CN104745605B - 重组人乳头瘤病毒6和11亚型蛋白毕赤酵母表达 - Google Patents
重组人乳头瘤病毒6和11亚型蛋白毕赤酵母表达 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因,所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子,其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体而言,本发明涉及人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白,其编码基因,及其制备方法和用途。
背景技术
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播,引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变,被列为性传播疾病。1995年,国际癌症研究中心公布的研究结果证实,HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见,HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此,研制高效、廉价的HPV疫苗,对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。
国内目前尚无系统的尖锐湿疣和HPV相关调查,但是各地区的分别调查基本可以说明HPV6、11在尖锐湿疣中的重要作用。近期的深圳地区的流行病学调查结果显示HPV 6、11型感染者在尖锐湿疣患者中约占80%(深圳市人民医院352例尖锐湿疣患者生殖道人乳头状瘤病毒基因亚型的分布及意义,唐敏; 戴勇; 吕晓萍; 李体远; 第三军医大学学报,2007年 21期);临沂地区的调查结果HPV 6、11型感染者在尖锐湿疣患者中占85.19%,(108例尖锐湿疣患者HPV的基因分型及临床分析,熊瑛; 社区医学杂志, 2007年 17期)。
尖锐湿疣是最常见的性病之一,其发病率逐年上升,据统计,尖锐湿疣在我国年轻成人中患病率可达0.5%-1%,有些地区发病数占全部性病病人的20%-31%,而且按照流行病学的统计原则,实际患者数量至少是统计数量的3倍甚至更多。庞大的发病人群加上几乎空白的国内疫苗市场,针对尖锐湿疣的预防性疫苗有着巨大的市场前景。
尖锐湿疣是一种发生于肛门、生殖器等部位的性传播疾病。研究表明许多型别HPV的感染与尖锐湿疣发病相关,但国内外的流行病学研究结果显示以HPV6、11型最多见,相关度可高达90%以上。因此,研制HPV6、11型疫苗将起到良好的预防尖锐湿疣作用。
HPV是无包膜二十面体对称病毒,其病毒基因组DNA为闭合环状,长度约7200-8000bp,由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF),编码病毒衣壳蛋白L1、L2。L1蛋白分子量约55kDa,为主要衣壳蛋白,以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构,在不同型别中氨基酸序列高度保守,能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小,多位于L1蛋白内部。HPV直径约为45~55nm,呈球形,无包膜,衣壳为由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒,称为病毒样颗粒(VLPs)。
昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLPs)。L1单独表达得到的VLPs与天然病毒衣壳结构类似,可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。
因此,鉴于在不同基因型的L1蛋白内部高度保守,并且能够单独表达形成(VLPs),以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过,以表达重组病毒蛋白得到的VLPs作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题,其中第一个必须克服的困难就是重组病毒蛋白的表达水平。
尽管现有技术中已经开发了一些针对HPV的疫苗,然而普遍还存在HPV蛋白表达效率低下,表达获得的蛋白活性低,无法组装成病毒样颗粒或组装获得的颗粒免疫效果不理想等问题。因此,本领域还有必要开发改进的HPV疫苗产品。
发明内容
利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统,具有表达量高、操作简便、成本低等特点,并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一,在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候,往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此,本发明的经过密码子优化后的HPV6和11 L1基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平,更有利于针对HPV6和11的预防性疫苗的研发与生产。
根据本发明的第一方面,提供一种分离的基因,其编码人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1,所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子。
在优选的实施方式中,所述分离的基因为能够在毕赤酵母中表达的HPV6和11 L1基因,所述基因分别具有SEQ ID NO:2和4所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面,提供一种表达载体,所述的表达载体中含有所述的基因的序列。
在一优选的实施方式中,所述的表达载体是毕赤酵母表达载体。
在本发明的第三方面,提供一种基因工程化的宿主细胞,所述的细胞含有所述的表达载体,或其基因组中整合有所述的基因。
在一优选的实施方式中,所述表达载体含有本发明的HPV6或11 L1基因。
根据本发明的一个具体实施方案,所述含有本发明的HPV6或11 L1基因的表达载体来源于pPICZαB载体。
在本发明的第四方面,提供一种基因工程化的宿主细胞,所述的细胞含有所述的表达载体,或其基因组中整合有所述的基因。
在一优选的实施方式中,所述的细胞是毕赤酵母细胞。较佳地,所述的毕赤酵母菌株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168菌株。最佳的,所述的毕赤酵母菌株是毕赤酵母X-33。
在一优选的实施方式中,所述宿主细胞含有本发明的HPV6或11 L1基因或表达载体的毕赤酵母菌株,所述菌株能够高水平地表达生产HPV6或11 L1蛋白。
在本发明的第五方面,提供一种具有免疫原性的大分子(即病毒样颗粒),该大分子的直径为50-80nm,主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1自我装配而成,所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1是毕赤酵母表达的。
在一优选的实施方式中,所述的具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得:
(1) 培养所述的宿主细胞,从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1,并组装形成具有免疫原性的大分子;
(2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
在本发明的第六方面,提供一种制备所述的具有免疫原性的大分子的方法,所述方法包括:
(1) 培养所述的宿主细胞,从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1,并组装形成具有免疫原性的大分子;
(2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
在本发明的第七方面,提供一种具有免疫原性的组合物,所述的组合物中含有:
(i) 有效量的所述的具有免疫原性的大分子;和
(ii) 药学上可接受的载体。
在一优选的实施方式,所述的药学上可接受的载体包括至少一种免疫刺激剂或佐剂。
在一优选的实施方式中,所述的佐剂是铝佐剂。
在一优选的实施方式中,所述的组合物是疫苗。
在本发明的第八方面,提供所述的具有免疫原性的大分子的用途,用于预防或治疗人乳头状瘤病毒感染相关疾病。
在一优选的实施方式中,所述的人乳头状瘤病毒感染相关疾病选自:尖锐湿疣、肿瘤(如宫颈癌、阴道癌、肛门或肛周的癌症、口咽部的癌症、上颌窦癌、肺癌)或宫颈上皮内瘤样病变。
在本发明的第九方面,提供了一种在毕赤酵母中表达HPV6和11 L1基因的方法,包括下述步骤:
(1) 将本发明的HPV6或11 L1基因克隆入表达载体中;
(2) 将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中;
(3) 使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选,获得生长情况最好的一个或多个菌株;
(4) 通过测试HPV6或11 L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选,获得表达量最高的一个或多个菌株;
(5) 使用步骤(4)所得的菌株进行表达,获得HPV6 L1蛋白或HPV11 L1蛋白。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(1)中所述的表达载体为pPICZαB载体,并且所述步骤(3)中使用的抗生素为Zeocin。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵母X-33菌株。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(4)中测试HPV6和11 L1基因的表达量的操作是通过Western blot方法进行的。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(5)中的表达步骤为在发酵罐中进行的发酵步骤。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1展示了HPV6琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切结果,其中,泳道1为表达质粒,泳道2为DNA标记。
图2展示了HPV11琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切结果,其中,泳道1为表达质粒,泳道2为DNA标记。
图3为HPV6 L1纯化后病毒样颗粒SDS-PAGE电泳鉴定图,其中,泳道M为标记,泳道1,2,3,4为纯化后HPV6 L1蛋白样品。
图4为HPV11 L1纯化后病毒样颗粒SDS-PAGE电泳鉴定图,其中,泳道M为标记,泳道1,2,3,4为纯化后HPV11 L1蛋白样品。
图5为HPV6L1纯化后病毒样颗粒电镜照片。
图6为HPV11L1纯化后病毒样颗粒电镜照片。
具体实施方式
实施例1 HPV6和11 L1密码子优化设计
遗传密码有64种,但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的,每个氨基酸都由一个以上的密码子编码,同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平,本发明人对野生型的HPV6 L1基因(Genebank FR751337.1)和野生型的HPV 11 L1基因(Genebank HE611271.1)进行改造:对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1(参见http://www.kazusa.or.jp/codon/)。然后在此基础上,又为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高,mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点,本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正,例如将天冬酰胺(Asn)最高频率密码子AAC修正为AAT,赖氨酸(Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA,天冬氨酸(Asp)最高频率密码子GAT修正为GAC,苯丙氨酸(Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC,酪氨酸(Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT,甘氨酸(Gly) 最高频率密码子GGT修正为GGA。改造后的6L1和11L1基因序列不含有以下内含子识别序列及转录因子结合位点:ATGACTCAT和TGACTA(转录因子GCN4结合位点);ATATAA(GAL4的结合位点);TATTTAA(TBP结合位点);TTAGTAA 和TTACTAA(YAP1结合位点);CAAAAT(ATTTTG);ATGACTAAT;ACTAATTAGG。
由此,本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV 6和11 L1基因的核苷酸序列,按照所述的序列全合成了HPV 6和11 L1基因,将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中,通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株;利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达HPV 6 L1蛋白或HPV 11 L1蛋白。从中分别筛选出1种全新的HPV 6 L1基因的核苷酸序列和1种全新的HPV 11 L1基因的核苷酸序列,可分别在毕赤酵母中高表达两种HPV L1蛋白,并在胞内同时形成病毒样颗粒(VLPs),破菌上清经过层析方法纯化后,纯化的病毒样颗粒纯度大于90%,吸附铝佐剂后,具有极高的免疫原性,可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的HPV 6和11 L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
表1 Pichia酵母密码子表
然后,本发明利用上述2种全新的适于毕赤酵母表达的HPVL1基因的核苷酸序列,采用现有常规的分子生物学技术,构建了基因工程菌,并发酵培养工程菌,分离纯化得到重组的HPV 6 L1和HPV 11 L1蛋白。
根据野生型HPV6 L1氨基酸序列(GenBank:,SEQ ID NO:1)和毕赤酵母偏爱性密码子,合成6L1序列。将野生型HPV 6L1 DNA序列进行改造,所有密码子均采用毕赤酵母中使用频率较高的密码子,得到SEQ ID NO:2。
根据野生型HPV11 L1氨基酸序列(GenBank:,SEQ ID NO:3)和毕赤酵母偏爱性密码子,合成11L1序列。将野生型HPV 11L1 DNA序列进行改造,所有密码子均采用毕赤酵母中使用频较最高的密码子,得到SEQ ID NO:4。
实施例2 HPV6和11 L1重组表达载体构建
合成所得SEQ ID NO:2的HPV6 L1序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体(Invitrogen)。
以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的6 L1 DNA片段。PCR程序:94℃5分钟,94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分50秒循环30次,72℃10分钟,10℃10分钟,运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extraction kit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收1500bp和3600bp片段。回收后6L1与pPICZalphaB用T4 连接酶(Takara)16℃过夜连接,第二天连接产物转化入E.coli DH5α,涂布于LB平板(含25ug/ml Zeocin),37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒,双酶切(HindIII+KpnI)鉴定,琼脂糖电泳检测(图1)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存,此重组载体命名为pPICZ6L1。
合成所得SEQ ID NO:4的HPV11 L1序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体(Invitrogen)。
以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的11 L1 DNA片段。PCR程序:94℃ 5分钟,94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分50秒循环30次,72℃10分钟,10℃10分钟,运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extractionkit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收1500bp和3600bp片段。回收后11L1与pPICZalphaB用T4 连接酶(Takara)16℃过夜连接,第二天连接产物转化入E.coli DH5α,涂布于LB平板(含25ug/mlZeocin),37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒,双酶切(HindIII+KpnI)鉴定,琼脂糖电泳检测(图2)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存,此重组载体命名为pPICZ11L1。
实施例3 HPV6和11 L1重组表达菌株构建与表达
以SacI线性化pPICZ6L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀,电转毕赤酵母X-33株(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含200μg/mlZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mlZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于4ml YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定,所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的一株菌冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
以SacI线性化pPICZ11L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀,电转毕赤酵母X-33株(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含200μg/mlZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mlZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于4ml YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定,所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的一株菌冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
实施例4 HPV6和11 L1重组蛋白的发酵罐培养
从工作种子库取1支菌种甘油冻存管,即实施例3所得的表达HPV6 L1的基因工程菌,融化后吸取100μL接入5ml YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1~2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1ml接入500ml YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2~6。镜检无杂菌污染。
发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4 273g,MgSO4 109g,CaSO4 .2H2O 17.6g,H3PO4 400.5ml,KOH 62g,甘油600g,PTM1 60ml,泡敌1ml,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO100%,添加PTM1(CuSO4 .5H2O 6.0g,NaI0.008g,MnSO4 3.0g,NaMoO4 0.2g,H3BO3 0.02g,ZnSO4 20.0g,CoCl2 0.5g,FeSO4.7H2O65.0g,biotin 0.2g,H2SO4 5.0ml,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200ml/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mlPTM1)。补料两小时后改为300ml/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12ml PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30ml/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90ml/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。每8小时取一次样,WesternBlot检测。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
从工作种子库取1支菌种甘油冻存管,即实施例3所得的表达HPV6 L1的基因工程菌,融化后吸取100μL接入5ml YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1~2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1ml接入500ml YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2~6。镜检无杂菌污染。
发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4 273g,MgSO4 109g,CaSO4 .2H2O 17.6g,H3PO4 400.5ml,KOH 62g,甘油600g,PTM1 60ml,泡敌1ml,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO100%,添加PTM1(CuSO4 .5H2O 6.0g,NaI0.008g,MnSO4 3.0g,NaMoO4 0.2g,H3BO3 0.02g,ZnSO4 20.0g,CoCl2 0.5g,FeSO4.7H2O65.0g,biotin 0.2g,H2SO4 5.0ml,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200ml/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mlPTM1)。补料两小时后改为300ml/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12ml PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30ml/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90ml/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。每8小时取一次样,WesternBlot检测。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达400g/L。
实施例5 HPV6和11 L1蛋白纯化
将实施例4中收集的HPV6 L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.4MNaCl,0.05% Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:
将表达HPV6 L1 VLP的毕赤酵母细胞,按1:3加入清洗缓冲液(100mM PB pH7.0,0.15M NaCl)混合,充分混匀,于8000rpm,离心5min,收集细胞,重复以上操作二遍。
将清洗后的细胞按1:5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。
将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS 50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV6L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(40mM PB, 0.6M NaCl, 50mM MOPS pH6.5, 0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl, pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV6L1 VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图3)。经过电镜(上海华东师范大学电镜中心)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图5),结果显示颗粒直径在60-100nm之间。
将实施例4中收集的HPV11 L1菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.4MNaCl,0.05% Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:
将表达HPV11 L1 VLP的毕赤酵母细胞,按1:3加入清洗缓冲液(100mM PB pH7.0,0.15M NaCl)混合,充分混匀,于8000rpm,离心5min,收集细胞,重复以上操作二遍。
将清洗后的细胞按1:5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。
将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS 50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV11L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(40mM PB, 0.6M NaCl, 50mM MOPS pH6.5, 0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl, pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV11L1 VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图4)。经过电镜(上海华东师范大学电镜中心)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图6),结果显示颗粒直径在60-100nm之间。
实施例6 HPV6和11 L1蛋白检测
以纯化的HPV6 L1的VLPs做标准蛋白浓度曲线,以诱导前菌体做阴性对照,采用ELISA夹心法检测HPV6 L1基因在毕赤酵母中发酵表达量,具体步骤如下:
用包被液2000倍稀释HPV6 L1的 VLPs的兔多抗,向酶标板的凹孔中各加入0.1mL稀释后的兔多抗,于4℃过夜后,移去包被液,并用0.3mL PBST洗涤凹孔,然后用0.3mL封闭液于37℃保温2小时,进行封闭。
用稀释液以对倍稀释的方式,将纯化的HPV6 L1的VLPs从浓度2μg/mL梯度稀释到0.0625 μg/mL,同时将获得的发酵菌体的破菌上清分别稀释 200 倍,然后分别向凹孔中加入 0.1 mL梯度稀释后不同浓度的HPV6 L1的 VLPs 溶液或稀释后的破菌上清,于37℃保温1小时后,移去抗原液,并用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;然后用稀释缓冲液将MAB885鼠单抗(购自CHEMICON公司) 1000 倍稀释后加入到凹孔中,每孔各0.1 mL,37℃保温1小时后,移去单抗溶液后,用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;再向凹孔中加入用稀释缓冲液 5000 倍稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各0.1mL,在37℃保温0.5小时后,移去酶标液,并用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔后,向凹孔中各加入 0.1 mL DAB显色液,室温下作用20分钟后,向每个凹孔中加入0.05 mL 2 M H2SO4终止液以终止反应,并用酶标比色仪测定OD450 值。
利用梯度稀释的HPV6 L1 的VLPs的 OD450的检测结果,制作标准蛋白浓度曲线,再通过标准蛋白浓度曲线换算获得HPV6 L1 蛋白的发酵表达量,结果如表1所示,其中:
用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度,例如:2 μg/mL,1 μg/mL,0.5μg/mL,0.25 μg/mL,0.125 μg/mL,作为标准浓度,通过ELISA检测,用浓度做纵坐标,对应OD450检测值做横坐标,建立标准线性回归方程。
发酵破菌液上清稀释一系列倍数,例如50,100,200,400倍。测出的OD450值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为μg/mL),再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。由于破菌液是由菌泥湿重:破菌缓冲液=1:5配制的,所以发酵菌泥的目的蛋白表达量(单位为μg/g菌泥)为5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌泥/L发酵液),则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为μg/L发酵液)。
发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)=稀释倍数×标准目的蛋白浓度(μg/mL)×OD450(发酵破菌液上清)/ OD450(标准目的蛋白浓度);
发酵目的蛋白表达量浓度(μg/L发酵液)=5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)×发酵液菌体密度(g菌泥/L发酵液)。
表2. HPV6 L1 VLPs发酵表达结果
样品 | VLPs浓度(μg/mL) | 发酵密度(g/L) | 发酵表达量(mg/L发酵液) |
破菌液上清1 | 174 | 440 | 396 |
破菌液上清2 | 161 | 425 | 321 |
由表2的结果可见,本发明的HPV6 L1蛋白基因的优化序列,不仅能够在毕赤酵母中表达HPV6 L1蛋白,而且表达量较高,能够满足工业化生产的要求。
以纯化的HPV11 L1的VLPs做标准蛋白浓度曲线,以诱导前菌体做阴性对照,采用ELISA夹心法检测HPV11 L1基因在毕赤酵母中发酵表达量,具体步骤如下:
用包被液2000倍稀释HPV11 L1的 VLPs的兔多抗,向酶标板的凹孔中各加入0.1mL稀释后的兔多抗,于4℃过夜后,移去包被液,并用0.3mL PBST洗涤凹孔,然后用0.3mL封闭液于37℃保温2小时,进行封闭。
用稀释液以对倍稀释的方式,将纯化的HPV11 L1的VLPs从浓度2μg/mL梯度稀释到0.0625 μg/mL,同时将获得的发酵菌体的破菌上清分别稀释 200 倍,然后分别向凹孔中加入 0.1 mL梯度稀释后不同浓度的HPV11 L1的 VLPs 溶液或稀释后的破菌上清,于37℃保温1小时后,移去抗原液,并用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;然后用稀释缓冲液将MAB885鼠单抗(购自CHEMICON公司) 1000 倍稀释后加入到凹孔中,每孔各0.1 mL,37℃保温1小时后,移去单抗溶液后,用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;再向凹孔中加入用稀释缓冲液 5000 倍稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG各0.1mL,在37℃保温0.5小时后,移去酶标液,并用 0.3 mL洗涤液洗涤凹孔后,向凹孔中各加入 0.1 mL DAB显色液,室温下作用20分钟后,向每个凹孔中加入 0.05 mL 2 M H2SO4终止液以终止反应,并用酶标比色仪测定OD450 值。
利用梯度稀释的HPV11 L1 的VLPs的 OD450的检测结果,制作标准蛋白浓度曲线,再通过标准蛋白浓度曲线换算获得HPV11 L1 蛋白的发酵表达量,结果如表2所示,其中:
用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度,例如:2 μg/mL,1 μg/mL,0.5μg/mL,0.25 μg/mL,0.125 μg/mL,作为标准浓度,通过ELISA检测,用浓度做纵坐标,对应OD450检测值做横坐标,建立标准线性回归方程。
发酵破菌液上清稀释一系列倍数,例如50,100,200,400倍。测出的OD450值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为μg/mL),再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。由于破菌液是由菌泥湿重:破菌缓冲液=1:5配制的,所以发酵菌泥的目的蛋白表达量(单位为μg/g菌泥)为5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为μg/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌泥/L发酵液),则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为μg/L发酵液)。
发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)=稀释倍数×标准目的蛋白浓度(μg/mL)×OD450(发酵破菌液上清)/ OD450(标准目的蛋白浓度);
发酵目的蛋白表达量浓度(μg/L发酵液)=5×发酵破菌液上清目的蛋白浓度(μg/mL)×发酵液菌体密度(g菌泥/L发酵液)。
表3. HPV11 L1 VLPs发酵表达结果
样品 | VLPs浓度(μg/mL) | 发酵密度(g/L) | 发酵表达量(mg/L发酵液) |
破菌液上清1 | 158 | 411 | 365 |
破菌液上清2 | 167 | 434 | 342 |
由表3的结果可见,本发明的HPV11 L1蛋白基因的优化序列,不仅能够在毕赤酵母中表达HPV11 L1蛋白,而且表达量较高,能够满足工业化生产的要求。
实施例7 HPV6和11 L1 疫苗制备
参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法,将实施例5中纯化获得的L1蛋白,吸附铝佐剂,制备获得具有免疫原性的HPV6 L1 疫苗,HPV11 L1 疫苗,以及双价HPV6和11 L1疫苗。
实施例8 HPV6和11 L1基因表达产物免疫原性的测定
选取 6~8 周龄的 SPF 级 BALB/c 小鼠(上海斯莱克实验动物责任有限公司),分为4组,每组6只小鼠。A、B、C、D组分别用0.1 mL 浓度为3.13 μg/mL、0.63 μg/mL、0.12 μg/mL、0.02 μg/mL的吸附铝佐剂的HPV6 VLP蛋白(作为检测组)进行免疫,E组小鼠用0.1 mL含有铝佐剂的缓冲液(0.32M氯化钠, 0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组),分别于第0、14天皮下注射免疫,共免疫二次,第二次免疫后两周采血。将采集得到的血液于 37℃放置 2 h 后,4000g 离心10 min,吸取上清,即得到鼠多抗血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:
分别用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV6 L1至1 μg/mL,向酶标板每个凹孔中各加 0.1 mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3 mL PBST 洗涤凹孔。用0.3 mL封闭液(5%脱脂奶粉 + PBST)于37℃保温 2 小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:400稀释的被检血清(免疫过HPV6 L1和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各0.1mL,于 37℃保温1小时后移去血清液,用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 各0.1 mL,37℃保温0.5 小时后移去酶标液,用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;然后向凹孔中加入0.1 mL DAB 显色液,室温避光作用 20分钟后加 2 M H2SO4 0.05 mL终止液终止反应,并用酶标比色仪测定OD450值.。检测组的阳转率结果如表4所示。
表4. HPV6 L1鼠血清转阳率
选取 6~8 周龄的 SPF 级 BALB/c 小鼠(上海斯莱克实验动物责任有限公司),分为4组,每组6只小鼠。A、B、C、D组分别用0.1 mL 浓度为6.25 μg/mL、1.25 μg/mL、0.25 μg/mL、0.05 μg/mL的吸附铝佐剂的HPV11 VLP蛋白(作为检测组)进行免疫,E组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲液(0.32M氯化钠, 0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组),分别于第0、14天皮下注射免疫,共免疫二次,第二次免疫后两周采血。将采集得到的血液于 37℃放置 2 h 后,4000g 离心10 min,吸取上清,即得到鼠多抗血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:
分别用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV11 L1至1 μg/mL,向酶标板每个凹孔中各加 0.1 mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3 mL PBST 洗涤凹孔。用0.3 mL封闭液(5%脱脂奶粉 + PBST)于37℃保温 2 小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:400稀释的被检血清(免疫过HPV11 L1和铝佐剂的鼠血清和只免疫铝佐剂的鼠血清)各0.1 mL,于 37℃保温1小时后移去血清液,用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 各0.1 mL,37℃保温0.5 小时后移去酶标液,用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;然后向凹孔中加入0.1 mL DAB 显色液,室温避光作用 20 分钟后加 2 M H2SO4 0.05 mL终止液终止反应,并用酶标比色仪测定 OD450值。检测组的阳转率结果如表5所示。
表5. HPV11 L1鼠血清转阳率
选取 6~8 周龄的 SPF 级 BALB/c 小鼠(上海斯莱克实验动物责任有限公司),分为4组,每组10只小鼠。混合双价疫苗动物给药剂量如下:
表6. 动物给药剂量
其中C组小鼠用0.1 mL含有铝佐剂的缓冲液(0.32M氯化钠, 0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组),分别于第0、14天皮下注射免疫,共免疫二次,第二次免疫后两周采血。将采集得到的血液于 37℃放置 2 h 后,4000g 离心10 min,吸取上清,即得到鼠多抗血清,于- 20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:
分别用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV6或11 L1至1 μg/mL,向酶标板每个凹孔中各加 0.1 mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3 mL PBST 洗涤凹孔。用0.3 mL封闭液(5%脱脂奶粉 + PBST)于37℃保温 2 小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:400稀释的被检血清(免疫过HPV6或11 L1和铝佐剂的鼠血清,只注射铝佐剂的鼠血清,注射生理盐水的鼠血清)各0.1 mL,于 37℃保温1小时后移去血清液,用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔。然后向每凹孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG各0.1 mL,37℃保温0.5 小时后移去酶标液,用0.3 mL洗涤液洗涤凹孔;然后向凹孔中加入0.1 mL DAB 显色液,室温避光作用 20 分钟后加 2 M H2SO4 0.05 mL终止液终止反应,并用酶标比色仪测定 OD450值。检测组的阳转率结果如表7所示。
表7. 双价混合HPV6和HPV11 L1鼠血清转阳率
结论
综上所述,本发明提供的 6和11型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 Ll 基因是优化过的 Ll 基因,具有以下优点:经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白,而且能够满足工业化生产的要求;同时,本发明提供的6和11型人乳头状瘤病毒疫苗,能够自组装形成 VLPs 结构,纯化的 VLPs 吸附佐剂后,通过血清转阳率的测定,在小鼠体内产生较强的免疫原性,而且由于采用毕赤酵母表达系统,因此该方法具有以下优点:成本低,产量高,产品性质更加均一稳定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.一种分离的基因,其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1,其特征在于,所述基因的序列为SEQIDNO : 2所示核苷酸序列。
2.一种表达载体,所述的表达载体中含有权利要求1所述的基因的序列。
3.一种基因工程化的宿主细胞,所述的细胞含有权利要求2所述的表达载体,或其基因组中整合有权利要求1所述的基因。
4.如权利要求3所述的宿主细胞,其特征在于,所述的细胞是毕赤酵母细胞。
5.一种制备具有免疫原性的大分子的方法,该大分子的直径为 50- 80 nm,主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1 自我装配而成,其特征在于,所述方法包括:
( 1 ) 培养权利要求4所述的宿主细胞,从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1,并组装形成具有免疫原性的大分子;
( 2 ) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤( 2 )中包括:
( a ) 破碎步骤( 1 )获得的宿主细胞,获得含有具有免疫原性的大分子的上清液;和
( b ) 将步骤( a )获得的上清液依次采用POROS 50 HS 柱层析和CHT柱层析进行纯化,从而获得所述的具有免疫原性的大分子。
7.一种在毕赤酵母中表达HPV6 L1基因的方法,包括下述步骤:
(1) 将经密码子优化的HPV6 L1基因克隆入表达载体中,所述基因的序列为SEQIDNO :2所示核苷酸序列;
(2) 将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中;
(3) 使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选,获得生长情况最好的一个或多个菌株;
(4) 通过测试HPV6 L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选,获得表达量最高的一个或多个菌株;
(5) 使用步骤(4)所得的菌株进行表达,获得HPV6 L1蛋白。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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