CN114057892B

CN114057892B - 胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN114057892B
Application number: CN202111299040.7A
Authority: CN
Inventors: 张大生
Original assignee: Changsha Axybio Biotechnology Co ltd
Current assignee: Changsha Axybio Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2023-02-10
Anticipated expiration: 2041-11-04
Also published as: CN114057892A

Abstract

本发明属于生物科技领域，具体涉及胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白及其编码基因和应用。本发明包含放线杆菌apxIC和APXII融合基因的重组5型腺病毒载体，共表达放线杆菌apxIC和APXII融合基因。试验表明，融合放线杆菌apxIC和APXII融合基因的重组腺病毒载体rAd‑apxIC‑APXII，仅需要一次注射就能和灭活疫苗免疫两次一样，刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。本发明的重组腺病毒载体rAd‑apxIC‑APXII，和灭活苗相比，生产成本低，应激更小，可以作为预防和治疗放线杆菌的疫苗或者药物。

Description

胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物科技领域，具体涉及胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

猪接触传染性胸膜肺炎又称猪副溶血嗜血杆菌病或猪嗜血杆菌胸膜肺炎，是一种呼吸道传染病，以呈现肺炎和胸膜炎症状和病变为特征，可引起猪的格氏病。该病自1957年发现以来，已在世界广泛流行，且有逐年增长的趋势。随着集约化养猪业的发展，该病对养猪业的危害越显严重。死于该病的病猪，全身多淤血而呈暗红色，或有大面积的淤斑形成，其特征性病变主要局限于呼吸器官。最急性病例为眼观患猪流有血色样鼻液，气管和支气管腔内充满泡沫样血色黏液性分泌物。肺炎病变多发生于肺的前下部，而不规则的周界清晰的出血性实变区或坏死灶则常见于肺的后上部，特别是靠近肺门的主支气管周围。肺泡和肺间质水肿，淋巴管扩张，肺充血、出血和血管内纤维素性血栓形成。尤其是非洲猪瘟频繁发生以后，作为肺部感染性疾病的传染性胸膜肺炎对现代养猪业的危害更加严重。对该病采取早期治疗是提高疗效的重要手段。预防该病的有效方法是对无病猪场应防止引进带菌猪，在引进种猪前应用血清学试验进行检疫。

猪接触传染性胸膜肺炎的病原体以前称为胸膜肺炎嗜血杆菌(Haemophiluspleuropneumonia)，因其与林氏放线杆菌的DNA具有同源性，故于1983年将之列入放线杆菌属，称为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)。该菌为革兰氏阴性小杆菌，具有典型的球杆形态，能产生荚膜，但不形成芽孢，无运动性，其特性是在血液琼脂上具有溶血的能力。由于不同血清型菌株之间交互免疫性不强，因此，目前尚无有效的预防疫苗，一般可从当地分离病菌，制备灭活苗，对母猪和2～3月龄仔猪进行免疫接种。此法具有较好的地区性防疫作用。

传染性胸膜肺炎有15种血清型，研究发现其中以1、5、9、11型毒力较强，国内以1、2、3、7型较为常见。由于胸膜肺炎放线杆菌极易产生耐药性，疫苗接种是防控本病的主要措施。目前，国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病。但由于放线杆菌血清型较多,灭活疫苗的保护效果十分有限。研究表明，通过分子生物学手段构建的一些放线杆菌弱毒疫苗和新兴起的一种ghosts疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有明显提高，但这两种疫苗也存在一些问题，弱毒疫苗随着毒力降低，其免疫原性也有所降低，且存在毒力返强的可能性，而ghosts疫苗则存在菌体裂解不彻底等缺点。以天然提取的放线杆菌毒力因子为组份的亚单位疫苗则不存在上述缺点，且这种疫苗能诱导产生很好的免疫保护，但就其制备方法而言，存在着提取成本高、产量低和不适于大量生产等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白。

本发明的再一目的在于提供上述融合蛋白的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体，特别是重组5型腺病毒载体。

本发明的再一目的在于提供上述重组5型腺病毒载体的应用。

根据本发明具体实施方式的胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MVLGQIAWLWANSPMHRNWSVSLLMKNVIPAIENDQYLLLVDDGFPIAYCSWAKLTLESEARYVKDTNSLKIDDWNAGDRIWIIDWIAPFGDSSLLYKHMRQRFPYDIGRAIRIYPSKKDTGKIIYLKGGKITKKVAEKTFLQYEQELITALQGGGGSGGGGSGGGGSMSKITLSSLKSSLQQGLKNGKNKLNQAGTTLKNGLTQTGHSLQNGAKKLILYIPQGYDSGQGNGVQDLVKAANDLGIEVWREERSNLDIAKTSFDTTQKILGFTDRGIVLFAPQLDNLLKKNPKIGNTLGSASSISQNIGKANTVLGGIQSILGSVLSGVNLNELLQNKDPNQLELAKAGLELTNELVGNIASSVQTVDAFAEQISKLGSHLQNVKGLGGLSNKLQNLPDLGKASLGLDIISGLLSGASAGLILADKEASTEKKAAAGVEFANQIIGNVTKAVSSYILAQRVASGLSSTGPVAALIAS

本发明还提上述胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：

ATGgtattgggacaaattgcttggttatgggcaaattctccaatgcaccgaaattggtcagtttcactgttaatgaagaatgttattcctgcaattgaaaatgaccaatatttgttactagttgatgatggttttcctattgcatattgcagttgggccaaattaactctagagagtgaggctcgctatgtaaaggacaccaattcattaaaaatagatgattggaatgcaggagatcgtatatggatcattgattggattgccccattcggggattcatctctattgtataaacatatgagacaacgttttccatacgatattggaagggcaattagaatctatcctagcaaaaaagatactggaaaaatcatatatttaaaaggaggaaaaataacaaaaaaagtagctgaaaagacatttcttcagtatgagcaagagttaataacagctctacaaGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTatgtcaaaaatcactttgtcatcattaaaatcgtccttacaacaaggattgaaaaatgggaaaaacaagttaaatcaagcaggtacaacactgaagaatggtttaactcaaactggtcattctctacagaatggggctaaaaaattaatcttatatattcctcaaggctatgattcgggtcaaggaaatggagttcaagatttagttaaagctgctaatgatttaggtattgaagtatggcgagaagaacgcagcaatttggacattgcaaaaactagctttgatacaactcagaaaattctaggttttactgatagaggaattgtattatttgcacctcagctagataatttattaaagaagaatcctaaaattggcaatacattaggaagtgcttctagcatctcacaaaatataggtaaagccaatactgtattaggtggtattcaatctattttaggatctgttttatctggagtaaatctgaatgaattacttcaaaataaagatcctaatcaattagaacttgcaaaagcagggctagaactgactaatgaattagttggtaatattgctagctcggtgcaaactgtagatgcatttgcagaacaaatatctaaactaggttcacatttacagaatgtgaaaggattaggaggattgagtaataaattacaaaatctaccagatctaggaaaagcaagtttaggtttggacattatctctggtttactttctggagcatctgcaggtctcattttagcagataaagaggcttcaacagaaaagaaagctgccgcaggtgtagaatttgctaaccaaattataggtaatgtaacaaaagcggtctcatcttacattcttgcccaacgagtcgcttcaggtttgtcttcaactggtcctgtcgctgcattaatcgcatctac。

传染性胸膜肺炎有15种血清型，其中以1、5、9型毒力较强，国内以1、2、3、7型较为常见。为了保证与胸膜肺炎放线杆菌1、2、3、4、5、7、8、15等血清型的基因序列一致性，以提高对所有放线杆菌基因型的感染，本发明选择将胸膜放线杆菌的ApxIIC和ApxII基因进行融合表达，从而实现ApxIIC和ApxII融合基因表达的蛋白免疫动物产生的抗体理论上能保护动物免受几乎所有放线杆菌基因型的感染。

其中，胸膜肺炎放线杆菌的ApxIIC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

gtattgggacaaattgcttggttatgggcaaattctccaatgcaccgaaattggtcagtttcactgttaatgaagaatgttattcctgcaattgaaaatgaccaatatttgttactagttgatgatggttttcctattgcatattgcagttgggccaaattaactctagagagtgaggctcgctatgtaaaggacaccaattcattaaaaatagatgattggaatgcaggagatcgtatatggatcattgattggattgccccattcggggattcatctctattgtataaacatatgagacaacgttttccatacgatattggaagggcaattagaatctatcctagcaaaaaagatactggaaaaatcatatatttaaaaggaggaaaaataacaaaaaaagtagctgaaaagacatttcttcagtatgagcaagagttaataacagctctacaa

胸膜肺炎放线菌ApxII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

atgtcaaaaatcactttgtcatcattaaaatcgtccttacaacaaggattgaaaaatgggaaaaacaagttaaatcaagcaggtacaacactgaagaatggtttaactcaaactggtcattctctacagaatggggctaaaaaattaatcttatatattcctcaaggctatgattcgggtcaaggaaatggagttcaagatttagttaaagctgctaatgatttaggtattgaagtatggcgagaagaacgcagcaatttggacattgcaaaaactagctttgatacaactcagaaaattctaggttttactgatagaggaattgtattatttgcacctcagctagataatttattaaagaagaatcctaaaattggcaatacattaggaagtgcttctagcatctcacaaaatataggtaaagccaatactgtattaggtggtattcaatctattttaggatctgttttatctggagtaaatctgaatgaattacttcaaaataaagatcctaatcaattagaacttgcaaaagcagggctagaactgactaatgaattagttggtaatattgctagctcggtgcaaactgtagatgcatttgcagaacaaatatctaaactaggttcacatttacagaatgtgaaaggattaggaggattgagtaataaattacaaaatctaccagatctaggaaaagcaagtttaggtttggacattatctctggtttactttctggagcatctgcaggtctcattttagcagataaagaggcttcaacagaaaagaaagctgccgcaggtgtagaatttgctaaccaaattataggtaatgtaacaaaagcggtctcatcttacattcttgcccaacgagtcgcttcaggtttgtcttcaactggtcctgtcgctgcattaatcgcatctac

胸膜肺炎放线菌ApxIIC基因与ApxII基因通过序列GGT GGC GGT GGC TCG GGCGGT GGT GGA TCT GGT GGC GGC GGA TCT连接，该序列编码的连接肽的氨基酸序列为“GGGGSGGGGSGGGGS”。

本发明还提供包含上述融合蛋白基因的重组表达载体，特别是重组5型腺病毒载体。

本发明在上述融合蛋白基础上，采用5型腺病毒作为载体，将放线杆菌的ApxIIC和ApxII毒力因子融合基因克隆到腺病毒表达载体，制备含有放线杆菌ApxIIC和APXII融合基因的重组5型腺病毒载体(具有肺部靶向性)，在肺部表达目的蛋白刺激机体产生特异性的抗体，起到很好的免疫效果。

本发明还提供重组表达载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白的编码基因；

(2)将步骤(1)所得的融合基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒上；

(3)用步骤(2)所得的腺病毒穿梭质粒和腺病毒包装质粒，共转染细胞；

(4)收集细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，获得放线杆菌apxIIC-APXII重组腺病毒粗提液。

根据本发明具体实施方式的重组表达载体的制备方法，步骤(2)中所述腺病毒穿梭载体质粒为pDC316。

步骤(3)中，腺病毒包装载体为pBHGlox(delta)E13Cre。

步骤(3)中，转染的细胞为HEK293细胞或猪的肺泡巨噬细胞。

具体的，本发明的重组5型腺病毒载体的制备方法包括以下步骤：

(1)人工合成放线杆菌apxIIC和APXII融合基因，将该基因亚克隆到腺病毒穿梭载体pDC316质粒上XhoI和HindIII限制性内切酶位点之间，获得重组穿梭质粒pDC316-apxIIC-APXII；

(2)将pDC316-apxIIC-APXII重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E13Cre共转染到HEK293细胞中；

(3)待细胞变圆脱落后，收集细胞上清和沉淀，离心，上清保存作为毒种；细胞反复冻融三次后，离心，收集上清，测定病毒滴度；命名为重组腺病毒rAd-apxIIC-APXII。

本发明还提供上述融合蛋白、重组表达载体在制备猪接触传染性胸膜肺炎疫苗或药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明选择E3基因缺失的腺病毒载体5型(Ad5)，将放线杆菌apxIIC和APXII融合基因克隆到pDC316穿梭载体，和腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E13Cre共转染HEK293细胞，获得携带放线杆菌apxIIC和APXII融合基因的重组5型腺病毒载体rAd-apxIIC-APXII，该种载体在纯化后可以安全使用，体内表达蛋白的周期可长达4周以上；能够刺激更强的细胞和体液免疫应答，产生特异性放线杆菌apxIIC和APXII抗体。

本发明选用腺病毒载体5型做载体，将基因递送到肺部表达蛋白，持续产生抗体。利用本发明腺病毒制成的疫苗只需要注射一次，不需要注射两次，减少兽医人员的工作量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示pDC316-apxIIC-APXII质粒和双酶切结果，其中，1:pDC316-apxIIC-APXII质粒；2:pDC316-apxIIC-APXII质粒XhoI和HindIII双酶切结果；M(DNA MARKER)：250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,8000,12000；

图2显示琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，其中，1：pDC316-apxIIC-APXII质粒，2：pBHGlox(delta)E13Cre质粒，3：M(DNA MARKER：100,250,500,750,1000,2000；

图3显示pDC316-RFP转染组的HEK293细胞能够产生红色荧光；

图4显示细胞培养上清和细胞沉淀裂解产物中病毒的APXII基因荧光定量PCR检测结果；

图5显示免疫印迹测定apxIIC-APXII融合蛋白的抗原抗体反应结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实验材料

基因、载体和细胞：重组腺病毒包装载体系统，pDC316穿梭质粒与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E13Cre；HEK293细胞、大肠杆菌DH5α由长沙爱科博生物科技有限公司实验室保存。

主要试剂：EcoRI、Xho I、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；转染试剂Lipo2000购自Invitrogen公司。DMEM/High Glucose细胞培养基；胰酶溶液购自Hyclone公司；胎牛血清FBS购自Gibco公司；青霉素/链霉素溶液购自Gibco公司。其余试剂均为进口或者国产分析纯。

实施例1pDC316-apxIIC-APXII质粒的构建和真核表达

1.1合成放线杆菌apxIIC-APXII融合基因(如SEQ ID NO.2所示)，将apxIIC-APXII融合基因克隆到puc57载体上，转化到top10大肠杆菌，克隆命名为puc57-apxIIC-APXII。

1.2用引物F/R扩增puc57-apxIIC-APXII质粒中的apxIIC-APXII基因，

F：5'-CGT TCT CGA GAC CAT GGT ATT GGG ACA AAT TG-3'，

R：5'-CGG GGA ATT CTC AGT AGA TGC GAT TAA TGC AG-3'。

将其亚克隆到pDC316载体中的XhoI和HindIII酶切位点中，转化到Top10大肠杆菌，阳性克隆命名为pDC316-apxIIC-APXII。

1.3pDC316-apxIIC-APXII双酶切鉴定的反应体系：pDC316-apxIIC-APXII，6μL；Hind III，1μL；Xho I，1μL；10*Buffer，2μL；H2O，10μL。总共20μL体系。对以上酶切体系放到37℃水浴反应30min后，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，双酶切结果见1。由图可以看出，得到了预期大小的目的片段。

1.4pDC316-apxIIC-APXII和pBHGlox(delta)E13Cre质粒提取

采用中提试剂盒提取pDC316-apxIIC-APXII和pBHGlox(delta)E13Cre的质粒，质粒提取后进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见附图2。由图可以看出，提出的质粒浓度和纯度能够达到转染的要求。

1.5融合蛋白apxIIC-APXII的真核表达

(1)在10cm培养皿里接种1×10⁶个HEK293细胞，培养到细胞长满皿底大约80-90％。

(2)使用lipo2000脂质体进行转染：分别取pDC316-apxIIC-APXII质粒或pDC316-RFP(pDC316-RFP能产生红色荧光，作为阳性对照来监控转染效率)5μg到0.5mL无血清的DMEM培养基中，同时取按10μL lipo2000加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中室温静置10min；

(3)将步骤(2)中含质粒的溶液分别逐滴加入到含lipo2000的溶液中，混匀，室温静置15min；

(4)将步骤(3)溶液加入到HEK293细胞中，6小时换含10％FBS的DMEM完全培养基继续培养；

(5)观察pDC316-RFP转染组的HEK293细胞是否产生红色荧光。转染后48小时，pDC316-RFP组能看到很强的红色荧光，结果见图3。说明转染效果非常好；

(6)收集pDC316-apxIIC-APXII质粒转染组的细胞上清(含有真核表达的apxIIC-APXII融合蛋白)备用。

实施例2包装重组5型腺病毒rAd-apxIIC-APXII

2.1包装重组5型腺病毒rAd-apxIIC-APXII

(1)在10cm培养皿里种1×10⁶个HEK293细胞，培养到细胞铺满皿底大约80-90％；

(2)使用lipo2000脂质体进行转染：取pDC316-apxIIC-APXII质粒1μg和pBHGlox(delta)E13Cre的质粒3μg加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中，同时取按10μL lipo2000加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中室温静置10min；

(3)将步骤(2)中质粒的溶液逐滴加入到含lipo2000的溶液中，混匀，室温静置15min；

(4)将上步溶液加入到HEK293细胞中，6小时换含10％FBS的DMEM完全培养基继续培养；

(5)细胞长满后按照1:3进行传代，培养基为10％FBS的完全培养基:

传代3天后,每天观察细胞病态反应(CPE)；

当细胞有明显的CPE现象，且有>50％脱壁时即收细胞进行裂解收病毒，步骤如下：

1)收集细胞于一15mL的干净离心管中。

2)1500g离心5min。

3)留1mL上清,多余部分弃去。

4)在干冰浴及37℃间快速反复冻融三次。

5)2000g离心15min。

2.2放大培养重组腺病毒(200个平皿为例)

(1)在直径10cm培养皿里接种3×10⁶个HEK293细胞；

(2)细胞长满后按照1:5进行传代，直到一共有200个皿细胞；

(3)将适量上步实验中得到的含腺病毒的细胞裂解上清加入到95％融会度的HEK293细胞中；

(4)大约48-72h，细胞有明显的CPE现象时，分别对细胞上清和细胞沉淀进行收集细胞。

(5)细胞沉淀用PBS洗三遍后，按照细胞培养上清的1/10体积加入PBS进行细胞重悬，-80℃和37℃反复冻融三次后，离心，收集上清备用。

2.3.PCR测定重组腺病毒的滴度

将收集的细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，用荧光定量PCR进行病毒滴度测定。引物序列如下：

APXII-120F：5'-AGAAAGCTGCCGCAGGTGTA-3'，

APXII-120R：5'-CGACAGGACCAGTTGAAGACAA-3'，

APXII-120PROBE：

5'-FAM-ATAGGTAATGTAACAAAAGCGGT-BHQ1-3'；

反应体系：2x PCR mix，10μL；APXII-120F，1μL；DNA，2μL；H2O，5μL；APXII-120R，1μL；APXII-120PROBE，1μL。

反应条件：95℃，3min；95℃，15s 40cycle；60℃，30s。

反应结束后的的扩增曲线如图4所示，结果表明，细胞培养上清的荧光定量PCR检测结果显示CT值在20.00(如图4-1所示)，判定细胞培养上清中的病毒的滴度为2.40×10^8次方个/mL；细胞沉淀裂解上清的荧光定量PCR检测结果显示CT值在14.50(如图4-2所示)，判定病毒的滴度为1.10×10^10次方个/mL。

实施例3测定rAd-apxIIC-APXII注射小鼠血清中的IgG水平

3.1重组rAd-apxIIC-APXII免疫小鼠

在小鼠模型上，研究重组rAd-apxIIC-APXII疫苗的免疫剂量，测定血清中IgG测定。

SPF级别的昆明小鼠(4-6周龄)，购自湖南景达实验动物有限公司。将重组腺病毒载体+生理盐水制成疫苗，注射体积为50μL，免疫后每周采血，制备血清冻存于-70℃冰箱备用。小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表1所示：

表1免疫分组及情况

备注：rAd5-Null*，为没有插入基因的空载体包装的重组病毒。某疫苗在首次免疫2周后进行第2次免疫。

3.2免疫印迹测定apxIIC-APXII融合蛋白的抗原抗体反应

(1)取1.3中的细胞培养上清100微升，加入蛋白上样缓冲液。

(2)将3.1中制备的样本10微升加入到点样孔，进行10％的SDS-PAGE电泳。电泳条件：恒压100V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

(3)转膜，将电泳结束后的胶块上的蛋白转移到PVDF膜上。

(4)封闭：将膜完全浸没5％的脱脂奶粉-TBST中，室温轻摇30min。

(5)用TBST，分别将3.1项下收集的各组(rAd5-Null，rAd-apxIIC-APXII-低，rAd-apxIIC-APXII-高，某疫苗)血清进行100倍稀释，在抗体孵育盒中，室温孵育10min，放4℃过夜。

(6)第二天从4℃拿出膜。洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

(7)用TBST按1:5000的比例，稀释Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP二抗，将稀释的而抗体加入抗体孵育盒中，室温孵育40min。

(8)洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

(9)ECL加到膜上后反应2min，胶片曝光：10s-3min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。

(10)免疫印迹的结果见图5。

结果如图5所示，第1组血清没有目的条带出现，第2，3，4组血清分别有目的条带出现，差别在于apxIIC-APXII蛋白的表达。说明rAd-apxIIC-APXII注射和放线杆菌疫苗免疫后的血清都能和真核表达的apxIIC-APXII蛋白产生特异性的抗原抗体反应。

3.3间接ELISA检测分离的血清样本中总IgG

包被上步制备的apxIIC-APXII蛋白抗原，以1μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃2h，然后用PBST(PBS+吐温)洗涤。每孔加100μL 5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释(1:100)的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释(1:2000)的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL TMB显色液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，室温显色10min后每孔加入50μL2M的硫酸终止反应，酶标仪测OD450nm吸光值。分析结果。当样品OD450值≥(阴性血清的OD450值+3倍标准方差)时即为阳性。

免疫4周后的血清APXIIC-APXII IgG抗体检测结果如表2所示：

表2免疫4周后小鼠血清中APXIIC-APXII IgG抗体水平

由表2可以看出，rAd5-Null组没有产生特异的apxIIC-APXII IgG抗体；低中高三个rAd5-apxIIC-APXII组，都能产生较高的apxIIC-APXII IgG抗体，其中，中高浓度组产生的抗体显著高于低浓度组，高浓度组约高于中浓度组，但差异不显著；某疫苗组产生的apxIIC-APXII IgG抗体水平高于rAd-apxIIC-APXII低浓度组，和rAd-apxIIC-APXII中浓度及高浓度组相当，说明rAd5-apxIIC-APXII一次免疫和某疫苗二次免疫的产生的抗体水平相当。

实施例4测定rAd-apxIIC-APXII注射小鼠血清中的IgG亚型和评价免疫效果

小鼠rAd-apxIIC-APXII注射方法和血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体检测

SPF级别的昆明小鼠(4-6周龄)，购自湖南景达实验动物有限公司。将重组腺病毒载体+生理盐水制成疫苗，注射体积为50μL，免疫后每周采血，制备血清冻存于-70℃冰箱备用。小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表3所示：

表3免疫分组及情况

备注：rAd5-Null*，为没有插入基因的空载体包装的重组病毒。某疫苗，在首次免疫2周后进行第2次免疫。

血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体(试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)的ELISA测定结果如表4：

表4血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体检测结果

	rAd5-Null	rAd-apxIIC-APXII	某疫苗组
				IgG1(ng/mL)	81.26±3.61	128.53±6.48	119.26±5.76
IgG2a(mg/mL)	6.76±0.41	8.76±0.72	8.57±0.69
				IgG2b(ng/mL)	105.63±6.19	156.38±8.46	149.95±7.26
IgG3(mg/mL)	4.26±0.43	5.65±0.64	5.53±0.56

IgG1水平升高，表明保护性免疫中免疫应答向Th2(体液免疫应答)方向发展；IgG2a水平升高，提示保护性免疫中免疫应答向Th1(细胞免疫应答)方向发展。由表4可以看出，和rAd5-Null组相比，rAd-apxIIC-APXII组和疫苗组的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体都升高了；rAd-apxIIC-APXII组和某疫苗组相比，无显著性差异。这些结果说明，rAd-apxIIC-APXII组和某疫苗组的细胞免疫应答和体液免疫应答水平相当。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 长沙爱科博生物科技有限公司

<120> 胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Leu Gly Gln Ile Ala Trp Leu Trp Ala Asn Ser Pro Met His

1 5 10 15

Arg Asn Trp Ser Val Ser Leu Leu Met Lys Asn Val Ile Pro Ala Ile

20 25 30

Glu Asn Asp Gln Tyr Leu Leu Leu Val Asp Asp Gly Phe Pro Ile Ala

35 40 45

Tyr Cys Ser Trp Ala Lys Leu Thr Leu Glu Ser Glu Ala Arg Tyr Val

50 55 60

Lys Asp Thr Asn Ser Leu Lys Ile Asp Asp Trp Asn Ala Gly Asp Arg

65 70 75 80

Ile Trp Ile Ile Asp Trp Ile Ala Pro Phe Gly Asp Ser Ser Leu Leu

85 90 95

Tyr Lys His Met Arg Gln Arg Phe Pro Tyr Asp Ile Gly Arg Ala Ile

100 105 110

Arg Ile Tyr Pro Ser Lys Lys Asp Thr Gly Lys Ile Ile Tyr Leu Lys

115 120 125

Gly Gly Lys Ile Thr Lys Lys Val Ala Glu Lys Thr Phe Leu Gln Tyr

130 135 140

Glu Gln Glu Leu Ile Thr Ala Leu Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Lys Ile Thr Leu Ser Ser

165 170 175

Leu Lys Ser Ser Leu Gln Gln Gly Leu Lys Asn Gly Lys Asn Lys Leu

180 185 190

Asn Gln Ala Gly Thr Thr Leu Lys Asn Gly Leu Thr Gln Thr Gly His

195 200 205

Ser Leu Gln Asn Gly Ala Lys Lys Leu Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Gly

210 215 220

Tyr Asp Ser Gly Gln Gly Asn Gly Val Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala

225 230 235 240

Asn Asp Leu Gly Ile Glu Val Trp Arg Glu Glu Arg Ser Asn Leu Asp

245 250 255

Ile Ala Lys Thr Ser Phe Asp Thr Thr Gln Lys Ile Leu Gly Phe Thr

260 265 270

Asp Arg Gly Ile Val Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Asn Leu Leu Lys

275 280 285

Lys Asn Pro Lys Ile Gly Asn Thr Leu Gly Ser Ala Ser Ser Ile Ser

290 295 300

Gln Asn Ile Gly Lys Ala Asn Thr Val Leu Gly Gly Ile Gln Ser Ile

305 310 315 320

Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val Asn Leu Asn Glu Leu Leu Gln Asn

325 330 335

Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr

340 345 350

Asn Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala Ser Ser Val Gln Thr Val Asp Ala

355 360 365

Phe Ala Glu Gln Ile Ser Lys Leu Gly Ser His Leu Gln Asn Val Lys

370 375 380

Gly Leu Gly Gly Leu Ser Asn Lys Leu Gln Asn Leu Pro Asp Leu Gly

385 390 395 400

Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala

405 410 415

Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys

420 425 430

Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr

435 440 445

Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Gly Leu

450 455 460

Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu Ile Ala Ser

465 470 475

<210> 2

<211> 1430

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtattgg gacaaattgc ttggttatgg gcaaattctc caatgcaccg aaattggtca 60

gtttcactgt taatgaagaa tgttattcct gcaattgaaa atgaccaata tttgttacta 120

gttgatgatg gttttcctat tgcatattgc agttgggcca aattaactct agagagtgag 180

gctcgctatg taaaggacac caattcatta aaaatagatg attggaatgc aggagatcgt 240

atatggatca ttgattggat tgccccattc ggggattcat ctctattgta taaacatatg 300

agacaacgtt ttccatacga tattggaagg gcaattagaa tctatcctag caaaaaagat 360

actggaaaaa tcatatattt aaaaggagga aaaataacaa aaaaagtagc tgaaaagaca 420

tttcttcagt atgagcaaga gttaataaca gctctacaag gtggcggtgg ctcgggcggt 480

ggtggatctg gtggcggcgg atctatgtca aaaatcactt tgtcatcatt aaaatcgtcc 540

ttacaacaag gattgaaaaa tgggaaaaac aagttaaatc aagcaggtac aacactgaag 600

aatggtttaa ctcaaactgg tcattctcta cagaatgggg ctaaaaaatt aatcttatat 660

attcctcaag gctatgattc gggtcaagga aatggagttc aagatttagt taaagctgct 720

aatgatttag gtattgaagt atggcgagaa gaacgcagca atttggacat tgcaaaaact 780

agctttgata caactcagaa aattctaggt tttactgata gaggaattgt attatttgca 840

cctcagctag ataatttatt aaagaagaat cctaaaattg gcaatacatt aggaagtgct 900

tctagcatct cacaaaatat aggtaaagcc aatactgtat taggtggtat tcaatctatt 960

ttaggatctg ttttatctgg agtaaatctg aatgaattac ttcaaaataa agatcctaat 1020

caattagaac ttgcaaaagc agggctagaa ctgactaatg aattagttgg taatattgct 1080

agctcggtgc aaactgtaga tgcatttgca gaacaaatat ctaaactagg ttcacattta 1140

cagaatgtga aaggattagg aggattgagt aataaattac aaaatctacc agatctagga 1200

aaagcaagtt taggtttgga cattatctct ggtttacttt ctggagcatc tgcaggtctc 1260

attttagcag ataaagaggc ttcaacagaa aagaaagctg ccgcaggtgt agaatttgct 1320

aaccaaatta taggtaatgt aacaaaagcg gtctcatctt acattcttgc ccaacgagtc 1380

gcttcaggtt tgtcttcaac tggtcctgtc gctgcattaa tcgcatctac 1430

<210> 3

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtattgggac aaattgcttg gttatgggca aattctccaa tgcaccgaaa ttggtcagtt 60

tcactgttaa tgaagaatgt tattcctgca attgaaaatg accaatattt gttactagtt 120

gatgatggtt ttcctattgc atattgcagt tgggccaaat taactctaga gagtgaggct 180

cgctatgtaa aggacaccaa ttcattaaaa atagatgatt ggaatgcagg agatcgtata 240

tggatcattg attggattgc cccattcggg gattcatctc tattgtataa acatatgaga 300

caacgttttc catacgatat tggaagggca attagaatct atcctagcaa aaaagatact 360

ggaaaaatca tatatttaaa aggaggaaaa ataacaaaaa aagtagctga aaagacattt 420

cttcagtatg agcaagagtt aataacagct ctacaa 456

<210> 4

<211> 926

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcaaaaa tcactttgtc atcattaaaa tcgtccttac aacaaggatt gaaaaatggg 60

aaaaacaagt taaatcaagc aggtacaaca ctgaagaatg gtttaactca aactggtcat 120

tctctacaga atggggctaa aaaattaatc ttatatattc ctcaaggcta tgattcgggt 180

caaggaaatg gagttcaaga tttagttaaa gctgctaatg atttaggtat tgaagtatgg 240

cgagaagaac gcagcaattt ggacattgca aaaactagct ttgatacaac tcagaaaatt 300

ctaggtttta ctgatagagg aattgtatta tttgcacctc agctagataa tttattaaag 360

aagaatccta aaattggcaa tacattagga agtgcttcta gcatctcaca aaatataggt 420

aaagccaata ctgtattagg tggtattcaa tctattttag gatctgtttt atctggagta 480

aatctgaatg aattacttca aaataaagat cctaatcaat tagaacttgc aaaagcaggg 540

ctagaactga ctaatgaatt agttggtaat attgctagct cggtgcaaac tgtagatgca 600

tttgcagaac aaatatctaa actaggttca catttacaga atgtgaaagg attaggagga 660

ttgagtaata aattacaaaa tctaccagat ctaggaaaag caagtttagg tttggacatt 720

atctctggtt tactttctgg agcatctgca ggtctcattt tagcagataa agaggcttca 780

acagaaaaga aagctgccgc aggtgtagaa tttgctaacc aaattatagg taatgtaaca 840

aaagcggtct catcttacat tcttgcccaa cgagtcgctt caggtttgtc ttcaactggt 900

cctgtcgctg cattaatcgc atctac 926

Claims

1.胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白的编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白的编码基因的重组表达载体。

5.根据要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体为重组5型腺病毒载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体共表达胸膜肺炎放线杆菌apxIIC基因和胸膜肺炎放线杆菌APXII基因，其中，apxIIC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，APXII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述胸膜肺炎放线杆菌apxIIC基因与所述胸膜肺炎放线杆菌APXII基因通过序列GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCT连接。

8.权利要求4所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白的编码基因；

(2)将步骤(1)所得的编码基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒上；

9.权利要求8所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述腺病毒穿梭载体质粒为pDC316；步骤(3)中，腺病毒包装质粒为pBHGlox(delta)E13Cre；步骤(3)中，转染的细胞为HEK293细胞或猪的肺泡巨噬细胞。

10.权利要求4所述的重组表达载体在制备猪接触传染性胸膜肺炎疫苗或药物中的应用。