CN113234760B - 包含猪繁殖与呼吸综合症orf5基因的重组5型腺病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

包含猪繁殖与呼吸综合症orf5基因的重组5型腺病毒载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉生物科技领域，具体涉及包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体及其制备方法和应用。本发明包含猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的重组5型腺病毒载体，共表达猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因和猪CTLA4基因。试验表明，融合CTLA4基因的重组腺病毒载体rAd‑CTLA4‑ORF5，仅需要一次注射就能和进口疫苗免疫两次一样，刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。本发明的重组腺病毒载体rAd‑CTLA4‑ORF5可以作为预防和治疗繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗或者药物。

Description

包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉生物科技领域，具体涉及包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS，蓝耳病)的病原体为动脉炎病毒属的成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球型，直径为55～60纳米。病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型，我国分离到的毒株为美洲型。病毒对酸、碱都较敏感，尤其很不耐碱，一般的消毒剂对其都有作用，但在空气中可以保持3周左右的感染力。猪繁殖与呼吸综合征的主要感染途径为呼吸道，空气传播、接触传播、精液传播和垂直传播为主要的传播方式，病猪、带毒猪和患病母猪所产的仔猪以及被污染的环境、用具都是重要的传染源。
剖检猪繁殖与呼吸综合征病死猪，主要眼观病变是肺弥漫性间质性肺炎，并伴有细胞浸润和卡他性肺炎区，肺水肿，在腹膜以及肾周围脂肪、肠系膜淋巴结、皮下脂肪和肌肉等处发生水肿。在显微镜下观察，可见鼻黏膜上皮细胞变性，纤毛上皮消失，支气管上皮细胞变性，肺泡壁增厚，膈有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。母猪可见脑内灶性血管炎，脑髓质可见单核淋巴细胞性血管套，动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞减少，细胞核破裂和空泡化。
一般情况下，种猪接种灭活苗，而育肥猪接种弱毒苗。因为母猪若在妊娠期后三分之一的时间接种活苗，疫苗病毒会通过胎盘感染胎儿；而公猪接种活苗后，可能通过精液传播疫苗病毒。考虑到蓝耳病灭活苗产生的抗体水平比较低，经典毒株的弱毒苗免疫对高致病性蓝耳病的保护力有限，而高致病性蓝耳病疫苗的使用具有很大的风险性。因此，有效的基因工程疫苗对保护蓝耳病具有重要的意义。
GP5蛋白是蓝耳病ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白，具有较好的免疫原性，能够诱导产生中和抗体。因此，GP5蛋白在蓝耳病的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义，是研制基因工程疫苗的最佳候选基因。
腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区(ITR)，ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元(E1、E2、E3、E4)承担调节功能，以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和复制必须因子，早期基因E1A、E1B产物还为E2等早期基因表达所必须。因此，E1区的缺失可造成病毒在复制阶段的流产。E3为复制非必须区，其缺失则可以大大地扩大插入容量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体。
本发明的再一目的在于提供上述重组5型腺病毒载体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述重组5型腺病毒载体的应用。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体，所述腺病毒载体共表达猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因和猪CTLA4基因。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体，猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:
ATGGATTCCAACAACAACTCTTCCCACATTCAGCTGATCTACAACCTGACTCTGTGCGAACTGAACGGTACCGACTGGCTGGCCCAGAACTTCGACTGGGCTGTAGAGACTTTCGTGATCTTCCCGGTGCTGACCCACATCGTTTCTTACGGTGCACTGACGACCTCTCACTTCCTGGACACCGTTGGCCTGGCTACTGTGTCTACCGCTGGCTACTACCACGGTCGTTACGTTCTGTCTTCTATCTACGCTGTTTGCGCGCTGGCGGCTCTGATTTGTTTTGTAATTCGTCTGGCGAAAAACTGCATGTCTTGGCGTTACTCCTGCACTCGTTACACGAACTTTCTGCTGGACACCAAAGGCCGTCTGTACCGTTGGCGCTCCCCGGTCATTGTTGAGAAACGCGGTAAAGTAGAAGTTGAAGGCCACCTGATTGACCTGAAGCGTGTTGTTCTGGACGGTTCTGCCGCTACTCCGCTGACTCGTGTATCCGCAGAACTGTGGGGTCGTCTG。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体，猪CTLA4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
ATGAAAGGGATGCACGTGGCCCAACCTGCAGTAGTGCTGGCCAACAGCCGGGGTGTTGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGGGTCTGCAGGCAAAGCTGCCGAGGTCCGGGTGACAGTGCTGCGGCGGGCCGGCAGCCAGATGACTGAAGTCTGTGCCGCGACATATACTGTGGAGGATGAGTTGACCTTCCTTGATGACTCTACATGCACTGGCACCTCCACCGAAAACAAAGTGAACCTCACCATCCAAGGGCTGAGAGCCGTGGACACTGGGCTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCCTGTACCCACCACCCTACTATGTGGGTATGGGCAACGGGACCCAGATTTATGTCATTGATCCAGAACCATGCCCAGATTCTGAT。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体，猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因与猪CTLA4基因通过GGGGSGGGGSGGGGS蛋白基因连接。
GGGGSGGGGSGGGGS蛋白对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCT。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因和猪CTLA4基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒上，获得重组穿梭质粒；
(2)重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体进行体外重组，得到重组腺病毒；
(3)包装重组腺病毒后，转染细胞。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，步骤(1)中，所述腺病毒穿梭载体质粒为PEC3.1(+)；穿梭载体pEC3.1-CTLA4-ORF5，携带CMV启动子，可以将CMV启动子替换为CAG启动子、SV40启动子以及beta肌动蛋白启动子等。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，步骤(2)中，腺病毒骨架载体为pAd-PL-DEST。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，步骤(2)中，重组腺病毒穿梭载体质粒通过重组臂attL1和重组臂attL2与腺病毒骨架载体pAd/PL-Dest上的重组臂体外重组，得到重组腺病毒pAd-CTLA4-ORF5。
根据本发明具体实施方式的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，步骤(3)中，转染的细胞为293T细胞或猪的肺泡巨噬细胞，或293系列的细胞。
本发明的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体可以作为预防和治疗繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗或者药物。
本发明的有益效果：
本发明选择E3基因缺失的腺病毒载体5型(Ad5)，将蓝耳病ORF5基因克隆到穿梭载体，体外重组到5型腺病毒骨架载体上，获得携带ORF5基因的重组5型腺病毒载体rAd-CTLA4-ORF5，该种载体在纯化后可以安全使用，体内表达蛋白的周期可长达4周；能够刺激更强的细胞和体液免疫应答，产生特异性ORF5抗体。
本发明选用5型腺病毒载体做载体，将基因递送到肺部表达蛋白，持续产生抗体。利用本发明腺病毒制成的疫苗只需要注射一次，不需要注射两次，减少兽医人员的工作量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示CTLA4-PRRS-ORF5的扩增结果，其中，M(DNA MARKER)：100,250,500,750,1000,2000；1:CTLA4-ORF5片段；
图2显示pEC3.1-CTLA4-PRRS-ORF5质粒BamHI和Xho I双酶切鉴定结果，其中，M(DNA MARKER)：100,250,500,750,1000,2000,3000,5000；1：pEC3.1-CTLA4-PRRS-ORF5质粒双酶切片段；
图3显示重组腺病毒载体XbaI单酶切电泳结果；1：重组腺病毒载体XbaI单酶切结果；M：DNA Marker(Takara)：15kb，8kb，5kb，2.5kb，1kb，0.5kb；
图4显示转染pAd-CTLA4-ORF5前后293T细胞的形态变化，a：转染前细胞形态，b：收毒前细胞形态；
图5显示2.4.2中的细胞上清，2.4.3中细胞和细胞上清的病毒DNA荧光定量PCR检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实验材料
基因、载体和细胞：重组腺病毒包装载体系统，包括腺病毒骨架载体pAd-PL-DEST及穿梭载体PEC3.1(+)；293T包装细胞、大肠杆菌DH5α和DB3.1由长沙爱科博生物科技有限公司实验室保存；
主要试剂：Bam HI，Xho I，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；转染试剂Lipo2000购自Invitrogen公司。DMEM/High Glucose细胞培养基；胰酶溶液购自Hyclone公司；胎牛血清FBS购自Gibco公司；青霉素/链霉素溶液购自Gibco公司。其余试剂均为进口或者国产分析纯。T4 DNA Ligase、Pac I及部分内切酶等购自NEB公司。LR Clonase II构自Invitrogen公司。
实施例1 构建pEC3.1-CTLA4-ORF5质粒
1.1合成CTLA4-ORF5基因
合成CTLA4-ORF5基因，基因克隆在Pet28a载体上，命名为Pet28a-CTLA4-ORF5。
CTLA4-ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ATGAAAGGGATGCACGTGGCCCAACCTGCAGTAGTGCTGGCCAACAGCCGGGGTGTTGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGGGTCTGCAGGCAAAGCTGCCGAGGTCCGGGTGACAGTGCTGCGGCGGGCCGGCAGCCAGATGACTGAAGTCTGTGCCGCGACATATACTGTGGAGGATGAGTTGACCTTCCTTGATGACTCTACATGCACTGGCACCTCCACCGAAAACAAAGTGAACCTCACCATCCAAGGGCTGAGAGCCGTGGACACTGGGCTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCCTGTACCCACCACCCTACTATGTGGGTATGGGCAACGGGACCCAGATTTATGTCATTGATCCAGAACCATGCCCAGATTCTGATGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTATGGATTCCAACAACAACTCTTCCCACATTCAGCTGATCTACAACCTGACTCTGTGCGAACTGAACGGTACCGACTGGCTGGCCCAGAACTTCGACTGGGCTGTAGAGACTTTCGTGATCTTCCCGGTGCTGACCCACATCGTTTCTTACGGTGCACTGACGACCTCTCACTTCCTGGACACCGTTGGCCTGGCTACTGTGTCTACCGCTGGCTACTACCACGGTCGTTACGTTCTGTCTTCTATCTACGCTGTTTGCGCGCTGGCGGCTCTGATTTGTTTTGTAATTCGTCTGGCGAAAAACTGCATGTCTTGGCGTTACTCCTGCACTCGTTACACGAACTTTCTGCTGGACACCAAAGGCCGTCTGTACCGTTGGCGCTCCCCGGTCATTGTTGAGAAACGCGGTAAAGTAGAAGTTGAAGGCCACCTGATTGACCTGAAGCGTGTTGTTCTGGACGGTTCTGCCGCTACTCCGCTGACTCGTGTATCCGCAGAACTGTGGGGTCGTCTGTAA
1.2pEC3.1-CTLA4-ORF5构建
1)CTLA4-ORF5片段的获得：
用引物从Pet28a-CTLA4-ORF5扩增CTLA4-PRRS-ORF5片段：引物序列如下：
CTLA4-ORF5-F：CGCGGATCCaccATGGATATGAAAGGGATGCACGTG
CTLA4-ORF5-R：CGCCTCGAGTTACAGACGACCCCACAGTTC
扩增的反应体系如下：
10*PCR buffer，5μL；CTLA4-ORF5-F，1μL；CTLA4-ORF5-R，1μL；dNTPs(10mM)，1μL；DNA，2μL；Taq DNA polymerase，0.5μL；H2O，39.5μL。
反应条件如下：
95℃ 5min；
95℃ 30S；56℃30S；72℃ 1min；30个循环；
72℃ 10min；
反应结束后进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，然后对目的CTLA4-ORF5片段进行回收。
如图1所示，CTLA4-ORF5片段大小约为942bp，条带清晰，均一性良好。
将pEC3.1(+)质粒和CTLA4-ORF5片段分别用BamHI和Xho I双酶切，并进行回收；将pEC3.1(+)和CTLA4-ORF5片段用T4连接酶进行连接，阳性克隆命名为pEC3.1-CTLA4-ORF5。
CTLA4-ORF5片段酶切反应体系：
回收的CTLA4-ORF5片段，8μL；BamHI，1μL；Xho I，1μL；10*Buffer，5μL；H2O，5μL。总共50μL体系。
Pec3.1(+)酶切反应体系：Pec3.1(+)，6μL；BamHI，1μL；Xho I，1μL；10*Buffer，2μL；H2O，10μL。总共20μL体系。
对以上酶切体系放到37℃水浴反应30min后，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后回收目的片段。并进行连接反应，连接反应的体系如下：
Figure BDA0003100988300000071
混匀，22℃反应4h。
之后转化到DH5α感受态细胞中。挑取阳性克隆进行揺菌，抽质粒进行双酶切鉴定。
双酶切反应体系：提取的质粒，6μL；BamHI，1μL；Xho I，1μL；10*Buffer，2μL；H2O，10μL，总共20μL体系。
双酶切结果如图2所示。
1.3体外同源重组腺病毒载体的构建pAd-CTLA4-PRRS-ORF5
1)反应体系：pEC3.1-CTLA4-PRRS-ORF5载体(100ng/μL)，3μl；pAd/pl-DEST腺病毒载体(100ng/μL)，1μL；LR Clonase II(Invitrogen)，2μL；H2O，4μL。反应条件：25℃反应1h。
2)蛋白酶K消化LR Clonase II重组酶
加入0.25μL蛋白酶K，37℃反应15m。
3)将5μL上步反应产物转化DB3.1感受态细胞，涂布于含Amp抗性(终浓度为100μg/mL)的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。
4)从培养皿上挑取单克隆菌落接种于5mL含Amp抗性(终浓度为100ug/mL)的LB液体培养液中，37℃恒温摇床(250rpm)培养过夜。
5)提取质粒用XbaI单酶切进一步鉴定提取的质粒
反应体系：10x Buffer，2μL；提取的载体质粒，8μL；Xba I，1μL；H2O，9μL。37℃水浴反应3h后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳。
电泳结果如图3所示，大条带大于15kb(说明载体为腺病毒载体)，存在小条带，且大小符合预期则目的克隆是正确的，命名为pAd-CTLA4-ORF5。
1.4重组腺病毒rAd-CTLA4-ORF5的包装
1.4.1准备进行转染的线性化pAd-CTLA4-ORF5质粒DNA
(1)用Pac I酶切pAd-CTLA4-ORF5质粒，反应体系：10×Neb Buffer 1，5μL；10xBSA，5μL；Pac I(10unit/μL)，1μL；pAd-CTLA4-ORF5，39μL。37℃水浴反应4h。
(2)酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀
1)在连接产物中加70μL TE(pH 8.0)及100μL酚：氯仿：异戊醇并混匀。
2)15000rpm离心5min。
3)转移上清至一干净的1.5mL EP管中。
4)加入10μL 3M NaOAc，混匀，再加入350μL无水乙醇，混匀。
5)-70℃冰箱放置15min，15000rpm离心15min。
6)70％酒精洗涤两遍，敞口放置15min至酒精完全挥发，然后用30uL H2O充分溶解。
1.4.2将Pac I线性化的腺病毒载体片段pAd-CTLA4-ORF5转染293T。
(1)提前12-24小时在一个25mm培养瓶里种0.5×106个293T细胞。
(2)使用lipo2000脂质体进行转染，按照说明书，取1μg线性化重组腺病毒DNA按DNA：lipid＝1：3的比例对达到50-70％融会度的293T细胞进行转染。
(3)转染后48h后进行一次传代，培养基为10％FBS的完全培养基。
(4)传代3天后每天观察细胞病态反应(CPE)。
(5)当细胞有明显的CPE现象，且有>50％脱壁时即收细胞进行裂解收病毒，步骤如下：
1)收集细胞于一15mL的干净离心管中。
2)1500g离心5min。
3)留1mL上清,多余部分弃去。
4)在干冰浴及37℃间快速反复冻融三次。
5)2000g离心15min。
6)将部分上清装于1.5mL EP管中置-80℃保存，另外适量上清用于后续的感染步骤。
1.4.3放大培养重组腺病毒
(1)提前12-24小时在两个250mm培养瓶里种3×106个293T细胞。
(2)在达到50-70％融会度的293T细胞中加入适量上步实验中得到的细胞裂解上清。
(3)此后每天观察细胞病态反应(CPE)。
(4)48h后，细胞有明显的CPE现象，即进行回收和裂解细胞并进行病毒收集。
1.4.4.PCR验证重组腺病毒的产生
(1)将1.4.2中的细胞上清，1.4.3中细胞和细胞上清取50μL，用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA。
(2)采用荧光定量PCR进行鉴定：
引物序列如下：
CTLA4-ORF5-F:GGCGTTACTCCTGCACTCG，
CTLA4-ORF5-R:CCCACAGTTCTGCGGATACA，
CTLA4-ORF5-Pbobe:FAM-ACACGAACTTTCTGCTGGACACC-BHQ1
反应体系：2x PCR mix，10μL；CTLA4-ORF5-F，1μL；DNA，2μL；H2O，5μL；CTLA4-ORF5-R，1μL；CTLA4-ORF5-Pbobe，1μL。
反应条件：
95℃ 3min；
95℃ 15s 40cycle；
60℃ 30s；
反应结束后的的扩增曲线如图5所示，阳性对照CT值最低，阴性对照(293T细胞)为阴性，试验成立。1.4.2中的细胞上清的DNA扩增结果CT值为26左右，说明转染后成功包装了病毒，1.4.3中细胞和细胞上清的病毒DNA荧光定量PCR检测结果CT值在24附近，说明用包装的病毒感染细胞后，病毒能够在293T细胞中增殖。
2.4.5重组腺病毒的大量扩增
大量扩增重组腺病毒包括以下步骤：扩增293T细胞→腺病毒感染细胞→收集腺病毒感染的细胞→对扩增的腺病毒进行纯化。
1)、将扩增到一定数量的293T细胞用胰酶消化，按每瓶2.3x106个细胞接种到10个大玻璃细胞瓶中，放入37℃培养箱培养。
2、细胞培养24h后，吸取培养基，加入9.25mL稀释好的腺病毒(将前面收集的腺病毒稀释100000倍)，放入37℃培养箱培养1h，然后加入36mL完全培养基，放入37℃培养箱培养；
3、在转染5～6天后用移液管(而不是胰酶)将细胞瓶中细胞吹下并转入50mL离心管中，1000rpm离心10min，收集上清；
4、最后将所有沉淀收集在一个离心管中，加入30mL前面收集的上清，重悬沉淀后进行超声，之后再1000rpm离心10min，收集上清。将所有上清收集在一起保存在-70℃为纯化备用；
5、将15％CsCl和40％CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；
6、将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
7、超速离心，30000rpm，4℃离心16小时；
8、离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16号针头将这一条带收集；
9、在TBS中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS中透析两次，每次一小时；
10、将纯化的腺病毒分装于EP管中；
11、在蛋白定量仪中测量透析液中的总蛋白量(1μg病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒)；
12、将病毒颗粒放在-80℃超低温冰箱长期保存。
将ORF5基因克隆在Pet28a载体上，并利用相同的方法构建重组5型腺病毒载体，命名为pAd-ORF5，并将该质粒进行包装和扩增。
实施例2 重组rAd5-CTLA4-ORF5疫苗的免疫剂量及血清IgG测定
在小鼠模型上，研究重组rAd5-CTLA4-ORF5疫苗的免疫剂量，测定血清中IgG测定。
SPF级别的昆明小鼠(4-6周龄)，购自湖南景达实验动物有限公司。注射体积为50μL，免疫后每周采血，制备血清冻存于-70℃冰箱备用。将重组腺病毒载体+生理盐水制成疫苗，小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表1所示：
表1 免疫分组及情况
Figure BDA0003100988300000121
备注：rAd5-Null*，为没有插入基因的空载体包装的重组病毒。某进口疫苗，在首次免疫2周后进行第2次免疫。
用间接ELISA检测分离的血清样本中总IgG。
包被抗原(真核表达的ORF5蛋白，本实验室制备)，以1μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃2h，然后用PBST(PBS+吐温)洗涤。每孔加100μL 5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释(1:100)的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释(1:2000)的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μLTMB显色液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，室温显色10min后每孔加入50μL2M的硫酸终止反应，酶标仪测OD450nm吸光值。分析结果。当样品OD450值≥(阴性血清的OD450值+3倍标准方差)时即为阳性。
免疫4周后的血清ORF5 IgG抗体检测结果如表2所示：
表2 免疫4周后小鼠血清中ORF5 IgG抗体水平
Figure BDA0003100988300000122
由表2可以看出，rAd5-Null组没有产生特异的ORF5 IgG抗体；低中高三个rAd5-ORF5组，都能产生较高的ORF5 IgG抗体，其中，中高浓度组产生的抗体显著高于低浓度组，高浓度组约高于中浓度组，但差异不显著；某进口疫苗组产生的ORF5 IgG抗体水平高于rAd5-CTLA4-ORF5低浓度组，和rAd5-CTLA4-ORF5-中浓度及高浓度组相当，说明rAd5-CTLA4-ORF5一次免疫和某进口疫苗二次免疫的产生的抗体水平相当。
实施例3 重组rAd5-CTLA4-ORF5疫苗诱发小鼠免疫反应评价
小鼠免疫方法和血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体检测
SPF级别的昆明小鼠(4-6周龄)，购自湖南景达实验动物有限公司。注射体积为50μL，免疫后每周采血，制备血清冻存于-70℃冰箱备用。将重组腺病毒载体+生理盐水制成疫苗，小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表3所示：
表3 免疫分组及情况
Figure BDA0003100988300000131
备注：rAd5-Null*，为没有插入基因的空载体包装的重组病毒。某进口疫苗，在首次免疫2周后进行第2次免疫。
血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体(试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)的ELISA测定结果如表4：
表4 血清中IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体检测结果
rAd5-Null rAd5-CTLA4-ORF5 某进口疫苗组
IgG1(ng/mL) 96.73±2.43 133.45±3.36 131.87±3.62
IgG2a(mg/mL) 7.03±0.35 8.37±0.49 8.43±0.52
IgG2b(ng/mL) 113.26±3.05 148.19±4.67 143.86±4.49
IgG3(mg/mL) 4.19±0.38 5.76±0.43 5.72±0.29
如表4所示，IgG1水平升高，表明保护性免疫中免疫应答向Th2(体液免疫应答)方向发展；IgG2a水平升高，提示保护性免疫中免疫应答向Th1(细胞免疫应答)方向发展。由表4可以看出，和rAd5-Null组相比，rAd5-CTLA4-ORF5组和某进口疫苗组的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体都升高了；rAd5-CTLA4-ORF5组和某进口疫苗组相比，无显著性差异。这些结果说明，rAd5-CTLA4-ORF5组和某进口疫苗组的细胞免疫应答和体液免疫应答水平相当。
本发明比较重组rAd5-ORF5疫苗与重组rAd5-CTLA4-ORF5疫苗的效果，按照实施例2、实施例3所述方法进行实验，通过对比可知，重组rAd5-CTLA4-ORF5疫苗的效果显著优于重组rAd5-ORF5疫苗，说明CTLA4基因与ORF5基因在5型腺病毒上共表达产生了协同增效的效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 长沙爱科博生物科技有限公司
<120> 包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggattcca acaacaactc ttcccacatt cagctgatct acaacctgac tctgtgcgaa 60
ctgaacggta ccgactggct ggcccagaac ttcgactggg ctgtagagac tttcgtgatc 120
ttcccggtgc tgacccacat cgtttcttac ggtgcactga cgacctctca cttcctggac 180
accgttggcc tggctactgt gtctaccgct ggctactacc acggtcgtta cgttctgtct 240
tctatctacg ctgtttgcgc gctggcggct ctgatttgtt ttgtaattcg tctggcgaaa 300
aactgcatgt cttggcgtta ctcctgcact cgttacacga actttctgct ggacaccaaa 360
ggccgtctgt accgttggcg ctccccggtc attgttgaga aacgcggtaa agtagaagtt 420
gaaggccacc tgattgacct gaagcgtgtt gttctggacg gttctgccgc tactccgctg 480
actcgtgtat ccgcagaact gtggggtcgt ctg 513
<210> 2
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaggga tgcacgtggc ccaacctgca gtagtgctgg ccaacagccg gggtgttgcc 60
agctttgtgt gtgagtatgg gtctgcaggc aaagctgccg aggtccgggt gacagtgctg 120
cggcgggccg gcagccagat gactgaagtc tgtgccgcga catatactgt ggaggatgag 180
ttgaccttcc ttgatgactc tacatgcact ggcacctcca ccgaaaacaa agtgaacctc 240
accatccaag ggctgagagc cgtggacact gggctctaca tctgcaaggt ggagctcctg 300
tacccaccac cctactatgt gggtatgggc aacgggaccc agatttatgt cattgatcca 360
gaaccatgcc cagattctga t 381
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct ggtggcggcg gatct 45
<210> 4
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaaggga tgcacgtggc ccaacctgca gtagtgctgg ccaacagccg gggtgttgcc 60
agctttgtgt gtgagtatgg gtctgcaggc aaagctgccg aggtccgggt gacagtgctg 120
cggcgggccg gcagccagat gactgaagtc tgtgccgcga catatactgt ggaggatgag 180
ttgaccttcc ttgatgactc tacatgcact ggcacctcca ccgaaaacaa agtgaacctc 240
accatccaag ggctgagagc cgtggacact gggctctaca tctgcaaggt ggagctcctg 300
tacccaccac cctactatgt gggtatgggc aacgggaccc agatttatgt cattgatcca 360
gaaccatgcc cagattctga tggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggtggcggc 420
ggatctatgg attccaacaa caactcttcc cacattcagc tgatctacaa cctgactctg 480
tgcgaactga acggtaccga ctggctggcc cagaacttcg actgggctgt agagactttc 540
gtgatcttcc cggtgctgac ccacatcgtt tcttacggtg cactgacgac ctctcacttc 600
ctggacaccg ttggcctggc tactgtgtct accgctggct actaccacgg tcgttacgtt 660
ctgtcttcta tctacgctgt ttgcgcgctg gcggctctga tttgttttgt aattcgtctg 720
gcgaaaaact gcatgtcttg gcgttactcc tgcactcgtt acacgaactt tctgctggac 780
accaaaggcc gtctgtaccg ttggcgctcc ccggtcattg ttgagaaacg cggtaaagta 840
gaagttgaag gccacctgat tgacctgaag cgtgttgttc tggacggttc tgccgctact 900
ccgctgactc gtgtatccgc agaactgtgg ggtcgtctgt aa 942

Claims (7)

1.包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体共表达猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因和猪CTLA4基因；猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
猪CTLA4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因与猪CTLA4基因通过GGGGSGGGGSGGGGS蛋白基因连接。
2.权利要求1所述的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因和猪CTLA4基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒上，获得重组穿梭质粒；
(2)重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体进行体外重组，得到重组腺病毒；
(3)包装重组腺病毒后，转染细胞。
3.根据权利要求2所述的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述腺病毒穿梭载体质粒为PEC3.1(+)。
4.根据权利要求2所述的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，腺病毒骨架载体为pAd-PL-DEST。
5.根据权利要求2所述的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，重组腺病毒穿梭载体质粒通过重组臂attL1和重组臂attL2与腺病毒骨架载体pAd/PL-Dest上的重组臂体外重组，得到重组5型腺病毒pAd-CTLA4-ORF5。
6.根据权利要求2所述的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，转染的细胞为293T细胞或猪的肺泡巨噬细胞。
7.权利要求1所述的包含猪繁殖与呼吸综合症ORF5基因的重组5型腺病毒载体在制备猪繁殖与呼吸综合症疫苗中的应用。
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