CN101979503A

CN101979503A - 表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法

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Publication number: CN101979503A
Application number: CN 201010504371
Authority: CN
Inventors: 丁家波; 蒋玉文; 赵启祖; 宁宜宝; 李旭妮; 毛开荣; 程君生
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2030-10-13
Also published as: CN101979503B

Abstract

本发明涉及表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。该重组菌株通过在布鲁氏菌S2株菌基因组中稳定地整合进Asia I口蹄疫病毒(FMDV)江苏株VP1基因，并同时破坏了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成的条件，使重组菌由光滑型转变为粗糙型，使菌株的安全性进一步提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果，该重组菌被命名为重组布鲁氏菌rS2-JS株。该菌能够表达Asia I FMDV VP1蛋白，并诱导相应抗体产生，对Asia I FMD有良好的基础免疫作用。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，同时实现了FMD疫苗的细胞免疫，并将为布鲁氏菌病和FMD的防控提供了一种良好的疫苗。

Description

表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法

所属技术领域本发明涉及牛、羊和猪对布鲁氏菌病和口蹄疫两种传染病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

布鲁氏菌存在光滑型(S)和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过人工诱变的方法获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但目前该菌株在基因水平与原始菌株之间的的区别尚为完全弄清楚。

已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本发明人所在实验室曾构建了wbkC和wboA基因缺失的重组布鲁氏菌疫苗株，并比较了它们之间的免疫效果。其后，又进一步构建了wboA基因不完全缺失株，系统地研究了wboA基因的不同缺失对重组菌的存活率、免疫保护性以及粗糙型表型等方面的特性，并最终确定了wboA基因1-897之间的片段为缺失的靶片段。

口蹄疫(FMD)是口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度传染性疫病，其特征是在口、舌、唇、鼻、蹄、乳房发生水泡，并溃烂形成烂，严重影响畜牧业发展。该病毒同时可以感染人并形成相似的症状，由于其严重的危害性世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类第一位烈性传染病。世界上绝大多数国家都流行过口蹄疫，但目前本病仅在亚洲部分国家和地区、非洲、中东和南美呈地方性流行或零星散发。已消灭口蹄疫的国家和地区常有重新暴发本病的例证。我国口蹄疫的发病也比较普遍，在我国曾经流行的主要有Asia I型、O型以及A型，近几年来Asia I型和O型流行较为普遍。

疫苗是控制口蹄疫的重要手段之一，目前我国市场上使用的口蹄疫疫苗有2种，即灭活疫苗和亚单位苗。灭活疫苗在我国已经使用了几十年，而FMD流行的不断严重的现状已经表明了其免疫效果的缺陷性。亚单位疫苗是近几年刚刚被批准使用的一种疫苗，其原理是通过化学方法，合成了FMDV病毒免疫保护性单位VP1的部分氨基酸(约二十多个)的乳化产物作为疫苗，其实质类似于灭活疫苗，主要介导B细胞免疫反应，其免疫保护效果仍在探索之中。作为侵入宿主细胞的病毒性疾病，FMD活苗由于能刺激机体的细胞免疫而达到令人满意的免疫效果，一度被世界各国广泛使用，但后来发现口蹄疫弱毒疫苗易出现毒力返强，因此从上世纪70年代已经停止使用活疫苗。活疫苗免疫所获得的保护效果提示FMD的免疫最好能通过刺激机体的T细胞免疫来实现。

由于布鲁氏菌感染动物后能够在宿主细胞中长时间存在，强毒布鲁氏菌能被宿主终身携带，布鲁氏菌疫苗株免疫动物后一般能在体内存活1～3周，能够充分介导宿主的T细胞免疫，弥补FMDV灭活疫苗的不足。另一方面，布鲁氏菌和FMDV感染的主要宿主均为猪、牛、羊。因此，表达FMDV的免疫保护基因的布鲁氏菌载体疫苗，将是同时解决布病和口蹄疫免疫防疫的有效手段。

本发明的目的是通过基因同源重组和蔗糖敏感基因的负筛选技术，构建获得既能表达Asia I型FMDV VP1基因，又不干扰布病临床检测的重组布鲁氏菌，以该重组菌制备的疫苗实现对布鲁氏菌病和Asia I型FMD的双重免疫。

发明内容

本发明是采用非抗性筛选技术，用密码子优化的Asia I型口蹄疫病毒江苏(JS)株VP1基因替代猪布鲁氏菌(Brucella suis，本发明又简称为布鲁氏菌)S2菌株wboA基因1-897bp之间的序列，构建了能够表达Asia I型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌rS2-JS株，该重组菌不仅能够良好地表达Asia I型VP1基因，而且使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，用该菌制备的疫苗免疫动物后，实现了对布鲁氏菌病和Asia I型FMD的双重免疫，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。

本发明是通过以下步骤实现的：

1.原核密码子优化的Asia I型FMDV JS株VP1基因的合成。

2.蔗糖敏感基因转移质粒构建将含有启动子序列的蔗糖敏感基因(Suc^R)克隆近pUC18的多克隆位点下游，然后将含有Asia I型FMDV JS株VP1基因表达框插入多克隆位点之间，并在VP1表达框的上、下游插入WboA基因(1-897位)的上、下游同源臂(L和R)，从而构建成包含L、VP1表达框、R，以及Suc^R基因的重组穿梭质粒pL-VP1(JS)-R-Sac。将重组穿梭质粒按常规方法电转化进布鲁氏菌S2株(疫苗生产菌株)的感受态细胞中。

3.重组菌的筛选与鉴定利用pUC18载体中的氨苄青霉素抗性(Amp^R)以及克隆进的蔗糖抗性(Suc^R)基因进行筛选。首先用50μg/ml Amp筛选出重组菌(第一次同源重组)，重组菌在不含氨苄青霉素的TSB培养后，再通过5％蔗糖TSA平板筛选出丢失氨苄青霉素抗性基因和蔗糖敏感基因粗糙型重组菌(第二次同源重组)。通过一对PCR引物，鉴定仅含有VP1基因的粗糙型重组菌。对获得的重组菌进行形态学、血清学及基因水平检测，并对重组菌安全性、免疫保护性进行鉴定。

4.疫苗制备对安全性和免疫保护性良好的重组菌，按布鲁氏菌S2株作为生产菌株生产布鲁氏菌活疫苗的常规方法，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗。用于预防布鲁氏菌病和Asia I型口蹄疫。

发明的详细描述

本发明所涉及基因为与光滑型表型相关的布鲁氏菌wboA基因。本发明所涉及基因重组技术包括：用蔗糖敏感基因和密码子优化的Asia I型FMDV JS株VP1基因构建穿梭质粒，并用此质粒破坏与光滑型表型相关的布鲁氏菌wboA基因。

本发明通过两次同源重组，并用Asia I型FMDV JS株VP1基因替代了光滑型布鲁氏菌(猪种)S2株的wboA基因第1～897bp之间的序列，最终筛选获得了粗糙型FMDV VP1 JS株重组布鲁氏菌rS2-JS株。

1.重组布鲁氏菌的构建及筛选

本发明利用同源重组及蔗糖敏感基因的负筛选技术，用AsiaⅠ型FMDV JS株VP1基因替换了布鲁氏菌wboA基因第1～897bp之间的序列，成功构建了能表达AsiaⅠ型FMDV JS株VP1蛋白的重组猪布鲁氏菌(Brucella suis)rS2-JD株(本菌株已于2010年9月27日送交北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCCNo.4192)。该重组菌株不仅能表达AsiaⅠ型FMDV JS株VP1蛋白，而且还使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型。重组菌在培养基上传20代后，遗传性状仍很稳定。动物试验表明重组菌比原始毒株S2安全性提高10～100倍，对布鲁氏菌病免疫保护性与S2相似；能提供不低于AsiaⅠ型口蹄疫灭活油苗的免疫保护效果。

具体操作方法如下：

(1)PCR扩增wboA基因上、下游同源臂

引物设计：

上游同源臂引物(序列2和序列3)：

F_WboaL 5’-CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3’(含SacI位点)；

R_WboaL 5’-CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3’(含XbaI位点)。

下游同源臂引物(序列4和序列5)：

F_WboaR 5’-ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3’(含XbaI位点)；

R_WboaR 5’-CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3’(含SphI位点)。

用Promega公司的细菌基因组提取试剂盒(Lot：187282)，参照说明书提取布鲁氏菌S2基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板扩增wboA上、下游的基因片断。PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃50s-54℃50s-72℃1min，进行30个循环，72℃延伸10min。获得的上游同源臂标注为L，下游同源臂标注为R。

(2)构建用于同源重组的穿梭质粒。

1)pUC-L-R质粒的构建

将以上(1)中PCR获得的左侧同源臂L，用SacI和XbaI酶双酶切后，克隆进同酶处理的pUC18质粒中，按常规方法筛选重组质粒pUC-L；将其与以上(1)中PCR获得右侧同源臂R均用XbaI和SphI双酶切后，连接、转化，筛选重组质粒pUC-L-R。

2)pLR-VP1质粒的构建

将合成的Asia I型FMDV JS株的VP1基因表达框用XbaI酶切后，克隆进同酶处理的pUC-L-R质粒中，筛选获得重组质粒pLR-VP1。

3)同源穿梭质粒pSac--VP1-JS的构建

设计引物(序列6和序列7) F：5’-CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3’(含SalI位点)；R：5’-CAAACCCGGGTGACCTGATAACACGTCTA-3’(含SmaI位点)，以pLR-VP1 质粒为模板，扩增出保护上下游同源臂(LR)以及VP1基因的大小为2780bp的序列。将该PCR产物用SalI和SmaI酶切后，克隆进同酶处理的pUC-SacB质粒(本发明人实验室构建保存)中，获得重组质粒pSac-VP1-JS。

(3)制备布鲁氏菌S2的电转化感受态细菌

将单个CFU的布鲁氏S2菌接种于100ml TSB培养基中培养至对数期的中期，放冰水中冷却。12000r/min离心10min，弃去培养基，再分别用100ml、50ml、10m、5m、2ml灭菌水各离心洗涤一次。最后将获得的菌体重悬于1ml 10％的甘油水溶液中，此即为待用的感受态细菌。

(4)电转化和筛选

1)电转化将3μg pSac--VP1-JS质粒加入到50μl布鲁氏S2感受态细菌中。混匀后转移到电极杯中。电击电压：2.5KV；电击时间：5毫秒。电击完成后，加入1ml SOC培养基(见本说明书附录)，置37℃摇振培养4h后，将全部菌落涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的胰大豆琼脂(TSA，美国BD公司)平板上，37℃培养72h。

2)用于鉴定第二次同源重组成功的PCR引物

设计如下引物(序列8和序列9)：

F25’-CCATTTCGACACTATC-3’；(该引物在同源重组左侧同源臂起始点上游25bp，位于布鲁氏菌S2基因组WboA基因上游。)

R1301：5’-TATGGTGAGGAATCCAGC-3’(该引物在同源重组左侧同源臂起始点下游1301bp，位于Asia I型FMDV JS株的VP1基因内部。)

阳性重组菌的预期大小为1326bp，非重组菌不能扩出任何条带。

3)筛选挑取平板上单个菌落(第一次重组菌)，接种到不含氨苄青霉素的胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)中，37℃摇振培养6-8h，将菌液用生理盐水进行1∶10、1∶100和1∶1000稀释，每稀释度各取菌液100μl涂布含5％蔗糖的TSA平板，37℃培养72h。挑取蔗糖平板上生长的菌落，用鉴定引物进行菌落PCR，筛选阳性重组菌。对PCR筛选获得的阳性菌，进一步用凝集试验验证其粗糙型特性。提取重组菌的基因组DNA，以F25和R1301为引物进行PCR，并将PCR产物进行克隆和序列测定，结果证实VP1基因已经整合到S2菌株基因组中，获得的重组菌命名为重组布鲁氏菌rS2-JS株。

2布鲁氏菌rS2-JS株的特性

(1)形态和生化特性检查革兰氏染色为阴性；柯氏染色成红色。菌体为球杆菌，单个散在，无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，大小约0.6～2.5μm。生化试验为硫化氢试验阳性。

(2)培养特性检查重组布鲁氏菌rS2-JS株，在pH 6.4～6.8的胰大豆琼脂(TAB)或其他适宜培养基(如马丁汤、胰肉汤、肝汤等)上生长良好；静止培养易出现沉淀，振摇后液体浑浊、不透明。

(3)粗糙型特性检查热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。

(4)血清学特性检查将S2和rS2-JS菌株培养物制成抗原注射小鼠2次，间隔1个月，第二次接种1个月后采血分离血清。S2株的抗血清与M5、M28、A387、A19等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阳性；与rS2-JS株和M111株等粗糙型布鲁氏菌凝集反应为阴性；而rS2-JS株抗血清与S2、M5、M28、A387、A19株等光滑性布鲁氏菌凝集反应为阴性，与粗糙型布鲁氏菌M111株凝集反应为阳性。表明rS2-JS菌株免疫小鼠后，其血清不含有对光滑型布鲁氏菌的凝集类抗体。

以上试验说明rS2-JS菌株免疫动物后，所产生的血清抗体通过凝集试验能够与光滑型布鲁氏菌感染或免疫后所产生的血清抗体相区别，即rS2-JS株免疫动物后不会对布鲁氏菌病血清学检疫产生干扰。

(5)基因特性检查

1)wboA基因检测根据GeneBank中收录的wboA基因[收录号：AY065979]，设计用于扩增wboA基因的引物(序列5和序列6)，以重组菌基因组DNA为模板，扩增wboA基因，结果为阴性；原始菌S2株对照为wboA阳性，PCR产物大小为550bp(扩增的序列为WboA基因阅读框第20到第570bp之间的序列)。

2)Asia I型FMDV JS株VP1基因检测根据设计的VP1基因表达框序列(序列1)，设计用于同时检测WboA基因上游和VP1基因的引物(序列7和序列8)，以重组菌基因组DNA为模板，扩增结果为阳性，PCR产物大小为1326bp；原始菌S2对照为阴性。

(6)毒力检查用生理盐水将固体培养基(TAB)上培养48h的培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠5只，每只1ml。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种胰

琼脂或其他适宜的培养基平板，根据其生长的菌落数计算豚鼠脾脏的含菌量，结果每个脾脏含菌不超过20万CFU。

(7)安全检验将日rS2-JS活菌用生理盐水稀释成1ml含活菌100亿，皮下注射体重18～20g的小白鼠5只，每只0.1ml，6日应全部健活。

(8)免疫原性

1)对布鲁氏菌病的免疫保护性用生理盐水将rS2-JS稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌S1330菌株(约60个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80％以上的豚鼠应无强毒出现。

2)对Asia IFMDV的免疫保护性用800亿～1000亿/ml菌液肌肉注射6～8月龄黄牛5只，1ml/只，1个月后再用相同剂量加强免疫1次，1ml/只。第二次免疫10天后，分离血清，用“牛、羊口蹄疫VP1结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒”测定抗体，结果5/5抗体阳性。

(9)遗传稳定性 rS2-JS株菌在TSA培养基上传30代，其形态和生化特性、培养特性、血清学特性、粗糙型特性、基因特性、毒力、免疫原性没有改变。

3疫苗制备与质量标准

(1)疫苗制备用重组布鲁氏菌rS2-JS株作为表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的粗糙型布鲁氏菌疫苗生产菌株，按布鲁氏菌S2株作为生产菌株生产布鲁氏菌活疫苗的常规方法，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)。用于预防布鲁氏菌病和Asia I型口蹄疫。用胰大豆肉汤(TSB)或用于布鲁氏菌S2菌株疫苗生产用培养基(如马丁汤、胰

肉汤、肝汤等)均可作为本发明的疫苗生产用培养基。培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入重组布鲁氏菌rS2-JS株种子菌液，37℃培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干稳定剂，充分混匀、分装于疫苗瓶中后立即进行冷冻真空干燥，即成为表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的布鲁氏菌rS2-JS株活疫苗，命名为重组口蹄疫Asia I型-布鲁氏菌病rS2-JS活疫苗。冷冻真空干燥后的疫苗应按其质量标准立即进行成品检验。

(2)质量标准本标准涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。

1)疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(1min内)溶解；

2)疫苗应纯粹无其他细菌；

3)用含5亿CFU活菌的疫苗接种18～20g的昆明系小白鼠，6天内应全部健活；

4)对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数为于800亿CFU～1000亿CFU。

本发明的积极意义

该重组菌株通过在布鲁氏菌S2株菌基因组中稳定地整合进Asia I FMDV JS株VP1基因，并同时破坏了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成的条件，使重组菌由光滑型转变为粗糙型，使菌株的安全性进一步提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果。该重组菌被命名为重组布鲁氏菌rS2-JS株，该菌能够表达Asia I FMDV JS株VP1蛋白，并诱导相应抗体产生，对Asia I FMD有良好的免疫作用。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，同时实现了FMD疫苗的细胞免疫，并将为布鲁氏菌病和FMD的防控提供了一种良好的疫苗。

实施例1

胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或其它适宜培养基作为重组菌的培养基，按培养基量加入适量的常用消泡剂，灭菌后按培养基量的1％～2％接入重组布鲁氏菌rS2-JS株种子菌液，在36～37℃逐渐加大通气量，按常规方法发酵培养28～38h h，，培养过程中可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1％～2％。

培养完成，取样用胰大豆琼脂(TSA，美国BD公司)按《规程》规定的方法作纯粹检验，为纯粹。

同时取样用TSA进行活菌计数，供浓缩时参考。

将纯粹检验合格的菌液，按总量0.2％～0.4％加入羧甲基纤维素钠，使菌体沉淀，吸去上清液，置2～8℃保存备用。

取浓缩的菌液按《规程》规定的方法进行纯粹检验，为纯粹。

取浓缩的菌液按《规程》规定的方法用TSA进行活菌计数，作为配苗时的参考。

经检验合格的菌液，按其菌数加入兽用生物制品常用的pH 7.0蔗糖明胶稳定剂(《规程》)，使其最终含量为5％～10％蔗糖和1％～1.5％明胶；加入最终含量为1％～3％的硫脲。充分混匀后、按800亿～1000亿/ml的剂量定量分装。分装后疫苗瓶迅速冷冻真空干燥后即成为表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的布鲁氏菌病活疫苗(rS2-JS株)，即为重组口蹄疫Asia I型-布鲁氏菌病rS2-JS活疫苗。

实施例2

成品检验

本发明涉及到的相关检验方法按《规程》的方法进行

(1)物理性状疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(1min内)溶解；

(2)纯粹检验疫苗应纯粹无其他细菌；

(3)用含5亿CFU活菌的疫苗接种18～20g的昆明系小白鼠，6天内应全部健活；

(4)活菌计数用TSA进行活菌计数对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数为于800亿CFU～1000亿CFU。

(5)安全检验将日rS2-JS株活疫苗用生理盐水稀释成1ml含活菌100亿CFU，皮下注射体重18～20g的小白鼠5只，每只0.1ml，6日应全部健活。

(6)免疫原性

1)对布鲁氏菌病的免疫保护性用生理盐水将rS2-JS株活疫苗稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌S1330菌株(约60个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80％以上的豚鼠应无强毒出现。

2)对Asia I FMDV的免疫保护性用800亿CFU～1000亿CFU/ml菌液肌肉注射6～8月龄黄牛5只，1ml/只，1个月后再用相同剂量加强免疫1次，1ml/只。第二次免疫10天后，分离血清，用“牛、羊口蹄疫VP1结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒”测定抗体，结果5/5抗体阳性。

附录

SOC培养基

组份浓度：2％(W/V)胰蛋白胨(Tryptone)，0.5％(W/V)酵母浸膏(Yeast Extract)，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl 10mM MgCl 2，20mM葡萄糖(glucose)。

配制量：100ml

配制方法

1.配制1M的glucose溶液：将18g的glucose溶解在90ml的去离子水中，定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。

2.向100ml SOB培养基中加入除菌的1M glucose溶液2ml，均匀混合。

3.4℃保存。

Claims

1.一种表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌，其特征在于采用非抗性筛选技术，用密码子优化的Asia I型口蹄疫病毒JS株VP1基因替代布鲁氏菌S2菌株wboA基因1-897bp之间的序列，构建了能够表达Asia I型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌rS2-JS株，该重组菌不仅能够良好地表达Asia I型VP1基因，而且使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，用该菌制备的疫苗免疫动物后，实现了对布鲁氏菌病和Asia I型FMD的双重免疫，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，本菌株已于2010年9月27日送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.4192。

2.一种表达Asia I型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为重组布鲁氏菌rS2-JS株菌疫苗制造用培养基，培养基灭菌后按培养基量的按1％～2％接入重组布鲁氏菌rS2-JS株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为重组口蹄疫Asia I型-布鲁氏菌病rS2-JS活疫苗。

3.如权利要求2所述的一种表达Asia I型FMDV VP1基因的重组布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用于布鲁氏菌S2菌株疫苗生产用培养基均可作为本发明的疫苗生产用培养基。