CN117187262A - 重组人乳头瘤病毒蛋白表达 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一类密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因,所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达重组人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子,其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。
Description
本申请是申请日为2014年2月18日,申请号为202010040941.3,发明名称为“重组人乳头瘤病毒蛋白表达”的发明专利的分案申请。
技术领域
本领域涉及分子生物学领域,具体而言,本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达的各种人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因,以及含有该人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因的载体,菌株,表达该基因的方法,及其用途。
背景技术
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播,引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变,被列为性传播疾病。1995年,国际癌症研究中心公布的研究结果证实,HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见,HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此,研制高效、廉价的HPV疫苗,对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。
目前已经确定的HPV型超过100种。采用灵敏的检测方法,可以从几乎100%的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系,将HPV分为低危型和高危型。HPV6、11、34、40、42等型多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中,属HPV低危型;而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以HPV16、18、31、33、35、39、45,52,58型感染更为多见,这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV 16、18型感染与宫颈癌的发生高度相关,较其他危险因素更密切。宫颈癌患者中,约50-60%是由HPV16感染引起,HPV18约占14%,HPV45占约8%,HPV31占约5%,其余型占23%(Walboomers JM.et al.J Pathol 1999;189:12-19)。
宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤,全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌,27万妇女死于此病,年龄标准化感染率达10.5%。早在80年代初,Haraldzur Hausen就发现人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的感染与宫颈癌发病有关,后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止,已发现了百余种HPV基因型,其中约40种可以感染生殖道粘膜。一个正常妇女一生中宫颈至少感染一种HPV的终生累计概率约为40%。
国内目前尚无系统的尖锐湿疣和HPV相关调查,但是各地区的分别调查基本可以说明HPV6、11在尖锐湿疣中的重要作用。近期的深圳地区的流行病学调查结果显示HPV6、11型感染者在尖锐湿疣患者中约占80%(数据来源:深圳市人民医院352例尖锐湿疣患者生殖道人乳头状瘤病毒基因亚型的分布及意义,唐敏;戴勇;吕晓萍;李体远;第三军医大学学报,2007年21期);临沂地区的调查结果HPV6、11型感染者在尖锐湿疣患者中占85.19%,(数据来源:108例尖锐湿疣患者HPV的基因分型及临床分析,熊瑛;社区医学杂志,2007年17期)。
HPV是无包膜二十面体对称病毒,其病毒基因组DNA为闭合环状,长度约7200-8000bp,由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF),编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa,为主要衣壳蛋白,以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构,在不同型别中氨基酸序列高度保守,能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小,多位于L1蛋白内部。
昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似,可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。
因此,鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守,并且能够单独表达形成VLP,以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过,以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题,其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中,往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载,野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。
因此,本领域中需要一种高水平表达基因的方法,所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV基因。
发明内容
为了解决上述技术问题,根据本发明的第一方面,提供了一种能够在毕赤酵母中表达的HPV基因,所述基因具有SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQID NO:8,SEQ ID NO:9或SEQID NO:10所示的核苷酸序列。
利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统,具有表达量高、操作简便、成本低等特点,并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一,在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候,往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此,本发明的经过密码子优化后的HPV基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水甲,更有利于针对HPV的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示,本发明的密码子优化过的HPV6,11,16,18,58基因在毕赤酵母中的表达量分别可最高达约134μg/mg,123μg/mg,135μg/mg,125μg/mg和132μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)。
根据本发明的第二方面,提供了一种在毕赤酵母中表达HPV L1基因的方法,包括下述步骤:
(1)将本发明的HPV L1基因分别各自克隆入表达载体中;
(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中;
(3)使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选,获得生长情况最好的一个或多个菌株;
(4)通过测试各HPV L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选,获得表达量最高的一个或多个菌株;
(5)使用步骤(4)所得的菌株进行表达,分别获得HPV L1蛋白。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(1)中所述的表达载体为pPICZαB载体,并且所述步骤(3)中使用的抗生素为Zeocin。。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵母X-33菌株。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(4)中测试HPV L1基因的表达量的操作是通过Western blot方法进行的。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(5)中的表达步骤为在发酵罐中进行的发酵步骤。
根据本发明的第三方面,提供了含有本发明的各HPV L1基因的表达载体。
根据本发明的一个具体实施方案,所述含有本发明的各HPV L1基因的表达载体来源于pPICZαB载体。
根据本发明的第四方面,提供了含有本发明的HPV L1基因或表达载体的毕赤酵母菌株,所述菌株能够高水平地表达生产各HPV L1蛋白,更利于针对HPV的预防性疫苗的研发与生产。
附图说明
图1显示了HPV6L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1:DL5000DNA Marker(Takara公司);2:BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-6L1样品1;3:BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-6L1样品2。
图2显示了HPV11L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1:DL5000DNA Marker(Takara公司);2:BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-11L1样品1。
图3显示了HPV16L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1:DL5000DNA Marker(Takara公司);2:pPICZαB-16L1样品1;3:pPICZαB-16L1样品2;4:BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-16L1样品1;BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-16L1样品2。
图4显示了HPV18L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1:DL5000DNA Marker(Takara公司);2:BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-18L1样品。
图5显示了HPV58L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1:BstBI+KpnI双酶切pPICZαB-58L1样品;2:DL5000DNA Marker(Takara公司)。
图6显示了破菌后的HPV6L1上清液Western-blot鉴定。1-8:重组表达菌株;9:PageRuler Prestained Protein Ladder;10:空宿主菌。
图7显示了破菌后的HPV11L1上清液Western-blot鉴定。1-8:重组表达菌株;9:PageRuler Prestained Protein Ladder;10:空宿主菌。
图8显示了破菌后的HPVl6L1上清液Western-blot鉴定。1-8:重组表达菌株;9:PageRuler Prestained Protein Ladder;10:空宿主菌。
图9显示了破菌后的HPV18L1上清液Western-blot鉴定。1:PageRuler PrestainedProtein Ladder;2-10:重组表达菌株。
图10显示了破菌后的HPV58L1上清液Western-blot鉴定。1:PageRulerPrestained Protein Ladder;2-5:重组表达菌株。
图11显示了HPV6L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-9:重组纯化蛋白样品;10:PageRuler Prestained Protein Ladder。
图12显示了HPV11L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1--4:重组纯化蛋白样品;5:PageRuler Prestained Protein Ladder;6-8:重组纯化蛋白样品。
图13显示了HPV16L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-7:重组纯化蛋白样品;8:PageRuler Prestained Protein Ladder。
图14显示了HPV18L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-4:重组纯化蛋白样品;5:PageRuler Prestained Protein Ladder;6-7:重组纯化蛋白样品。
图15显示了HPV58L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-5:重组纯化蛋白样品;6:PageRuler Prestained Protein Ladder;7-8:重组纯化蛋白样品。
图16显示了HPV6L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
图17显示了HPV11L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
图18显示了HPV16L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
图19显示了HPV18L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
图20显示了HPV58L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
序列说明
SEQ ID NO:1为野生型HPV6L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为野生型HPV11L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为野生型HPV16L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为野生型HPV18L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为野生型HPV58L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为本发明的HPV6L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7为本发明的HPV11L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8为本发明的HPV16L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9为本发明的HPVl8L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10为本发明的HPV58L1基因的核苷酸序列。
具体实施方式
通过以下实施例详细描述本发明,以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的,并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性,但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明,温度以℃为单位或者为环境温度,压力接近或等于大气压。除非另有说明,在下述各实施例中用到的限制性内切酶均购自New England Biolab公司。应当理解的是,除非另有说明,下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明,所使用的培养基均为市售可得的常规培养基,本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见,在本文中有可能使用各种通用的缩写,本领域技术人员完全能够理解其含义。
实施例
实施例1:HPVL1密码子优化设计
遗传密码有64种,但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的,每个氨基酸都由一个以上的密码子编码,同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平,本发明人根据野生型的HPV6L1氨基酸序列(Genebank CBY85547.1),HPV11L1氨基酸序列(Genebank CCE60515.1),HPV16L1氨基酸序列(Genebank AAC09292.1),HPV18L1氨基酸序列(Genebank AAP20601.1)和HPV58L1氨基酸序列(Genebank BAA31851.1)进行基因序列改造:对其所有的氨基酸基因全部采用使用频率最高和较高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1(参见http://www.kazusa.or.jp/codon/)。然后在此基础上,又为了避免翻译山来的mRNA的GC比例过高,mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点,本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正,例如将一些天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT,赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA,天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC,苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC,酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT,甘氨酸(Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA。改造后的HPVL1基因序列不含有以下内含子识别序列及转录因子结合位点:ATGACTCAT和TGACTA(转录因子GCN4结合位点);ATATAA(GAL4的结合位点);TATTTAA(TBP结合位点);TTAGTAA和TTACTAA(YAP1结合位点);ATGACTAAT;ACTAATTAGG。
由此,本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV L1基因的核苷酸序列,按照所述的序列全合成了HPV L1基因,将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中,通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株;利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达HPV L1蛋白。从中分别筛选出全新的HPV L1基因的核苷酸序列,可分别在毕赤酵母中高表达HPV L1蛋白,并在胞内同时形成病毒样颗粒(VLPs),破菌上清经过层析方法纯化后,纯化的病毒样颗粒纯度大于90%,吸附铝佐剂后,具有极高的免疫原性,可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的HPV L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQID NO:8,SEQ ID NO:9或SEQID NO:10所示。
表1Pichia酵母密码子表
实施例2:HPV L1重组表达载体构建
合成所得的HPV L1基因序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体(Invitrogen)。以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的HPV L1DNA片段,PCR引物。HPV6L1,正向引物:5’-CGATGGAACTTCGAAACGATGTGGAGACC-3’(BstBI)(SEQ ID NO:11);反向引物:5’-GACCTGGGTACCCTATTATCTCTTGGTTTTAG-3’(KpnI)(SEQ ID NO:12)。HPV11L1,正向引物:5’-CGATGGAACTTCGAAACGATGTGGAGACC-3’(BstBI)(SEQ ID NO:13);反向引物:5’-GACCTGGGTACCCTATTATTTCTTGG-3’(KpnI)(SEQ ID NO:14)。HPV16L1,正向引物:5’-CGATGGAACTTCGAAACGATGATGTCCTTG-3’(BstBI)(SEQ ID NO:15);反向引物:5’-GACCTGGGTACCCTATTAAAGCTTTC-3’(KpnI)(SEQ ID NO:16)。HPV18L1,正向引物:5’-CGATGGAACTTCGAAACGATGGCTTTGTGG-3’(BstBI)(SEQ ID NO:17);反向引物:5’-GACCTGGGTACCCTATTATTTTCTGGC-3’(KpnI)(SEQ ID NO:18)。HPV58L1,正向引物:5’-CGATGGAACTTCGAAACGATGTCCGTTTGG-3’(BstBI)(SEQ ID NO:19);反向引物:5’-GACCTGGGTACCCTATTATTTCTTAAC-3’(KpnI)(SEQ ID NO:20)。PCR程序:94℃5分钟,94℃ 30秒、55℃30秒、72℃1分50秒循环30次,72℃10分钟,10℃10分钟,运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extraction kit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约1500bp和3600bp片段。回收后HPVL1与pPICZalphaB以摩尔比为5∶1的比例用T4连接酶(Takara)16℃过夜连接,第二天连接产物转化入E.coli DH5 α,涂布于低盐LB平板(含25ug/mL Zeocin),37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒,双酶切(BstBI+KpnI)鉴定,琼脂糖电泳检测(图1)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存,重组载体分别命名为pPTCZ6L1,pPICZ11L1pPICZ16L1,pPICZ18L1和pPICZ58L1。
实施例3:HPV L1重组表达菌株构建与表达
以SacI线性化pPICZ6L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%2醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH20溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图6),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
以SacI线性化pPICZ11L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH20溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invi trogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图7),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
以SacI线性化pPICZ16L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH20溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图8),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
以SacI线性化pPICZ18L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%7醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH20溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图9),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
以SacI线性化pPICZ58L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH20溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图10),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
实施例4:HPV L1重组蛋白的发酵罐培养
从实施例3所得的表达HPV6L1的基因工程菌工作种子库,取1支菌种甘油冻存管,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSMl(K2SO4273g,MgSO4109g,CaSO4·2H2O17.6g,H3PO4400.5mL,KOH62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1∶15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O6.0g,NaI 0.008g,MnSO43.0g,NaMoO40.2g,H3BO30.02g,ZnSO420.0g,CoCl20.5g,FeSO4·7H2O65.0g,biotin0.2g,H2SO45.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
从实施例3所得的表达HPV11L1的基因工程菌工作种子库,取1支菌种甘油冻存管,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4273g,MgSO4109g,CaSO4·2H2O17.6g,H3PO4400.5mL,KOH62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1∶15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,D0(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O6.0g,NaI0.008g,MnSO43.0g,NaMoO40.2g,HaBO30.02g,ZnSO420.0g,CoCl20.5g,FeSO4·7H2O65.0g,biotin0.2g,H2SO45.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
从实施例3所得的表达HPV16L1的基因工程菌工作种子库,取1支菌种甘油冻存管,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4273g,MgSO4109g,CaSO4·2H2O17.6g,H3PO4400.5mL,KOH62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1∶15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O6.0g,NaI0.008g,MnSO43.0g,NaMoO40.2g,H3BO30.02g,ZnSO420.0g,CoCl20.5g,FeSO4·7H2O65.0g,biotin0.2g,H2SO45.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
从实施例3所得的表达HPV18L1的基因工程菌工作种子库,取1支菌种甘油冻存管,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4273g,MgsO4109g,CaSO4·2H2O17.6g,H3PO4400.5mL,KOH62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1∶15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O6.0g,NaI0.008g,MnSO43.0g,NaMoO40.2g,H3BO30.02g,ZnSO420.0g,CoCl20.5g,FeSO4·7H2O65.0g,biotin0.2g,H2SO45.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
从实施例3所得的表达HPV58L1的基因工程菌工作种子库,取1支菌种甘油冻存管,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4273g,MgSO4109g,CaSO4·2H2O17.6g,H3PO4400.5mL,KOH62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1∶15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O6.0g,NaI0.008g,MnSO43.0g,NaMoO40.2g,H3BO30.02g,ZnSO420.0g,CoCl20.5g,FeSO4·7H2O65.0g,biotin0.2g,H2SO45.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
实施例5:HPV L1蛋白纯化
收集的HPV6L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7Nacl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:将表达HPV6L1VLP的毕赤酵母细胞,按1∶5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mM MOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV6L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5nM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS,pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV6L1VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图11)。经过电镜(复旦大学化学系电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图16),结果显示颗粒直径在50-100nm之间。
收集的HPV11L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7Nacl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:将表达HPV11L1VLP的毕赤酵母细胞,按1∶5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5MNaCl,50mM MOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mMMOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV11L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS,pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6MNaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV11L1VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图11)。经过电镜(华东师范大学电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图17),结果显示颗粒直径在50-100nm之间。
收集的HPV16L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7NaCl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:将表达HPV16L1VLP的毕赤酵母细胞,按1∶5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mMMOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV16L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS,pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6MNaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV16L1VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图13)。经过电镜(华东师范大学电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图18),结果显示颗粒直径在50-100nm之间。
收集的HPV18L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7NaCl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:将表达HPV18L1VLP的毕赤酵母细胞,按1∶5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5MNaCl,50mMMOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPVl8L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5rmM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS,pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV18L1VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图14)。经过电镜(华东师范大学电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图19),结果显示颗粒直径在50-100nm之间。
收集的HPV58L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7NaCl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:将表达HPV58L1VLP的毕赤酵母细胞,按1∶5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mMMOPS,pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV58L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(B1O-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS,pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6MNaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV58L1VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图15)。经过电镜(中国科学院武汉病毒研究所分析检测中心)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图20),结果显示颗粒直径在50-100nm之间。
实施例6:本发明的HPVL1重组蛋白的表达量测定
本实施例根据Bradford法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa夹心法测得的HPVL1VLP的表达量,计算得到HPVL1VLP在破菌后总蛋白中的含量。具体步骤如下:
1.使用Bradford法测定发酵菌体破菌上清液中总蛋白含量
使用上海博彩生物科技有限公司市售的K4000Bradford protein quantitationreagent试剂盒进行测定。
在7支1.5ml EP管内一次加0μl,10μl,20μl,40μl,80μl,100μl BSA标准品(0.5mg/ml)和实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液40μl(稀释100倍),用水补足至总体积为100μl,混匀。每一浓度设3个平行样。每管加入900μl Bradford solution,立即混匀,室温放置10分钟后分别测定OD595光吸收值。根据6组BSA标准品作出蛋白浓度对吸光值标准曲线开计算得到线性方程式,再根据破菌上清液所得光吸收值与标准曲线线性方程式计算出发酵菌体破菌上清液的总蛋白含量。
2.用Elisa夹心法测定HPVL1VLP在发酵后菌体破菌上清液中的含量
使用纯化的HPVL1VLP做标准蛋白浓度曲线,诱导前的菌体作为阴性对照。
用包被液(1.6gNa2CO3,2.95g NaHCO3)将兔抗HPVL1VLP多抗稀释2000倍,然后向酶标板的各凹孔中各加入0.1ml稀释后的兔多抗,4℃过夜。移去包被液,用0.3ml PBST(PBS,pH7.0,0.05%Tween-20)洗涤凹孔,再用0.3ml封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。
用稀释液(PBS,pH7.0)以连续二倍稀释的方式,将实施例5中获得的纯化HPVL1VLP从浓度2μg/ml梯度稀释到0.0625μg/ml,以此作为标准样品。同时将实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍,然后分别向凹孔中加入0.1ml梯度稀释后的不同浓度的HPVL1VLP溶液或稀释后的破菌上清液,于37℃保温1小时后,移去抗原液,并用0.3ml PBST洗涤凹孔。然后用抗体稀释缓冲液(PBS,pH7.0,2%脱脂奶粉)将MAB885鼠抗HPV52L1VLP单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中,每孔加0.1ml,37℃保温1小时。移去单抗溶液,用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG0.1ml,37℃保温0.5小时。移去抗体溶液,并用0.3ml PBST洗涤凹孔,向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司),室温作用20分钟。向每个凹孔中加入0.05ml2M H2SO4终止液以终止反应,并用酶标比色仪测定OD450吸光值。
利用梯度稀释的HPVLIVLP的OD450的检测结果,制作标准蛋白浓度曲线,冉通过标准蛋白浓度曲线换算得HPVL1蛋白的发酵表达量。
本实施例的结果示于表2-6。
由表2可以看出,本发明的HPV6L1基因的表达量最高可达到134.1μg/mg(破菌上清液中的HPV6L1VLP/破菌上清液总蛋白)。
表2:本发明的HPV6L1基因的表达量
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由表3可以看出,本发明的HPV11L1基因的表达量最高可达到123.8μg/mg(破菌上清液中的HPV11L1VLP/破菌上清液总蛋白)。
表3:本发明的HPV11L1基因的表达量
由表4可以看出,本发明的HPV16L1基因的表达量最高可达到135.8μg/mg(破菌上清液中的HPV16L1VLP/破菌上清液总蛋白)。
表4:本发明的HPV16L1基因的表达量
由表5可以看出,本发明的HPV18L1基因的表达量最高可达到125.4μg/mg(破菌上清液中的HPV18L1VLP/破菌上清液总蛋白)。
表5:本发明的HPV18L1基因的表达量
由表6可以看出,本发明的HPV58L1基因的表达量最高可达到132.1μg/mg(破菌上清液中的HPV58L1VLP/破菌上清液总蛋白)。
表6:本发明的HPV58L1基因的表达量
实施例7:HPV L1疫苗制备
参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法,将实施例5中纯化获得的HPVL1蛋白,吸附磷酸铝佐剂,制备获得具有免疫原性的HPV疫苗。
实施例8:HPV L1基因表达产物免疫原性的测定
HPV6L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV6L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1∶1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1∶5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO450μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表7所示。三个检测组的转阳率结果如表8所示。
表7HPV6L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 | 1μg组 | 0.1μg组 | 0.01μg组 |
阳转率 | 100% | 100% | 12.5% |
表8HPV6L1转阳率结果
阴性平均值:0.007;Cutoff值:0.014
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
HPV11L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV11L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1∶1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1∶5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO450μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表9所示。三个检测组的转阳率结果如表10所示。
表9HPV11L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 | 1μg组 | 0.1μg组 | 0.01μg组 |
阳转率 | 100% | 100% | 25.0% |
表10HPV11L1转阳率结果
阴性平均值:0.007;Cutoff值:0.014
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
HPV16L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV16L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1∶1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1∶5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO450μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表11所示。三个检测组的转阳率结果如表12所示。
表11HPVl6L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 | 1μg组 | 0.1μg组 | 0.01μg组 |
阳转率 | 100% | 100% | 25.0% |
表12HPV16L1转阳率结果
阴性平均值:0.007;Cutoff值:0.014
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
HPV18L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV18L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1∶1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用棉释液1∶5000棉释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO450μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表13所示。三个检测组的转阳率结果如表14所示。
表13HPV18L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 | 1μg组 | 0.iμg组 | 0.01μg组 |
阳转率 | 100% | 100% | 12.5% |
表14HPV18L1转阳率结果
阴性甲均值:0.007;Cutoff值:0.014
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
HPV58L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV58L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1∶1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1∶5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO450μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表15所示。三个检测组的转阳率结果如表16所示。
表15HPV58L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 | 1μg组 | 0.1μg组 | 0.01μg组 |
阳转率 | 100% | 100% | 12.5% |
表16HPV58L1转阳率结果
阴性平均值:0.006;Cutoff值:0.012
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
综上所述,本发明提供的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因,具有以下优点:经过优化的基因适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白,而且能够满足工业化生产的要求;同时,本发明提供的人乳头状瘤病毒疫苗,能够自组装形成VLPs结构,纯化的VLPs吸附佐剂后,通过血清转阳率的测定,说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性,而且由于采用毕赤酵母表达系统,因此该方法具有以下优点:成本低,产量高,产品性质更加均一稳定。
Claims (8)
1.一种分离的基因,其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1,其特征在于,所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子,所述的基因具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10所示核苷酸序列。
2.一种表达载体,所述的表达载体中含有权利要求1所述的基因的序列。
3.一种基因工程化的宿主细胞,所述的细胞含有权利要求2所述的表达载体,或其基因组中整合有权利要求1所述的基因。
4.如权利要求3所述的宿主细胞,其特征在于,所述的细胞是毕赤酵母细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞,其特征是,所述毕赤酵母选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。
6.一种制备具有免疫原性的大分子的方法,该大分子的直径为50-80nm,主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1自我装配而成,其特征在于,所述方法包括:
(1)培养权利要求3所述的宿主细胞,从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1,并组装形成具有免疫原性的大分子;
(2)分离所述的具有免疫原性的大分子。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中包括:
(a)破碎步骤(1)获得的宿主细胞,获得含有具有免疫原性的大分子的上清液;和
(b)将步骤(a)获得的上清液依次采用离子交换柱层析和羟基磷灰石柱层析进行纯化,从而获得所述的具有免疫原性的大分子。
8.一种在毕赤酵母中表达HPV11、16、18和58L1基因的方法,包括下述步骤:
(1)将经密码子优化的HPV11、16、18和58L1基因克隆入表达载体中,所述的基因具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示核苷酸序列;
(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中;
(3)使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选,获得生长情况最好的一个或多个菌株;
(4)通过测试HPV11、16、18和58L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选,获得表达量最高的一个或多个菌株;
(5)使用步骤(4)所得的菌株进行表达,获得HPV11、16、18和58L1蛋白。
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