CN107823639A - 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的灭活疫苗及其制备方法,属于兽用生物制品领域。本发明所述疫苗由BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b四种基因亚型组成,牛病毒性腹泻灭活疫苗是利用细胞转瓶、全悬浮及微载体培养的传代细胞系进行病毒增殖,并对制苗工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示:使用本发明的牛病毒性腹泻灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应,所有的牛都产生了免疫保护,说明本发明的疫苗安全可靠,可预防不同BVDV基因亚型引起的疾病,本发明所述的疫苗还包括以上四个基因亚型抗原制备的各型单价灭活疫苗、二价灭活疫苗和四价灭活疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒的灭活疫苗及其制备方法,属于兽用生物制品领域。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由属于黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种病毒性传染病,主要侵害牛、羊、鹿、耗牛、猪等动物,各年龄牛均易感。临床主要表现为腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染与免疫耐受,免疫抑制,怀孕母畜流产或产生畸形胎儿等。1946年Olafson等在美国首次发现该病,以发热、腹泻和咳嗽为特征,称为牛病毒性腹泻。Ramsey和Chiverst于1953年首先发现了黏膜病(Mucosal disease,MD),1971年美国兽医协会将其统一命名为牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)。该病在世界范围内广泛分布,是造成全球养牛业经济损失的主要病原。另外,BVDV还是牛源生物制品(血清、冻精等)的潜在污染源,给相关领域造成巨大的经济损失。上世纪80年代初,李佑民等首次在流产胎儿的脾脏中分离并鉴定出BVDV,证明该病在我国的存在。血清学调查表明,BVD在我国呈上升趋势。
根据BVDV基因组5’-UTR的序列比较,可将BVDV分为I型、II型两个基因型,其中属于基因I型的BVDV I a与BVDV I b在世界范围内流行,而基因II型中主要流行的是BVDV IIa与BVDV II b。我国主要流行BVDV I a与BVDV I b,近年也出现了BVDV II a与BVDV II b的相关报道。
发明内容
本发明的目在于采用牛肾细胞(MDBK)繁殖牛病毒性腹泻病毒,将四种不同基因亚型的BVDV作为抗原分别制备成相应的单价苗、二价苗与四价疫苗,用于预防不同基因亚型BVDV引起的疾病。
本发明的技术方案
1.一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于该灭活疫苗由BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b四种基因亚型组成,含有BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b四种灭活抗原。
2.本发明所述的牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于所述灭活抗原是用牛病毒性腹泻病毒L株、牛病毒性腹泻病毒L2株、牛病毒性腹泻病毒T株和牛病毒性腹泻病毒D株制备的,其中L株病毒已于2017年03月15日、其他三株(L2株、T株和D株)于2017年10月26日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号分别为CGMCC No.13787、CGMCC No.14719、CGMCC No.14718和CGMCC No.14720。
3.本发明所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗的制备方法,其特征在于该方法步骤包括:
(1)细胞培养:将牛肾细胞系(MDBK)采用贴壁培养或/和悬浮培养或/和微载体培养的方式进行传代和培养;
(2)毒种繁殖:将牛病毒性腹泻病毒L株、牛病毒性腹泻病毒L2株、牛病毒性腹泻病毒T株和牛病毒性腹泻病毒D株作为生产种毒分别接种在牛肾细胞上,并通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原;
(3)抗原灭活:将制备的病毒液使用灭活剂进行灭活;
(4)配苗:将相应的佐剂与灭活好的抗原按一定比例进行配苗。
本发明具体实施方式
1.BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株的分离鉴定
本发明所用毒株BVDV-L株、BVDV-L2株均于2010年分离自疑似发病牛的粪便,BVDV-T株于2012年分离自疑似发病牛的白细胞,BVDV-D株在2014年分离自疑似发病牛的病料。上述四种病毒接种MDBK细胞后均可产生细胞病变,都能被BVDV标准阳性血清中和,BVDVIFA荧光抗体检测阳性,参照牛病毒性腹泻粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程规程(SN/T1905-2007),针对BVDV 5’-UTR设计特异性引物,引物序列如下:
BVDV-P1:5’-AGGCTAGCCA TGCCCTTAGT-3’20(序列1)
BVDV-P2:5’-TCTGCAGCAC CCTATCAGG-3’19(序列2)
RT-PCR后扩增出288bp特异性片段。
根据上述四种病毒5’-UTR的序列比较,BVDV-L株属于BVDV I a亚型,BVDV-L2株属于BVDV I b亚型,BVDV-T株属于BVDV II a亚型,BVDV-D株属于BVDV II b亚型。
2.抗原制备
本发明提供了利用转瓶贴壁培养、悬浮培养技术、微载体悬浮培养技术培养牛肾细胞系(MDBK,来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)用以制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原:
(1)利用转瓶贴壁培养细胞制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原
1)培养细胞:首先复苏种细胞MDBK到细胞瓶中,生长48小时左右,经EDTA-胰酶细胞分散液消化,按照体积比1:3的比例进行传代。加细胞生长液(含有10%(v/v)的小牛血清的DMEM培养液,pH值为7.0)转瓶培养,细胞长满单层90%~100%时,用于继续传代或接种病毒。
2)繁殖毒种:取生长良好的上述MDBK细胞,用PBS洗2~3次,将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照(V/V)0.1%的接毒量分别接种MDBK细胞,加入维持液(含2%(V/V)的小牛血清的DMEM培养液,pH值为7.0)进行培养。28~36小时细胞80%出现细胞病变时将转瓶置于-20℃反复冻融2~3次,收获细胞培养毒液作为生产用毒种。
3)接毒、收毒:当MDBK细胞已长满单层90%~100%左右时,弃去细胞生长液,用PBS洗2~3次,将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照(V/V)0.1%的接毒量分别接种MDBK细胞,加入维持液(含2%(V/V)的小牛血清的DMEM培养液,pH值为7.0)进行培养。28~36小时当细胞80%出现细胞病变时收获细胞培养毒液作为制苗用抗原。
(2)利用悬浮培养技术制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原1)细胞复苏及驯化:从液氮罐中取出保存的MDBK细胞,置37℃水浴锅内快速融化,1000r/rmin离心1min,弃去冻存液,用含8%~10%小牛血清的DMEM培养液重悬细胞,接种于细胞瓶中,培养48小时左右,用EDTA-胰酶细胞分散液消化,按照体积比1:5的比例进行传代。48小时后将细胞再次消化,收集细胞接种于250ml三角瓶中,置于37℃、100转/分振荡悬浮培养。调节pH值在6.8~7.4之间。待细胞增加至一定量时,转入专用悬浮培养瓶中进行培养,进行细胞训化,定期观察,直到细胞团块消失,细胞96h内生长到2~4×106个/ml。
2)反应器放大培养细胞:将驯化好的MDBK细胞接种至2L生物反应器,提高转速150r/min,充分悬浮细胞,降低转速至50~80r/min,加入消泡剂(体积比0.1%),培养72h,细胞密度达到2~4×106个/ml,更换15L反应器,降低转速至40~60r/min,加入低血清悬浮培养基(含1%小牛血清)培养,使细胞密度达到2×106个/ml,更换150L反应器,以转速150r/rmin,充分悬浮细胞,加入0.1%消泡剂,培养48~72h,当细胞密度达到2×106个/ml,放大至1000升反应器。
3)接毒、收毒:当细胞密度达到2×106个/ml时,将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照0.1%的接毒量分别在1000升反应器内进行接种,加入无血清专用悬浮培养基进行悬浮培养,每隔3小时取样,检测细胞形态,12~16小时收获上清液,同时用一定量的培养基重悬细胞,采用高压均质机将重悬的细胞进行压力破碎,释放病毒粒子,与之前收获的上清液混匀后作为制苗用抗原。
(3)利用微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原
1)细胞复苏及传代培养:复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中,生长48h左右,经EDTA-胰酶细胞分散液消化,按照体积比1:3的比例进行传代。细胞长满90%~100%时,用PBS洗涤2~3次,加入胰酶-EDTA溶液消化,收集细胞并计数,每升培养基中加入3~5克微载体Cytodex I(购自GE公司),按照每个微载体添加15~20个细胞的比例进行细胞接种。
2)生物反应器培养接种细胞:向生物反应器中加入细胞培养基(Gibco公司,DMEM高糖培养基,血清浓度为8%~10%),微载体投放量为3~5g/L,调节各项指标,溶氧量为35%、温度为36.7℃、搅拌速度为50~60r/min、pH为7.15~7.40;每个微载体上细胞数达到150个以上时,排出反应器中培养基,用PBS洗涤收集在容器中的微载体,并排出PBS,反复2~3次。
3)接毒、收毒:将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照0.1%的接毒量分别加入到生物反应器中,改变搅拌速度进行均匀接种,然后加入细胞培养基(含2%血清DMEM高糖培养基),进行病毒繁殖,控制反应器中培养条件:溶氧量为25%、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.4。培养结束后分别收集病毒液作为制苗用抗原。
(4)病毒液灭活
制备的病毒液按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯净性检验,应无细菌、霉菌、支原体,且每毫升BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒含量均不低于107.5TCID50。使用甲醛或BEI灭活,检验合格后,进行乳化配苗。
将检验合格的BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒,分别置于不同容器内,加入一定工作浓度的甲醛或BEI,30℃~37℃,灭活24~36小时,取样按10%接种量接种MDBK细胞,盲传三代,进行灭活检测。
(5)乳化配苗
1)单苗的配制
将分别制得的BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒灭活抗原与佐剂按体积比1:1进行混合乳化,分别配制成BVDV I a型、BVDV I b型、BVDV II a型、BVDV II b型单价苗。
2)二价苗的配制
将分别制得的BVDV-L株、BVDV-L2株病毒灭活抗原按比例混合,使得每剂量疫苗中,灭活前BVDV的抗原含量均不低于107.5TCID50/ml,将抗原缓缓注入佐剂中,按抗原:佐剂体积比1:1进行混合乳化,配制成BVDV I a+b型二价苗。
将分别制得的BVDV-T株、BVDV-D株病毒灭活抗原按体积比混合,使得每剂量疫苗中,灭活前BVDV的抗原含量均不低于107.5TCID50/ml,将抗原缓缓注入佐剂中,按抗原:佐剂体积比1:1进行混合乳化,配制成BVDV II a+b型二价苗。
3)四价苗的配制
将分别制得的BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒灭活抗原按一定比例混合,使得每剂量疫苗中,灭活前BVDV的抗原含量均不低于107.5TCID50/ml,将抗原缓缓注入佐剂中,按抗原:佐剂体积比1:1进行混合乳化,配制成BVDV I(a+b)、II(a+b)型四价疫苗。
3.疫苗成品检验
(1)无菌检验
按现行《中国兽药典》附录(中华人民共和国兽药典二〇一五年版三部,中国农业出版社,2016年,本发明称《中国兽药典》)进行,应符合规定。
(2)安全性试验
试验共需对7种疫苗进行安全性试验,方法一致。下述为检测一种疫苗安全性试验的方法。
1)替代动物试验:
试验选用1.5~2.0kg的健康家兔6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组家兔各腿部肌肉注射疫苗1.0ml,对照组家兔各腿部肌肉注射细胞培养物1.0ml,连续观察7天并每天下午定点测量体温,应不出现死亡及不良反应,无临床异常表现,体温正常。
选用350~400g健康雌性豚鼠6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗0.5ml,对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物0.5ml,连续观察7天,应不出现死亡及不良反应,无临床异常表现。
2)本体动物试验:试验选用6月龄以上BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml,对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml;选用2~3月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感犊牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组犊牛各头颈部肌肉注射疫苗2.0ml,对照组犊牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml。连续观察14天,应不出现死亡及不良反应,无临床异常表现,体温正常。
(3)效力试验
试验共需对7种疫苗进行效力试验,方法基本一致。下述为检测单价苗效力试验的方法,多价苗稍有不同,具体方法见实施例2。
1)中和抗体检测法:试验选用350~400g健康雌性豚鼠8只(BVDV血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性),其中免疫组5只,对照组3只,免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗0.2ml,对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物0.2ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天心脏采血测定中和抗体水平,应至少4只豚鼠的BVDV中和抗体效价≥1:64。
2)牛体免疫攻毒法:试验选用2~3月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛10头,其中免疫组5头,攻毒对照组5头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗1.0ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天将免疫组连同攻毒对照牛5头,共计10头牛进行BVDV强毒攻毒,每头牛左右鼻孔、口腔、颈部两侧肌肉各注射2.0ml BVDV强毒株。攻毒后连续观察14天,每天上午定点测量体温,观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测与病毒分离。攻毒对照牛均应至少3头发病,免疫组牛均应至少4头保护。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明制苗用毒株:BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均为本发明在我国国内分离获得,其中L株病毒已于2017年03月15日、其他三株(L2株、T株和D株)于2017年10月26日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号分别为CGMCC No.13787、CGMCC No.14719、CGMCC No.14718和CGMCC No.14720。牛肾细胞系(MDBK)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(保藏编号:CL21,请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著,中国兽医菌种目录(第二版),中国农业科学技术出版社,2002年,p166)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种预防牛病毒性腹泻病毒的灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b四种灭活抗原,包括BVDV Ia型、BVDV I b型单价苗,BVDV I a+b型二价苗;BVDV II a型、BVDV II b型单价苗,BVDV IIa+b型二价苗与BVDV I(a+b)、II(a+b)型四价疫苗共7种疫苗;该7种灭活疫苗采用细胞转瓶、全悬浮及微载体培养三种不同方法进行培养,并对该疫苗制备方法中的病毒增殖、制苗工艺等进行了优化。疫苗安全和效力检验结果显示:使用本发明的BVD灭活疫苗免疫牛后没有任何局部和全身不良反应,所有的牛都产生了免疫保护,说明本发明的疫苗安全可靠,可预防不同BVDV基因亚型引起的疾病。
实施例
实施例1
——牛病毒性腹泻灭活疫苗的制备
1.抗原制备
本实施例提供了利用转瓶贴壁培养、悬浮培养技术、微载体悬浮培养技术培养牛肾细胞系(MDBK)制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒的方法。
(1)利用转瓶贴壁培养细胞制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原
1)培养细胞:首先复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中,生长48小时左右,经EDTA-胰酶细胞分散液消化,按照体积比1:3的比例进行传代。加细胞生长液(含有10%(v/v)的小牛血清的DMEM培养液,pH值为7.0)转瓶培养,细胞长满单层90%~100%时,用于分别接种BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒。
2)繁殖毒种:将上述生长良好的MDBK细胞用PBS洗2~3次,将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照(V/V)0.1%的接毒量分别接种MDBK细胞,加入维持液(含2%(V/V)的小牛血清的DMEM培养液,pH值为7.0)进行培养。28~36小时细胞80%出现细胞病变时将转瓶置于-20℃反复冻融2~3次,收获细胞培养毒液作为生产用毒种。
3)抗原制备:当MDBK细胞已长满单层90%~100%左右时,弃去细胞生长液,用PBS洗2~3次,将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照(V/V)0.1%的接毒量分别接种MDBK细胞,加入维持液(含2%(V/V)的小牛血清的DMEM培养液,pH值为7.0)进行培养。28~36小时当细胞80%出现细胞病变时收获细胞培养毒液作为制苗用抗原。
(2)利用悬浮培养技术制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原
1)细胞复苏及驯化:从液氮罐中取出保存的MDBK细胞,置37℃水浴锅内快速融化,1000r/rmin离心1min,弃去冻存液,用含8%~10%小牛血清的DMEM培养液重悬细胞,接种于细胞瓶中,培养48小时左右,用EDTA-胰酶细胞分散液消化,按照体积比1:5的比例进行传代。48小时后将细胞再次消化,收集细胞接种于250ml三角瓶中,置于37℃、100转/分振荡悬浮培养。调节pH值在6.8~7.4之间。待细胞增加至一定量时,转入专用悬浮培养瓶中进行培养,进行细胞驯化化,定期观察,直到细胞团块消失,细胞96h内生长到2~4×106个/ml。
2)反应器放大培养细胞:将驯化好的MDBK细胞接种至2L生物反应器,提高转速150转/分,充分悬浮细胞,降低转速至50~80r/rmin,加入消泡剂(体积比0.1%),培养72h,细胞密度达到2~4×106个/ml,更换15L反应器,降低转速至40~60r/rmin,加入低血清悬浮培养基(含1%小牛血清)培养,使细胞密度达到2×106个/ml,更换150L反应器,以转速150r/rmin,充分悬浮细胞,加入0.1%消泡剂,培养48~72h,当细胞密度达到2×106个/ml,放大至1000升反应器。
3)接毒、收毒:当细胞密度达到2×106个/ml时,将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照0.1%的接毒量分别在1000升反应器内进行接种,加入无血清专用悬浮培养基进行悬浮培养,每隔3小时取样,检测细胞形态,12~16小时收获上清液,同时用一定量的培养基重悬细胞,采用高压均质机将重悬的细胞进行压力破碎,释放病毒粒子,与之前收获的上清液混匀后作为制苗用抗原。
(3)利用微载体悬浮培养技术制备BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株抗原
1)细胞复苏及传代培养:复苏种细胞牛肾细胞系MDBK到细胞瓶中,生长48h左右,经EDTA-胰酶细胞分散液消化,按照体积比1:3的比例进行传代。细胞长满90%~100%时,用PBS洗涤2~3次,加入胰酶-EDTA溶液消化,收集细胞并计数,每升培养基中加入3~5克微载体Cytodex I(购自GE公司),按照每个微载体添加15~20个细胞的比例进行细胞接种。
2)生物反应器培养接种细胞:向生物反应器中加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基,血清浓度为8%~10%),微载体投放量为3~5g/L,调节各项指标,溶氧量为35%、温度为36.7℃、搅拌速度为50~60r/min、pH为7.15~7.40;每个微载体上细胞数达到150个以上时,排出反应器中培养基,用PBS洗涤收集在容器中的微载体,并排出PBS,反复2~3次。
3)接毒、收毒:将BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株均按照0.1%的接毒量分别加入到生物反应器中,改变搅拌速度进行均匀接种,然后加入细胞培养基(含2%血清DMEM高糖培养基),进行病毒繁殖,控制反应器中培养条件:溶氧量为25%、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.4。培养结束后分别收集病毒液作为制苗用抗原。
(4)病毒液灭活
制备的病毒液按照《中国兽药典》附录进行纯净性检验,无细菌、霉菌、支原体。
病毒液病毒含量如表1。
表1 病毒含量测定结果
结果显示BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒含量均不低于107.5TCID50/ml。
1)BEI配制:将0.4mol/L BEA和0.4mol/L NaOH按体积比1:1混合,37℃环化1小时,生成BEI,调节pH至7.2~7.6。
2)灭活及检验:将检验合格的BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒,分别置于不同容器内,加入工作浓度为0.003M的BEI,30℃,灭活24~36小时,取样按10%接种量接种MDBK细胞,盲传三代,进行灭活检测。
3)中和:灭活完全后,加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。
(5)乳化配苗
将分别制得的BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒灭活抗原与206佐剂按体积比1:1进行混合乳化,保持30℃,分别配制成BVDV I a型、BVDV I b型、BVDV II a型、BVDV II b型单价苗。
将分别制得的BVDV-L株、BVDV-L2株病毒灭活抗原按比例混合,使得每剂量疫苗中,灭活前BVDV的抗原含量均不低于107.5TCID50/ml,将抗原缓缓注入206佐剂中,按抗原:佐剂体积比1:1进行混合乳化,保持30℃,配制成BVDV I a+b型二价苗。
将分别制得的BVDV-T株、BVDV-D株病毒灭活抗原按比例混合,使得每剂量疫苗中,灭活前BVDV的抗原含量均不低于107.5TCID50/ml,将抗原缓缓注入206佐剂中,按抗原:佐剂体积比1:1进行混合乳化,保持30℃,配制成BVDV II a+b型二价苗。
将分别制得的BVDV-L株、BVDV-L2株、BVDV-T株、BVDV-D株病毒灭活抗原按比例混合,使得每剂量疫苗中,灭活前BVDV的抗原含量均不低于107.5TCID50/ml,将抗原缓缓注入206佐剂中,按抗原:佐剂体积比1:1进行混合乳化,保持30℃,配制成BVDV I(a+b)、II(a+b)型四价疫苗。
实施例2
——牛病毒性腹泻灭活疫苗的成品检验
1.无菌检验:按现行《中国兽药典》附录进行,应符合规定。上述检验结果见表2。
表2 物理性状、无菌检验结果
2.安全检验
(1)替代动物检验
1)单价疫苗(BVDV I a灭活苗,BVDV I b灭活苗,BVDV II a灭活苗和BVDV II b灭活苗):
每一种疫苗各用1.5~2.0kg的健康家兔6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组家兔各腿部肌肉注射疫苗1.0ml,对照组家兔各腿部肌肉注射细胞培养物1.0ml,连续观察7天并每天下午定点测量体温,结果,四种疫苗的检验动物均健活,免疫组腿部注射部位触摸无异样,无流鼻液、打喷嚏等症状,精神、采食正常,体温均低不高于40.0℃。
另每一种疫苗各选用350~400g健康雌性豚鼠6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗0.5ml,对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物0.5ml,连续观察7天,结果四种疫苗的检验动物均健活,免疫组颈部皮下触摸无硬块,无流鼻液、打喷嚏等症状,精神、采食正常。
2)BVDV I a+b二价灭活苗和BVDV II a+b二价灭活苗:
每种二价疫苗各用1.5~2.0kg的健康家兔6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组家兔各腿部肌肉注射疫苗2.0ml(两点注射,1.0ml/点),对照组家兔各腿部肌肉注射细胞培养物2.0ml(两点注射,1.0ml/点),连续观察7天并每天下午定点测量体温,结果两种二价疫苗的检验动物均健活,免疫组腿部注射部位触摸无异样,无流鼻液、打喷嚏等症状,精神、采食正常,体温均低不高于40.0℃。
另每种疫苗各选用350~400g健康雌性豚鼠6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗1.0ml(两点注射,0.5ml/点),对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物1.0ml(两点注射,0.5ml/点),连续观察7天,结果两种二价疫苗的检验动物均健活,免疫组颈部皮下触摸无硬块,无流鼻液、打喷嚏等症状,精神、采食正常。
3)BVDV I(a+b)、II(a+b)四价疫苗:
用1.5~2.0kg的健康家兔6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组家兔各腿部肌肉注射疫苗4.0ml(四点注射,1.0ml/点),对照组家兔各腿部肌肉注射细胞培养物4.0ml(四点注射,1.0ml/点),连续观察7天并每天下午定点测量体温,结果检验动物均健活,免疫组腿部注射部位触摸无异样,无流鼻液、打喷嚏等症状,精神、采食正常,体温均低不高于40.0℃。
另选用350~400g健康雌性豚鼠6只,其中免疫组4只,对照组2只,免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗1.0ml(两点注射,0.5ml/点)、腿部肌注1.0ml(两点注射,0.5ml/点),对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物1.0ml(两点注射,0.5ml/点)、腿部肌注1.0ml(两点注射,0.5ml/点),连续观察7天,结果检验动物均健活,免疫组颈部皮下触摸无硬块,无流鼻液、打喷嚏等症状,精神、采食正常。
(2)本动物检验
1)单价疫苗(BVDV I a灭活苗,BVDV I b灭活苗,BVDV II a灭活苗和BVDV II b灭活苗):每一种疫苗用6月龄以上BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml,对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml;选用2月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感犊牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组犊牛各头颈部肌肉注射疫苗2.0ml,对照组犊牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml。连续观察14天,结果四种单价疫苗组检验动物均健活,颈部肌肉注射部位触摸无异样,无流鼻液、流眼泪、打喷嚏等症状,精神、采食正常,体温均不高于40.0℃。
2)BVDV I a+b二价灭活苗和BVDV II a+b二价灭活苗:每种疫苗用6月龄以上BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗4.0ml,对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml;选用2月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感犊牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组犊牛各头颈部肌肉注射疫苗4.0ml,对照组犊牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml。连续观察14天,结果两种疫苗检验动物均健活,颈部肌肉注射部位触摸无异样,无流鼻液、流眼泪、打喷嚏等症状,精神、采食正常,体温均不高于40.0℃。
3)BVDV I(a+b)、II(a+b)四价疫苗:用6月龄以上BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗8.0ml(两点注射,4.0ml/点),对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物8.0ml(两点注射,4.0ml/点);选用2月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感犊牛4头,其中免疫组2头,对照组2头,免疫组犊牛各头颈部肌肉注射疫苗8.0ml(两点注射,4.0ml/点),对照组犊牛各颈部肌肉注射细胞培养物8.0ml(两点注射,4.0ml/点)。连续观察14天,结果检验动物均健活,颈部肌肉注射部位触摸无异样,无流鼻液、流眼泪、打喷嚏等症状,精神、采食正常,体温均不高于40.0℃。
安全检验结果见表3。
表3 安全检验结果
3.效力检验
(1)中和抗体检测法
1)单价疫苗(BVDV I a灭活苗,BVDV I b灭活苗,BVDV II a灭活苗和BVDV II b灭活苗):选用350~400g健康雌性豚鼠8只(BVDV血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性),其中免疫组5只,对照组3只,免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗0.2ml,对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物0.2ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天心脏采血测定中和抗体水平,4只豚鼠的BVDV I a中和抗体效价>64(检验结果见表4)。
表4 效力(豚鼠)检测结果-单价苗
2)BVDV I a+b二价灭活苗和BVDV II a+b二价灭活苗:每种选用350~400g健康雌性豚鼠12只(BVDV血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性),其中免疫组10只,5只用于检测BVDV I a抗体水平,5只用于检测BVDV I b抗体水平,对照组2只,免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗0.4ml,对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物0.4ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天心脏采血测定中和抗体水平,5只豚鼠的BVDV I a中和抗体效价>64,5只豚鼠的BVDV I b中和抗体效价>64(检验结果见表5)。
3)BVDV I(a+b)、II(a+b)四价疫苗:选用350~400g健康雌性豚鼠22只(BVDV血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性),其中免疫组20只,5只用于检测BVDV I a抗体水平,5只用于检测BVDV I b抗体水平,5只用于检测BVDV II a抗体水平,5只用于检测BVDVII b抗体水平,对照组2只,免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗0.8ml(两点注射,0.4ml/点),对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物0.8ml(两点注射,0.4ml/点),21天后同样方式加强免疫,二免后21天心脏采血测定中和抗体水平,5只豚鼠的BVDV I a中和抗体效价>64,5只豚鼠的BVDV I b中和抗体效价>64,5只豚鼠的BVDV II a中和抗体效价>64,5只豚鼠的BVDV II b中和抗体效价>64(检验结果见表5)。
表5 效力(豚鼠)检测结果-多价苗
(2)牛体免疫攻毒法
1)单价灭活苗(BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b):每一种单价疫苗选用2~3月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛10头,其中免疫组5头,攻毒对照组5头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗1.0ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天将免疫组连同攻毒对照牛5头,共计10头牛进行BVDV强毒攻毒,每头牛左右鼻孔、口腔、颈部两侧肌肉各注射2.0ml BVDV强毒。攻毒后连续观察14天,每天上午定点测量体温,观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测,结果见表6(BVDV I a灭活苗),BVDV I b灭活苗效检结果见表7,BVDV II a灭活苗效检结果见表8,BVDV II b灭活苗效检结果见表9。
表6 BVDV I a单价苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
表7 BVDV I b单价苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
表8 BVDV II a单价苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
表9 BVDV II b单价苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
2)二价灭活苗(BVDV I a+b和BVDV II a+b):每一种二价疫苗选用2~3月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛20头,其中免疫组10头,攻毒对照组10头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天将免疫组连同攻毒对照牛10头,共计20头牛进行BVDV强毒攻毒,攻毒方式为每头牛左右鼻孔、口腔、颈部两侧肌肉各注射2.0ml BVDV强毒。攻毒后连续观察14天,每天上午定点测量体温,观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测,结果见表10和11。
3)BVDV I(a+b)、II(a+b)四价疫苗:选用2~3月龄BVDV抗原、抗体双阴性(抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性)的健康易感牛40头,其中免疫组20头,攻毒对照组20头,免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗4.0ml,21天后同样方式加强免疫,二免后21天将免疫组连同攻毒对照牛20头,共计40头牛进行BVDV强毒攻毒,其中10头牛(5头免疫,5头攻毒对照)使用BVDV-L株攻毒,10头牛(5头免疫,5头攻毒对照)使用BVDV-L2株攻毒,10头牛(5头免疫,5头攻毒对照)使用BVDV-T株攻毒,10头牛(5头免疫,5头攻毒对照)使用BVDV-D株攻毒,攻毒方式为每头牛口腔、左右鼻孔和颈部两侧肌肉各注射2.0ml BVDV强毒(分5个点,共10ml)。攻毒后连续观察14天,每天上午定点测量体温,观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测,结果见表12。
表10 BVDV I a+b二价苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
表11 BVDV II a+b二价苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
表12 BVDV I(a+b)、II(a+b)四价疫苗检测结果
注:符合体温升高、有明显临床症状、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。
结果表明,使用BVDV单价苗(BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b)、二价苗(BVDV I a+b、BVDV II a+b)、四价疫苗(BVDV I(a+b)、II(a+b))免疫牛后,能够有效抵抗强毒株的攻击,对BVDV强毒株的保护率至少为80%。
序列表
<120> 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法
<130> 17199
<141> 2017-11-10
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aggctagcca tgcccttagt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tctgcagcac cctatcagg 19
Claims (11)
1.一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于该灭活疫苗是由BVDV I a、BVDV I b、BVDVII a、BVDV II b四种基因亚型灭活抗原制备的牛病毒性腹泻灭活疫苗。
2.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于所述灭活抗原是用牛病毒性腹泻病毒L株、牛病毒性腹泻病毒L2株、牛病毒性腹泻病毒T株和牛病毒性腹泻病毒D株制备的,其中L株病毒已于2017年03月15日、其他三株(L2株、T株和D株)于2017年10月26日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号分别为CGMCC No.13787、CGMCC No.14719、CGMCCNo.14718和CGMCC No.14720。
3.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV I a亚型引起BVD的灭活疫苗,即BVDV I a亚型灭活疫苗。
4.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV I b亚型引起BVD的灭活疫苗,即BVDV I b亚型灭活疫苗。
5.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV II a亚型引起BVD的灭活疫苗,即BVDV II a亚型灭活疫苗。
6.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV II b亚型引起BVD的灭活疫苗,即BVDV II b亚型灭活疫苗。
7.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV I a、BVDV I b亚型所引起的BVD灭活疫苗,即BVDV I a+b二价灭活疫苗。
8.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV II a、BVDV II b亚型所引起的BVD灭活疫苗,即BVDV II a+b二价灭活疫苗。
9.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗,其特征在于包括用于BVDV I型、II型(均包括a、b亚型)所引起的BVD灭活疫苗,即BVDV I(a+b)、II(a+b)型四价灭活疫苗。
10.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗的制备方法,其特征在于该方法步骤包括:
(1)细胞培养:使用MDBK细胞进行传代和培养;
(2)毒种繁殖:将牛病毒性腹泻病毒L株、牛病毒性腹泻病毒L2株、牛病毒性腹泻病毒T株和牛病毒性腹泻病毒D株作为生产种毒分别接种牛肾细胞,并通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原;
(3)抗原灭活:将制备的病毒液使用灭活剂进行灭活;
(4)配苗:将相应的佐剂与灭活好的抗原按一定比例进行配苗。
11.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻灭活疫苗的制备方法,其特征在于该方法中MDBK细胞是采用贴壁培养或/和悬浮培养或/和微载体培养的方式进行传代和培养。
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