CN105112349A - 一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用。本发明提供的羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株是将布鲁氏菌MB6的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。通过实验证明：本发明得到的羊种布鲁氏菌对布鲁氏菌病具有良好的免疫保护效果，毒力小，安全性高，可用于羊、牛等布鲁氏菌病的免疫预防，通过免疫学技术能将野生株感染动物与免疫动物区分开来，对布鲁氏菌病的监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用价值。

Description

一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用。

背景技术

布氏杆菌病(布病)是由布氏杆菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病，该病传染性强，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。布病在我国流行范围广泛，危害严重，虽然自新中国成立后对布病开展了全面性的系统防御，但近些年来，该病的疫情呈明显上升趋势，被列为再度肆虐的传染病，引起国内各地区的高度关注。

目前用于布鲁氏菌病防控的弱毒活疫苗主要有国外的牛型19号弱毒菌株(S19)和羊型Rev.1弱毒菌株，国内自主研制的羊型5号弱毒菌株(M5)和猪型2号弱毒菌株(S2)。在我国主要使用由S2株(猪型2号苗)制备的弱毒疫苗，该疫苗适用的宿主广泛，毒力弱，免疫保护持续时间较长，免疫保护效率较高，目前成功地防治了牛、羊、猪等布氏杆菌病；但该疫苗和其它光滑型布鲁氏菌疫苗一样存在一定缺陷，即免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，不能与野生菌株布鲁氏菌感染动物相区分，给布鲁氏菌病的诊断带来了很大的麻烦，这在一定程度上限制了疫苗的使用。因此，研制一种既具有良好的免疫保护效果，且安全性高，同时又能区分自然感染和疫苗免疫的标记型布鲁氏菌活疫苗具有重要的实际意义。

bp26蛋白，又称为CP28(CytosolubleProtein)或OMP28，具有较强免疫原性，是一种可以由细胞内向外释放的可溶性外周浆蛋白，在不同种型布鲁氏菌间具有高度保守性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体。研究发现，bp26基因的缺失突变对布鲁氏菌的生物学特性和免疫原性几乎没有影响，常被作为布鲁氏菌血清学检测的靶蛋白，被认为是目前布鲁氏菌最为合适的基因缺失疫苗分子标志之一。但有研究发现仅缺失布鲁氏菌bp26蛋白分子作为诊断抗原存在假阳性现象，而且，不同宿主动物对不同毒力菌株bp26基因编码蛋白的免疫原性存在差异，因此，以bp26蛋白作为鉴别诊断抗原会影响布鲁氏菌基因缺失疫苗的实际应用效果，从而，双基因缺失的布鲁氏菌减毒活疫苗受到越来越多的关注。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是布鲁氏菌外膜的主要成分，是一种重要的毒力因子，由类脂A、核心寡聚糖和O抗原三部分组成。LPS的完整性决定布鲁氏菌表型，对LPS合成过程中所需酶的编码基因进行突变可导致产生结构不完整的粗糙型LPS，使其毒力变弱，经常被用作减毒活菌苗候选株进行研究。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wboA、wz和wbkC。wboA基因编码一种糖基转移酶，该酶参与布鲁氏菌LPS中O链的形成，该基因的缺失或破坏会影响布氏杆菌光滑型表型的形成。RB51是由流产布鲁氏菌2308株通过利福平抗性筛选而获得，是一株缺少O-链的粗糙型菌株，免疫动物后血清中不产生抗O-链抗体，可用于布鲁氏菌病血清学的鉴别诊断。目前，RB51疫苗已被美国、墨西哥、智利等国家批准应用。

布鲁氏菌的残余毒力是评价布鲁氏菌疫苗有效性的一个重要指标。一般疫苗要求残余毒力不能太强，否则会引起免疫动物病，但也不能太弱，否则不能刺激机体产生保护性免疫。研究表明，粗糙型布鲁氏菌虽然毒力下降，安全性提高，但可能由于过度弱化，致使免疫动物不能产生足够的保护力。另外，有些粗糙型菌株免疫动物后，仍能产生微弱地针对O-侧链的抗体，从而干扰布病的检测，使粗糙型菌株作为布病疫苗的实际应用价值遭受质疑。因此，研制既具有免疫保护作用，又能区分疫苗免疫和野生毒株感染的粗糙型布鲁氏菌标记疫苗已成为布鲁氏菌病疫苗的未来发展方向。

在防治布鲁氏菌感染过程中，机体的细胞免疫是控制布鲁氏菌感染的关键。L7/L12蛋白是布鲁氏菌的一种核糖体蛋白，在菌体合成蛋白质多肽链的过程中通过与延伸因子(EFs)相互作用发挥功能，在各种生物型布鲁氏菌中较为保守，是布鲁氏菌侵染宿主过程中的优势抗原。有研究表明，L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，刺激CD4⁺Th1淋巴辅助细胞释放IFN-γ因子，从而起到增强免疫保护效果的作用。

粗糙型布鲁氏菌基因缺失疫苗虽然能够解决目前布鲁氏菌病活疫苗存在的难题，但可能会存在疫苗的免疫保护作用较弱的缺陷，这为疫苗的广泛使用带来了一定的限制。利用某些蛋白分子多亚基聚合体的聚合功能，扩展免疫原性分子的免疫原性，达到增强疫苗免疫保护效果的目的。目前报道的具有聚合和放大抗原免疫原性的多聚体蛋白主要是2,4-二氧四氢蝶啶合成酶(Lumazinesynthase，LS)。

布鲁氏菌2,4-二氧四氢蝶啶合成酶(Brucellaspp.Lumazinesynthase，BLS)是先以二聚体的形式形成稳定的五聚物，再由两个稳定的五聚体形成一个十聚体，因此，BLS具有更高的热稳定性和更稳定的化学性质，有研究表明，在BLS的氨基末端插入外源性多肽片段不会改变BLS的三维结构，这为BLS作为提高抗原免疫原性的聚合功能提供了基础保证；此外，BLS具有较好的佐剂作用，JulianaCassataro等将Omp31的1oop区的27个氨基酸与BLS连接制备重组蛋白，免疫Balb/C小鼠后用绵羊附睾型布鲁氏菌攻毒，其保护性与ReV.1疫苗相当。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。

上述重组菌中，所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且缺失所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段；

所述布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列4的第58-582位核苷酸分子；

所述BLS蛋白的编码基因为序列表中序列2的第504-977位核苷酸分子；

所述L7/L12蛋白的编码基因为序列表中序列2的第978-1352位核苷酸分子；

所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列5的第1-897位核苷酸分子。

上述重组菌中，所述替换和所述缺失均通过同源重组的方式实现的；

所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因是将含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白编码基因、L7/L12蛋白编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源重组；

所述含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白编码基因、L7/L12蛋白编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段通过PUC19-SacB-bp26_NC-BL重组载体导入所述布鲁氏菌；

所述PUC19-SacB-bp26_NC-BL重组载体为将序列表中序列2所示的缺失突变盒bp26_NC-BL插入pUC19-SacB载体的SacⅠ和PstⅠ酶切位点间，且保持pUC19-SacB载体的其他序列不变得到的载体；

所述缺失布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段是将含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源重组；

所述含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段通过PUC19-SacB-wboA_N/C重组载体导入所述布鲁氏菌；

所述PUC19-SacB-wboA_N/C重组载体将序列3所示的缺失突变盒wboA-NC插入到pUC19-SacB载体中的SacⅠ和PstⅠ酶切识别位点间，且保持pUC19-SacB载体的其他序列不变得到的载体；

所述bp26蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1-503位；

所述bp26蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1353-2117位；

所述wboA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第1-618位；

所述wboA蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第619-1209位。

上述重组菌中，所述含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白的编码基因、L7/L12蛋白的编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段为序列表中序列2；所述含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段为序列表中序列3。

上述重组菌中，所述pUC19-SacB载体为将序列表中序列1所示的蔗糖敏感基因(SacB^r)插入PUC19载体的NdeI酶切识别位点间得到的载体。

上述重组菌中，所述布鲁氏菌为羊种布鲁氏菌；所述羊种布鲁氏菌具体为羊种布鲁氏菌菌株MB6；所述羊种布鲁氏菌菌株MB6的保藏编号为CGMCCNo.10964。

本发明的第二个目的是提供羊种布鲁氏菌菌株MB6。

本发明提供的羊种布鲁氏菌菌株MB6的保藏编号为CGMCCNo.10964。

本发明的第三个目的是提供一种布鲁氏菌疫苗。

本发明提供的布鲁氏菌疫苗的活性成分为上述重组菌。

上述布鲁氏菌疫苗是通过皮下、注射、口服或喷雾等方法来免疫动物的。

本发明的第四个目的是提供上述重组菌或上述羊种布鲁氏菌菌株MB6的新用途。

本发明提供了上述重组菌或上述羊种布鲁氏菌菌株MB6在制备如下1)-6)中的应用：

1)布鲁氏菌疫苗；

2)降低动物组织载菌量的产品；

3)诱发细胞免疫的产品；

4)诱发体液免疫的产品；

5)预防和/或治疗布鲁氏菌病的产品；

6)鉴别或辅助鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本的产品。

本发明的第五个目的是提供上述布鲁氏菌疫苗的新用途。

本发明提供了上述布鲁氏菌疫苗在制备具有如下1)-5)中至少一种功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围：

1)降低动物组织载菌量；

2)诱发细胞免疫；

3)诱发体液免疫；

4)预防和/或治疗牛布鲁氏菌病和/或羊布鲁氏菌病和/或猪布鲁氏菌病；

5)鉴别或辅助鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本的方法。

本发明提供的鉴别待测样本为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本的方法包括如下步骤：将待测样本与布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原混匀，

若所述待测样本与所述布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原发生凝集反应，则待测样本为或候选为上述布鲁氏菌疫苗免疫样本；

若所述待测样本与所述布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原不发生凝集反应，则待测样本为或候选为野生型布鲁氏菌感染样本。

上述方法中，所述布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原的制备方法具体如下：

(1)将上述重组菌接种于肝浸液琼脂克氏瓶，37℃培养48h，用生理盐水洗涤并离心，收集菌体。

(2)将120g氢氧化钠溶于2LPH8.9的碳酸盐缓冲液，然后加入乳酸540mL，并用PH8.9碳酸盐缓冲液定容到6L，得到缓冲液。

(3)将4g虎红染料和396mL蒸馏水混匀，得到虎红染液。

(4)将步骤(1)的菌体和碳酸盐缓冲液混匀(按每克菌体加入22.5mL碳酸盐缓冲液的比例)，得到菌悬液；然后将菌悬液与步骤(3)的虎红染液混匀(按每35mL菌悬液加入1mL虎红染液)，离心收集菌体沉淀。

(5)将步骤(4)收集的菌体沉淀与步骤(2)的缓冲液混匀(按每克菌体加入6mL缓冲液)，得到抗原。

(6)用布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株阳性血清(兔血清)标化步骤(5)获得的抗原，即得到布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明提供的羊种布鲁氏菌活疫苗是以自行从布鲁氏菌阳性的奶样中的分离的羊种布鲁氏菌菌株为母本菌株经缺失bp26基因和wboA基因后得到的。

2、本发明提供的羊种布鲁氏菌活疫苗一方面为粗糙型疫苗，用血清学方法可区分疫苗免疫和自然流行野生菌株感染，另一方面缺失了bp26基因和wboA基因，可作为分子标记利用ELISA或胶体金试纸条区分疫苗免疫和自然感染，从而解决了常规的布鲁氏菌疫苗不能区分人工免疫接种还是野生菌感染的问题。

3、本发明提供的羊种布鲁氏菌活疫苗是在临床分离株的基础上经缺失bp26基因和wboA基因后得到的，其毒力较原有菌株下降，与现有布鲁氏菌病疫苗S2相当。

4、本发明提供的羊种布鲁氏菌活疫苗通过保护性抗原L7/L12核蛋白表达量的增加而加强疫苗的免疫防治效果。

5、本发明提供的羊种布鲁氏菌活疫苗通过BLS聚合和放大抗原免疫原性的特性，相比现有布鲁氏菌S2活疫苗，具有更好的免疫保护效果。

本发明提供了一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用。本发明提供的羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株是将布鲁氏菌MB6的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。通过实验证明：本发明的分子标记疫苗株MB6Δbp26ΔwboA-BL对布鲁氏菌病具有良好的免疫保护效果，毒力更小，安全性显著提高，可用于牛、羊、猪等家畜布鲁氏菌病的免疫预防，通过免疫学技术能将野生株感染动物与免疫动物区分开来，对布鲁氏菌病的监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为羊奶中Brucella分离株VirB8-PCR鉴定。其中，泳道1为DNA2000Marker；泳道2～16为羊奶中布鲁氏菌分离株MB1～MB15。

图2为羊奶中Brucella分离株AMSO-PCR鉴定。其中，泳道1为DNA2000Marker；泳道2～16为羊奶中布鲁氏菌分离株MB1～MB15。

图3为PUC19-SacB-bp26_N/C-BL重组质粒PCR鉴定结果。其中，泳道1为DNA2000Marker，泳道2为bp26-N片段，泳道3为BL融合片段，泳道4为bp26-C片段，泳道4为bp26_NC-BL片段。

图4为PUC19-SacB-wboA_N/C重组质粒PCR鉴定结果。其中，泳道1为DNA2000Marker，泳道2为wboA-N片段，泳道3为wboA-C片段，泳道4为wboA-NC片段。

图5为重组菌株MB6Δbp26ΔwboA-BL的PCR鉴定结果。其中，图5A为以bp26-F/bp26-R为引物PCR扩增产物；图5B为以wboA-F/wboA-R为引物PCR扩增产物，泳道1为DNA2000Marker，泳道2为重组菌株MB6Δbp26ΔwboA-BL，泳道3为MB6菌株，泳道4阴性对照。

图6为小鼠接种布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株后细胞因子水平检测。图6A为INF-γ水平的检测结果，图6B为IL-4水平的检测结果。其中，其中，ConA为阳性对照；PBS为阴性对照。

图7为小鼠攻毒后脾脏载菌量变化结果。

图8为绵羊接种布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株后细胞因子INF-γ水平检测。

图9为小鼠血清的ELISA检测结果。其中，图9A为以bp26为包被抗原的ELISA检测结果；图9B为以wboA为包被抗原的ELISA检测结果。

图10为绵羊血清的ELISA检测结果。其中，图10A为以bp26为包被抗原的ELISA检测结果；图10B为以wboA为包被抗原的ELISA检测结果。

保藏说明

菌种名称：羊种布鲁氏菌

拉丁名：Brucellamelitensis

菌株编号：MB6菌株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年6月5日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10964

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的质粒pKOBEG-SacB在文献“王玉飞等，布鲁氏菌自杀载体的改建及其在突变株构建中的应用”中公开过，公众可从军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

下述实施例中的布鲁氏菌S2活疫苗(S2株)和布鲁氏菌M5活疫苗(M5株)是金宇保灵生物制品有限公司的产品。

下述实施例中的布鲁氏菌A19活疫苗(A19株)是齐鲁动物保健品有限公司的产品。

下述实施例中的布鲁氏菌强毒株16M在文献“2308、16M、S1330三株不同种布鲁氏菌的毒力测定”中公开过，公众可从内蒙古自治区农牧科学院动物传染病所获得。

下述实施例中的布鲁氏菌M111株在文献“基因缺失粗糙型布鲁氏菌rS2-ΔWboA株的构建及生物学特性研究”中公开过，公众可从内蒙古自治区农牧科学院动物传染病所获得。

实施例1、羊种布鲁氏菌MB6菌株的分离鉴定

1、样品的采集与血清学检测

选取来自内蒙古自治区呼和浩特市5个羊养殖户，共430只，绵羊360只，山羊70只，按常规抽检进行血清学检测，具体操作参照国标号GB/T18646-2002进行。

采集SAT检测为阳性(抗体效价1:200～1:800)的绵羊或山羊奶样，共21只，每只5mL于无菌试管中，冷藏送至实验室。

2、细菌分离培养

将奶样混匀，8000rmp，4℃离心15min，弃去上清，取沉淀悬液300μL分别接种于布鲁氏菌选择性培养基，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养，每隔12h观察细菌生长情况。培养4d后，在15个培养基上长出无色、透明、边缘整齐、隆起的露珠状菌落，命名为MB1～MB15，对15个菌株进行染色鉴别，结果15个菌株革兰氏染色均呈阴性，柯氏染色均呈红色，多为单个，有少数双个或链状排列。

3、PCR鉴定

采用TIAGEN基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明分别提取上述15个菌株的基因组DNA。

采用VirB8-PCR方法对8个菌株进行属的鉴定：分别以上述15个菌株的基因组DNA为模板，采用Vir8-F和Vir8-R引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，其引物序列如下：

Vir8-F:5’-GATATGAGCTCGTGTTGTGCGCCTGAAGCGCAAT-3’；

Vir8-R:5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGAGAAAATTGCTAGCACGAG-3’。

PCR反应体系：10×PCRbuffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.3μl，引物(10μM)各1μl，模板1μl，用灭菌蒸馏水补至25μl。

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，进行30个循环；72℃延伸10min。

结果如图1所示：从图中可看出，15株菌株均能扩增出大小为719bp的特异条带，而阴性对照无目的片段出现，表明15株菌株均属于布鲁氏菌。

采用AMOS-PCR方法对15个菌株进行种/型的鉴定：分别以上述15个菌株的基因组DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。其引物序列如下：

IS711-F：5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’；

A-R：5’-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3’；

M-R：5’-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3’；

O-R：5’-CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3’；

S-R：5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTAGG-3’。

PCR反应体系：10×PCRbuffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.3μl，引物(10μM)各1μl，模板1μl，用灭菌蒸馏水补至25μl。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。

结果如图2所示：有12株菌株(MB1、MB2、MB4、MB5、MB6、MB8、MB9、MB10、MB11、MB12、MB14、MB15)能扩增出大小为731bp的特异条带，而其余3株(MB3、MB7、MB13)均扩增出498bp的特异条带，而阴性对照无目的片段出现。

4、生化特性鉴定

将上述扩增出大小为731bp的菌株(MB1、MB2、MB4、MB5、MB6、MB8、MB9、MB10、MB11、MB12、MB14、MB15)交叉划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板，挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，37℃，200rmp培养48h，以羊种布鲁氏菌16M为参考菌株，对布鲁氏菌分离株进行生化特性鉴定。

结果如表1所示：15株菌株(MB1、MB2、MB4、MB5、MB6、MB8、MB9、MB10、MB11、MB12、MB14、MB15)均符合羊种布鲁氏菌的特性。

表1、布鲁氏菌分离株的生化试验鉴定

5、生物学特性鉴定

对上述鉴定的12株布鲁氏菌分离株(MB1、MB2、MB4、MB5、MB6、MB8、MB9、MB10、MB11、MB12、MB14、MB15)进行生物学特性鉴定，以羊种布鲁氏菌16M菌株为对照。

结果如表2所示：12株菌株(MB1、MB2、MB4、MB5、MB6、MB8、MB9、MB10、MB11、MB12、MB14、MB15)均不依赖CO₂，不产生H₂S，在含硫堇(1：25000)的培养基上不生长，能在含碱性复红(1:25000)的培养基上生长，在含硫堇(1:50000)和碱性复红(1:50000)的培养基上均能生长，不被噬菌体Tb和Wb裂解，能被噬菌体Bk2裂解，血清因子表明除MB4菌株和MB11菌株属于羊种布鲁氏菌3型外，其余菌株均属于羊种布鲁氏菌1型。

表2、布鲁氏菌分离株的生物学特性鉴定

6、布鲁氏菌分离株的毒力鉴定

将上述12株布鲁氏菌分离株(MB1、MB2、MB4、MB5、MB6、MB8、MB9、MB10、MB11、MB12、MB14、MB15)以1×10⁶CFU/只剂量分别接种18～20g雌性Balb/C小鼠，每组5只，腹股沟皮下接种，同时以16M菌株和M5菌株为对照。于接种后15天剖杀，无菌采集脾脏分别加入1mL无菌生理盐水，制成悬液。用生理盐水10倍梯度连续稀释，分别取1:1000和1:10000稀释液涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板，置于37℃温箱培养5～7天，计算脾脏含菌量。

结果如表3所示：从表中可看出，MB6菌株接种小鼠的脾脏平均载菌量(9.58×10⁴CFU)低于其它11株菌株和16M菌株的脾脏载菌量，但高于M5菌株的脾脏平均载菌量。

表3、Brucella分离株的小鼠脾脏载菌量测定结果

将MB6菌株以1×10⁹CFU/只的剂量接种250～300g雌性Hartley豚鼠，疫苗免疫后15d，剖杀各组豚鼠，计算豚鼠每克脾脏含菌量评价MB6菌株的毒力大小。

结果如表4所示：MB6菌株感染的豚鼠每克脾脏含菌量为1.25×10⁶CFU/g，稍高于M5疫苗感染的豚鼠每克脾脏含菌量(6.86×10⁵CFU/g)。

表4、不同菌株免疫的豚鼠脾脏含菌量测定结果

7、免疫保护性试验

将MB6菌株接种Balb/C小鼠，同时以M5疫苗为对照，每组10只，腹股沟皮下注射，接种剂量为1×10⁶CFU活菌/0.2mL/只，另取5只小鼠作为阴性对照，皮下注射0.2mL的0.01M、PH为7.2的无菌PBS溶液(每升含2.86gNa₂HPO₄·12H₂O、0.312gNaH₂PO₄·2H₂O、8.5gNaCl)。分别于免疫后30d断尾采血，收集血清，用虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原测定抗体水平。

结果表明：实验组小鼠通过虎红平板凝集抗原检测时，均能在2min内出现凝集反应；通过试管凝集试验抗原检测时，抗体效价均达到1:100以上，无明显差异，而PBS对照组的小鼠血清学反应检测结果均呈阴性。

接种后45d分别用强毒布鲁氏菌16M株以200CFU/只的剂量进行攻毒，每只0.1mL，腹腔注射，攻毒后15天剖杀各组小鼠，无菌采集脾脏分别加入1mL无菌生理盐水，制成悬液，适当稀释后涂布于TSA平板，置于5％CO₂，37℃温箱培养5～7天，根据其生长的菌落数评价分离株的免疫保护效果。

结果如表5所示：与PBS对照组相比，MB6菌株和M5菌株均对小鼠具有免疫保护作用，且MB6菌株和M5菌株之间无明显差异。

表5、不同菌株对小鼠的免疫保护效力比较

注:保护单位为PBS组小鼠脾脏细菌数的对数值减去免疫组小鼠脾脏细菌数的对数值；

8、遗传稳定性鉴定

将MB6菌株接种于5mLTSB液体培养基中，37℃，200r/min摇床培养36h后，按1:100比例接种至新的TSB液体培养基中振荡培养36h，如此反复在体外传至30代，分别标记为E1～E30。取E1、E5、E10、E20、E30代次培养物，进行培养形态、生化特性、生物学特性、毒力及免疫保护性鉴定，观察布鲁氏菌分离株的遗传稳定性。

结果如表6所示：各代次菌株均符合羊种布鲁氏菌生物型1的特性，毒力没有变化。

表6、布鲁氏菌MB6菌株体外传代遗传稳定性鉴定结果

以上鉴定和分析的结果表明：MB6菌株的分类命名为羊种布鲁氏菌(Brucellamelitensis)，该菌株已于2015年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.10964。

实施例2、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL的构建及鉴定

一、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26-BL的获得

1、PUC19-SacB载体的构建

PUC19-SacB重组载体为将如序列表中序列1所示的蔗糖敏感基因(SacB^r)插入PUC19载体的NdeI酶切识别位点间，且保持PUC19载体的其他序列不变得到的载体。

2、引物的设计

根据羊种布鲁氏菌菌株MB6基因序列中bp26基因(bp26蛋白的氨基酸序列为序列6，bp26蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列4)的上、下游核苷酸序列，设计相应的特异性引物bp26-N-F/bp26-N-R和bp26-C-F/bp26-C-R，并在上游片段的正向引物bp26-N-F和下游片段的反向引物bp26-C-R的5’端引入限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ位点及其相应的保护性碱基。引物序列如下：

bp26-N-F:5’-ATATGAGCTCGTGTTGTGCGCCTGAAGCGCAAT-3’；

bp26-N-R:5’-CACCACACGGCCAAGGACGAGCATGATTGTGGAAAATGA-3’；

bp26-C-F:5’-ACAATCATGCTCGTCCTTGGCCGTGTGGTGGAAATC-3’；

bp26-C-R:5’-CGGCTGCAGTTTCCGTTCATCATTTGG-3’；

根据羊布鲁氏菌菌株MB6基因组中L7/L12基因和BLS基因序列，设计特异性引物L7/L12-F/L7/L12-R，BLS-F/BLS-R，引物序列如下：

BLS-F:5’-ACTCGTGCTAGCAATTTTCTCATGAACCAAAGCTGTCCGAAC-3’；

BLS-R:5’-ATCTTTGCGAGATCAGCCATGACAAGCGCGGCGATGCGGCT-3’；

L7/L12-F:5’-AGCCGCATCGCCGCGCTTGTCATGGCTGATCTCGCAAAGAT-3’；

L7/L12-R:5’-AGGGCGTCATACCCCAGCTATTTACTTGAGTTCAACCTTGGC-3’；

根据缺失的bp26基因序列，设计相应的特异性检测引物，引物序列如下：

bp26-F:5’-ATGAACACTCGTGCTAGCAATTTTCTCG-3’；

bp26-R:5’-TTACTTGATTTCAAAAACGACATTGACC-3’。

3、自杀载体PUC19-SacB-bp26_N/C-BL的构建

(1)用TIANGEN公司的细菌基因组提取试剂盒，参照说明书提取羊布鲁氏菌菌株MB6的基因组DNA，以羊布鲁氏菌菌株MB6的基因组DNA为模板，采用引物bp26-N-F/bp26-N-R进行PCR扩增，得到大小为503bp的bp26基因的上游同源臂序列(如序列2的第1-503位的核苷酸所示)，命名为bp26-N；采用引物bp26-C-F/bp26-C-R进行PCR扩增，得到大小为765bp的bp26基因下游同源臂序列(如序列2的第1353-2117位的核苷酸所示)，命名为bp26-C；采用引物BLS-F/BLS-R进行PCR扩增，得到大小为474bp的BLS基因片段(如序列2的第504-977位的核苷酸所示)，BLS基因编码的BLS蛋白的氨基酸序列如序列表中序列8所示；采用引物L7/L12-F/L7/L12-R进行PCR扩增，得到大小为375bp的L7/L12基因序列(如序列2的第978-1352位的核苷酸所示)，L7/L12基因编码的L7/L12蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示。

上述PCR反应体系：10×ExTaqbuffer5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，ExTaq聚合酶0.5μL，模板DNA1μL，水35.5μL。

上述PCR扩增条件：94℃5min，94℃45s，58℃45s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。

用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，参照说明书对PCR扩增产物进行回收纯化。

(2)首先，以BLS-F/L7/L12-R为引物，利用OverlapPCR的方法将BLS和L7/L12基因片段相连接，得到BL片段；然后以bp26-N-F/bp26-C-R为引物，通过OverlapPCR将上述bp26-N、BL、bp26-C连接，得到缺失突变盒bp26_NC-BL(如序列表中序列2所示)，PCR产物经琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化。

上述PCR反应体系：10×ExTaqbuffer5μL，dNTPs(10mM)6μL，上游引物(10μM)4μL，下游引物(10μM)4μL，ExTaq聚合酶1μL，模板(200ng/μL)均为1μL，水27μL。

上述PCR扩增条件：94℃5min，94℃45s，48℃45s，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min。

(4)用限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ对缺失突变盒bp26_NC-BL和pUC19-SacB重组载体进行双酶切；

上述酶切反应体系(50μL)：10×buffer5μL，SacⅠ(NEB)1μL，PstⅠ(NEB)1μL，DNA模板30μL，水13μL；

上述酶切反应条件：37℃作用过夜。反应结束后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收。

(5)在T4DNA连接酶的作用下，对上述回收的缺失突变盒bp26_NC-BL与PUC19-SacB重组载体进行连接；

上述连接体系(10μL)：10×T4Ligasebuffer1μL，片段6μL，载体1μL，T4DNALigase1μL，补水至10μL；上述连接反应条件：16℃过夜连接。

(6)连接产物经常规热击法转化DH5a感受态细胞，长出的菌落用质粒小提试剂盒提取质粒，质粒经PCR鉴定(PCR鉴定的引物为bp26-N-F/bp26-C-R)正确后，送上海生工测序，测序正确的命名为PUC19-SacB-bp26_NC-BL。

结果如图3所示：其中，M为DNA2000Marker；1为bp26-N片段；2为BL片段，3为bp26-C片段；4为bp26_NC-BL片段；PCR扩增分别获得了大小为503bp的bp26-N片段、大小为849bp的BL片段、大小为765bp的bp26-C片段和大小为2117bp的bp26_NC-BL片段，与预期结果相符。

经过测序验证表明：PUC19-SacB-bp26_NC-BL为将序列表中序列2所述的缺失突变盒bp26_NC-BL片段插入到pUC19-SacB中的SacⅠ和PstⅠ酶切识别位点间，且保持pUC19-SacB载体的其他序列不变得到的载体。

序列2所示的DNA分子中，第1-503位为bp26基因的上游同源臂序列、第504-1352位为BL融合基因序列，第1353-2117位为bp26基因的下游同源臂序列。

4、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26-BL的获得

(1)布鲁氏菌MB6感受态细胞的制备

挑取TSA平板上新鲜培养的实施例1获得的布鲁氏菌MB6单菌落接种于5mLTSB液体培养基中，37℃，200rmp摇床培养12h后按2％转接至100mLTSB中，37℃振荡培养至OD₆₀₀≈0.8时，停止培养，然后冰浴30min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体。菌体沉淀经预冷10％甘油洗涤3次，每次5min，菌体沉淀用1mL10％甘油重悬，得到布鲁氏菌MB6感受态细胞，按100μL/管分装，-80℃保存备用。

(2)布鲁氏菌电转化

将3μgPUC19-SacB-bp26_N/C-BL质粒加入到100μL布鲁氏菌MB6感受态细胞中，充分混匀，冰浴10～15min，将混合液全部加入到预冷的2mm的电击杯中(贴壁加入避免产生气泡)，冰浴10～15min，然后于1.8kV、25μF、400Ω的电击参数下进行电击，电击结束后立即加入1mL预热的TSB培养基重悬细菌，转入5mL离心管中，37℃复苏24h，复苏后的转化产物全部涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的TSA平板，37℃培养。

(3)布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26-BL的筛选

挑取电转后培养5～7d的单菌落在无抗的TSB培养基中培养12h后，适当稀释后涂布在含5％蔗糖的TSA固体培养基上，37℃培养5d～7d后挑取单菌落，设计特异性检测引物bp26-F/bp26-R，用PCR方法鉴定(PCR鉴定的引物bp26-F/bp26-R)同源重组双交换重组菌。

布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26-L7/L12是将布鲁氏菌MB6中bp26基因部分片段替换为BLS基因片段和L7/L12基因片段后得到的重组菌。bp26基因部分片段如序列表中序列4的第58～582位核苷酸所示。

二、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL的获得

1、引物的设计

根据羊种布鲁氏菌菌株MB6基因序列中wboA基因(wboA蛋白的氨基酸序列为序列7，wboA蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列5)的上、下游核苷酸序列，设计相应的特异性引物wboA-N-F/wboA-N-R和wboA-C-F/wboA-C-R，并在上游片段的正向引物wboA-N-F和下游片段的反向引物wboA-C-R的5’端引入限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ位点(斜体表示)及其相应的保护性碱基。引物序列如下：

wboA-N-F:5’-TATTGTTGCAGACGGAGCAGCCCTCCAC-3’；

wboA-N-R:5’-CGCATACTCCTTGTCACTGATTTCCCGTGTCTACTC-3’；

wboA-C-F:5’-ACACGGGAAATCAGTGACAAGGAGTATGCGGAGCTT-3’；

wboA-C-R:5’-CGGGGGAACTTATCTCTCAACTTCCAT-3’；

根据缺失的wboA基因序列，设计相应的特异性检测引物，引物序列如下：

wboA-F：5’-CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3’；

wboA-R：5’-CAAACCCGGGTGACCTGATAACACGTCTA-3’。

2、自杀载体PUC19-SacB-wboA_N/C的构建

(1)用TIANGEN公司的细菌基因组提取试剂盒，参照说明书提取布鲁氏菌MB6的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，采用引物wboA-N-F/wboA-N-R进行PCR扩增，扩增得到大小为618bp的wboA基因的上游同源臂序列，将其命名为wboA-N(如序列3的第1-618位核苷酸所示)；采用引物wboA-C-F/wboA-C-F进行PCR扩增，扩增得到大小为591bp的wboA基因下游同源臂序列，将其命名为wboA-C(如序列3的第619-1209位核苷酸所示)。

上述PCR反应体系：10×ExTaqbuffer5μL，dNTPs(10mM)4μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，ExTaq聚合酶0.5μL，模板DNA1μL，水35.5μL。

上述PCR扩增条件：94℃5min；94℃45s，48℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。

用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，参照说明书对扩增的PCR产物进行回收纯化。

(2)采用wboA-N-F/wboA-C-R为引物，通过OverlapPCR方法将wboA-N和wboA-C连接，得到缺失突变盒wboA-NC(如序列表中序列3所示)。

上述PCR反应体系：10×ExTaqbuffer5μL，dNTPs(10mM)6μL，上游引物(10μM)4μL，下游引物(10μM)4μL，ExTaq聚合酶1μL，模板(wboA-N)(200ng/μL)1μL，模板(wboA-C)(200ng/μL)1μL，水28μL。

上述PCR扩增条件：94℃5min，94℃45s，44℃45s，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min。

(3)用限制性内切酶SacⅠ和PstⅠ对缺失突变盒wboA-NC和pUC19-SacB载体进行双酶切，37℃作用过夜。反应结束后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物进行回收。

上述酶切反应体系(50μL)：10×buffer5μL，SacⅠ(NEB)1μL，PstⅠ(NEB)1μL，DNA模板30μL，水13μL。

(4)在T4DNA连接酶的作用下，对上述回收的缺失突变盒wboA-NC与PUC19-SacB载体进行连接，得到连接产物。

上述连接体系(10μL)：10×T4Ligasebuffer1μL，片段6μL，载体1μL，T4DNALigase1μL，补水至10μL；连接反应条件：16℃过夜连接。

(5)将上述连接产物经常规热击法转化DH5a感受态细胞，长出的菌落用质粒小提试剂盒提取质粒，质粒经酶切和PCR鉴定(PCR鉴定的引物wboA-N-F/wboA-C-R)正确后，送上海生工测序，测序正确的命名为PUC19-SacB-wboA_N/C。

结果如图4所示：其中，泳道1为DNA2000Marker，泳道2为wboA-N片段，泳道3为wboA-C片段，泳道4为wboA-NC片段，经PCR扩增分别获得了大小为618bp的wboA-N片段、大小为591bp的wboA-C片段和大小为1209bp的缺失突变盒wboA-NC片段。

PUC19-SacB-wboA_N/C为将序列3所述的缺失突变盒wboA-NC插入到pUC19-SacB载体中的SacⅠ和PstⅠ酶切识别位点之间，且保持pUC19-SacB载体的其他序列不变得到的载体。序列3中，第1-618位为wboA基因的上游同源臂序列、第619-1209位为wboA基因的下游同源臂序列。

3、布鲁氏菌MB6Δbp26-BL感受态细胞的制备

按照步骤一的4中的布鲁氏菌MB6感受态的制备方法制备布鲁氏菌MB6Δbp26-BL感受态细胞。

4、布鲁氏菌电转化

将3μgPUC19-SacB-wboA_N/C质粒加入到100μL的布鲁氏菌MB6Δbp26-L7/L12感受态细胞中，充分混匀，冰浴10～15min，将混合液全部加入到预冷的2mm的电击杯中(贴壁加入避免产生气泡)，冰浴10～15min，然后于1.8kV、25μF、400Ω的电击参数下进行电击，电击结束后立即加入1mL预热的TSB培养基重悬细菌，转入5mL离心管中，37℃复苏24h，复苏后的转化产物全部涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的TSA平板，37℃培养。

5、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL的筛选

挑取电转后培养5d～7d的单菌落在无抗的TSB培养基中培养12h后，适当稀释后涂布在含5％蔗糖的TSA固体培养基上，37℃培养5d～7d后挑取单菌落，利用设计的特异性引物wboA-F/wboA-R，通过PCR方法鉴定(PCR鉴定的引物wboA-F/wboA-R)同源重组双交换菌，将鉴定正确的命名为布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL。

结果如图5所示：其中，图5A为以bp26-F/bp26-R为引物的PCR结果，图5B为wboA-F/wboA-R为引物的PCR结果，泳道1为DNA2000Marker，泳道2为重组菌株MB6Δbp26ΔwboA-BL，泳道3为MB6菌株，泳道4为阴性对照，重组菌株扩增获得了大小为1077bp和225bp的片段，而MB6菌株扩增得到大小为753bp和1122bp的目的条带。

布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL是将以BLS-L7/L12融合基因替换布鲁氏菌MB6基因组中bp26基因部分片段并同时缺失wboA基因部分片段后得到的重组菌，bp26基因部分片段如序列表中序列4的第58～582位核苷酸所示，wboA基因部分片段如序列表中序列5的第1～897位核苷酸所示。

三、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL的生物学特性鉴定

1、形态学鉴定

布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL经革兰氏染色为阴性；经柯氏染色呈红色。菌体为球杆菌，单个散在，无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，大小约0.6～2.5μm，具有布鲁氏菌的典型特征。

2、培养特性鉴定

布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株在pH6.4～6.8的胰大豆琼脂(TSA)培养基上生长的菌落粗糙粘稠、边缘不整齐，颗粒大小不均一；在液体培养基(如马丁汤、胰眎肉汤、肝汤等)中培养时出现絮状沉淀，液体较透明。

3、生化特性鉴定

对布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株进行生化鉴定结果如表7所示：从表中可看出，布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株符合羊种布鲁氏菌的特性。

表7、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株生化鉴定结果

4、生物学特性鉴定

对布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株进行生物学特性鉴定，以羊种布鲁氏菌16M为对照。

结果如表8所示：布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL均符合羊种布鲁氏菌生物型1的特性，不依赖CO₂，不产生H₂S，在含硫堇(1:25000)培养基上不生长，在含碱性复红(1:25000)培养基上生长，与A和M因子血清不凝集，与R因子血清呈凝集现象。

表8、布鲁氏菌分离株的生物学特性鉴定

5、粗糙型特性鉴定

用无菌生理氯化钠溶液将布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL稀释成每毫升含2.5×10⁹CFU～3×10⁹CFU的菌悬液，置90℃水浴中30min后出现凝集；结晶紫染色检查结果表明能被结晶紫着色。

6、血清学特性检测

将布鲁氏菌M5株和布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株制成抗原腹腔注射小鼠2次，间隔1个月，第二次接种1个月后采血分离血清。血清与布鲁氏菌S2株、16M株、A19株等光滑型布鲁氏菌和M111株等粗糙型布鲁氏菌进行凝集反应。

试验结果：布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL小鼠血清与布鲁氏菌S2株、16M株、A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阴性，与M111株等粗糙型布鲁氏菌凝集反应呈阳性；而M5小鼠血清与S2株、16M株和A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应呈阳性，与粗糙型布鲁氏菌M111株凝集反应呈阴性。

7、遗传稳定性

将布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株(标记为E1代)在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上连续传30代，且各代次标记为E2～E30代，分别鉴定其形态和生化特性、培养特性、基因特性、毒力、安全性及免疫原性等特性。

结果表明：布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株各代次的形态、生化特性、培养特性、基因特性、毒力、安全性及免疫原性均没有发生变化，遗传稳定性良好。

实施例3、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL作为布鲁氏菌疫苗在免疫小鼠中的应用

1、毒力鉴定

参照《药典》对布病疫苗菌种毒力的测定方法，用生理氯化钠溶液将培养44h～48h的布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL的新鲜培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU活菌的悬液，同时以布鲁氏菌S2活疫苗为对照，腹腔注射250～300g健康雌性豚鼠，每组5只，每只1mL。接种后15d扑杀各组豚鼠，无菌采集脾脏混合称重，取0.1g脾脏分别加入1mL无菌生理氯化钠溶液，制成悬液。吸取0.1mL，用生理盐水10倍梯度连续稀释，分别取1:100和1:1000稀释涂布胰眎琼脂平板，置于37℃温箱培养3～5天，根据其生长的菌落数计算每克脾脏的含菌量。

结果表明：免疫布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL和布鲁氏菌S2株的豚鼠每克脾脏的平均含菌量均不超过20万CFU，接种布鲁氏菌S2株的豚鼠脾脏平均含菌量为2.32×10⁴CFU/g，而接种布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL重组菌的豚鼠脾脏平均含菌量为1.25×10⁴CFU/g。

2、安全性检验

参照《药典》对布病疫苗安全性的测定方法，用生理氯化钠溶液将培养44h～48h的MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株的新鲜培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU的菌悬液，腹股沟皮下注射18～20g健康的雌性Balb/C小鼠，每组10只，每只0.25ml，连续观察7天。

结果表明：7日内小鼠全部健活，小鼠精神状态良好，行为活跃，摄食量正常。

3、疫苗效力评价

(1)小鼠免疫

取4～6周龄雌性Balb/C小鼠45只，随机分成3组，即实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组15只，腹股沟皮下注射，实验组接种布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株，每只0.2mL，接种剂量为1×10⁸CFU活菌/只；阳性对照组接种S2活疫苗，每只0.2mL，接种剂量为1×10⁸CFU活菌/只，阴性对照组注射0.2mL的PH7.2、0.01M的PBS。

(2)体液免疫水平的检测

于免疫后28d断尾采血，收集血清，用试管凝集抗原测定疫苗诱导的体液免疫水平。具体步骤如下：

1)布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原的制备：

A、将布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株接种于布氏琼脂培养基(43g布氏琼脂溶于1L蒸馏水)，37℃培养72h，用生理盐水洗下培养物，离心收集菌体，生理盐水洗涤一次，调整浓度为每毫升含200亿活菌的菌悬液。将菌悬液给体重1.5公斤的家兔耳静脉注射3次，每次1mL，间隔10天，当血清效价达到1:640-1:1280时放血，分离血清，即为阳性血清。将未免疫的健康家兔放血分离血清，即为阴性血清。

B、将布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株接种于布氏琼脂培养基，37℃培养48h，用生理盐水洗下菌苔，离心收集菌体，生理盐水洗涤一次，经涂片镜检无杂菌后，用4层纱布过滤，于70℃水浴灭菌，经检验无活菌后，用PH8.9的碳酸盐缓冲液(0.5％氯化钠，0.5％石炭酸，0.05M碳酸钠，0.1M碳酸氢钠)调整浓度为1000亿/mL，即为原液。

C、取滴度较高的阳性血清，加入适量的阴性血清，以1:500稀释。将原液按1:14、1:16、1:18、1:20、1:22稀释度稀释，将上述稀释的抗原和血清各0.5mL混匀，置于37℃±l℃温箱反应24小时观察结果，以标准化的对照管做比较。当凝集结果呈“++”时的原液稀释度即为最适稀释度。

D、将PH8.9的碳酸盐缓冲液作为稀释液将步骤B的原液按最适稀释度10倍浓度的量进行稀释，即为布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原。

2)用PH8.9的碳酸盐缓冲液作为抗原和血清的稀释液。将布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原作1:20稀释，被检小鼠血清作1:12.5、l:25、l:50、1:100和1:200稀释。每管加布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原0.5ml与各稀释度血清等量混合(同时设阴阳性血清对照)，振荡摇匀，置37℃±l℃温箱反应24小时。若血清1:50稀释时，出现50％以上凝集则判为阳性；若血清1:25稀释时，出现50％以上凝集判为可疑。

血清学检测结果表明，通过布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原检测时，布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫小鼠的抗体效价均达到1:100以上，而S2菌株免疫小鼠和PBS接种小鼠血清检测结果均为阴性；通过布鲁氏菌试管凝集抗原(购自中国兽医药品监察所，批号201302)检测时，布鲁氏菌S2疫苗免疫小鼠血清的抗体效价均达1:100以上，而布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫小鼠和PBS接种小鼠血清检测结果均为阴性。

(3)细胞免疫水平的检测

免疫后30d，各组取5只小鼠处死，无菌分离脾脏，采用EZ-Sep^TMMouse1×淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏淋巴细胞，然后用小鼠细胞因子ELISPOT试剂盒测定IL-4和IFN-γ细胞因子水平。

ELISPOT检测结果如图6所示：MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株分泌IFN-γ水平明显高于S2疫苗株分泌的IFN-γ水平，差异显著，且均高于PBS对照组；MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株与S2疫苗株分泌的IL-4水平稍高于PBS对照组，差异不显著。说明MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株能够诱发细胞免疫，尤其是IFN-γ水平明显提高。

(4)攻毒试验

免疫后45d用强毒布鲁氏菌16M株以200CFU/只的剂量接种攻毒，攻毒后15天剖杀，无菌采集脾脏，分别加入1mL的灭菌生理盐水，匀浆制成悬液，适当稀释后接种于TSA平板，置于37℃温箱培养3～5天，根据其生长的菌落数，确定布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株的保护性。

用16M攻毒后，脾脏载菌量变化结果如图7所示(图中PBS表示阴性对照组的实验结果，S2表示阳性对照组的实验结果，MB6Δbp26ΔwboA-BL表示布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL疫苗组的实验结果)：免疫布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL疫苗的小鼠攻毒后脾脏平均含菌量为8.7log₂CFU/g，而S2疫苗免疫的小鼠攻毒后脾脏平均含菌量为11.3log₂CFU/g，二者显著性差异，但均低于PBS组的脾脏平均含菌量。说明布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL疫苗可以明显降低脾脏平均含菌量。

实施例4、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL作为布鲁氏菌疫苗在免疫绵羊中的应用

1、动物免疫

取怀孕绵羊30只，打耳号，随机分为3组：实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组10只，每只5mL，口服免疫，以投药器喷注到绵羊舌根及咽喉部位，实验组免疫100亿CFU的实施例2制备的布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL，阳性对照组免疫100亿CFU的S2活疫苗、阴性对照组免疫PH7.2、0.01M的PBS。

2、动物免疫后的临床表现

接种绵羊后，逐日记录怀孕绵羊的妊娠反应，体温变化、饮食情况及精神状态，绵羊分娩后，观察羔羊生长活力，包括精神状态、食欲情况及体重变化。

动物免疫后的临床结果：布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL免疫绵羊后，绵羊均没有发生接种不良反应，包括发热、呼吸急促、食欲下降、行动迟缓或跛行、流产或死胎等症状，绵羊体温变化正常，均在38.0℃～39.9℃范围之内，与布鲁氏菌S2活疫苗没有明显差异，与阴性对照组绵羊也没有明显差异。

所有绵羊均正常分娩，羔羊活力良好，可自行站立、正常吃奶，体温正常，行动自如，体重正常增加，与布鲁氏菌S2活疫苗免疫组和阴性对照组均没有明显差异。

3、绵羊免疫后抗体水平检测

于免疫后30d采集各组绵羊血液，分离血清，按实施例3的试管凝集抗原检测方法测定各组绵羊血清的抗体水平；用绵羊INF-γELISA检测试剂盒测定INF-γ因子水平，以评价菌株诱导的细胞免疫水平。

(1)血清学检测结果表明：通过布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原检测时，布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫绵羊的抗体效价均达到1:100以上，而S2菌株免疫绵羊和PBS接种绵羊血清检测结果均为阴性；通过商品化布鲁氏菌试管凝集抗原检测时，布鲁氏菌S2疫苗免疫绵羊血清的抗体效价均达1:100以上，而布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫绵羊和PBS接种小鼠绵羊检测结果均为阴性。

(2)ELISA检测结果如图8所示：布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL接种绵羊后产生的IFN-γ水平明显高于布鲁氏菌S2活疫苗组，而且均高于PBS阴性对照组。说明MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株能够诱发细胞免疫，尤其是IFN-γ水平明显提高。

4、免疫保护性试验

免疫后45天用200CFU剂量16M强毒株眼结膜感染攻毒。攻毒后30天剖杀，取1g脾脏，加入1ml生理盐水中，用组织捣碎机器捣碎后取100μL涂布TSA平板，37℃培养3-5天，对生长出的细菌采用AMOSPCR进行鉴定。

试验结果：16M强毒株攻毒后，根据细菌分离情况，阴性对照组5只羊全部感染，布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL能提供90％(9/10)的保护，而且S2疫苗的保护率为80％(8/10)，差异显著，说明布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL具有更好的免疫保护效果。

实施例5、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL分子标记功能的验证

一、bp26蛋白基因的克隆、表达及纯化

1、根据GenBank中bp26基因的序列，设计相应的特异性引物bp26-F1/bp26-R1，分别在上下游引物的5’端引入限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点(斜体表示)及其相应的保护性碱基。引物序列如下：

bp26-F1：5’-CGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGCTG-3’；

bp26-R1：5’-CGGGTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’。

以MB6基因组DNA为模板，以bp26-F1/bp26-R1为引物进行PCR扩增得到bp26片段，对bp26片段进行回收纯化。然后按常规方法对PCR产物进行酶切、连接、转化等操作，对长出的菌落进行PCR鉴定，鉴定正确的命名为重组载体PET28a-bp26，并对其进行测序验证。

结果表明：重组载体PET28a-bp26为将序列表中序列4的第58～582位核苷酸分子插入PET28a载体的NdeⅠ和xhoⅠ酶切位点间，且保持PET28a载体的其他序列不变得到的载体。

将重组载体PET28a-bp26导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌PET28a-bp26/BL21。

2、蛋白bp26的表达和纯化

将重组菌PET28a-bp26/BL21接种到5ml含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养液中，次日，2％转接到2LLB培养液中，于37℃200rmp震荡培养，当OD₆₀₀值达0.5时，加入终浓度为0.5mMIPTG进行诱导表达，诱导6h后，离心收集菌体。

将菌体沉淀重悬于缓冲液中(20mMPB，0.5MNaCl，pH7.4)中，超声破碎后取上清与Ni-NTAAgarose结合后以洗脱缓冲液(300mM咪唑，20mMPB，0.5MNaCl，pH7.4)洗脱，收集目的蛋白峰。

二、wboA蛋白基因的克隆、表达及纯化

1、根据GenBank中wboA基因的序列，设计相应的特异性引物wboA-F1/wboA-R1，分别在上下游引物的5’端引入限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点(斜体表示)及其相应的保护性碱基。引物序列如下：

wboA-F1：5’-CGCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGCTG-3’；

wboA-R1：5’-CGGCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’。

以MB6基因组DNA为模板，以wboA-F1/wboA-R1为引物进行PCR扩增得到wboA片段，对wboA片段进行回收纯化。然后按常规方法对PCR产物进行酶切、连接、转化等操作，对长出的菌落进行PCR鉴定，鉴定正确的命名为重组载体PET28a-wboA，并对其进行测序验证。

结果表明：重组载体PET28a-wboA为将序列表中序列5的第1～897位核苷酸分子插入PET28a载体的NdeⅠ和xhoⅠ酶切位点间，且保持PET28a载体的其他序列不变得到的载体。

将重组载体PET28a-wboA导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌PET28a-wboA/BL21。

2、蛋白wboA的表达和纯化

将重组菌PET28a-wboA/BL21接种到5ml含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养液中，次日，2％转接到2LLB培养液中，于37℃200rmp震荡培养，当OD₆₀₀值达0.5时，加入终浓度为0.5mMIPTG进行诱导表达，诱导6h后，离心收集菌体。

将菌体沉淀重悬于缓冲液中(20mMPB，0.5MNaCl，pH7.4)中，超声破碎后取上清与Ni-NTAAgarose结合后以洗脱缓冲液(300mM咪唑，20mMPB，0.5MNaCl，pH7.4)洗脱，收集目的蛋白峰。

三、布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原的制备

1、菌液制备

将布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株接种于布氏琼脂培养基(43g布氏琼脂溶于1L蒸馏水)，37℃培养48h，用生理盐水洗下菌苔，离心收集菌体；将菌体用生理盐水洗涤一次，经涂片镜检无杂菌后，用4层纱布过滤，70℃水浴灭菌，经检验无活菌后，离心收集菌体备用。

2、缓冲液配制

将120g氢氧化钠溶于2LPH8.9碳酸盐缓冲液(0.5％氯化钠，0.5％石炭酸，0.05M碳酸钠，0.1M碳酸氢钠)，然后加入乳酸540mL，并用PH8.9碳酸盐缓冲液定容到6L，115℃灭菌30分钟，得到缓冲液，备用。

3、虎红染液的配制

称取虎红染料4g，加入灭菌蒸馏水396mL，充分震荡使其溶解，得到虎红染液，4℃保存备用。

4、抗原的制备

将1g步骤1获得的菌体与22.5mLPH8.9碳酸盐缓冲液混匀，得到菌悬液，用磁力搅拌器搅拌30min；然后将35mL菌悬液与1mL步骤3获得的虎红染液混匀，搅拌30min；通过4层纱布过滤，离心收集菌体；将1g菌体与6mL步骤2制备的缓冲液混匀，搅拌30min，得到抗原，4℃保存备用。

5、抗原的标化

用布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株阳性血清(兔血清)标化步骤4获得的抗原，具体操作如下:

1)用阴性血清将布鲁氏菌阳性血清(兔血清)配制成每毫升血清含25、50、100和200凝集单位。

阳性血清的制备：给体重1.5公斤的家兔耳静脉注射3次，每次1mL，间隔10天，当血清效价达到1:640-1:1280时放血，分离血清，即为阳性血清。将未免疫的健康家兔放血分离血清，即为阴性血清。

2)取一洁净玻板，划成横4纵6的24方格。

3)用微量吸管依次吸取每毫升含25单位、50单位、100单位和200单位的血清加入第1、2、3和4纵列各格，每格30μL。

4)取0.5mL步骤4获得的抗原，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL稀释液(PH8.9的碳酸盐缓冲液)稀释抗原，然后各取30μL分别与上述不同单位的血清混匀，混匀后4min内记录反应结果。反应结果：在25单位血清呈(-)反应，在50单位血清呈(+)反应，在100单位血清呈(++)反应，在200单位血清呈(+++)反应的抗原为最适稀释度的抗原。

结果表明：最适稀释度的抗原为0.4mL稀释液稀释的抗原(即0.5mL抗原加0.4mL稀释液)，即为布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原。

四、布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL分子标记功能的验证

1、小鼠血清的验证

对实施例3收集的小鼠血清进行分子标记的验证，分别采用血清学检测和ELISA方法进行验证。

(1)血清学检测

分别吸取30μL血清和30μLMB6Δbp26ΔwboA-BL凝集抗原或30μL布鲁氏菌虎红平板凝集抗原(购自中国兽医药品监察所，批号201301)，均匀混合涂于玻璃板上，1～2min内观察凝集结果.

试验结果：接种MB6Δbp26ΔwboA-BL的小鼠血清与MB6Δbp26ΔwboA-BL凝集抗原作用时能在2min内出现凝集反应，呈阳性，接种S2的小鼠血清和PBS对照组的小鼠血清检测均呈阴性，而以布鲁氏菌虎红凝集抗原检测时，接种MB6Δbp26ΔwboA-BL的小鼠血清RBPT检测结果呈阴性，而接种S2的小鼠血清能在2min内出现凝集反应，PBS对照组的小鼠血清检测呈阴性。

(2)ELISA检测

分别以bp26蛋白和wboA蛋白为包被抗原，用ELISA法检测各组小鼠血清中抗体水平。检测方法如下：将纯化的蛋白用包被液稀释至3μg/mL，加至ELISA微孔板，100μl/孔，4℃包被过夜；次日，加入洗涤缓冲液，重复洗涤三次，每次3～5min，最后一次拍干至无水为止；每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h；按上述方法洗涤三次，将待检血清用抗体稀释液稀释，100μl/孔，37℃温箱中孵育2h；再次洗涤三次，将兔抗鼠HRP-IgG用抗体稀释液1:20000稀释，100μl/孔，37℃温箱中孵育1h；洗涤三次，每孔加入100μL新鲜的TMB显色液，37℃温箱中孵育10～15min；每孔加入50μL2MH₂SO₄终止反应，用酶联免疫检测仪测定OD₄₅₀值。

结果如图9所示：纵坐标代表的是OD₄₅₀值，横坐标代表血清不同稀释度：从图中可以看出，当血清稀释倍数在100～3200时，无论以bp26为包被抗原(图9A)还是以wboA为包被抗原(图9B)，S2疫苗接种的小鼠血清的OD₄₅₀值均明显高于MB6Δbp26ΔwboA-BL小鼠血清的OD₄₅₀值，而布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL免疫小鼠血清与PBS阴性对照没有明显差异，从而证实了布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL具有分子标记功能。

2、绵羊血清的验证

对实施例4收集的绵羊血清通过上述血清学方法和免疫学方法进行验证。

(1)血清学检测

血清学试验检测结果：接种MB6Δbp26ΔwboA-BL的绵羊血清与MB6Δbp26ΔwboA-BL凝集抗原作用时能在2min内出现凝集反应，呈阳性，接种S2的绵羊血清和PBS对照组的绵羊血清检测均呈阴性，而以布鲁氏菌虎红凝集抗原检测时，接种MB6Δbp26ΔwboA-BL的绵羊血清RBPT检测结果呈阴性，而接种S2的绵羊血清能在2min内出现凝集反应，PBS对照组的绵羊血清检测呈阴性。

(2)ELISA检测

ELISA检测结果如图10所示：纵坐标代表的是OD₄₅₀值，横坐标代表血清不同稀释度，从图中可以看出，无论以bp26蛋白为包被抗原(图10A)还是以wboA蛋白为包被抗原(图10B)，S2接种的绵羊血清的OD₄₅₀值均明显高于MB6Δbp26ΔwboA-BL免疫的绵羊血清的OD₄₅₀值，而MB6Δbp26ΔwboA-BL免疫血清与PBS对照组没有明显差异，从而证实了布鲁氏菌重组菌MB6Δbp26ΔwboA-BL具有分子标记功能。

实施例6、布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株作为布鲁氏菌疫苗在奶牛上的应用

1、动物免疫

取健康奶牛(18月龄)9头，打耳号，随机分为3组：实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组3头，按皮下注射途径进行免疫，实验组免疫实施例2制备的布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株(1×10¹⁰CFU/每头)，阳性对照组免疫A19疫苗(1×10¹⁰CFU/每头)，阴性对照免疫0.01M、PH7.2的PBS液。

2、动物免疫后的临床表现

免疫后，逐日记录奶牛的疫苗接种反应，主要包括精神状态，采食情况、体温变化、行为情况及接种前、后一个月的奶牛泌乳量变化。

动物接种后的临床反应结果：奶牛接种布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株后1个月内均没有发生疫苗接种不良反应，接种前，奶牛一个月的泌乳量约为13.68kg，接种后奶牛的一月泌乳量为13.68kg；A19疫苗接种奶牛后，在前1～3天出现发热，食欲不振，精神萎靡、行动迟缓、注射部位红肿等症状，随后症状逐渐恢复，约在第8天恢复正常，接种前，奶牛一个月的泌乳量约为13.68kg，接种后奶牛的一月泌乳量为12.47kg，明显下降。

3、奶牛免疫后抗体水平检测

于免疫后30d采集各组奶牛血液，分离血清，按实施例3的试管凝集抗原检测方法测定各组奶牛血清的抗体水平。

血清学检测结果表明：通过布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原检测时，布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫奶牛的抗体效价均达到1:100以上，而A19菌株免疫奶牛和PBS接种奶牛血清检测结果均为阴性；通过商品化布鲁氏菌试管凝集抗原检测时，布鲁氏菌A19疫苗免疫奶牛血清的抗体效价均达1:100以上，而布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫奶牛和PBS接种奶牛检测结果均为阴性。

实施例7、布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株作为布鲁氏菌疫苗在猪上的应用

1、动物免疫

取健康小型巴马猪15头，打耳号，随机分为3组：实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组5头，按皮下注射途径进行免疫，实验组免疫实施例2制备的布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株(2×10¹⁰CFU/每头)，阳性对照组免疫S2疫苗(2×10¹⁰CFU/每头)，阴性对照免疫0.01M、PH7.2的PBS液。

2、动物免疫后的临床表现

免疫后，逐日记录小型猪的疫苗接种反应，主要包括精神状态，采食情况、体温变化、行为情况。

动物接种后的临床反应结果：小型猪接种布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株后1个月内均没有发生疫苗接种不良反应，精神状态良好，饮食正常，行为活跃，粪便正常，与布鲁氏菌S2活疫苗没有明显差异，与阴性对照组也没有明显差异。

3、小型巴马猪免疫后抗体水平检测

于免疫后30d采集各组巴马猪血液，分离血清，按实施例3的试管凝集抗原检测方法测定各组巴马猪血清的抗体水平。

血清学检测结果表明：通过布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株试管凝集试验抗原检测时，布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫巴马猪的抗体效价均达到1:50以上，而A19菌株免疫巴马猪和PBS接种巴马猪血清检测结果均为阴性；通过商品化布鲁氏菌试管凝集抗原检测时，布鲁氏菌S2疫苗免疫巴马猪血清的抗体效价均达1:50以上，而布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL菌株免疫小型猪和PBS接种小型猪检测结果均为阴性。

Claims (10)

1.一种重组菌，是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且缺失所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段；

所述布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列4的第58-582位核苷酸分子；

所述BLS蛋白的编码基因为序列表中序列2的第504-977位核苷酸分子；

所述L7/L12蛋白的编码基因为序列表中序列2的第978-1352位核苷酸分子；

所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列5的第1-897位核苷酸分子。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述替换和所述缺失均通过同源重组的方式实现的；

所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因是将含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白编码基因、L7/L12蛋白编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源重组；

所述缺失布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段是将含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源重组；

所述bp26蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1-503位；

所述bp26蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1353-2117位；

所述wboA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第1-618位；

所述wboA蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第619-1209位。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白的编码基因、L7/L12蛋白的编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段为序列表中序列2；所述含有wboA蛋白编码基因上游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段为序列表中序列3。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于：所述布鲁氏菌为羊种布鲁氏菌；所述羊种布鲁氏菌具体为羊种布鲁氏菌菌株MB6；所述羊种布鲁氏菌菌株MB6的保藏编号为CGMCCNo.10964。

6.羊种布鲁氏菌菌株MB6，其保藏编号为CGMCCNo.10964。

7.一种布鲁氏菌疫苗，其活性成分为权利要求1-5中任一所述的重组菌。

8.权利要求1-5中任一所述的重组菌或权利要求6所述的羊种布鲁氏菌菌株MB6在制备如下1)-6)中的应用：

1)布鲁氏菌疫苗；

2)降低动物组织载菌量的产品；

3)诱发细胞免疫的产品；

4)诱发体液免疫的产品；

5)预防和/或治疗布鲁氏菌病的产品；

6)鉴别或辅助鉴别待测样本为权利要求7所述的布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本的产品。

9.权利要求7所述布鲁氏菌疫苗在制备具有如下1)-5)中至少一种功能的产品中的应用：

1)降低动物组织载菌量；

2)诱发细胞免疫；

3)诱发体液免疫；

4)预防和/或治疗牛布鲁氏菌病和/或羊布鲁氏菌病和/或猪布鲁氏菌病；

5)鉴别或辅助鉴别待测样本为权利要求7所述的布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本。

10.一种鉴别待测样本为权利要求7所述的布鲁氏菌疫苗免疫样本还是野生型布鲁氏菌感染样本的方法，包括如下步骤：将待测样本与布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原混匀，

若所述待测样本与所述布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原发生凝集反应，则待测样本为或候选为权利要求8所述的布鲁氏菌疫苗免疫样本；

若所述待测样本与所述布鲁氏菌MB6Δbp26ΔwboA-BL虎红平板凝集抗原不发生凝集反应，则待测样本为或候选为野生型布鲁氏菌感染样本。