CN110004100A - 一株重组o型口蹄疫病毒vp1基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株重组O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法。本发明以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，以蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的O型口蹄疫病毒VP1基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌RA343‑VP1‑FMDV‑O株。该重组疫苗株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，能产生针对FMDV VP1抗体，从而实现对FMD的免疫保护。该重组疫苗株按特定工艺开发成具有耐热保护特点的新型疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和口蹄疫的双重免疫保护。

Description

一株重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗 生产方法
技术领域
本发明涉及一株重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法， 属兽用生物制品领域。
技术背景
布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特 征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性 能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫 生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。 目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中 国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。
2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分 离到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发现了一株牛种布鲁氏菌分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利申请人已对其进行了 全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介于强毒和弱毒之间， 测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为Abortus 343。本发明对此分离株进行了诱导和驯化，筛 选获得了稳定的粗糙型布鲁氏菌疫苗株，命名为RA343，并已取得相关专利(ZL201410240895.6)。目前该疫苗株已经完成了全部的实验室研发和临床试验，进入新兽药注册环节。
口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus, FMDV)引起的牛、羊等的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫病毒有7个血清 型(O型，A型，C型，AsiaI型，SAT1，SAT2，SAT3)，每种血清型之间均没有交叉保护力，即任意一种血清型均可单独引起口蹄疫的暴发，其中O型分布最广，也是引起口蹄 疫暴发流行的主要的血清型。其中O型分布最广，也是引起口蹄疫暴发流行的主要的血清 型。在中国，O型口蹄疫成散在发生，主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。VP1蛋白是FMDV 的主要结构蛋白，也是病毒感染细胞的关键，具有与细胞受体结合的位点，所以VP1基因 是研制基因工程疫苗的首选靶抗原。
发明内容
本发明的目的是以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，利用蔗糖自杀质粒 为载体，将含有特定启动子序列的O型FMDV VP1基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁 氏菌基因组中，构建了能够高效表达型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌RA343-VP1(FMDV-O)株。该重组疫苗株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良 好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，能产生针对FMDV VP1抗体，从而实现对FMD 的免疫保护。该重组菌株制备疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和口蹄疫的双重免疫保护。
本发明的技术方案
1.一株重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫 动物后能同时实现对布病和O型口蹄疫的双重免疫保护，其生产菌株是一株含有能够高效 表达O型口蹄疫病毒VP1基因的的重组粗糙型布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株(简称布 鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株)，该菌株是通过将P3启动子与VP1序列进行密码子优化， 人工合成基因片段，并构建含有P3-VP1(FMDV-O)序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖 自杀质粒载体pUC/P3-VP1+，将鹦鹉热衣原体外膜蛋白VP1基因表达框部分无痕插入到布 鲁氏菌基因组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测 序鉴定其稳定性，获得重组粗糙型布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株。并于2019年03月14 日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.17333。
2.本发明所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于其生产用重组布鲁氏菌 RA343-VP1-FMDV-O株菌区别于其他细菌的特异性是采用一对特异性PCR引物扩增出大小 为1031bp的特异性片段(序列23)；
重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株VP1(FMDV-O)基因的表达验证是通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方式验证VP1(FMDV-O)基因转录水平的表达；
通过蛋白印记法(Western Blot)验证VP1(FMDV-O)基因在蛋白水平的表达；
将重组菌免疫小鼠，监测小鼠体内VP1(FMDV-O)抗体的表达情况。
3.本发明所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗的生产方法是用胰 蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.17333株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的 1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.17333株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h， 加入兽用生物制品冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型 RA343-VP1-FMDV-O株牛种布鲁氏菌病疫苗。
4.如权利要求1和3所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗其中的冻干 保护剂，其配方为：PVP 5～15g，BSA5～15g，海藻糖50～100g，甘露醇50g，硫脲 10～15g，抗坏血酸2g，维生素C 2g，199培养2g，磷酸氢二钾1.25g，磷酸二氢钾0. 52g，溶于注射用水1000ml中。
5.本发明所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫效果是通过将 疫苗免疫绵羊后，分别采用布鲁氏菌及鹦鹉热衣原体进行攻毒保护试验进行评价。
本发明的有益效果
1.布鲁氏菌病和口蹄疫是严重危害我国牛羊养殖业的两大疫病。本发明用布鲁氏菌疫 苗RA343为载体，构建了能成功表达了O型FMDV VP1基因的新型疫苗株——重组布鲁氏 菌RA343-VP1-FMDV-O株，巧妙解决了我国当前牛羊群中两种重要疾病(布鲁氏菌病和O型口蹄疫)的防控难题，实现了“一针防两病”的构想，减少了生产实践中的免疫成本和劳动力成本；2.目前就全球范围内，困扰布病免疫防控的关键技术难题是疫苗免疫产生的抗体(光滑型抗体)干扰了布病的临床诊断。而本发明采用粗糙型布鲁氏菌(RA343株)作为 载体，疫苗免疫动物后产生的是粗糙型抗体，不干扰布病的临床诊断，从根本上改进了现有布病疫苗的弱点；3.本发明弥补了O型口蹄疫疫苗缺少细胞免疫的不足，提高了免疫保护效果。考虑到口蹄疫弱毒疫苗毒力返强的风险，目前全球均使用灭活疫苗预防O型口蹄疫，要想取得较好的免疫效果，往往需要使用高浓度的病毒抗原，从而加大动物机体的免疫负荷， 过多消耗免疫潜能。即便如此，基于以体液免疫为主的O型口蹄疫灭活疫苗也常常出现免 疫失败的现象。本发明采用布鲁氏菌RA343活疫苗株作为载体，在诱导产生针对O型口蹄疫病毒VP1抗体的同时，也有效诱导宿主产生强烈的细胞免疫反应，从而实现了对O型口 蹄疫良好的免疫保护；4.本发明从根本上缩短了常规口蹄疫疫苗的生产周期，大幅降度生 产成本。将经典的病毒培养转化为细菌发酵，使O型口蹄疫疫苗的生产成本发生本质降低。 以前为了尽量提高O型口蹄疫疫苗的免疫保护效果，往往需要培养大量病毒，并进行高度 浓缩，从而获得足够浓度的抗原用于生产疫苗。本发明中由于O型口蹄疫病毒VP1基因被 稳定整合到粗糙型布鲁氏菌活疫苗RA343基因组中，因此只需要按照细菌发酵方式，经过 36小时发酵培养，即可生产出大量的抗原，满足疫苗生产的需要，省时省力又省心；5.为 了确保O型口蹄疫病毒VP1抗原稳定高效表达，本发明一方面采用无痕插入技术代替质粒 介导，直接将O型FMDV VP1基因插入到布鲁氏菌疫苗株RA343的基因组中，并通过传代 验证了其稳定性，从而确保了外源基因不会因为在生产传代过程中被丢失。另一方面，发明 实施过程中我们以布鲁氏菌易于翻译的密码子代替VP1基因中稀有密码子，这种对密码子 进行优化的方法促进了外源基因的高效表达。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明中涉及的微生物资源为牛种布鲁氏菌RA343株，该株菌是2009年本实验室从 山东某奶牛场流产牛体内分离到一株牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)分离株A343株的 诱导和驯化而获得一株粗糙型弱毒菌株，该株均已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏 中心，保藏号为：CGMCC No.8886；牛种布鲁氏菌2308株菌(即为CVCC 788株)，羊种 布鲁氏菌BM28株菌(即为CVCC 920株)由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏和供 应，见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第 二版，中国农业科技出版社，2002，p24、p29)。
附图说明
图1绿色荧光质粒GFP-pZL1790质粒图谱。
图2重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株PCR特异性结果图中1为marker，2 为重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株，3为大肠杆菌，4为葡萄球菌和5为沙门氏菌。
图3qPCR验证VP1基因相对表达量(The relative expression VP1-FMDV-O gene)图 中纵坐标为相对表达值。1为RA343菌株，2为重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株。
图4重组疫苗Western Blot鉴定图中纵坐标为450nm吸收值(absorbamce at450nm)； 横坐标为感染后的时间(day post infenction)。1为RA343菌株，2为重组布鲁氏菌 RA343-VP1-FMDV-A株，3为marker。
图5VP1基因诱导的特异性抗体反应结果。
图6冻干曲线示意图图中纵坐标为温度(℃)；横坐标为冻干时间。
本发明具体实施方式
1.重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株的构建
(1)布鲁氏菌RA343表达外源基因的启动子筛选(详见实施例1)
根据布鲁氏菌RA343(CGMCC No.8886，ZL201410240895.6)全基因组及基因功能预测的分析，筛选出三个在布鲁氏菌中可持续高水平表达的分子伴侣的启动子P1、P2、 P3，并分别在绿色荧光质粒GFP-pZL1790(本实验室构建)的绿色荧光基团上游插入布鲁 氏菌启动子P1、P2、P3及常见启动子tac、trc、T7，构建六种携带不同启动子的绿色荧光 质粒P1-GFP-pZL1790，P2-GFP-pZL1790，P3-GFP-pZL1790，tac-GFP-pZL1790， trc-GFP-pZL1790，以及T7-GFP-pZL1790。分别将其电转到布鲁氏菌RA343株中，通过绿 色荧光蛋白相对表达量的高低筛选出适合的用于外源基因表达的强启动子P3。
(2)是通过将P3启动子与O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的进行密码子优化， 人工合成基因片段，并构建含有P3-VP1-FMDV-O序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自 杀质粒载体pUC/P3-VP1+，及无痕插入将口蹄疫基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因 组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其 稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovine brucella)重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株。
2.重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株的常规生物学特性
(1)形态和生化特性
重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆 光观察微带蓝色乳光。染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～ 0.6μm之间。革兰氏染色为阴性。该菌的生长不依赖于CO2，能在含硫瑾和碱性复红的培 养基上生长，H2S试验强阳性。
(2)热凝集试验、吖啶黄实验和菌落结晶紫试验结果表明重组布鲁氏菌 RA343-VP1-FMDV-O株菌保留了鲁氏菌RA343株菌的粗糙型特性。
(3)特异性
1)血清学特异性以重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株菌培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应不出现凝集，与粗糙型血清应出现凝集。
2)PCR特异性PCR反应结果表明扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应 出现1条特异性PCR条带(附图2)，大小为1031bp。
(4)毒力
用生理盐水将在固体培养基上培养48～72h的培养物洗下，稀释成每毫升含活菌10 亿的悬液，腹股沟皮下注射体重350～400g的豚鼠(Hartley品系)5只，1ml/只。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据其生长的菌落数，计 算吞噬脾脏的含菌量，每1g脾脏含菌量应不超过20万个。
(5)小鼠的安全性
体重20～20g的Balb/C小鼠分成5只/组，将重组菌RA343-VP1-FMDV-O株稀释成1×1012CFU/ml至1×108CFU/ml的菌悬液，腹股沟皮下注射0.1ml/只，同时设立对照组。 接种后1周内观察并记录小鼠的健康状况，结果接种1011CFU/只及以下重组菌的免疫组的 小鼠6日全部健活。结果表明重组疫苗以不同剂量免疫非靶动物具有良好的安全性。
3.重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗的制备
该疫苗是用表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株作为生产菌株，其生产方法是：以用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.17333株 的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.17333株种子 菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，优选 为耐热保护剂，经充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型 RA343-VP1-FMDV-O株布鲁氏菌病疫苗；该疫苗免疫动物后能同时实现对布病和O型口 蹄疫的双重免疫保护。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——重组布鲁氏菌株RA343-VP1-FMDV-O的构建
1.布鲁氏菌RA343感受态细胞的制备
挑取布鲁氏菌RA343株单个接菌落，接种与100ml TSB培养基中培养至细菌生长对数 期，放冰水中冷却。12000r/min离心10min，弃去液体培养基，再分别用不同体积的无菌去 离子水反复洗涤数次。最后将获得的菌体重悬于1ml 10％的甘油水溶液中，将制备完成的亲 本株RA343株感染态细菌置于-80℃保存备用。
2.布鲁氏菌RA343表达外源基因的启动子筛选
(1)绿色荧光质粒GFP-pZL1790的构建
pZL1790质粒由本实验室保存，GFP绿色荧光基因由上海生工公司合成，设计引物(序 列28和序列29)扩增绿色荧光基因并添加酶切位点，引物序列如下：
序列28GFP-F：tgagtcgaca tggtctcgaa gggcgaagaa 30
序列29GFP-R：ataccgcggt tacttataca gttca 25
上游引物加入Sal I酶切位点，下游引物加入Sac I酶切位点，使用上述引物以GFP绿色荧光基因为模板进行PCR，反应体系如下：
PCR反应体系(50μL)：Max 2×buffer 25μL，上下游引物(10μM)各 1μL，ddH2O 22μL，模板DNA1μL。
反应条件：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃30s，31个循环；72℃10min。
将6×Loading Buffer100μL与PCR扩增产物20μL充分混匀后加入0.8％的琼脂 糖凝胶孔中，150V电泳25min左右，用凝胶成像系统成像分析，切取含目的片段的琼脂 糖凝胶块，按照Takara凝胶回收试剂盒(Code No:9762)说明书进行PCR产物的回收 纯化。对绿色荧光基因回收产物与pZL1790质粒进行定量后，分别进行双酶切，反应体系 如下：
Sal I 1μL，Sac I 1μL，10×buffer 5μL，核酸1μg，ddH2O补齐至50μL。
37℃酶切30min后，将酶切产物进行连接，反应体系如下：
T4连接酶1μL，10×buffer 2μL，酶切后pZL1790质粒2μL，酶切后绿色荧光基因15μL。
将反应体系放入4℃冰箱连接过夜。将连接后重组的绿色荧光质粒GFP-pZL1790通过 热激转化法转化到DH5α感受态细胞中进行分子克隆，使用含有氯霉素的培养基进行筛选， 并测序获得阳性质粒(图1)。
(2)三种布鲁氏菌启动子及三种常用启动子
根据布鲁氏菌RA343全基因组及基因功能预测的分析，筛选出三个在布鲁氏菌中可 持续高水平表达的分子伴侣启动子P1、P2、P3，将其密码子优化后在上海生工公司合成了含有启动子P1，P2，P3以及常见启动子tac，trc和T7序列的质粒，使用不同启动子各 自的引物(表1)分别扩增出启动子P1，P2，P3，tac，trc和T7的PCR产物(添加KpnI 和EcoRI酶切位点)，PCR反应体系与条件如下：
PCR反应体系(50μL)：Max 2×buffer 25μL，上下游引物(10μM)各 1μL，ddH2O 22μL，模板DNA1μL。
反应条件：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃30s，31个循环；72℃10min。
表1启动子PCR扩增引物表
(3)启动子PCR产物电泳与纯化
将6×Loading Buffer100μL与PCR扩增产物20μL充分混匀后加入0.8％的琼脂 糖凝胶孔中，150V电泳25min左右，用凝胶成像系统成像分析，切取含目的片段的琼脂 糖凝胶块，按照Takara凝胶回收试剂盒(Code No:9762)说明书进行PCR产物的回收 纯化。
(4)载有启动子的绿色荧光蛋白质粒的构建
PCR产物纯化后用KpnI和EcoRI双酶切后分别克隆至相同限制酶双酶切的质粒GFP-pZL1790上，构建出6个理论上能够在布鲁氏菌中表达出绿色荧光蛋白质粒： P1-GFP-pZL1790，P2-GFP-pZL1790、P3-GFP-pZL1790、tac-GFP-pZL1790，trc-GFP-pZL1790 和T7-GFP-pZL1790。构建好的质粒经过测序验证后，电转化入布鲁氏菌RA343株菌中。
(5)电转化
取3μg的YGT-pZL1790(作为阴性对照)、P1-YGT-pZL1790、P2-YGT-pBBR1mcs2、 P3-YGT-pZL1790、tac-YGT-pZL1790、trc-YGT-pZL1790和T7-YGT-pBBR1mcs2质粒分别 加入到50μL的RA343感受态细菌中，充分混匀后转移到电击杯中电击。电击电压和时间 分别为：1.8kv，3ms。电击完成后，立即加入1mlTSB培养基在37℃摇振培养4h，然后 将菌液涂布到2块含50μg/mL卡那霉素的TSA培养皿中，37℃培养48h以上，生长出 的菌落即为电转化阳性菌。得到的基因工程重组菌命名为RA343-YGT-pZL1790(作为阴 性对照)、RA343-P1-YGT-pZL1790、RA343-P2-YGT-pZL1790、RA343-P3-YGT-pZL1790， RA343-tac-YGT-pZL1790、RA343-trc-YGT-pZL1790和RA343-T7-YGT-pZL1790。
(6)通过布鲁氏菌细胞感染实验筛选强启动子
小鼠巨噬细胞RAW264.7传代至六孔板，分别编为RA343组、RA343-P1-YGT-pZL1790、RA343-P2-YGT-pZL1790、RA343-P3-YGT-pZL1790、RA343-tac-YGT-pZL1790、RA343-trc -YGT-pZL1790和RA343-T7-YGT-pZL1790组，培养至铺满6孔板底部。将对应菌接种到20ml的TSB培养基中，180r/min，37℃恒温摇床培养至对数期。收菌，PBS反复重悬菌 体。按照布鲁氏菌与RAW364.7感染比(MOI)50:1、200:1、500:1三个感染强度分别进 行感染，然后置于CO2浓度为5％的37℃恒温培养箱。侵染1h后六孔板中每孔加入终浓 度为50μg/ml的庆大霉素，作用45min。感染24h、48h、72h之后的小鼠巨噬细胞用PBS 清洗3次以终止侵染。加入甲醛固定液进行固定，然后用荧光显微镜在激发光下进行荧光 检测，并根据相同激发光强度下绿色荧光的强弱筛选出了强启动子P3。
3.O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的密码子优化及无痕插入
(1)构建穿梭质粒pUC/P3-VP1+
在上海生物工程有限公司人工合成并密码子优化了的启动子P3及口蹄疫VP1基因序列， 以克隆质粒作为模板，以VP1-F(序列13)、VP1-R(序列14)作为引物扩增VP1基因。以布鲁氏菌RA343基因组DNA为模板，设计引物up-F(序列15)、up-R(序列16)、down-F (序列17)、down-R(序列18)分别扩增1号染色体814594位上游941bp碱基为上同源 臂，下游781bp碱基为下同源臂(上下游同源臂分别添加XbaI和BamHI限制酶切位点)， 将启动子P3及口蹄疫VP1基因无痕插入到布鲁氏菌基因组中，引物如表2所示：
表2wboA基因上下游同源臂引物
PCR反应体系均为：50μL的反应体系中，含25μL 2×Buffer，混合引物储存液2μL，Taq酶1μL，模板DNA 1μL，ddH2O 21μL。
PCR反应程序均为：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃60s，31个循环；72℃10min。
将PCR扩增的布鲁氏菌上下游同源臂及口蹄疫VP1基因片段的PCR产物进行纯化回收， 测定浓度后按照公式计算融合PCR中各模板的用量：
并通过融合PCR将上同源臂、VP1基因、下同源臂融合到一起。
PCR反应体系：50μL的反应体系中，含25μL 2×Buffer，混合引物储存液2μL，Taq酶1μL，模板DNA2μL，ddH2O 20μL。
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃3min，31个循环；72℃10min。
通过XbaI和BamHI限制酶进行双酶切PCR胶回收产物及pUC19质粒，将融合片段连接到穿梭质粒pUC19的多克隆位点，获得重组穿梭质粒，命名为pUC/VP1+。
(2)电转入
将1～10ng pUC/P3-VP1+质粒加入到50μLRA343株感受态细菌中，混匀。冰浴10min，吸取到2nm的电转化杯中进行点击。设定参数：2.5kV，5ms。电击完成后，电转化杯加入1mlTSB培养基，吸取菌悬液加入TSB培养基三角瓶中置37℃摇振培养至少4h。
(3)阳性重组菌RA343-VP1-FMDV-O的筛选
氨苄筛选：将37℃振摇培养4h的菌液6000r/min离心3min，轻轻吸去部分上清，保留 约200μL上清，并将沉淀菌体轻轻吹至均匀，然后全部菌落涂布到1块含50μg/ml氨苄青霉 素的TSA培养基平板上，37℃培养至少72h。筛选含有氨苄的重组子。
蔗糖负筛选：在含氨苄青霉素的TSA平板上的挑取单个菌落，接种到不含氨苄青霉素 的TSB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，培养24h后用生理盐水按1：102、1:103、1：104倍稀释菌液，每稀释度各取菌液100μL涂布含5&蔗糖的TSA平板，37℃培养至少72h。
从5％蔗糖平板上随机挑取单个菌落，利用引物(序列19和序列20)进行菌落PCR筛选阳性重组菌，阳性菌的大小为1584bp；
序列19F:ggagggacaa gcgtaaacca 20,
序列20R:ccagtattcg gaagcgtgag c 21
同时进行测序验证启动子P3与VP1基因无痕插入到布鲁氏菌基因组中。将阳性重组菌 命名为重组布鲁氏菌(Brucella)RA343-VP1-FMDV-O株(本发明简称重组菌 RA343-VP1-FMDV-O株)，该菌株已于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏编号为CGMCC No.17333。
实施例2——重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株的常规生物学特性
1.形态和生化特性
重组菌菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性。 该菌的生长不依赖于CO2，能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长，H2S试验强阳性。
2.热凝集试验
将重组株接种于TSA培养基，置于37℃培养46h，然后勾取培养物放入装有生理盐水 约100ml的试管中，摇匀，使其比浊到含活菌10亿/ml的菌悬液，取出后的菌悬液分成2管，每管4～5ml,置90℃水浴中加热1h，在30min和60min时观察结果，重组疫苗和亲本株 均呈凝集阳性为粗糙型，该重组疫苗保留了RA343粗糙型的特性。
3.吖啶黄实验
用蒸馏水配制1:500中性吖啶黄溶液，取吖啶黄溶液一滴置于玻片上，用接种环钩取少 许培养48h的重组疫苗，与亲本株混匀，立即观察结果。3min内出现凝集，重组疫苗为粗 糙型菌落。
4.菌落结晶紫试验
将重组株做10倍系列稀释，接种与TSA平板培养物上，置37℃培养72～96h，用蒸馏水将结晶紫储存液做1:40倍稀释，吸取适量的稀释染液覆盖长满单个菌落的TSA平板染色15～20s，弃去结晶紫染液于消毒液中，用放大镜或低倍显微镜观察菌落边缘着色情况。重组菌落边缘着色，界限不清晰，为粗糙型。
5.特异性
(1)血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应不出现凝集，与粗糙型血清应出现凝集。
(2)PCR特异性合成如下2条引物(序列21、序列22)，将其配成引物混合储存液， 各引物浓度均为25μM。
(序列21)RA343-FMDV(O)-F：caggagggac aagcgtaaac c 21
(序列22)RA343-FMDV(O)-R：gaggacgtgc tgccttctgt g 21
模板：以RA343培养菌落或试剂盒提取的RA343基因组DNA。
PCR反应体系：50μl的反应体系中，含5μl 10×Buffer，8μl 2.5mM dNTPs，混合引物 储存液2μl，Taq酶2U，模板DNA 1μl(或挑取菌落少许)。
PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。
扩增产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现1条特异性PCR条带，大小为1031bp的RA343-VP1-FMDV-O特异性片段，而使用其他菌株(大肠杆菌、葡萄球菌、沙 门氏菌)基因组为模板则无条带产生(图2)。
序列23：
(3)毒力用生理盐水将在固体培养基上培养48～72h的培养物洗下，稀释成每毫升含 活菌10亿的悬液，腹股沟皮下注射体重350～400g的豚鼠(Hartley品系)5只，1ml/只。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据其生长的菌落数， 计算吞噬脾脏的含菌量，每1g脾脏含菌量应不超过20万个。
(4)小鼠的安全性
体重20～20g的Balb/C小鼠分成5只/组，将重组菌RA343-VP1-FMDV-O株稀释成1×1012CFU/ml至1×108CFU/ml的菌悬液，腹股沟皮下注射0.1ml/只，同时设立对照组。接 种后1周内观察并记录小鼠的健康状况，结果表明，重组疫苗的1011CFU/只及以下免疫组的 小鼠6日全部健活。结果表明重组疫苗以不同剂量免疫非靶动物具有良好的安全性。
实施例3——重组菌RA343-VP1-FMDV-O株在靶动物体内的稳定性
利用重组菌RA343-VP1-FMDV-O以1×1010CFU/头份免疫成年绵羊的实验组，免疫后第 3d采血接种于TSA培养基进行细菌分离，对分离菌进行PCR鉴定，并继续传代未免疫的成年绵羊，按此方法连续传5代。连续传代后的重组疫苗株表型没有发生改变，且1号染色体中插入的VP1基因稳定存在。
实施例4——重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株VP1基因的表达验证
(1)qPCR验证VP1基因在转录水平的表达
吸取适量重组菌与RA343亲本株菌液，80℃恒温水浴锅灭活菌液2h以上，用TAKARA细菌基因组提取试剂盒提取细菌RNA，进行反转录后以16s基因作为内参，通过qPCR对 VP1基因转录的mRNA进行相对定量；所用引物如表3所示：
表3qPCR引物列表
反应体系如下：2×Premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，Rox0.4μL， 模板2μL,去离子水6.6μL。
反应条件如下：95℃30s，95℃5s、60℃34s 40个循环。
结果表明重组菌RA343-VP1-FMDV-O株VP1基因的mRNA的相对表达量显著高于亲本株RA343，VP1基因在转录水平有较高的表达量(图3)。
(2)Western blot鉴定重组疫苗VP1基因的表达
将布鲁氏菌重组菌RA343-VP1-FMDV-O株和亲本株RA343接种TSB培养基振荡培养24～48h，经超声波裂解，加上样缓冲液，沸水浴10min后进行SDS-PAGE和Wsetern Blot 分析，结果发现重组菌株RA343-VP1-FMDV-O相对亲本株RA343在35kD左右有明显条带， 用蛋白印记法验证了VP1蛋白的表达(图4)。
(3)重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株菌刺激小鼠的VP1特异性抗体
小鼠随机分成3组，每组30只。第一组腹股沟皮下免疫重组菌RA343-VP1-FMDV-O株菌，109CFU/只；第二组腹股沟皮下免疫亲本株RA343株，109CFU/只；第三组是空白组， 免疫生理盐水，1ml/只。
免疫组小鼠免疫后14d起进行采血分离血清，通过间接ELISA方法，测定口蹄疫VP1抗体。结果显示重组菌RA343-VP1-FMDV-O株组口蹄疫VP1抗体水平OD450保持在1.0以 上，为阳性，亲本株RA343组及空白组OD450保持在0.5以下，为阴性(图5)。
实施例5——重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株菌的耐热保护剂筛选和效果验证。
依据重组菌株RA343-VP1-FMDV-O的特性和共融性能，设计成4组耐热保护剂(分别标记为配方1、2、3和4)，按常规冻干曲线(图6)分别进行冻干，通过冻干前后以及冻干 后37℃保存7日耐老化试验结果(表4)，确定耐热保护剂配方1冻干RA343-VP1-FMDV-O 效果最好，冻干后不结晶，冻干菌存率达86.9％；37℃保存7日不萎缩，活菌减少率为13.0％。 明显优于明胶蔗糖对照。
表4不同保护剂配方冻干结果(活菌数：108CFU/ml)
保护剂配方及配制方法见下表5：
表5耐热冻干保护剂配方
注：配制方法
(1)溶液1：在洁净烧杯中，加入注射用水(100℃)适量，按配方依次称取PVP、甘 露醇、海藻糖、硫脲加入烧杯中，边加入边用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，再用注射用水定 容至500ml，经116℃灭菌30min。
实施例6——重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗(简称重组布鲁氏 菌RA343-VP1-FMDV-O疫苗)免疫后对布鲁氏菌和口蹄疫的免疫保护效果测定
1.重组菌RA343-VP1(FMDV-O)疫苗对布鲁氏菌免疫保护效果
将45只清洁级绵羊随机分为三组，每组15只。一组口服免疫50亿CFU的RA343疫 苗株，一组口服免疫50亿CFU的RA343-VP1-FMDV-O重组疫苗株，一组对照口服免疫相 同剂量的生理盐水。免疫后第0d，7d，14d，28d，42d，60d采集血液，分离血清，用微量 试管凝集方法检测布鲁氏菌抗体IgG。3个组免疫后第8周用最小感染量为5×106CFU/只剂 量B.melitensis M28株眼结膜感染攻毒。观察并记录采食情况、体重和精神状态等。攻毒后30d剖杀，取脾脏和腹股沟淋巴结，捣碎研磨，接种TSA培养基，37℃培养至少3d，分离 细菌并鉴定。结果表明，免疫RA343及RA343-VP1-FMDV-O重组菌株免疫羊后7d开始出 现布鲁氏菌抗体，7～28d抗体水平持续增加，免疫后28d抗体效价达到高峰，随后开始逐 渐下降。对照组无抗体产生。羊的脾脏和腹股沟淋巴结细菌分离结果表明，重组疫菌 RA343-VP1-FMDV-O株亲本株RA343均对羊能提供87％的免疫保护率。
2.重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O疫苗对口蹄疫免疫保护效果
将40只清洁级绵羊随机分为两组，每组20只，实验组按照50亿CFU菌的剂量皮下注射重组菌RA343-VP1-FMDV-O株疫苗免疫成年绵羊，对照组皮下注射等剂量的生理盐水。 30日后分别接种口蹄疫病毒105TCID50。14d后观察两组绵羊的口蹄疫感染率，测定免疫重 组疫苗组的免疫保护效果。结果对照组20只绵羊均发病，口蹄疫感染率100％；实验组仅有 4只绵羊发病，口蹄疫感染率80％。说明重组疫苗对口蹄疫病毒的免疫保护率达到80％。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 一株重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌的构建及其疫苗生产方法
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(PI-F)
<400> 1
cggggtaccc cgtgtcagcc cgccatccac a 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(PI-R )
<400> 2
ccggaattcg gtcacgccct cgaacttgc 29
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成(P2-F )
<400> 3
cggggtaccc cgatgcggtg gtaagctcct tca 33
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(P2-R)
<400> 4
ccggaattcc ggcggcagcg cctcatacat t 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(P3-F)
<400> 5
cggggtaccc cgaaatgtgc cgctcttctc gc 32
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(P3-R)
<400> 6
ccggaattcc caggagttgg tcgttcccag a 31
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(tac-F)
<400> 7
cggggtgcct cgaatagctg acgtgcca 28
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(tac-R)
<400> 8
ccggaaaaag gacacacttt aacaataggc 30
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(trc-F)
<400> 9
cggggtttga caattaatca tccgg 25
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(trc-R)
<400> 10
ccggaacatt atacgagccg gatgatt 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(T7-F)
<400> 11
cggggttaat acgactcact ataggga 27
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(T7-R)
<400> 12
ccggaatctc cctatagtga gtcg 24
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(VP1-F)
<400> 13
gatactaagc ataatcttta gaggtgagta tg 32
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(VP1-R)
<400> 14
ctgatagcgg gacaaaaagt taggat 26
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(up-F)
<400> 15
ggctctagaa tacgcttatt gagaatgttc g 31
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(up-R)
<400> 16
agcggcacat tttcttaatg cgcgggaata gc 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(down-F)
<400> 17
tcaagcagtc gctgttcttg cttcagcttg tt 32
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(down-R)
<400> 18
ccggatccta agccgacgag caaatagaag g 31
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(F)
<400> 19
atcagttcta gagacaagga 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(R)
<400> 20
attgttacac cgctaccctg g 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(RA343-FMDVO-F)
<400> 21
caggagggac aagcgtaaac c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(RA343-FMDVO-R)
<400> 22
gaggacgtgc tgccttctgt g 21
<210> 30
<211> 1031
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 30
caggagggac aagcgtaaac catctcgcga acctccaact tcataactct agcaccgggg 60
ggaaaacttt tgtggccaat gtcaccacaa atgggtctgc ataacggtcc ttgccatttt 120
aactataaat gagctattcc cgcgcattaa gagtagacac gggaaatcag tcgcggatcc 180
gcgaaatgtg ccgctcttct cgctggaaaa ttccagggcg aaccagaaat tcatcgatgc 240
gatttattcc gcgggcagaa gcggggtgag cgagactgtg tgacgcctgt aaagagtgcg 300
gggcaaggaa tctgtttttg tctggctctt gtgacttgca gtgaaaaact gcctttctta 360
tatacgcctc gcacagggct ttgatgacag gccggaaacc ggtccgcttt ctggaaccca 420
accttgaagc aggcattgtg aaaaccgata ggaactgccc atggaacgct cggtcgaggt 480
cttggcagtt tgctgaatgg agagaaatat ggctaaggtt attggtatcg atcttggtac 540
gaccaactcc tggatgacca cctccaccgg tgaatccgca gatcctgtta ccgctaccgt 600
cgaaaactat ggtggtgaaa cccaggtcca gcgtcgtcac cacaccgacg tctcgttcat 660
cctggaccgc ttcgtcaagg tcaccccgcg cgaccagatc aacgtcctgg acctgatgca 720
gaccccgtcg tataccctgg ttggtgcact gctgcgtacc gctacctatt atttcgcaga 780
cctggaagtt gcagtcaagc acgaaggcga cctgacctgg gtcccgaacg gtgcaccgga 840
agccgccctg gacaacacca ccaacccgac ggcctatcac aaggcacctc tgacccgtct 900
ggccctgccg tataccgccc ctcaccgcgt tcttgcaacc gtttataatg gcaactgcaa 960
gtatgcagct ggttcgctga ccaacgttcg tggtgacctg caggtcctgg cacagaaggc 1020
agcacgtcct c 1031
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(16S-F)
<400> 24
cacaagcggt ggagcat 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(16S-R)
<400> 25
gcaactaagg gcgaggg 17
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(VP1-F)
<400> 26
gaccccgtcg tataccctg 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(VP1-R)
<400> 27
cagacgggtc agaggtgcc 19
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(GFP-F)
<400> 28
tgagtcgaca tggtctcgaa gggcgaagaa 30
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(GFP-R)
<400> 29
ataccgcggt tacttataca gttca 25

Claims (5)

1.一株重组O型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布病和O型口蹄疫的双重免疫保护，其生产菌株是一株含有能够高效表达O型口蹄疫病毒VP1基因的的重组粗糙型布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株(简称布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株)，该菌株是通过将P3启动子与VP1序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3-VP1(FMDV-O)序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3-VP1+，将鹦鹉热衣原体外膜蛋白VP1基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovine brucella)重组粗糙型布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株。并于2019年03月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.17333。
2.如权利要求1所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于其生产用重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株菌区别于其他细菌的特异性是采用一对特异性PCR引物扩增出大小为635bp的特异性片段(序列23)；
重组布鲁氏菌RA343-VP1-FMDV-O株VP1(FMDV-O)基因的表达验证是通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方式验证VP1(FMDV-O)基因转录水平的表达；
通过蛋白印记法(Western Blot)验证VP1(FMDV-O)基因在蛋白水平的表达；
将重组菌免疫小鼠，监测小鼠体内VP1(FMDV-O)抗体的表达情况。
3.如权利要求1所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗的生产方法是用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.17333株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.17333株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型RA343-VP1-FMDV-O株牛种布鲁氏菌病疫苗。
4.如权利要求1和3所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗其中的冻干保护剂，其配方为：PVP 5～15g，BSA 5～15g，海藻糖50～100g，甘露醇50g，硫脲10～15g，抗坏血酸2g，维生素C 2g，199培养2g，磷酸氢二钾1.25g，磷酸二氢钾0.52g，溶于注射用水1000ml中。
5.如权利要求1所述的一种重组粗糙型布鲁氏菌疫苗，其特征在于该疫苗免疫效果是通过将疫苗免疫绵羊后，分别采用布鲁氏菌及鹦鹉热衣原体进行攻毒保护试验进行评价。
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