质分子量标准；2-5：SEQ ID NO：4序列构建的不同酵母菌种诱导后的破菌上清；6-9：SEQ ID NO：21序列构建的不同酵母菌种诱导后的破菌上清；10-13：SEQ ID NO：1序列构建的不同酵母菌种诱导后的破菌上清；14：SEQ ID NO：3序列构建的酵母菌种诱导后的破菌上清。

图5显示了不同优化方法优化后的HPV58L1基因和天然HPV58L1基因在毕赤酵母中表达情况比较结果。其中，各泳道如下：

1：阴性酵母破菌上清；M：蛋白质分子量标准；2-5：SEQ ID NO：22序列构建的酵母菌种诱导后的破菌上清；6-10：SEQ ID NO：5序列构建的酵母菌种诱导后的破菌上清；11-13：SEQ ID NO：8序列构建的酵母菌种诱导后的破菌上清；14：SEQ ID NO：7序列构建的酵母菌种诱导后的破菌上清。

图6显示了HPV52L1蛋白的POROS 50HS纯化SDS-PAGE(图6A)和Westernblotting(图6B)分析结果。其中，各泳道如下：A：阳离子纯化样品；B和C：阳离子纯化上样起始和结束时收集的流穿样品；M：蛋白质分子量标准；1-15：洗脱峰收集的样品。

图7显示了HPV58L1蛋白的POROS 50HS纯化SDS-PAGE(图7A)和Westernblotting(图7B)分析结果。其中，各泳道如下：M：蛋白质分子量标准；2-15：洗脱峰收集的样品。

图8显示了HPV52L1蛋白的凝胶过滤层析SDS-PAGE(图8A)和Western印迹分析(图8B)结果。其中，各泳道如下：A：阴性酵母破菌上清；B：蛋白分子量标准；1-5：第一峰收集的样品，每管10ml；6-13：第二峰收集的样品，每管10ml。图中指针所指的位置为HPV L1蛋白。

图9显示了HPV58L1蛋白的凝胶过滤层析SDS-PAGE(图9A)和Western印迹分析(图9B)结果。其中，各泳道如下：M：蛋白分子量标准；1-5：第一峰收集的样品，每管10ml；6-13：第二峰收集的样品，每管10ml。图中指针所指的位置为HPV L1蛋白。

图10显示了HPV52L1蛋白的CHT纯化SDS-PAGE(图10A)和Western blot分析(图10B)结果。其中，各泳道如下：1：凝胶过滤层析第一峰收集的样品；2和3：羟基磷灰石层析上样起始和结束时收集的流穿样品；M：蛋白质分子量标准；4-11：洗脱峰收集的样品。

图11显示了HPV58L1蛋白的CHT纯化SDS-PAGE(图11A)和Western blot分析(图11B)结果。其中，各泳道如下：1：凝胶过滤层析第一峰收集的样品；2和3：羟基磷灰石层析上样起始和结束时收集的流穿样品；M：蛋白质分子量标准；4-13：洗脱峰收集的样品。

图12显示了4种HPV病毒样颗粒的透射电镜照片。

图13显示了单价和四价疫苗小鼠血清中特异性抗体滴度比较柱状图。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，发现人乳头瘤状病毒HPV52和HPV58的主要衣壳蛋白L1用常规技术无法成功表达，其主要原因之一是天然基因序列未经合理的优化。本发明人对基因编码序列进行了针对性优化设计，将优化后的HPV52L1蛋白的编码序列(SEQ ID NO：1)或HPV58L1蛋白的编码序列(SEQ ID NO：5)转入合适的宿主毕赤酵母(P.pastoris)，从而实现了HPV52L1和HPV58L1的高水平分泌表达，在此基础上完成了本发明。

在本发明的生产工艺中，因为HPV52L1和HPV58L1的表达水平高，可大幅度提高产品得率，从而获得表达量高、自组装性能高、提纯方便、得率高和性状稳定的HPV L1蛋白以及自组装的VLP，因而大幅了降低生产成本，非常适合大规模生产。

术语

如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“VLP”或“VLPs”指通过体外基因重组技术获得的病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)，它具有天然病毒的外部结构但不包含病毒DNA/RNA，因此VLP在体内不会复制，提高了疫苗应用的安全性。同时，VLP具有极好的免疫原性。

如本文所用，术语“HPV52L1”和“HPV52VLP”分别指人乳头瘤状病毒HPV52的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。

如本文所用，术语“HPV58L1”和“HPV58VLP”指人乳头瘤状病毒HPV58的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。

如本文所用，术语“HPV16L1”和“HPV16VLP”指人乳头瘤状病毒HPV16的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。

如本文所用，术语“HPV18L1”和“HPV18VLP”指人乳头瘤状病毒HPV18的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。

如本文所用，术语“HPV L1”和“HPV VLP”指人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1和由该L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。

序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在酵母细胞中表达的HPV52L1蛋白的编码序列以及HPV58L1蛋白的编码序列。

HPV52L1的天然核苷酸序列是已知的(如SEQ ID NO：3所示)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

HPV58L1的天然核苷酸序列是已知的(如SEQ ID NO：7所示)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明人先根据毕赤酵母密码子偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下对HPV52L1或HPV58L1的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子偏爱性而获得的优化序列并不适合在毕赤酵母中表达。

因此，本发明人还根据其他因素进行了针对性的二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变基因中A+T组成、改变G+C含量、改变mRNA 5’及3’非翻译区(UTR)、和/或改变mRNA的二级结构及翻译起始密码子的AUG旁侧序列等。

经过测试和筛选，在众多修饰序列中获得了一个特别优化的HPV52L1编码序列。此优化的HPV52L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，与HPV52L1天然序列的同源性较低，仅约76.0％。本发明优化的HPV52L1编码序列仍然编码天然的HPV52L1蛋白。

经过测试和筛选，在众多修饰序列中获得了一个特别优化的HPV58L1编码序列。此优化的HPV58L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，与HPV58L1天然序列的同源性较低，仅约79.0％。本发明优化的HPV58L1编码序列仍然编码天然的HPV58L1蛋白。

本发明的优化的HPVL1编码序列可用常规方法获得，例如通过全基因合成。

工程菌的制备和发酵生产

本发明的发明点主要在于改构的HPV L1基因。至于将改构的HPV L1基因插入质粒、转化毕赤酵母、工程菌的筛选、工程菌的发酵、以及产物的分离等技术基本上按本领域已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件)。

通常，可在优化基因的5’端与3’端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方法，将优化基因克隆入表达载体(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体。利用常规方法(如G418抗性或Southern印迹法)选出高拷贝转化株，摇瓶表达选出高表达工程细胞。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut⁺)或慢速利用甲醇型(Mut^s)。

整合入毕赤酵母染色体(或基因组)中的HPV L1编码序列的拷贝数没有特别限制，可以为1-50个或更高，通常为2-30个。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于毕赤酵母生长、表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括(但并不限于)以下培养基：

YPD平板	酵母提取物	1％
			蛋白胨	2％
	葡萄糖	2％
			琼脂	1％
BMGY培养液	酵母提取物	1％
			蛋白胨	2％
	磷酸钾缓冲液，pH 6.0	100mM
			YNB	1.34％
	生物素	(4×10^-5)％
			甘油	1％
BMMY培养液	酵母提取物	1％
			蛋白胨	2％
	磷酸钾缓冲液，pH 6.0	100mM
			YNB	1.34％
	生物素	(4×10^-5)％
			甲醇	0.5％

此外，对于大规模生产HPV L1，可选择无机盐培养基，也可在无机盐培养基基础上进行一定更改，但所含离子成份宜与无机盐培养基相似。

无机盐发酵培养基	85％H₃PO₄	26.7ml/L
			CaSO₄·2H₂O	1.0g/L
	K₂SO₄	18.2g/L
			MgSO₄	7.27g/L
	KOH(固体)	4.13g/L
			PTM₁	4.35ml/L
	甘油	4％(w/v)

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，HPV L1的发酵及诱导温度保持在28-30℃。

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决。

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料。

(e)就诱导期甲醇浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常甲醇浓度控制在0.5-5％。

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为12-160小时，较佳地为24-120小时。

如果表达的HPV L1存在于培液上清，则发酵样品先以离心、过滤等方式去除细胞，获得含目的蛋白质HPV L1的发酵清液。如果表达的HPV L1存在于细胞内，则发酵样品先经破壁、离心、过滤等方式去除细胞碎片，获得含目的蛋白质的滤液。

含目的蛋白质的发酵清液或滤液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

经过上述纯化可得到HPVL1(尤其是HPV52L1和HPV58L1)纯品，纯化得率通常为20％以上，纯度95％以上，纯品得率约2-5mg/L培液，远高于现有技术中采用酿酒酵母表达HPV的水平(提高至少2-5倍)。此外，对于本发明毕赤酵母高水平表达的HPV L1，大多已经自组装形成病毒样颗粒(VLP)，因此不需复性。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组的HPV L1蛋白或由其自组装的病毒样颗粒，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有HPV52L1蛋白或HPV52VLP；或仅含有HPV58L1蛋白或HPV58VLP)，也可以是多价的(含有其他HPV亚型的L1蛋白或VLP)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明HPV L1蛋白或由其自组装的病毒样颗粒(VLP)。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如多肽、VLP或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组的HPV52L1或HPV58L1蛋白或自组装的病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的(仅含有HPV52L1蛋白或HPV52VLP或仅含有HPV58L1蛋白或HPV58VLP)，但优选是多价疫苗，即含有其他HPV亚型的L1蛋白或VLP。

一种优选的多价疫苗含有选自下组的HPV亚型的至少两种或多种L1蛋白或VLP：HPV16、HPV18、HPV52、HPV58、HPV31、HPV33和HPV6。

一种特别优选的疫苗是含有以下4种HPV亚型的VLP的四价疫苗：HPV16、HPV18、HPV52和HPV58。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗HPV感染。

在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质或VLP。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他亚型的HPV的免疫原(如病毒样颗粒)一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)优化后的主要衣壳蛋白L1基因非常适合毕赤酵母表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。

(2)含有优化的主要衣壳蛋白L1基因的毕赤酵母具有高密度生长的特性，非常适于大规模高密度的发酵生产。由于表达水平高，因此得率大幅度提高。

(3)与酿酒酵母相比，毕赤酵母的发酵培养基成本很低。

(4)外源基因被整合在毕赤酵母的染色体上，不易丢失。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.HPV52L1毕赤酵母表达系统的构建

1.目的基因的获得

优化序列：根据天然HPV52L1的氨基酸序列，根据以下因素进行优化设计：毕赤酵母密码子偏爱性、基因中A+T的组成、G+C含量、mRNA的二级结构及翻译起始密码子的AUG旁侧序列等。

一种优化的目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因编码HPV52L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。人工全合成该优化基因(SEQ IDNO：1)，并在其5’端与3’端分别引入NotI、EcoRI酶切位点。

对照序列1：野生型的HPV52L1基因(SEQ ID NO：3)，编码相同的HPV52L1蛋白。

对照序列2和3：仅根据毕赤酵母密码子偏爱性原则进行优化所产生的核苷酸序列(SEQ ID NO：4和21)，编码相同的HPV52L1蛋白。全合成对照序列，并在两端引入酶切位点。

2.表达质粒的构建及高表达工程细胞的获得

用全合成方法获得优化的主要衣壳蛋白L1基因，按照该优化合成的序列，设计并合成PCR引物(见表1)。均在上游引物引入EcoRI酶切位点，下游引物引入NotI位点。

以全合成的或天然的HPV的L1基因为模板，通过PCR扩增HPV52L1的编码序列(见图1)，用NotI/EcoRI双酶切后扩增产物后，插入相同酶酶切后的pPIC3.5K质粒(可购自Invitrogen公司，质粒图谱见图2)，取酶切鉴定以及测序正确的构建质粒(见图3)，获得质粒pPIC3.5K-HPV52L1(optimal)。。用类似方法，获得质粒pPIC3.5K-HPV52L1(control1)、pPIC3.5K-HPV52L1(control2)和pPIC3.5K-HPV52L1(control3)。

按照Invitrogen公司操作手册，选用Kpn2I限制性内切酶从质粒HIS4位置切开质粒。质粒经酚/氯仿抽提后浓缩至10ul.将80ul毕赤酵母感受态细胞和10ul浓缩后的质粒混匀后加到预冷的电击杯中。电击杯放置冰上5min，设置参数1500V/5ms电击，结束后加入1ml 1M山梨醇溶液至电击杯中。混匀后涂布至MD筛选平板上，置于28度培养箱培养3-5天。

待酵母单克隆长出后，挑取一定数量的单克隆按照顺序转接到另一块MD筛选培养基上，置于28度培养箱培养3天。

从MD平板上挑取单克隆，按照下列方法诱导，并用空质粒转化毕赤酵母KM71(可购自Invitrogen公司)作为胞内表达的背景对照。

1挑取单克隆，接种至50ml BMGY中，(250ml尖底离心管)，28度，250-300rpm，摇至OD600＝2-6(对数生长，大约16-18小时)。

2室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞。

3在25ml摇瓶中加入上述培养物10ml，加盖四层灭菌纱布，放入摇床继续生长。

4每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。

5诱导72小时后，离心收集酵母细胞。储存于-80度，直至开始检测。

6用Western blot方法来分析酵母细胞胞内目的蛋白表达情况。

诱导结束后，采用Western blot检测目的蛋白的表达，其中检测目的蛋白的一抗是抗HPV16L1的鼠源单克隆抗体(购自美国BD公司)，检测呈阳性的克隆就是转入了HPV52L1基因并整合到染色体的毕赤酵母克隆。不同优化序列和天然序列的诱导筛选结果如图4所示。泳道10-13中所示的是SEQ ID NO：1序列构建的4种不同酵母菌种诱导后的破菌上清，与对照相比，其HPV52L1表达量最高。

实施例2.HPV58L1毕赤酵母表达系统的构建

重复实施例1，不同点在于，用以下HPV58 L1的编码序列替换HPV52 L1的编码序列：

优化的HPV58 L1目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。该基因编码HPV58L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。人工全合成该优化基因(SEQID NO：5)，并在其5’端与3’端分别引入NotI、EcoRI酶切位点。

对照序列4：野生型的HPV58L1基因(SEQ ID NO：7)，编码相同的HPV58L1蛋白。

对照序列5和6：仅根据毕赤酵母密码子偏爱性原则进行优化所产生的核苷酸序列(SEQ ID NO：8和22)，编码相同的HPV58L1蛋白。全合成对照序列，并在两端引入酶切位点。

结果获得质粒pPIC3.5K-HPV58L1(optimal)。酶切鉴定见图3。用类似方法，获得质粒pPIC3.5K-HPV58L1(control4)、pPIC3.5K-HPV58L1(control5)、pPIC3.5K-HPV58L1(control6)。

不同优化序列和天然序列的诱导筛选结果如图5所示，其中泳道6-10中所示的是SEQ ID NO：5序列构建的5种不同酵母菌种诱导后的破菌上清，其HPV58L1表达量最高。

实施例3HPV52L1蛋白的发酵表达

挑选实施例1中的以下毕赤酵母克隆：野生型对照1(对应于图4泳道14)、对照2(泳道3)、对照3(泳道6)、以及优化序列(泳道10)，按Invitrogen的毕赤酵母发酵手册进行15升发酵罐的发酵。泳道10的克隆称为“毕赤酵母-HPV52L1”。

结果：在毕赤酵母中采用对照序列1(SEQ ID NO：3)时，HPV52 L1蛋白L1蛋白没有表达；采用对照序列2和3时(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：21)时，HPV52 L1表达量很低。与之相反，采用SEQ ID NO：1所示的优化序列时，表达的HPV52 L1蛋白表达量最高。

实施例4HPV58L1蛋白的发酵表达

挑选实施例2中的以下毕赤酵母克隆：野生型对照4(对应于图5泳道14)、对照5(泳道12)、对照6(泳道2)、以及优化序列(泳道7)，按Invitrogen的毕赤酵母发酵手册进行15升发酵罐的发酵。泳道7的克隆称为“毕赤酵母-HPV58L1”。

结果：在毕赤酵母中采用对照序列4(SEQ ID NO：7)时，HPV58 L1蛋白L1蛋白没有表达；采用对照序列5和6时(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：22)时，HPV58 L1表达量低。与之相反，采用SEQ ID NO：5所示的优化序列时，表达的HPV58 L1蛋白表达量最高。

实施例5 HPV52病毒样颗粒的纯化和制备

材料与方法

1培养基和缓冲溶液

酵母膏胨葡萄糖液体培养基：酵母膏胨葡萄糖粉末购于上海生工公司，按照说明书配制相应浓度的液体培养基；

发酵培养基：Breaking Buffer：100mM PB，400mM NaCl，pH7.1；

Buffer A：50mM MOPSNa，500mM NaCl，pH7.1；

Buffer B：50mM MOPSNa，1.5M NaCl，pH7.1；

Buffer C：50mM MOPSNa，1.25M NaCl，5mM NaP，0.03％Tween 80，pH7.1；

Buffer D：200mM NaP，1.25M NaCl，0.03％Tween 80，pH7.1。

215L发酵罐发酵表达HPV52 L1蛋白

挑取筛选的表达HPV52L1蛋白的毕赤酵母阳性克隆(毕赤酵母-HPV52L1)于50ml YPD培养基中，28℃，250rpm，过夜培养。然后将上述培养的酵母种子转接入500ml YPD培养基中，28℃，250rpm，过夜培养。最终将上述准备500ml酵母种子转接入已灭菌的含有4.5L发酵培养基的15L发酵罐中。按照Invitrigen毕赤酵母发酵手册描述的方法进行发酵，诱导72h。

3酵收集母菌体

用PALL公司的0.22μm UMP-1057中空纤维柱处理2L发酵液(菌体浓度为40％)。先按约1.67倍浓缩发酵液，然后采用等体积洗滤的方式交换缓冲溶液，使菌体中的缓冲溶液缓冲能力达到Breaking Buffer。处理后的样品用BreakingBuffer进行稀释使溶液中菌含量大约为20％，最终的体积大约为4L。

4高压均质机破碎酵母细胞

使用高压均质机破碎酵母细胞。上一步骤处理后的样品破碎前先用涡旋仪混合均匀。采用1200bar×2次破碎条件破碎酵母细胞。

5中空纤维微滤系统澄清破菌液

采用PALL公司中空纤维柱0.65μm UJP-1147R中空纤维处理4L料液。先将破菌液浓缩一定倍数之后，再缓慢加入缓冲溶液，保持此体积不变进行洗滤。

6阳离子交换层析

采用柱体积20ml的POROS 50HS强阳离子交换介质纯化上述澄清后的样品。用Breaking Buffer平衡柱子4-5柱体积，上样结束后用Buffer A清洗柱子，直到UV280平稳后，然后用Buffer B采用线性洗脱方式，洗脱10个柱体积。最后用100％Buffer B再洗脱两个柱体积。整个过程中运行速度为10ml/min。收集洗脱峰处每一份的样品，用SDS-PAGE/Western印迹分析。

7凝胶过滤层析

将阳离子交换的洗脱峰中含HPVL1纯度最高的每份样品集中，加入Tween 80至终浓度为0.03％，混匀后浓缩至20ml。用500ml柱体积Sepharose 4FF柱纯化浓缩后的样品，凝胶过滤缓冲溶液：50mM MOPSNa，1.25M NaCl，5mM NaP，0.03％Tween80，pH7.1。先用凝胶过滤缓冲溶液平衡分子筛柱子3-4个柱体积，然后通过AKTA(美国GE公司)上样环注入上述浓缩后的样品，整个过程运行速度为5ml/min。收集每一个峰，每管收集10ml，然后进行SDS-PAGE/Western印迹分析。

8羟基磷灰石层析

采用柱体积5ml的羟基磷灰石预装柱(美国伯乐公司)纯化凝胶过滤层析第一个峰的样品。用Buffer C平衡柱子4-5柱体积，上样结束后用Buffer C清洗柱子，直到UV280平稳后，然后用Buffer D采用线性洗脱方式，洗脱10个柱体积。最后用100％Buffer D再洗脱两个柱体积。整个过程中运行速度为2ml/min.收集洗脱峰处每一份的样品，用SDS-PAGE/Western印迹分析。

9病毒样颗粒的分析

采用透射电镜，激光动态散射仪和超速离心分析三种方法来验证分离获目的蛋白是否是病毒样颗粒。分离纯化的样品先吸附到铜网上，然后用2％磷钨酸负染，样品烘干后用JEM 2100(日本JEOL公司)投射电镜观察样品。

结果：

1.收集菌体

本实施例用中空纤维收集菌体。采用4倍体积的breaking buffer洗滤使菌体中的缓冲溶液达到breaking buffer缓冲能力和pH。浓缩阶段时间为0.21h，洗滤阶段时间为1.73h。

2.破菌液澄清

纯化样品是否澄清会影响下游纯化工艺。离心结合过滤膜过滤的方法澄清后的样品，浊度很高，存在大量脂类等不溶解杂质，对层析填料损伤很大，影响层析柱的载量和重复性。如果中试和工业规模应用这种处理方法，会导致纯化工艺重复性差，可能会造成不同批次终产品的纯度不同。本实施例使用PALL公司中空纤维柱UJP-1147R微滤膜过滤处理4L料液，按照2.5倍浓缩后2倍体积连续洗滤的顺序进行澄清实验，滤出液浊度为289NTU。滤出液的澄清度达到层析要求。

3病毒样颗粒的分离纯化

3.1阳离子交换层析

阳离子交换层的结果如图6所示，Western blotting图结果显示，所有蛋白峰中均有目的蛋白。SDS-PAGE图显示，从第6管开始杂蛋白减少，第6管开始的样品中目的蛋白在总蛋白中的含量较第1管至第5管中高，且杂蛋白更少。因此选择第6管开始的所有样品，浓缩至20ml，进行凝胶过滤层析。

3.2凝胶过滤层析

经凝胶过滤层析后的纯化结果如图8。从Western blotting结果以及分子筛层析图可以看出，两个蛋白峰中收集的样品中均含有目的蛋白。由于最终需要的产品是病毒样颗粒，第一个洗脱峰峰收集的样品是病毒样颗粒，第二个蛋白峰收集的样品中HPV52L1蛋白是没有组装完全的蛋白或是五聚体组装成比较小的病毒样颗粒，从而进入分子筛第二个峰中，无法与杂蛋白分离。

3.3羟基磷灰石层析

层析结果如图10所示。从SDS-PAGE和Western blotting图中上样和流穿目的蛋白分布情况可以得出，羟基磷灰石能特异性地吸附目的蛋白，羟基磷灰石纯化效果很好，能够去除凝胶过滤层析无法去除的杂蛋白，特别是分子量较大的蛋白。最终洗脱峰中目的蛋白得到浓缩同时纯度得到提高。经过三步纯化后的病毒样颗粒纯度达到了98％以上。SDS-PAGE显示的55KD的蛋白条带为完整L1蛋白的条带，显示的较小的条带为L1降解的条带。

4验证病毒样颗粒

采用透射电镜观察分离纯化得到的病毒样颗粒以及解开重新组装后的病毒样颗粒，结果见图12。从电镜结果可以看出，分离纯化获得的HPV病毒样颗粒大小不均一，颗粒直径分布在20nm至100nm之间，与HPV的VLP的颗粒直径分布相同。

实施例6HPV58病毒样颗粒的纯化和制备

重复实施例5，不同点在于：用菌株毕赤酵母-HPV58L1替换毕赤酵母-HPV52L1。

结果如图7、9、11和12所示。与HPV52VLP的结果类似，同样获得了HPV58VLP。分离纯化获得的HPV58病毒样颗粒大小不均一，颗粒直径分布也在20nm至100nm之间。

实施例7

HPV16L1和HPV18L1的制备以及VLP的制备

重复实施例1、3和5，不同点在于：用下表所示的本发明人优化的HPV16L1和HPV18L1的基因序列替换优化的HPV52L1基因，并用下表所示的相应引物替换扩增HPV52L1的引物。

表1 各HPV亚型的优化基因以及引物

结果，同样获得了HPV16L1和HPV18L1以及HPV16VLP和HPV18VLP，病毒样颗粒的照片如图12所示。

实施例8动物试验

材料与方法

1铝佐剂：

选用磷酸铝佐剂，Adju-Phos，购于Brenntag，浓度为20mg/mL，使用时用灭菌后的生理盐水稀释10倍。

2用于动物试验的病毒样颗粒的制备：

测量纯化后的病毒样颗粒蛋白浓度，测量结果为：HPV16 VLP和HPV52 VLP浓度为40μg/mL，HPV18 VLP和HPV58 VLP浓度为150μg/mL，直接用于下列单价和四价疫苗的制备。

3单价和四价疫苗的制备方法：

HPV16VLP和HPV52VLP的单价铝吸附物的制备方法：

取500μL样品，加入250μL灭菌过的生理盐水，再加入稀释过的2mg/mL的磷酸铝佐剂250μL，室温旋转搅拌1小时，4℃保存。

HPV18VLP和HPV5VLP的单价铝吸附物的制备方法：

取124μL样品，加入616μL灭菌过的生理盐水，再加入稀释过的2mg/mL的磷酸铝佐剂250μL，室温旋转搅拌1小时，4℃保存。

四价(HPV16VLP，HPV18VLP，HPV52VLP，HPV58VLP)铝吸附物的制备方法：

取500μL HPV16VLP样品，134μL HPV18VLP样品，500μL HPV52VLP样品和HPV58VLP样品，混匀后加入634μL灭菌过的生理盐水，再加入稀释过的2mg/mL的磷酸铝佐剂634μL，室温旋转搅拌1小时，4℃保存。

对照组铝吸附物的制备方法：

取750μL生理盐水，250μL稀释过的2mg/mL的磷酸铝佐剂250μL，混匀后4℃保存。

4动物试验

(1)免疫剂量

表2免疫方案

(2)免疫方案：第0和21天分别进行肌肉注射，两点注射，每点注射62.5ul疫苗，第35天小鼠眼球取血，按照2.5方法检测血清抗体。

5 ELISA检测血清抗体

(1)按照每孔100ng纯化的病毒样颗粒4℃过夜包板，然后用PBST清洗三次，然后用2％BSA 4℃过夜封闭酶标板。

(2)用PBST清洗酶标板三次，平板可放于-20℃保存，用于检测。

(3)用0.3％BSA按照下表中不同的稀释比，稀释各小鼠的血清，取100ul稀释后的血清加入到酶标板中，每种实验动物血清做三个复孔。空白组直接用100μl 0.3％BSA代替血清稀释液。阳性组一抗稀释液为100μl抗HPV16L1抗体。

(4)加入一抗稀释液或0.3％BSA后，放置于37℃烘箱中孵育1h，然后用PBST清洗酶标板三次。

(5)加入辣根过氧化氢酶标记的抗小鼠二抗，二抗用0.3％BSA稀释5000倍，每孔加入100μl，放置于37℃烘箱中孵育1h，然后用PBST清洗酶标板三次。

(6)显色：将A液和B液等比例混合，每孔各加100ul。振荡混匀，室温避光显色5-30分钟，加终止液100ul终止反应，酶标仪450nm读取光吸收值。

(7)血清中抗体滴度定义为：实验组ELISA读数与ELISA空白组度数之比大于2.1的血清最高稀释倍数。

结果

动物试验结果如下表所示：

表3 抗体滴度

动物试验结果显示：

免疫过HPV16VLP单价疫苗的小鼠组平均几何抗体滴度可以达到7241；

免疫过HPV18VLP单价疫苗的小鼠组平均几何抗体滴度可以达到47051；

免疫过HPV52VLP单价疫苗的小鼠组平均几何抗体滴度可以达到3880；

免疫过HPV58VLP单价疫苗的小鼠组平均几何抗体滴度可以达到35658；

免疫过四价疫苗的小鼠组抗HPV16VLP的平均几何抗体滴度可以达到13512，抗HPV18 VLP的平均几何抗体滴度可以达到33270，抗HPV52VLP的平均几何抗体滴度可以达到5487，抗HPV58VLP的平均几何抗体滴度可以达到40960。

从以上数据可以得出，单价疫苗和四价疫苗均能够激起小鼠强烈的体液免疫应答，血清中的特异性抗体滴度显著增加，混合后的四价疫苗中四种病毒样颗粒的免疫原性没有得到影响，同样可以激起小鼠强烈的体液免疫应答。

这表明，本发明的含四种病毒样颗粒的多价疫苗组合物可以用作预防宫颈癌的疫苗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种编码人乳头瘤状病毒的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列选自下组：

(a)编码人乳头瘤状病毒52的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的主要衣壳蛋白L1编码区如SEQ ID NO:1所示；和

(b)编码人乳头瘤状病毒58的主要衣壳蛋白L1的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的主要衣壳蛋白L1编码区如SEQ ID NO:5所示。

2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求2所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求1所述的人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1的编码序列。

4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，它是毕赤酵母(PichiaPastoris)。

5.一种生产人乳头瘤状病毒HPV52和/或HPV58主要衣壳蛋白L1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养如权利要求3所述的宿主细胞，从而表达人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白L1，其中所述的宿主细胞是毕赤酵母；

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的人乳头瘤状病毒HPV主要衣壳蛋白L1或由人乳头瘤状病毒HPV主要衣壳蛋白L1构成的病毒样颗粒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的人乳头瘤状病毒HPV52的主要衣壳蛋白L1的编码序列。