CN102321638B

CN102321638B - 一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5修饰基因及其应用

Info

Publication number: CN102321638B
Application number: CN 201110262408
Authority: CN
Inventors: 姜平; 华莉; 李玉峰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-09-06
Also published as: CN102321638A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因及其应用。猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因，序列如SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.3、SEQ IDNO.4或SEQ IDNO.5所示。含有该猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因的重组质粒。含有所述的重组质粒的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。结果显示所构建的重组质粒能够诱导产生较高水平的体液免疫应答、淋巴细胞增殖应答以及细胞因子应答。重组沙门氏菌能够诱导较高水平的抗体应答；诱导较高水平的干扰素；病毒血症水平低；攻毒后组织器官的损伤比较轻微，生物安全水平高。

Description

一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因及其应用。

技术背景

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白(又称E蛋白)是由ORF5编码的囊膜蛋白，是病毒的一个主要结构蛋白。E蛋白是一种跨膜糖蛋白，位于病毒粒子的包膜上，是重要的保护性抗原蛋白，但不能产生较强的中和抗体，GP5基因免疫保护效率也不理想，其可能的主要原因是：(1)GP5蛋白中存在中和表位和非中和表位，非中和表位对中和表位有干扰作用；(2)GP5蛋白上的糖基化位点也能使病毒发生免疫逃避，从而使产生的抗体水平降低；(3)基因在猪体细胞内表达效率比较低，抗原递呈作用比较弱，因此，为了提高基因疫苗免疫效力，有必要对这3个方面进行综合考虑，设计出新的抗原分子。

鼠寒沙门氏菌属于肠杆菌科，是一组胞内侵袭性致病菌，故能有效递呈抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫反应与细胞免疫反应，并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。近年来减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究越来越多，通过黏膜自然感染途径运送DNA疫苗，是一种很有前途的方法，有报道用该菌携带PRRSV GP5-M基因可以诱导小鼠产生PRRSV特异性免疫。

发明内容

本发明的目的是提供新的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因。

本发明的另一目的是提供含有该修饰基因的重组质粒。

本发明的又一目的是提供携带该重组质粒的减毒鼠寒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因，序列如SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.3、SEQ IDNO.4或SEQ IDNO.5所示。

含有所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因的重组质粒。

所述的重组质粒优选将所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因插入真核表达载体pCI的Xho I和Xba I酶切位点间。

所述的重组质粒进一步优选将SEQ IDNO.3所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因插入真核表达载体pCI的Xho I和Xba I酶切位点间。

含有所述的重组质粒的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。

本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。

本发明所述的含有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因的重组质粒在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。

本发明所述的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

本发明针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白在猪体细胞内表达效率比较低，抗原递呈作用比较弱，不能产生较强的中和抗体，免疫保护效率不理想的缺陷，通过对高致病性PRRSV SY0608毒株ORF5基因进行了3个方面的修饰和改造，设计出新的抗原分子编码基因，主要包括(1)根据哺乳动物偏嗜性，对天然的GP5基因密码子进行优化，改成哺乳动物偏嗜的密码子；(2)突变糖基化位点，将第30、34、35和51位的氨基酸N(天冬氨酸)改变成A(丙氨酸)；(3)利用最新发现的PRRSV GP4和N蛋白上的T细胞表位，分别插入至GP5蛋白非中和抗原表位和中和表位中间，并构建含有该修饰基因的重组质粒，发现其在哺乳动物细胞中表达效率显著高于原始基因。所构建的重组质粒能够诱导产生较高水平的体液免疫应答、淋巴细胞增殖应答以及Th1和Th2型细胞因子应答。

将筛选得到的体液免疫应答、淋巴细胞增殖应答以及Th1和Th2型细胞因子应答水平最高的修饰基因重组质粒pCI-SynGP5/GP4-5转化至减毒鼠寒沙门氏菌，获得重组沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5，分别进行小鼠免疫试验和仔猪攻毒保护免疫试验，发现其较之重组质粒pCI-SynGP5/GP4-5能够诱导较高水平的抗体应答；诱导较高水平的干扰素；病毒血症水平低；攻毒后组织器官的损伤比较轻微，生物安全水平高。以上结果证明本发明所构建的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在猪体实验中有良好的免疫效果，在蓝耳病的防制方面有开发和应用前景，可在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中应用。

附图说明

图1GP5基因的扩增，

1为Marker，2为GP5基因。

图2酶切得到的基因SynGP5、SynGP5/GP4-5和SynGP5/N-7，

1Marker，2、3、4分别为SynGP5、SynGP5/GP4-5和SynGP5/N-7。

图3SynGP5/GP4-3基因的扩增，

a、基因SynGP5-GP4-3的扩增；b、基因GP4-3-SynGP5的扩增；c、基因SynGP5/GP4-3的扩增；其中，1、3、5为Marker，2、4、6分别为SynGP5-GP4-3、GP4-3-SynGP5、SynGP5/GP4-3。

图4重组真核质粒的双酶切鉴定，

其中，1：1kb DNALadder；2：DNALadder DL2000；3：Xho I和Xba I双酶切的pCI-neo载体；4：Xho I和Xba I双酶切的pCI-GP5重组质粒；5：Xho I和Xba I双酶切的pCI-SynGP5重组质粒；6：Xho I和Xba I双酶切的pCI-SynGP5/GP4-5重组质粒；7：Xho I和Xba I双酶切的pCI-SynGP5/N-7重组质粒；8：Xho I和Xba I双酶切的pCI-SynGP5/GP4-3重组质粒。

图5Western blot鉴定蛋白的表达，

其中，1：pCI-neo载体转染HEK-293A的细胞裂解产物；2：pCI-GP5重组质粒转染HEK-293A的细胞裂解产物；3：pCI-SynGP5重组质粒转染HEK-293A的细胞裂解产物；4：pCI-SynGP5/GP4-5重组质粒转染HEK-293A的细胞裂解产物；5：pCI-SynGP5/N-7重组质粒转染HEK-293A的细胞裂解产物；6：pCI-SynGP5/GP4-3重组质粒转染HEK-293A的细胞裂解产物。

图6重组真核质粒诱导抗体应答；

其中，a：ELISA抗体应答；b：中和抗体应答。

图7重组真核质粒免疫鼠诱导的淋巴细胞增殖应答。

图8重组真核质粒免疫鼠脾细胞体外诱导的细胞因子应答，

其中，a：IFN-γ；b：IL-4。

图9重组沙门氏菌质粒的双酶切鉴定，

其中，1：DNALadder DL2000；2：Xho I和Xba I双酶切的pCI-SynGP5/GP4-5。

图10免疫猪外周血淋巴细胞体外诱导的细胞因子检测。

图11攻毒后各免疫组及对照组的平均体温变化。

图12攻毒后各组的病毒血症检测。

图13攻毒后各组的肺脏组织病理学观察。

具体实施方式

实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因修饰及其真核表达质粒的构建与鉴定

1.1引物设计

根据PRRSV SY0608毒株GP5基因序列(GenBank：：EU144079.1)设计合成一对特异性引物SY GP5.1和SY GP5.2，以pShuttle-GP5质粒(李玉峰，姜平，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定[J].中国病毒学，2006，21(4)：364-367)为模板，扩增GP5基因。

上游引物SY GP5.15’-ATTCTCGAGATGTTGGGGAAGTGC-3’(SEQ ID NO.6)，

下游引物SY GP5.25’-CGATCTAGACTAGAGACGACCCCATT-3’(SEQ ID NO.7)，分别在上、下游引物的5’端引入限制性酶切位点XhoI、XbaI，以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2PCR扩增GP5目的基因片段

取模板pShuttle-GP5质粒0.5μL，加入PCR混合液24.5μL(2.5μL10×buffer、2μL dNTP(2.5mM)、1.5μL Mg²⁺(25mM)、两条引物(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)各1μL(20pM)、0.2μL Taq酶(2.5U)、灭菌双蒸水16.3μL)。反应循环参数：94℃预变性10min；94℃变性45s；58℃退火30s；72℃延伸30s，共进行35个循环；然后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物(结果见图1)。回收PCR产物，-20℃保存备用。

1.3修饰的ORF5基因的获得

人工合成了3条修饰的ORF5基因：第一条是SynGP5，在天然的GP5基因(SEQ ID NO.1)的基础上按哺乳动物偏嗜，又修改了糖基化位点，即第30、34、35和51位的氨基酸将N改变成A所得，序列如SEQ ID NO.2所示；第二条是SynGP5/GP4-5，在SynGP5的基础上，第32、33个氨基酸间再插入GP4-5(氨基酸序列：CLFAILLAI；核苷酸序列：TGTCTTTTTGCCATCCTACTGGCAATT(SEQ ID NO.8))所得，序列如SEQ ID NO.3所示；第三条是SynGP5/N-7，在SynGP5的基础上，第32、33个氨基酸间插入N-7(氨基酸序列：VRHHFTPSE；核苷酸序列：GTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAG(SEQ ID NO.9))所得，序列如SEQID NO.4所示。合成时，在目的基因的两端加入了Xho I和Xba I的酶切位点，通过Xho I和Xba I两个酶切位点，把该基因片段克隆入真核表达载体中，获得的的质粒分别命名为pTG19T-SynGP5、pTG19T-SynGP5/GP4-5和pTG19T-SynGP5/N-7，通过双酶切的方式获得基因SynGP5、SynGP5/GP4-5和SynGP5/N-7，结果见图2。

1.4重叠PCR扩增SynGP5/GP4-3

以SynGP5/N-7为模板，用以下引物将N-7突变为GP4-3(氨基酸序列：LLVGFKCFV；碱基序列：CTCTTGGTTGGTTTTAAATGTTTCGTG(SEQ ID NO.10))，扩增SynGP5/GP4-3，具体方法为：首先以SynGP5/N-7为模板用引物SynGP5/GP4-3.1：5’-ATTCTCGAGATGTTGGGCAAGTG-3’(SEQ ID NO.11)和SynGP5/GP4-3.2：5’-CACGAAGCACTTGAAGCCCACCAACAGGCTGGCGGCGGCCAG-3’(SEQ ID NO.12)扩增得到SynGP5-GP4-3；再以SynGP5/N-7为模板，用引物SynGP5/GP4-3.3：5’-CTGTTGGTGGGCTTCAAGTGCTTCGTGAACGCCGCCAGCTCC-3’(SEQ ID NO.13)和SynGP5/GP4-3.4：5’-TTATCTAGACTACAGGCGGCCCC-3’(SEQ ID NO.14)扩增得到GP4-3-SynGP5。扩增SynGP5-GP4-3和GP4-3-SynGP5的PCR反应循环参数：94℃预变性10min；94℃变性45s；50/56℃退火30s；72℃延伸30s，共进行35个循环；然后72℃延伸10min。两个PCR产物有GP4-3这个重叠部分。两个PCR产物回收并纯化后，与Melting solution混合，置于94℃水浴锅10min，等水浴锅自然冷却后，收起产物作为PCR模板，混合体系如下：

以SynGP5-GP4-3和GP4-3-SynGP5的混合产物作为模板，用引物SynGP5/GP4-3.1(SEQ IDNO.11)和SynGP5/GP4-3.4(SEQ ID NO.14)扩增得到SynGP5/GP4-3。该PCR体系为：PCR取模板4μL，加入PCR混合液21μL(2.5μL10×buffer、2μL dNTP(2.5mM)、1.5μL Mg²⁺(25mM)、两条引物各1μL(20pM)、0.2μLTaq酶(2.5U)、灭菌双蒸水12.8μL)。反应循环参数：52℃退火30s；72℃延伸45s；94℃变性45s；58℃退火30s；72℃延伸45s，共进行35循环；然后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物SynGP5/GP4-3，结果见图3。

1.5重组真核质粒的构建与鉴定

将PCR扩增的GP5、SynGP5/GP4-3基因和酶切的SynGP5、SynGP5/GP4-5、SynGP5/N-7基因回收并纯化，同时对pCI-neo真核载体(Promega)进行XhoI和XbaI酶切与回收，然后将各段基因分别连接入pCI-neo载体的XhoI和XbaI之间，分别得到重组质粒pCI-GP5、pCI-SynGP5、pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-SynGP5/N-7和pCI-SynGP5/GP4-3，通过XhoI和XbaI双酶切以及测序对重组质粒进行鉴定，酶切鉴定结果见图4，测序结果显示GP5基因序列为SEQ ID NO.1，SynGP5基因序列为SEQ ID NO.2，SynGP5/GP4-5序列为SEQ ID NO.3，SynGP5/N-7基因序列为SEQ ID NO.4，SynGP5/GP4-3基因序列为SEQ ID NO.5。

将构建好的重组质粒转染HEK-293A细胞(购自QbioGen公司)。细胞裂解产物经12％SDS-PAGE电泳后，用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体5F12(马苏，戴建君，李玉峰，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定[J].南京农业大学学报，2008，31(1)：72-76)进行Western blot分析，发现转染pCI-SynGP5、pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-SynGP5/N-7和pCI-SynGP5/GP4-3的细胞在相应大小处有目的条带，pCI-GP5在目的位置的条带不明显，pCI-neo在目的位置没有条带(结果见图5)，证明上述GP5基因经修饰后在哺乳动物细胞表达效率更高。

实施例2表达修饰的GP5蛋白的真核质粒DNA小鼠免疫特性研究

2.1真核表达质粒的大量制备

利用碱裂法大量提取质粒，用分光光度计测定OD260和OD280，计算各重组真核质粒含量和纯度。DNA含量(μg/mL)＝样品稀释倍数×50×OD260。

2.2小鼠分组与免疫实验

取6-8周龄雌性Balb/c小鼠70只，分为7组，每组10只。第一组为阴性对照组，注射PBS，第二、三、四、五、六、七组分别腿部肌肉注射免疫pCI-neo、pCI-GP5、pCI-SynGP5、pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-SynGP5/N-7和pCI-SynGP5/GP4-3，剂量为每只小鼠免疫100μg，首免第21、42天后分别以相同的剂量加强免疫(免疫质粒前24h，腿部肌肉注射2％盐酸利多卡因，50μL/只)。

2.3免疫后各反应指标的检测

分别于首次免疫后42和63d采血测定ELISA抗体和中和抗体；取脾脏，分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应；并测定脾脏淋巴细胞体外刺激后细胞因子应答。

2.4结果

2.4.1体液免疫应答

将重组真核质粒免疫Balb/c小鼠，首免后6周各组均可检测到ELISA抗体，首免后9周ELISA抗体达到较高的水平，结果见图6a，其中，pCI-SynGP5和pCI-SynGP5/GP4-5免疫组抗体显著高于其它免疫组(P＜0.01)，其次为pCI-SynGP5/N-7免疫组；pCI-GP5和pCI-SynGP5/GP4-3免疫组抗体水平较低，pCI-neo和阴性对照组均未产生一定的特异性ELISA抗体。中和试验结果(图6b)显示，首免后9周可检测到中和抗体，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组中和抗体最高，平均达到1∶22，显著高于其他各组(P＜0.05)，其次为pCI-SynGP5/N-7、pCI-SynGP5/GP4-3和pCI-SynGP5免疫组，pCI-GP5免疫组产生的中和抗体较低，pCI-neo和阴性对照组均未产生一定的特异性中和抗体。

2.4.2淋巴细胞增殖应答

分别在首免后6周和首免后9周分离鼠的淋巴细胞，进行PRRSV特异性的淋巴细胞增殖试验，结果表明，首免后6周各组均没有淋巴细胞的特异性的增殖，首免后9周可检测到各组的淋巴细胞增殖应答，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组的淋巴细胞增殖应答显著高于其他各免疫组(P＜0.05)，pCI-SynGP5/N-7、pCI-SynGP5/GP4-3和pCI-SynGP5免疫组的淋巴细胞增殖应答水平依次降低，阴性对照组、pCI-neo和pCI-GP5免疫组均未产生淋巴细胞的增殖。该结果说明，修饰的ORF5基因可以诱导小鼠产生淋巴细胞增殖应答，其中pCI-SynGP5/GP4-5更能提高细胞免疫应答(结果见图7)。

2.4.3细胞因子应答

应用美国R&D公司的小鼠细胞因子(IL-4及IFN-γ)ELISA检测试剂盒，检测免疫鼠的脾细胞体外经特异性PRRSV抗原刺激后细胞因子分泌水平。首免后9周可从各组刺激孔的细胞上清中检测出细胞因子的应答，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组产生的IL-4及IFN-γ细胞因子应答显著高于其他各免疫组(P＜0.05)，其次为pCI-SynGP5/N-7、pCI-SynGP5/GP4-3和pCI-SynGP5免疫组，pCI-GP5免疫组中IL-4及IFN-γ的分泌量较低，阴性对照组和pCI-neo免疫组的最低，如图8a和图8b。结果表明，修饰的ORF5基因可以诱导小鼠产生细胞因子应答，其中，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组诱导产生的Th1和Th2型细胞因子应答最高(结果见图8)。

实施例3表达修饰的GP5蛋白的真核质粒及其重组减毒沙门氏菌对仔猪的免疫特性研究

3.1重组减毒沙门氏菌的构建及鉴定

制备减毒沙门氏菌SL3263(猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株，中国兽医药品监察所，下同)的感受态细胞，然后通过电转化将重组质粒转移入减毒沙门氏菌SL3263中，转化后，将转化产物涂布含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。挑取转化出的单个菌落在含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD600nm＝1.0；采用碱裂法提取质粒，然后双酶切鉴定，证明获得重组减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5(图9)。

3.2猪体免疫和攻毒保护实验

将30头仔猪随机分为6组，每组5头，隔离饲养。第1组接种英国勃林格殷格翰公司的PRRSV活疫苗(1头份/头)，第2组接种质粒pCI-SynGP5/GP4-5(500μg/头)，第3组接种质粒pCI-neo(500μg/头)，前三组均为颈部肌肉免疫，第4、5组分别口服免疫SL-pCI-SynGP5/GP4-5(10⁸CFU/mL)和减毒沙门氏菌SL3263(10⁸CFU/mL)，2mL/头，第6组设为攻毒对照，免疫PBS。除了第1组，其余各组在两周后进行第二次免疫。二免后两周所有组用PRRSV SY0608(CGMCC No.4932)强毒株攻毒，每头猪滴鼻3mL TCID50为10^-5.0/mL的病毒液，每个鼻孔各1.5mL。

3.3免疫和攻毒后各项指标的检测

分别在首次免疫后14天(二免前)、28天(攻毒前)及攻毒后第7天、14天、21天采血，分离血清，用于PRRSV特异性ELISA抗体、中和抗体、血清中细胞因子及病毒血症检测。攻毒后每日观察记录猪的临床表现，测量每只猪直肠体温。所有组实验动物于攻毒后21天剖检，观察并记录肺脏病理变化，采集肺脏样品用于制备组织病理切片。

3.4结果

3.4.1PRRSV特异性的ELISA及中和抗体测定

结果见表1，，由表1可见：首免后2周，各组均未检出ELISA抗体和中和抗体，首免后4周，PRRSV活疫苗免疫组的ELISA抗体水平达到了1∶800，中和抗体水平为1∶4，其余各组中，除了SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫组产生了1∶100的ELISA抗体水平，其他各组的抗体水平均未检出。此结果说明，与PRRSV活疫苗免疫组相比，SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫组诱导产生了较低的体液免疫应答，pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-neo、SL3263和攻毒对照组都没有产生有效的体液免疫应答。

表1试验猪ELISA及中和抗体测定结果

3.4.2细胞因子的检测

应用英骏公司的猪细胞因子(IL-4及IFN-γ)ELISA检测试剂盒，检测细胞因子的含量。首免后2周，各组血清中均未检测出IFN-γ和IL-4的分泌。首免后4周，免疫猪的外周血淋巴细胞体外经特异性PRRSV抗原刺激后，各组上清中均能检测到IFN-γ的分泌，其中，PRRSV活疫苗免疫组的分泌量最高，其次为SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫组，差异显著性分析结果表明，SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫组与其他各组(除了PRRSV活疫苗免疫组)的差异均显著(P＜0.05)，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组、pCI-neo免疫组、SL3263免疫组和攻毒对照组产生的IFN-γ量较低。与此同时，各组上清中均未检出IL-4的细胞因子应答(结果见图10)。

3.4.3攻毒猪临床表现及体温变化

攻毒后，pCI-neo、SL3263免疫组和攻毒对照组体温升高至40-40.5℃，并持续一周左右，同时表现出食欲不振、喜卧、呼吸困难、咳嗽、轻度腹泻等临床症状；pCI-SynGP5/GP4-5免疫组的体温升高至40℃左右，也出现类似的临床症状；而PRRSV活疫苗免疫组和SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫组只是间断地有两三天的体温达到39.5℃，均没有出现类似明显的临床症状(结果见图11)

3.4.4病毒血症检测

与pCI-neo免疫组、SL3263免疫组和攻毒对照组相比，接种pCI-SynGP5/GP4-5、PRRSV活疫苗和SL-pCI-SynGP5/GP4-5的猪攻毒后7d血液中PRRSV RNA含量有明显的降低，差异极显著(P＜0.01)。SL-pCI-SynGP5/GP4-5免疫组攻毒后7d血液中PRRSV RNA含量显著低于pCI-SynGP5/GP4-5免疫组(P＜0.05)。攻毒后14d除对照组外，各组血液中病毒含量明显降低。该结果说明，SL-pCI-SynGP5/GP4-5、pCI-SynGP5/GP4-5和PRRSV活疫苗免疫组在一定程度上降低了病毒的感染，并且将减毒沙门氏菌作为载体后可提高质粒DNA对机体的免疫保护作用(结果见图12)。

3.4.5攻毒猪肺脏肉眼病变及组织病理学变化

攻毒后3周宰杀所有实验猪，观察肺脏的大体病变，结果为：pCI-neo免疫组、SL3263免疫组和攻毒对照组猪肺脏明显间质增宽、出血，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组有一定程度的病变，而SL-pCI-SynGP5/GP4-5和PRRSV活疫苗肺脏病变很不明显(表2)。

肺脏组织病变观察结果为：pCI-neo免疫组、SL3263免疫组和攻毒对照组所有猪均出现明显的肺泡壁增厚、单核细胞浸润、支气管分泌物增多和肺泡水肿等间质性肺炎(图13c、图13e、图13f)，pCI-SynGP5/GP4-5免疫组病变较轻微(图13b)，而SL-pCI-SynGP5/GP4-5和PRRSV活疫苗肺脏病变很不明显(图13d、图13a)，各组病变情况判定见表2。

表2试验猪肺脏大体病变和组织病理学变化

-，没有病变；+，轻度病变；++，中度病变；+++，严重病变

生物材料保藏信息

SY0608，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒与2011年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.4932。

Claims

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因，其特征在于序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因，其特征在于序列如SEQ ID NO.3所示。

3.含有权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因插入真核表达载体pCI的Xho I和Xba I酶切位点间。

5.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将SEQ ID NO.3所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因插入真核表达载体pCI的Xho I和Xba I酶切位点间。

6.含有权利要求5所述的重组质粒的减毒沙门氏菌。

7.SEQ ID NO.3所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。

8.权利要求5所述的重组质粒在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。

9.权利要求6所述的减毒沙门氏菌在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。