CN111867622A - 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 - Google Patents

经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 Download PDF

Info

Publication number
CN111867622A
CN111867622A CN201880087729.3A CN201880087729A CN111867622A CN 111867622 A CN111867622 A CN 111867622A CN 201880087729 A CN201880087729 A CN 201880087729A CN 111867622 A CN111867622 A CN 111867622A
Authority
CN
China
Prior art keywords
wzm
brucella
strain
rev1
brucellosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880087729.3A
Other languages
English (en)
Inventor
玛利亚·何苏斯·格里罗·多尔塞特
布特赫兹·圣朗漫阿贝拉斯度里
莱尔·帕拉西奥斯·查韦斯
萨拉·米娜·布埃诺
安娜·扎巴扎·巴兰瓜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Publica de Navarra
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Publica de Navarra
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC, Universidad Publica de Navarra filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Publication of CN111867622A publication Critical patent/CN111867622A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/098—Brucella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本申请提供了经修饰的布鲁氏菌菌株、其作为药物的用途、及其作为用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的药物的用途。已通过使wzm基因失活对布鲁氏菌菌株进行了修饰。此外，本申请提供了包含经修饰的布鲁氏菌菌株的药物组合物、该药物组合物作为药物的用途、以及该药物组合物作为用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的药物的用途。本申请还提供了包含经修饰的布鲁氏菌菌株和药学上可接受的载体或稀释剂的试剂盒，以及其在治疗和/或预防布鲁氏菌病中的用途。

Description

经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株
技术领域
本发明可以包括在用于治疗和/或预防布鲁氏菌病(brucellosis)的新疗法领域中。具体而言，本申请涉及布鲁氏菌属(genus Brucella)的新疫苗株。该菌株可以用作药物，特别是用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的药物。
背景技术
布鲁氏菌病是一种人畜共患病。在动物中，布鲁氏菌感染导致流产、不育、产量降低以及动物和动物产品的交易受限。另外，细菌从受感染的动物传播给人类，从而造成使人衰弱且常常致残的疾病，针对该疾病没有疫苗，并且其治疗需要长期服用高剂量的抗生素且经常复发。
因此，布鲁氏菌病是重要的公共健康问题。已经表明，人布鲁氏菌病的流行与动物布鲁氏菌病的流行直接相关。因此，并且在没有用于人类的疫苗的情况下，该疾病的预防需要控制在动物中的感染。在大多数社会经济背景下，控制布鲁氏菌病的唯一可行方法是通过基于家畜疫苗接种的计划，通过大规模疫苗接种计划或通过对感染动物进行疫苗接种、诊断和屠宰的计划。
针对动物布鲁氏菌病的参考疫苗是用于牛的光滑(S)菌株流产布鲁氏菌S19(Brucella abortus S19)和用于绵羊和山羊的光滑(S)菌株马尔他布鲁氏菌Rev1(Brucella melitensis Rev1)(世界动物卫生组织陆生动物手册(OIE TerrestrialManual)，2016年，第2.4.3和2.7.2章)。这两种菌株均为减毒活疫苗，无佐剂，生产和采购成本低，并且对反刍动物(人主要感染源)中的野外株(field strain)的感染非常有效。然而，技术上的缺点是这两种菌株在疫苗接种后产生的免疫应答不能与野外株强毒感染后所诱导的免疫应答区分开，从而产生感染动物和接种疫苗动物的区分问题(DIVA)。为了解决这个问题，已经付出了大量的科学努力。一种策略是开发布鲁氏菌的粗糙(R)菌株，这是由于缺少脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)中的O-多糖(O-Polysaccharide，O-PS)(已知的布鲁氏菌毒力因子和用于测试以进行感染的血清学诊断的主要抗原)导致了可用作活疫苗使用的减毒株，该减毒株不会显著干扰血清学诊断检测。在这种情况下，在90年代，通过继代培养开发了具有R表型的自发突变体，该突变体被称为流产布鲁氏菌RB51(B.abortusRB51)(Schurig et al.,1991.Veterinary Microbiology,28:171-188)。菌株RB51已在一些国家用于抗牛布鲁氏菌病，其结果是有争议的。由于没有O-PS抗原，RB51、和一批衍生自马尔他布鲁氏菌(B.melitensis)的R突变体在不同的LPS合成途径中均具有良好的遗传学特征，减少了强毒感染的血清学诊断中的干扰问题。然而，已经显示出R疫苗并不理想，因为R疫苗对强毒感染的保护作用远低于参考疫苗流产布鲁氏菌S19和马尔他布鲁氏菌Rev1(González et al.,2008.PLoS One,3(7):e2760；Barrio et al.,2009.Vaccine,27:1741-1749)。
另一方面，已经提出使用异种蛋白绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)来进行细菌标记以解决DIVA问题(Chacón-Díaz et al.,2011.Vaccine.29(3):577-82)。
此外，当前的疫苗还存在其他问题，例如引起流产以及存在于先前接种过疫苗的成年动物的乳汁中(OIE陆生动物手册，2016年，第2.4.3和2.7.2章)，从而引起人类感染，并且在马尔他布鲁氏菌Rev1的情况下，对链霉素(首选抗生素)具有抗性。因此，目前需要一种不具有上述所有缺点的有效的布鲁氏菌疫苗和/或治疗剂。
本发明的目的是提供一种用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的优势布鲁氏菌菌株。
附图说明
图1：该图示出了通过框内双重重组的缺失方法的策略，该策略用于获得布鲁氏菌Δwzm(BrucellaΔwzm)和同胞(未突变)菌株；
图2：布鲁氏菌Δwzm突变体和补充有质粒pSRK-wzm或pBBR-wzm的菌株的遗传评估。使用F9和R5(表1)通过PCR来评估完整的wzm基因的存在(319bp)或不存在(无扩增)。MW：分子量标记；1：Rev1同胞；2：Rev1Δwzm；3：Rev1Δwzm-pSRK-wzm；Pc1：互补质粒pSRK-wzm；Pm：突变质粒pJQKm-Δwzm；C-：PCR阴性对照；4：16M同胞；5：16MΔwzm；6：16MΔwzm-pBBR-wzm；Pc2：pBBR-wzm；7：2308同胞；8：2308Δwzm；9：2308Δwzm-pBBR-wzm；10：S19同胞；11：S19Δwzm；12：S19Δwzm-pBBR-wzm；
图3：与同胞菌株(下排)相比，布鲁氏菌Δwzm突变体(上排)通过草酸结晶紫染色(crystal violet-oxalate staining)显示出粗糙表型；
图4：BrucellaΔwzm突变体的R-LPS具有完整的核心，并且合成在细菌内部积累的游离O-PS。用质粒pSRK-wzm或pBBR-wzm对这些马尔他布鲁氏菌Δwzm和流产布鲁氏菌Δwzm菌株进行互补，恢复了S-LPS表型。(A)Rev1Δwzm、16MΔwzm、2308Δwzm和S19Δwzm的LPS银染的代表性图像；(B)识别Rev1Δwzm中的O-PS表位M、16MΔwzm中的O-PS表位C或2308Δwzm和S19Δwzm中的O-PS表位A的血清的蛋白质印迹(Western Blot)；1：Rev1同胞；2：Rev1Δwzm；3：Rev1Δwzm-pSRK-wzm；4：16M同胞；5：16MΔwzm；6：2308同胞；7：2308Δwzm；8：2308Δwzm-pBBR-wzm；9：S19同胞；10：S19Δwzm；11：S19Δwzm-pBBR-wzm；(C)使用一级MoAb抗C O-PS表位和标记有德克萨斯红(Texas Red)的二级抗体对16MΔwzm::gfp-pBBR-wzm、16MΔwzm::gfp、和16M同胞进行免疫荧光和落射荧光显微镜检查；
图5：Rev1Δwzm比Rev1更易受链霉素影响。在无菌PBS中将指数增长的细菌调节至≈2×103CFU/mL，并以一式三份将100μL铺板在BAB和补充有2.5×g/mL链霉素的BAB(BAB-Str2.5)中。将Rev1同胞菌株(Rev1)用作对照。在37℃下孵育5天后，计算出CFU/mL的数目。数据点表示平均值±标准偏差(n＝3)。结果代表了三个独立的实验。平均值的统计比较通过ANOVA和PLSD检验进行；
图6：16MΔwzm比16M更易受干燥影响，但Rev1Δwzm相对于Rev1不那么易受干燥影响。使含有≈109CFU/mL的16MΔwzm、16M、Rev1Δwzm或Rev1的悬浮液在12孔聚苯乙烯平板中干燥，然后避光保持在室温下。在将干燥的沉淀物在PBS中再水化后，对活细胞的数目进行定量，并在六天后确定存活细菌的百分比。数据点表示平均值±标准偏差(n＝3)。平均值的统计比较通过ANOVA和PLSD检验进行；
图7：作为对先天免疫系统的阳离子肽的易感性的模型，Rev16Δwzm比16MΔwzm、以及Rev1和16M亲本菌株和同胞菌株更易受多粘菌素B(Polymyxin B)影响。将2×103CFU/mL至3×103CFU/mL培养物的PBS溶液与在PSA中制备的不同浓度的多粘菌素B一起孵育(1h，37℃)，然后通过在BAB中铺板并孵育该平板(5天，37℃)来对活细胞的数目进行定量。数据点表示每个多粘菌素B浓度下的CFU/mL的平均值±标准偏差(n＝3)。平均值的统计比较通过ANOVA和PLSD检验进行：*p＜0.0001；
图8：Rev1Δwzm和16MΔwzm比Rev1和16M亲本菌株更易受常规绵羊血清和牛血清影响，这主要是由于血清补体的作用。使≈104CFU/mL的细菌培养物的PBS溶液与来自绵羊(A)或奶牛(B)的正常血清或去补体(热灭活，56℃，1h)血清混合。孵育(18h，37℃)后，将每种悬浮液在BAB上铺板，并且孵育平板(5天，37℃)，以确定CFU/mL的数目和细菌存活百分比。使用具有最小核心(C+)的马尔他布鲁氏菌突变体作为对正常血清易感性的对照。结果表示为存活百分比的平均值±标准偏差(n＝3)。平均值的统计比较通过ANOVA和PLSD检验进行；
图9：与其他布鲁氏菌Δwzm突变体相比，Rev1Δwzm在BALB/c小鼠中减毒更多，并引起瞬时脾肿大峰，该峰通常与有效的免疫原能力有关。小图表示腹膜内接种：(A-B)Rev1Δwzm和Rev1Δwzm::gfp与Rev1亲本菌株；(C-D)16MΔwzm和16MΔwzm::gfp与16M亲本菌株；(E-F)2308Δwzm与2308亲本菌株；(G-H)S19Δwzm与S19菌株的BALB/c小鼠中的脾脏的细菌载量和脾脏重量。Δwzm突变体的注射剂量为108CFU/小鼠，S-LPS菌株的注射剂量为106CFU/小鼠。结果表示为每个选定时间点的对数CFU/脾脏或重量克/脾脏的平均值±标准偏差(n＝5)。用相应的布鲁氏菌::Tn7-gfp(Brucella::Tn7-gfp)标记的菌株获得了相似的结果，表明gfp标记不会影响布鲁氏菌的生物学特性；
图10：与Rev1或16M亲本菌株或同胞菌株(左侧)相比，Rev1Δwzm和16MΔwzm(右侧)不引起胎盘肉眼可见的病变。箭头指出了与Rev1Δwzm或16MΔwzm中的健康胎盘相比，个体胎盘的肉眼可见的病变；
图11：用Rev1Δwzm::gfp或16MΔwzm::gfp进行疫苗接种的绵羊中对布鲁氏菌LPS的血清学应答。用1×1010CFU至2×1010CFU的Rev1Δwzm::gfp(n＝14)或16MΔwzm::gfp(n＝8)对3-4个月龄的羔羊进行皮下疫苗接种。使用未接种疫苗(n＝13)的羔羊组或用1×109CFU至2×109CFU Rev1::gfp(n＝12)进行疫苗接种的羔羊组作为对照。在接种疫苗后的第一个月期间，通过临床检查(直肠体温和接种部位触诊)和睾丸触诊来评估无害性。通过：(A)标准玫瑰红测试(sRBT)；(B)补体固定测试(CFT)；(C)针对R-LPS抗原的凝胶扩散测试(GDT-R/LPS)；以及(D)抗GFP ELISA测试(仅针对用16MΔwzm::gfp进行疫苗接种的羔羊)定期采集血清样品以进行血清学分析。
图12：杀菌实验。来自用Rev1Δwzm进行疫苗接种的羔羊的热处理的(在图中称为血清处理)和未处理的免疫血清在37℃、10％CO2下孵育18h，进行马尔他布鲁氏菌H38和流产布鲁氏菌2308强毒感染。结果表示为接种物中细菌计数相对于初始计数的标准化百分比。来自用Rev1Δwzm处理的羔羊的免疫血清能够杀死马尔他布鲁氏菌H38、流产布鲁氏菌2308或绵羊布鲁氏菌(B.ovis)PA。
发明内容
本申请提供了经修饰的布鲁氏菌菌株、其作为药物的用途、及其作为用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的药物的用途。布鲁氏菌菌株已通过使wzm基因失活而进行了修饰。此外，本申请提供了包含经修饰的布鲁氏菌菌株的药物组合物、该药物组合物作为药物的用途、以及该药物组合物作为用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的药物的用途。本申请还提供了包含经修饰的布鲁氏菌菌株和药学上可接受的载体或稀释剂的试剂盒，以及其在治疗和/或预防布鲁氏菌病中的用途。
具体实施方式
定义
如本申请中所使用的，术语“治疗”和“疗法”是指以修复健康问题为目标意在用于治疗和/或减轻疾病和/或症状的一组卫生的、药理的、外科的和/或物理的手段。术语“治疗”和“疗法”包括预防性方法和治愈性方法，因为两种方法均针对个体或动物的健康的维持和/或重建。不论症状、疾病和失能的起源如何，在本申请的上下文中，应把施用合适的药物以减轻和/或治疗健康问题解释为治疗或疗法的一种形式。
如本申请中所使用的，术语“预防”是指一组用于预防疾病和/或症状的发作和/或发展的卫生的、药理的、外科的和/或物理的手段。术语“预防”涵盖预防方法，因为这些方法用于维持动物或个体的健康。
术语“治疗有效量”是指具有治疗作用并且能够治疗和/或预防布鲁氏菌病的物质的量。
术语“布鲁氏菌病”是指由来自布鲁氏菌属的细菌引起的感染性疾病。布鲁氏菌病可出现在个体或动物中。
术语“个体”、“患者”或“受试者”在本申请中可互换使用，并且无意以任何方式进行限制。“个体”、“患者”或“受试者”可以具有任何年龄、性别和身体状况。如本申请中所使用的术语“动物”是指不是人的任何多细胞真核异养生物。
如本申请中使用的术语“疫苗”是指旨在通过增强机体的自然免疫反应来治疗现有疾病和/或感染的“治疗性疫苗”，以及旨在预防疾病和/或感染在健康个体或动物中发展的“预防性疫苗”。
术语“经修饰的”是指已从其原始形式更改的任何事物。在本申请中，术语“经修饰的”是指依赖于人为干预的任何改变。
如本文所用，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的稀释剂”意指与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且在不限制本发明范围的情况下，包括：额外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；成盐抗衡离子，例如钠、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；以及亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮。在一个优选的实施方式中，药学上可接受的载体或稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(Phosphate Buffered Saline，PBS)。优选地，PBS的pH为6.85。
术语“药学上可接受的佐剂”是指增强身体对抗原的免疫反应的任何和所有物质。药学上可接受的佐剂的非限制性实例是：明矾(Alum)、弗氏不完全佐剂MF59、dsRNA的合成类似物(例如聚(I：C))、细菌LPS、细菌鞭毛蛋白、咪唑喹啉、含有特定CpG基序的寡脱氧核苷酸、细菌细胞壁的片段(例如胞壁酰二肽和
Figure BDA0002601623360000041
)。
经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株
在第一个方面，本申请提供了经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株，其中wzm基因已被灭活。
马尔他布鲁氏菌Rev1是自发减毒的并且从强毒株马尔他布鲁氏菌6056通过与链霉素(Streptomycin，Str)依赖性相关的连续自发突变以及随后对该依赖性进行逆转而获得的菌株(Herzberg and Elberg 1953.Journal of Bacteriology 66:585-599；Herzbergand Elberg 1953.Journal of Bacteriology 66:600-605)。Rev1菌株自50年代以来已在全球范围内用作预防小反刍动物的布鲁氏菌病的唯一有效疫苗，并且是国际公认的控制绵羊和山羊布鲁氏菌病的标准疫苗(OIE陆生动物手册，2016年，第2.4.3和2.7.2章)。Rev1的原种批次可在位于法国迈松阿尔福94706(94706Maisons-Alfort,France，AFSSA)的OIE的布鲁氏菌病参考实验室或欧洲药典(法国，斯特拉斯堡Cedex 1，67029，BP 907)获得。此外，Rev1菌株是可商购的，可以从不同的供应商处购买。例如，该菌株可购自西班牙CZVVeterinaria的“CZV Rev1”。
wzm基因编码了双组分ABC转运体系统的一部分，该系统需要将O-PS输出到周质，然后在周质中O-PS被组装到核心部分上以生成S-LPS。wzm基因可具有以下序列(SEQ IDNO:1)：
ATGATATCGTATATGGCTAATGTCTGGAAGGTACGCCACTTCTGGTGGCACCTTTCAATGTCTGATTTACGTGGGCGCTTCAGGCGGTCCTCCTTGGGAATATTATGGGCAGTTATACAGCCACTAGCGCTCACGCTGCTACTGTCTTTCGTGTTTTCTAAATTGTTGAATCAAAGTATATCTGCATATGCCCCCTATATTCTATCTGGGATTATTATCTGGGAATACATATCATTTACAGTGGTTGGTGGCTCAACAGCGCTTGTGCAAGCCGATGCATATATAAAGCAAACCAGAAATCCTCTTGCAATTTACACGCTTAGGAACACTGTTTCTGGCTTGGTCGTATTATCCGTAGCAAGTATCTCCCTATTCGGGTGGGTACTTATCATGTTTCCTGAAAACTTCTCGCTTTCATGGTTAGCAATACCAACTTTGCTACCCATCCTTGCTTTGATAGTTTGGCCGCTTGCCACAATCGTCGGCTACATCGGCGCAAGATTTCGAGATCTGCCGAATGCTCTGGCGCTCGTGTTACAGGCAGCTTGGTTTGTTTCGCCGGTCTATTTTAAAGAATCGATGTTCAGGCAGGGTGGATTGAATGCATTCGTTGATTATAACCCTATTTACCACGTGATGCAGATTCTAAGAGCCCCTGTCCTTTATGGGGAATGGCCTACGGCTACCAATTACATTTGGTGCTTAGGTGTGAGCCTCCTCCTAACCTGCGTGGCAGTAGCTGTGGGGATGCGTGCGGAGAAGAGAGCCATTTTTTACCTATGA
可以通过本领域已知的任何形式的基因修饰使wzm基因失活。失活可包括使基因从宿主基因组中部分或完全缺失。失活可包括单个的无义突变，这使得表达的蛋白质失去功能。失活可包括参与wzm基因转录的启动子、核糖体结合位点或其他转录调节子的突变和/或缺失。失活可包括导致框移和/或使所得初生蛋白失去功能的序列的插入。上述任何缺失、插入或突变可以使用等位基因交换(Hmelo et al.,2015.Nature Protocols,10(11):1820-41)或使用CRISPR/Cas9系统(Wang et al.,2016.ACS Synthetic Biology,5(7):721-32)来进行。在一个优选的实施方式中，wzt基因没有被灭活。
在一个优选的实施方式中，wzm基因的失活是由于基因的部分缺失。优选地，部分缺失包括使SEQ ID NO:1的至少50％、60％或70％缺失。更优选地，部分缺失包括使SEQ IDNO:1的至少80％缺失。在一个优选的实施方式中，wzm基因的灭活不能通过将转座子插入该基因的编码序列中来实现。
在本发明的实施例中，使用等位基因交换质粒pJQKmΔwzm使马尔他布鲁氏菌Rev1和16M中的SEQ ID NO:1的核苷酸80-721缺失，产生相应的Δwzm突变体(图1)。因此，在优选的实施方式中，通过使SEQ ID NO:1的核苷酸80-721缺失来实现wzm基因的失活。
在一个优选的实施方式中，对经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株进行了进一步修饰以使以下基因失活：znuA；norD；bip；tcpB；cgs；ricA；bvrR；bvrS；编码virB IV型分泌系统的基因中的一种或多种基因，该编码virB IV型分泌系统的基因中的一种或多种基因选自由马尔他布鲁氏菌16M ORFBMEIIII0025、BMEII0026、BMEII0027、BMEII0028、BMEIIII0029、BMEII0030、BMEII0031、BMEIIII0032、BMEII0033、BMEII0034、和BMEII0035组成的组；和/或参与LPS的形成、修饰和/或组装、和/或代谢途径的基因中的一种或多种基因，包括但不限于：ppdK、wbdR、gmd、manA、manB、manC、per、pgm、wbkA、wbkB、wbkC、wbkD、wbkF、wadC、和wzt(染色体区域wbk、wbo和wad)。
在一个优选的实施方式中，对经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株进行了进一步修饰，使得自体N-甲酰基转移酶活性得到抑制，并且功能性表达编码除N-甲酰基转移酶之外的N-酰基转移酶的异源基因。例如，可以使wbkC失活，并且可以在菌株中引入异源wbdR并使异源wbdR在菌株中表达(参见WO2017/108515A1)。
在一个优选的实施方式中，对经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株进行了进一步修饰以表达荧光蛋白，优选为GFP。经修饰的菌株中的荧光蛋白的表达可用于进一步区分Rev1接种个体或动物与感染个体或动物(Chacón-Díaz et al.,2011.Vaccine.29(3):577-82；EP 2 508 201A1)。简而言之，该方法可以描述如下：当用进一步修饰的菌株对个体或动物进行疫苗接种时，将产生针对经修饰的菌株以及荧光蛋白的抗体。可在血清学测试中使用针对荧光蛋白产生的抗体来测试该个体或动物是否已被自然产生的布鲁氏菌菌株或被本发明的进一步修饰的菌株感染。因此，包含经进一步修饰以表达荧光蛋白的经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株的试剂盒可以进一步包括与荧光蛋白结合的抗体、和/或荧光蛋白。优选地，荧光蛋白是GFP。
在一个优选的实施方式中，菌株已被冻干。冻干可用于增加菌株的稳定性和保质期。
在第二个方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含根据任何先前公开的实施方式的经修饰的菌株以及药学上可接受的载体或稀释剂和/或药学上可接受的佐剂。
在一个优选的实施方式中，药物组合物包括已进行了进一步修饰以表达荧光蛋白的经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株。
本文所述的药物组合物还可含有其他物质。这些物质包括但不限于冷冻保护剂、冻干支持剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂和稳定剂。在一些实施方式中，药物组合物可以是冻干的。
本文所用的术语“冷冻保护剂”包括这样的试剂：通过优先从菌株的表面排除而为菌株提供抵抗冰冻诱导的应激的稳定性。冷冻保护剂还可在一次干燥和二次干燥以及长期产品存储期间提供保护。冷冻保护剂的非限制性实例包括：糖，例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖和乳糖；聚合物，例如右旋糖酐、羟乙基淀粉和聚乙二醇；表面活性剂，例如聚山梨酸酯(例如，PS-20或PS-80)；以及氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。通常使用在生物系统中展示出的毒性低的冷冻保护剂。
在一个实施方式中，将冻干保护剂添加至本文所述的药物组合物中。本文所用的术语“冻干保护剂”包括通过以下方式在冻干或脱水过程(初级和次级冻干循环)过程中为菌株提供稳定性的试剂：通过提供无定形玻璃态基质和通过经由氢结合代替在干燥过程中去除的水分子而与菌株表面结合。这有助于使冻干循环过程中的产品降解减到最少，并改善产品长期稳定性。冻干保护剂的非限制性实例包括：糖，例如蔗糖或海藻糖；氨基酸，例如谷氨酸一钠、非晶态甘氨酸或组氨酸；甲胺，如甜菜碱；感胶离子序列盐(lyotropic salt)，例如硫酸镁；多元醇，例如三元或更高级的糖醇，例如甘油(glycerin)、赤藓糖醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克；及其组合。添加到药物组合物中的冻干保护剂的量通常是在冻干药物组合物时不会导致菌株的降解量不可接受。
在一些实施方式中，填充剂包含在药物组合物中。本文所用的术语“填充剂”包括提供冷冻干燥产品的结构而不直接与药物产品相互作用的试剂。除了提供药学上讲究的块体外，填充剂还可在改善塌陷温度、提供冻融保护、以及增强长期存储的应变稳定性方面赋予有用的品质。填充剂的非限制性实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。填充剂可以是结晶的(例如甘氨酸、甘露醇、或氯化钠)或无定形的(例如右旋糖酐、羟乙基淀粉)，并且通常以0.5％至10％的量用于制剂中。
其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如在1980年Osol,A.主编的第16版雷明顿药物科学(Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))中描述的那些也可以包括在本文所述的药物组合物中，条件是它们不对药物组合物的所需特性产生不利影响。如本文所用，“药学上可接受的载体”意指与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的并且包括：额外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；成盐抗衡离子，例如钠、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；以及亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮。
在一个优选的实施方式中，药物组合物进一步包括佐剂。优选地，佐剂选自由以下组成的列表：氢氧化明矾、弗氏不完全佐剂
Figure BDA0002601623360000071
dsRNA的合成类似物(例如聚(I：C))、细菌LPS、细菌鞭毛蛋白、咪唑喹啉、含有特定CpG基序的寡脱氧核苷酸、细菌细胞壁的片段(例如胞壁酰二肽和
Figure BDA0002601623360000072
)。
可以制备药物组合物用于口服施用、舌下施用、颊施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、腹膜内施用、结膜施用、直肠施用、透皮施用、局部施用和/或吸入介导施用。在一个优选的实施方式中，药物组合物可以是适合于静脉内施用、肌内施用、结膜施用、透皮施用、腹膜内施用和/或皮下施用的溶液。在另一个实施方式中，药物组合物可以是适合于舌下施用途径、颊施用途径和/或吸入介导施用途径的溶液。在一个替代性实施方式中，药物组合物可以是适合于吸入介导施用的气雾剂。在一个优选的实施方式中，可以将药物组合物制备用于皮下和/或腹膜内施用。
药物组合物可以进一步包含现有技术中已知的普通赋形剂和载体。对于固体药物组合物，可以使用常规的无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素，葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于注射溶液，药物组合物可进一步包括冷冻保护剂、冻干支持剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂和药学上可接受的载体。对于气雾剂施用，药物组合物通常以细分形式与表面活性剂和推进剂一起提供。表面活性剂当然必须是无毒的，并且通常溶于推进剂中。这种试剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric酸和油酸)与脂肪族多元醇或其环酐的酯或偏酯。可以采用混合酯，例如混合甘油酯或天然甘油酯。如果需要，还可以包括载体，正如例如用于鼻内递送的卵磷脂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酸酯。
在一个优选的实施方式中，药物组合物是能够诱导免疫应答的疫苗。用于疫苗的药物组合物的设计已经明确，并且在例如，宾夕法尼亚州伊斯顿麦克出版公司的最新版“雷明顿药物科学”(Remington's Pharmaceutical Sciences,latest edition,MackPublishing Co.,Easton,PA)以及Plotkin和Orenstein的宾夕法尼亚州费城桑德斯名称为“疫苗”的第四版的书(Vaccines,4th Ed.,Saunders,Philadelphia,PA(2004))中进行了描述。
经修饰的Rev1菌株的医学用途
在第三个方面，本发明的菌株或药物组合物可以用作药物。在第四个方面，本发明的经修饰的菌株或药物组合物可以用于治疗和/或预防布鲁氏菌病。
在一个优选的实施方式中，引起布鲁氏菌病的感染剂选自由流产布鲁氏菌(B.abortus)、马尔他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌(B.suis)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、犬布鲁氏菌(B.canis)、沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、田鼠布鲁氏菌(B.microti)、鲸型布鲁氏菌(B.ceti)和鳍型布鲁氏菌(B.pinnipedialis)组成的组。优选地，引起布鲁氏菌病的感染剂选自由流产布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌和绵羊布鲁氏菌组成的组。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物用于治疗和/或预防人、牛、山羊、绵羊、猪和/或狗的布鲁氏菌病。优选地，菌株或药物组合物用于治疗和/或预防山羊和/或绵羊的布鲁氏菌病。
在一个优选的实施方式中，使个体或动物接种至少104CFU(菌落形成单位(colonyforming unit))的菌株。优选地，使个体或动物接种至少105、106、107、108、109、1010、1011或1012CFU的菌株。更优选地，使个体或动物接种至少109CFU的菌株。在一个替代性实施方式中，使个体或动物接种104-1012CFU的菌株。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物通过粘膜进行和/或结膜进行皮下、皮内、静脉内、腹膜内施用。优选地，通过皮下施用菌株或药物组合物。在一个替代性实施方式中，药物组合物通过结膜施用进行施用。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物用于预防布鲁氏菌病。在该实施方式中，菌株或药物作为预防性疫苗施用。优选地，将菌株或药物组合物施用于有被布鲁氏菌属的细菌感染的风险的个体或动物。
在一个实施方式中，经修饰的菌株或药物组合物用于治疗布鲁氏菌病。在一个优选的实施方式中，布鲁氏菌病的治疗还涉及药物的施用。还设想了与经修饰的菌株或药物组合物同时或不同时施用药物的实施方式。该药物可以选自由皮质类固醇、青霉素、头孢菌素、大环内酯、氯霉素、四环素、氨基糖苷、甲氧苄啶、利福平、喹诺酮和磺胺甲恶唑组成的组。
包含经修饰的Rev1菌株的试剂盒
在第五个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株，其中wzm基因已被灭活；和(ii)药学上可接受的载体或稀释剂。
经修饰的菌株可以与本申请中概述的任何前述实施方式一致。此外，药学上可接受的载体或稀释剂可以是本申请中描述的任何上述药学上可接受的载体或稀释剂。在一个优选的实施方式中，试剂盒包括关于如何对菌株与药学上可接受的载体或稀释剂进行组合的说明书。
在一个优选的实施方式中，经修饰的菌株是冻干物。该冻干物可以容纳在与药物可接受的载体或稀释剂分离的容器中。此外，试剂盒可包括关于如何对冻干菌株与药学上可接受的载体或稀释剂进行组合的说明书。
在一个优选的实施方式中，试剂盒可进一步包含佐剂。优选地，佐剂选自由以下组成的列表：明矾、弗氏不完全佐剂MF59、dsRNA的合成类似物(例如聚(I：C))、细菌LPS、细菌鞭毛蛋白、咪唑喹啉、含有特定CpG基序的寡脱氧核苷酸、细菌细胞壁的片段(例如胞壁酰二肽和
Figure BDA0002601623360000091
)。
在一个优选的实施方式中，包括在试剂盒中的说明书也可以概述向个体或动物的菌株施用。施用的概述可以包括要使用的剂量、要使用的施用频率和/或要使用的施用途径。
在第六个方面，本发明提供了任何所述试剂盒在治疗和/或预防布鲁氏菌病中的用途。试剂盒的用途可以与本申请中概述的任何医学用途和施用方法一致。
经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株
在第七个方面，本申请提供了经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株，其中wzm基因已被灭活。
“马尔他布鲁氏菌16M(B.melitensis 16M)”被明确表征并且可从美国典型培养物保藏库(American Type Culture Collection，ATCC 23456)免费获得。
可以通过本领域已知的任何形式的基因修饰使wzm基因失活。失活可包括使基因从宿主基因组中部分或完全缺失。失活可包括单一的无义突变，这使得表达的蛋白质无功能。失活可包括参与wzm基因转录的启动子、核糖体结合位点或其他转录调节子的突变和/或缺失。失活可包括导致框移和/或使所得初生蛋白无功能的序列的插入。任何上述缺失、插入或突变可以使用等位基因交换(Hmelo et al.,2015.Nature Protocols,10(11):1820-41)或使用CRISPR/Cas9系统(Wang et al.,2016.ACS Synthetic Biology,5(7):721-32)来进行。在一个优选的实施方式中，wzt基因没有被灭活。
在一个优选的实施方式中，wzm基因的失活是由于基因的部分缺失。优选地，部分缺失包括使SEQ ID NO:1的至少50％、60％或70％缺失。更优选地，部分缺失包括使SEQ IDNO:1的至少80％缺失。在一个优选的实施方式中，wzm基因的灭活不能通过将转座子插入基因的编码序列中来实现。
在一个优选的实施方式中，通过使SEQ ID NO:1的核苷酸80-721缺失来实现wzm基因的失活。
在一个优选的实施方式中，对经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株进行了进一步修饰以使以下基因失活：znuA；norD；bip；tcpB；cgs；ricA；bvrR；bvrS；编码virB IV型分泌系统的基因中的一种或多种基因，该编码virB IV型分泌系统的基因中的一种或多种基因选自由马尔他布鲁氏菌16M ORFBMEIIII0025、BMEII0026、BMEII0027、BMEII0028、BMEIIII0029、BMEII0030、BMEII0031、BMEIIII0032、BMEII0033、BMEII0034、和BMEII0035组成的组；和/或参与LPS的形成、修饰和/或组装、和/或代谢途径的基因中的一种或多种基因，包括但不限于：ppdK、wbdR、gmd、manA、manB、manC、per、pgm、wbkA、wbkB、wbkC、wbkD、wbkF、wadC、和wzt(染色体区域wbk、wbo和wad)。
在一个优选的实施方式中，对经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株进行了进一步修饰，使得自体N-甲酰基转移酶活性得到抑制，并且功能性表达了编码除N-甲酰基转移酶之外的N-酰基转移酶的异源基因。例如，可以使wbkC失活，并且可以在菌株中引入异源wbdR并使异源wbdR在菌株中表达(参见WO2017/108515 A1)。
在一个优选的实施方式中，对经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株进行了进一步修饰以表达荧光蛋白，优选为GFP。经修饰的菌株中的荧光蛋白的表达可用于进一步区分16M接种个体或动物与感染个体或动物(CChacón-Díaz et al.,2011.Vaccine.29(3):577-82；EP 2 508 201A1)。因此，包含经进一步修饰以表达荧光蛋白的经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株的试剂盒可以进一步包括与荧光蛋白结合的抗体、和/或荧光蛋白。优选地，荧光蛋白是GFP。
在一个优选的实施方式中，菌株已被冻干。冻干可用于增加菌株的稳定性和保质期。
在第八个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据任何先前公开的实施方式的经修饰的菌株以及药学上可接受的载体或稀释剂和/或药学上可接受的佐剂。
在一个优选的实施方式中，药物组合物包括已进行了进一步修饰以表达荧光蛋白的经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株。
本文所述的药物组合物还可含有其他物质。这些物质包括但不限于冷冻保护剂、冻干支持剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂和稳定剂。在一些实施方式中，药物组合物可以是冻干的。
在一个实施方式中，将冻干保护剂添加至本文所述的药物组合物中。在一些实施方式中，填充剂包含在药物组合物中。其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如在1980年Osol,A.主编的第16版雷明顿药物科学(Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))中描述的那些也可以包括在本文所述的药物组合物中，条件是它们不对药物组合物的所需特性产生不利影响。
在一个优选的实施方式中，药物组合物进一步包括佐剂。优选地，佐剂选自由以下组成的列表：明矾、弗氏不完全佐剂
Figure BDA0002601623360000101
dsRNA的合成类似物(例如聚(I：C))、细菌LPS、细菌鞭毛蛋白、咪唑喹啉、含有特定CpG基序的寡脱氧核苷酸、细菌细胞壁的片段(例如胞壁酰二肽和
Figure BDA0002601623360000102
)。
可以制备药物组合物用于口服施用、舌下施用、颊施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、腹膜内施用、结膜施用、直肠施用、透皮施用、局部施用和/或吸入介导施用。在一个优选的实施方式中，药物组合物可以是适合于静脉内施用、肌内施用、结膜施用、透皮施用、腹膜内施用和/或皮下施用的溶液。在另一个实施方式中，药物组合物可以是适合于舌下施用途径、颊施用途径和/或吸入介导施用途径的溶液。在一个替代性实施方式中，药物组合物可以是适合于吸入介导施用的气雾剂。在一个优选的实施方式中，可以将药物组合物制备用于皮下和/或腹膜内施用。
药物组合物可以进一步包含现有技术中已知的普通赋形剂和载体。对于固体药物组合物，可以使用常规的无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素，葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于注射溶液，药物组合物可进一步包括冷冻保护剂、冻干支持剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂和药学上可接受的载体。对于气雾剂施用，药物组合物通常以细分形式与表面活性剂和推进剂一起提供。表面活性剂当然必须是无毒的，并且通常溶于推进剂中。这种试剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric酸和油酸)与脂肪族多元醇或其环酐的酯或偏酯。可以采用混合酯，例如混合甘油酯或天然甘油酯。如果需要，还可以包括载体，正如例如用于鼻内递送的卵磷脂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酸酯。
在一个优选的实施方式中，药物组合物是能够诱导免疫应答的疫苗。用于疫苗的药物组合物的设计已经明确，并且在例如，宾夕法尼亚州伊斯顿麦克出版公司的最新版“雷明顿药物科学”(Remington's Pharmaceutical Sciences,latest edition,MackPublishing Co.,Easton,PA)以及Plotkin和Orenstein的宾夕法尼亚州费城桑德斯名称为“疫苗”的第四版的书(Vaccines,4th Ed.,Saunders,Philadelphia,PA(2004))中进行了描述。
经修饰的16M菌株的医疗用途
在第九个方面，本发明的菌株或药物组合物可以用作药物。在第十个方面，本发明的经修饰的菌株或药物组合物可以用于治疗和/或预防布鲁氏菌病。
在一个优选的实施方式中，引起布鲁氏菌病的感染剂选自由流产布鲁氏菌(B.abortus)、马尔他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌(B.suis)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、犬布鲁氏菌(B.canis)、沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、田鼠布鲁氏菌(B.microti)、鲸型布鲁氏菌(B.ceti)和鳍型布鲁氏菌(B.pinnipedialis)组成的组。优选地，引起布鲁氏菌病的感染剂选自由流产布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌和绵羊布鲁氏菌组成的组。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物用于治疗和/或预防人、牛、山羊、绵羊、猪和/或狗的布鲁氏菌病。优选地，菌株或药物组合物用于治疗和/或预防山羊和/或绵羊的布鲁氏菌病。
在一个优选的实施方式中，使个体或动物接种至少104CFU(菌落形成单位(colonyforming unit))的菌株。优选地，使个体或动物接种至少105、106、107、108、109、1010、或1011CFU的菌株。更优选地，使个体或动物接种至少109CFU的菌株。在一个替代性实施方式中，使个体或动物接种104-1012CFU的菌株。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物通过粘膜进行和/或结膜进行皮下、皮内、静脉内、腹膜内施用。优选地，通过皮下施用菌株或药物组合物。在一个替代性实施方式中，药物组合物通过结膜施用进行施用。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物用于预防布鲁氏菌病。在该实施方式中，菌株或药物作为预防性疫苗施用。优选地，将菌株或药物组合物施用于有被布鲁氏菌属的细菌感染的风险的个体或动物。
在一个优选的实施方式中，菌株或药物组合物用于治疗布鲁氏菌病。在该实施方式中，菌株或药物作为治疗性疫苗进行施用。优选地，将菌株或药物组合物施用于患有布鲁氏菌属的细菌感染的个体或动物。
包含修饰的16M菌株的试剂盒
在第十一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)经修饰的马尔他布鲁氏菌16M菌株，其中wzm基因已被灭活；和(ii)药学上可接受的载体或稀释剂。
经修饰的菌株可以与本申请中概述的任何前述实施方式一致。此外，药学上可接受的载体或稀释剂可以是本申请中描述的任何上述药学上可接受的载体或稀释剂。在一个优选的实施方式中，试剂盒包括关于如何对菌株与药学上可接受的载体或稀释剂进行组合的说明书。
在一个优选的实施方式中，经修饰的菌株是冻干物。该冻干物可以容纳在与药物可接受的载体或稀释剂分离的容器中。此外，试剂盒可包括关于如何对冻干菌株与药学上可接受的载体或稀释剂进行组合的说明书。
在一个优选的实施方式中，试剂盒可进一步包含佐剂。优选地，佐剂选自由以下组成的列表：明矾、弗氏不完全佐剂MF59、dsRNA的合成类似物(例如聚(I：C))、细菌LPS、细菌鞭毛蛋白、咪唑喹啉、含有特定CpG基序的寡脱氧核苷酸、细菌细胞壁的片段(例如胞壁酰二肽和
Figure BDA0002601623360000121
)。
在一个优选的实施方式中，包括在试剂盒中的说明书也可以概述向个体或动物的菌株施用。施用的概述可以包括要使用的剂量、要使用的施用频率和/或要使用的施用途径。
在第十二个方面，本发明提供了任何所述试剂盒在治疗和/或预防布鲁氏菌病中的用途。试剂盒的用途可以与本申请中概述的任何医学用途和施用方法一致。
PCR-Multiplex诊断试剂盒
在第十三个方面，本发明提供了一种用于对部分或完全缺失wzm的布鲁氏菌菌株进行鉴定的试剂盒。在一个优选的实施方式中，该试剂盒包含正向和反向引物，该正向和反向引物退火到布鲁氏菌属物种的基因组中的wzm侧翼区域。优选地，试剂盒包含SEQ ID NO:2作为正向引物以及、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4作为反向引物。引物组可以扩增Rev1或16M野生型菌株中约1,573bp(F1和R4；AMP NO:1)或约724bp(F1和R5；AMP NO:2)的扩增子；或在Δwzm突变体中扩增931bp的条带(F1和R4；AMP NO:3)(表1)。由于BMEI1415与其他布鲁氏菌物种中相应直系同源物的同一性至少为99.6％，因此该试剂盒可用于区分野生型布鲁氏菌菌株和布鲁氏菌Δwzm突变体。
实施例
实施例1：培养大肠杆菌(E.coli)和布鲁氏菌菌株
将所有菌株保存在-20℃的冷冻管中，在补充有3％无菌乳糖(ApplichemPanreac)或20％-40％甘油(v/v)的脱脂牛奶中收集细菌培养物。
为制备具有已知浓度的布鲁氏菌的悬浮液，通过使细菌在血琼脂基2号(Oxoid)平板(普通平板(BAB)，或用于绵羊布鲁氏菌(B.ovis)的补充有5％胎牛血清(Gibco)(的平板BAB-S))上生长来制备冷冻管中的预培养物。孵育(37℃下，3-5天，对于绵羊布鲁氏菌在补充有10％CO2的气氛中)该预培养物后，将来自BAB或BAB-S平板的2-3个菌落转移至新鲜的BAB或BAB-S平板，并如前所述孵育2天。将生长的菌落收集在pH 6.85的无菌PBS中以获得浓缩的细菌悬浮液，将该浓缩的细菌悬浮液在相同的稀释剂中稀释直至获得这样的悬浮液：在通过分光光度法调节的600nm光密度下吸光度为大约0.170单位。在我们的条件下，该悬浮液含有大约109CFU/mL。细菌的确切数目总是通过在PBS中进行系列稀释、铺板(100μL，一式三份)以及将平板在37℃下孵育3-5天来追溯确定。计算CFU/mL的数目。
对于布鲁氏菌的液体培养，将BAB或BAB-S平板中的4-5个菌落接种到胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，Pronadisa)中，并在37℃和150rpm下孵育过夜。
在Luria Bertani(LB，Pronadisa)肉汤中或LB琼脂平板上培养大肠杆菌。将大肠杆菌培养物在37℃下孵育。
在琼脂平板和培养物中包括适当浓度的抗生素以进行选择。所有抗生素均购自Sigma。
实施例2：wzm基因的测序
使用PureLinkTM微生物组DNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)来提取Rev1的基因组。使用引物F1 gcaaattgaaatggcagatg和R4 atgaaacgtggcgttagtcc(表1)扩增wzm基因，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化PCR产物，并通过桑格法(Sangermethod)进行测序。
所得序列是AMP NO:1(表1)，该AMP NO:1包括本申请中所述的SEQ ID NO:1。Rev1中的该序列与马尔他布鲁氏菌16M强毒株中wzm基因的序列(基因库：CP007763.1)相同，并且与流产布鲁氏菌2308(基因库：NC_007618)和疫苗S19(基因库：CP000887.1)的序列99.6％相同。
根据测序，相同的等位基因交换质粒可用于使马尔他布鲁氏菌(16M和Rev1菌株)和流产布鲁氏菌(2308和S19菌株)物种中的wzm部分缺失。
表1.在该工作中使用的扩增子编号(AMP NO)和通过测序或通过用指定引物对与野生型wzm或Δwzm基因的DNA进行PCR获得的相应的DNA片段大小。
Figure BDA0002601623360000131
*F：正向；R：反向。
实施例3：克隆等位基因交换质粒
使用等位基因交换质粒pJQKm-Δwzm通过双重重组事件构建所有布鲁氏菌Δwzm菌株(图1)。根据京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopaedia of Genes andGenomes，KEGG)和国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)中的可获得的马尔他布鲁氏菌16M菌株序列信息，使用Primer3设计构建wzm截短形式(Δwzm)所需的引物。
使用PureLinkTM微生物组DNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)来提取和纯化布鲁氏菌菌株的基因组。可替代地，通过将细菌重新悬浮在超纯水中并煮沸悬浮液(100℃，20分钟)然后离心(4,000rpm，10分钟)来提取DNA。通过收集上清液回收DNA。
为了克隆wzm部分缺失的等位基因交换质粒，通过引物F1 gcaaattgaaatggcagatg和R2 agcgcccacgtaaatcag(AMP NO:3，表1)使用PCR扩增了484bp的片段(AMP NO:4，表1)。使用PCR和引物F3 ctgatttacgtgggcgcttaacctgcgtggcagtagc和R4atgaaacgtggcgttagtcc(表1)扩增465bp的片段(AMP NO:5，表1)。通过使用重叠延伸PCR将两种PCR产物合并在一起，并使用F1 gcaaattgaaatggcagatg和R4atgaaacgtggcgttagtcc扩增全长产物，以产生Δwzm盒(图1)。Δwzm片段缺失了wzm野生型基因的82％(从wzm野生型的总计783bp中缺失了Δ80-721)。使用制造商说明书(
Figure BDA0002601623360000142
TA
Figure BDA0002601623360000141
Thermo FisherScientific)将Δwzm盒克隆到pCR2.1质粒中。
先前已经描述了pJQKm自杀载体(Scupham and Triplett,1997.Gene,202,53-59)。使用BamHI和XbaI消化pCR2.1Δwzm和pJQKm，对Δwzm插入物和pJQKm载体进行凝胶提取和纯化。使用T4 DNA连接酶连接Δwzm插入物和pJQKm载体，得到等位基因交换质粒pJQKmΔwzm。
为了使gfp插入到马尔他布鲁氏菌菌株的基因组中，通过改变先前描述的方法，使用mini-Tn7系统(Choi et al,2005.Nature Methods,2(6):443-8)。组成型gfp表达受包含在片段rrnB P1-gfp中的rrnB P1启动子控制。从质粒pUC18T-mini-Tn7-gfp-Gmr(基因库：DQ493877.2)中提取rrnB P1-gfp构建体。因此，用引物rrnBP1-Fgttgcgcggtcagaaaattatttta和Gfp_F-R2 ttatttgtatagttcatccatgcca(AMP NO:7)扩增rrnB P1-gfp片段，并使用制造商说明书(
Figure BDA0002601623360000144
TA
Figure BDA0002601623360000143
Thermo Fisher Scientific)将该rrnB P1-gfp片段克隆到pCR2.1质粒中，然后使用EcoRI亚克隆到对50μg/mL卡那霉素(Kmr)耐药的pUC18R6KT-mini-Tn7-Kmr中(Llobet et al,2009.Antimicrobial Agents andChemotherapy,53(1):298–302)。这产生了质粒pUC18R6KT-mini-Tn7-gfp(表1)。
实施例4：大肠杆菌与布鲁氏菌菌株的接合及突变体的PCR评估
通过接合将pUC18R6KT-mini-Tn7-gfp或pJQKmΔwzm转化到大肠杆菌S17(λpir)中并将质粒转染到接收布鲁氏菌菌株中。在使用pJQKmΔwzm等位基因交换质粒使wzm部分缺失的情况下，用0.5mL的大肠杆菌S17(λpir)-pJQKmΔwzm过夜培养液来培养1mL马尔他布鲁氏菌过夜培养液。
对于布鲁氏菌Δwzm菌株，通过使细菌在补充有50μg/mL卡那霉素(Kmr)的BAB中生长以及对5％蔗糖(Sacs)的易感性，来选择第一次重组(染色体中自杀载体的整合)后的转移接合子的选择。通过蔗糖抗性和卡那霉素敏感性来选择第二次重组(突变质粒的切除，并通过等位基因交换导致突变菌株的构建)(图1)。最后，通过两次PCR筛选得到的菌落，即一次PCR用引物F1 gcaaattgaaatggcagatg和R4 atgaaacgtggcgttagtcc，在Δwzm突变体中扩增931bp的片段和在亲本菌株中扩增1,573bp的片段(表1)，并且另一个PCR用F9atgatatcgtatatggctaatg和R5 gcgtgtaaattgcaagagga在野生型菌株和同胞菌株中扩增319bp的PCR产物(图2)。对于PCR，通过将细菌重悬于超纯水中并在100℃下将悬浮液煮沸20分钟，然后以4,000rpm离心所得液体10分钟并收集上清液来提取基因组DNA。
在所有情况下，在大多数实验中每个突变体和一个同胞菌株(即与对应的突变体进行相同的继代培养；图1)均使用三个克隆作为对照，来评估基因操纵期间不存在不受控制的变化。
鉴定出wzm基因部分缺失(82％)的Rev1菌株，并称为Rev1Δwzm。该菌株也根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏在保藏机构。
通过与供体大肠杆菌S17pBBR-wzm或大肠杆菌S17pSRK-wzm接合来补充布鲁氏菌Δwzm突变体。在补充有20μg/mL氯霉素(BAB-Cm20)或50μg/mL卡那霉素(BAB-Km50)的BAB平板上选择补充后的菌株，从而允许分别选择带有非整合质粒pBBR-wzm或pSRKwzm的接合体。通过PCR以F9 atgatatcgtatatggctaatg和R5 gcgtgtaaattgcaagagga引物(表1)仅在携带野生型wzm基因(亲本菌株和同胞菌株)或pBBR-wzm或pSRK-wzm互补质粒的菌株(图2)中扩增319bp的DNA片段(AMP NO:6)来检查转移接合子(图2)。
实施例5：布鲁氏菌Δwzm突变体的表型表征
如表2所示，通过用于布鲁氏菌分型的经典标记物按照以下标准章程(Alton etal.,1988.Techniques for the Brucellosis.Laboratory Paris:INRA)进行对选定的Δwzm突变体克隆的分析：草酸结晶紫排斥测试；过氧化氢酶测试；氧化酶测试；脲酶测试和吖啶黄测试(均来自Sigma Aldrich)；对Tb、Wb、Iz和R/C噬菌体的敏感性；与抗A和抗M单特异性血清的凝集；CO2依赖性和血清依赖性；对染料(例如，硫堇蓝10g/mL、20g/mL和40μg/mL、品红10g/mL和20μg/mL、和番红100μg/mL；Sigma)的易感性和对抗生素青霉素5mg/mL(P5)和链霉素2.5μg/mL(Str2.5)的易感性。
此外，考虑到用草酸结晶紫技术进行的染色为阳性，Rev1Δwzm、16MΔwzm、2308Δwzm和S19Δwzm菌株显示出R-LPS表型(图3)。
此外，还通过SDS-PAGE研究了所有Δwzm突变体和互补菌株的LPS结构，并对LPS进行了银染修饰。如图4A所示，Rev1Δwzm、16MΔwzm、2308Δwzm和S19Δwzm突变体均显示出具有与亲本菌株和/或同胞菌株相同的完整核心的R-LPS。然而，当使用抗M、抗C或抗A O-PS表位通过蛋白质印迹法进行抗原性分析时，所有Δwzm突变体均显示出O-PS含量较低或与S-LPS的O-PS中存在的表位抗原性不同的表位(Cloeckaert et al.,J GenMicrobiol.1992Jun；138(6):1211-9)(图4B)。此外，通过使用一级MoAb(单克隆抗体)抗CO-PS表位和用德克萨斯红标记的第二抗体，通过落射荧光显微镜检查对16MΔwzm::gfp-pBBR-wzm互补性进行了评估。使用16MΔwzm::gfp菌株和16M同胞菌株作为对照(图4C)。
除了PCR评估(参见实施例4，图2)，表型表征还显示出互补菌株恢复了S-LPS表型(图3、图4B和图4C)。
表2.RevlΔwzm、16MΔwzm、2308Δwzm和S19Δwzm的表型表征
Figure BDA0002601623360000151
ND：未确定
实施例6：在小鼠体内和体外继代培养后Rev1Δwzm和16MΔwzm中wzm的缺失是稳定的。
使布鲁氏菌Δwzm突变体在BAB平板中继代培养20个连续传代：通过在37℃下孵育平板后，每3-4天将菌落转移到新鲜平板上。除了分析这些培养物外，还将生长的细菌在4℃下保存2个月，以评估该生长的细菌在储存后的稳定性。此外，选择在实施例12和实施例13中描述的实验中从小鼠脾脏分离的CFU的代表性数目用于稳定性评估。
通过PCR使用引物F1 gcaaattgaaatggcagatg和R4 atgaaacgtggcgttagtcc从而允许在wt和Δwzm细菌中扩增DNA(表1)、以及通过表型分析(即在37℃孵育后的菌落大小和草酸结晶紫染色)来分析选择的每种培养物是否存在缺失。最后，为了分析在37℃下孵育5天后的菌落大小和通过对大约3,000CFU进行结晶紫染色的菌落相，通过分光光度法来将接种物，调节为≈2×103CFU/mL，并以一式三份(3×100μL)铺在五块板中。
分析的所有菌落均显示出预期的基因型和表型，这表明基因修饰是稳定的。
实施例7：16MΔwzm而非Rev1Δwzm的生长受在孵化气氛中存在10％的CO2的抑制。通过在补充有牛胎儿血清的琼脂中生长修复该缺陷。
在正常气氛中孵育的或补充有10％CO2的BAB平板中研究了Δwzm突变体的细菌生长。为此，将100μL含≈5×102CFU/mL的细菌悬浮液以一式三份铺板，并在孵育(3-5天，37℃)后确定CFU/100μL的数量。此外，通过将在BAB和BAB-S中制备的所有细菌稀释液接种，对16MΔwzm进行了分析以确定抑制频率(即，CO2孵育后分离的CFU/mL数目相对于在正常气氛中孵育后分离的CFU/mL数目)。每次计数重复三次。结果表示为单次计数的平均值±标准偏差(n＝9)。平均值的统计比较通过单向方差分析(one-way ANOVA)和PLSD检验来进行。
如表3所示，在CO2孵育条件下，16MΔwzm而非Rev1Δwzm在BAB中无法生长。
表3.在正常气氛下孵育的或补充有10％CO2的BAB平板上的生长。含有≈5×102CFU/mL的细菌悬浮液的CFU/100μL数目。以一式三份在BAB中进行100μL铺板的三次实验的平均值和标准偏差。
Figure BDA0002601623360000161
aPLSD检验：相对于正常气氛以及相对于16M同胞菌株和Rev1同胞菌株，p＜0.0001
在CO2气氛中孵育BAB平板后，16MΔwzm的抑制频率为1×10-2CFU/mL至0.39×10- 2CFU/mL。当在BAB-S平板中培养16MΔwzm时，没有出现该表型(表4)。
表4.在正常气氛或补充有10％CO2的气氛中孵育的BAB平板和BAB-S平板中的16MΔwzm和16MΔwzm::gfp的抑制频率。
Figure BDA0002601623360000162
Figure BDA0002601623360000171
实施例8：Rev1Δwzm比Rev1更易受链霉素影响
与其他布鲁氏菌物种(例如，马尔他布鲁氏菌16M、以及流产布鲁氏菌2308和流产布鲁氏菌S19)相比，当Rev1在正常气氛下孵育时展示出2.5μg/mL的对链霉素(Str2.5)的相对抗性(在10％CO2中，所有马尔他布鲁氏菌菌株均显示出相似的抗性)。体外对Str2.5的该相对抗性与基于链霉素的治疗(对人选择的抗生素)对人和动物模型Rev1感染无效直接有关(Grillóet al.2006.J Antimic Chemother.58(3):622–626)。
为了评估Rev1Δwzm中的这一特性，在PBS中制备了含≈2×103CFU/mL的细菌悬浮液，并通过以一式三份将100μL铺板于BAB和补充有Str2.5的BAB(BAB-Str2.5)来进行培养。使用Rev1同胞菌株作为对照。将平板在37℃正常气氛下孵育5天，并确定CFU/mL的平均值±标准偏差(n＝3)。重复实验三遍。平均值的统计比较通过ANOVA和PLSD检验进行；
结果，Rev1Δwzm比Rev1同胞更易受Str2.5影响(p＜0.001)(图5)。
实施例9：16MΔwzm比16M更易受干燥影响，并且Rev1Δwzm与Rev1一样易受影响。
通过在12孔聚苯乙烯平板中等分200μL/孔的≈109CFU/mL的TSB悬浮液测试Rev1Δwzm、16MΔwzm、Rev1和16M的抗干燥性。使悬浮液在室温下避光干燥6天。然后，将沉淀物在PBS中重新水化，连续稀释，并铺在BAB平板上，以确定存活细菌的数量和百分比。
从图6中可以看到，16MΔwzm中wzm基因的部分缺失进一步降低(p＜0.001)了16M同胞菌株在干燥环境中存活的能力。然而，Rev1Δwzm与Rev1同胞一样易受影响。这些发现提供了16MΔwzm相比16M强毒株在环境中的存留可能性较小的证据。
实施例10：Rev16Δwzm比16MΔwzm更易受到先天免疫系统的杀菌阳离子肽的影响。两种Δwzm突变体都比亲本菌株或同胞菌株更易受到影响。
使用多粘菌素B作为对先天免疫系统的阳离子肽的细菌药敏模型。为此，将成指数增长的Rev1Δwzm或16MΔwzm调整为在PBS中为2×103CFU/mL至3×103CFU/mL，并在24孔微量滴定板中以一式两份与3mg/mL至0.188mg/mL不同浓度的多粘菌素B的磷酸盐水缓冲液(PSA；0.133M NaCl，0.1M；NaH2PO4，pH4.6)混合。将悬浮液(100μL，一式三份)铺在BAB中，并在37℃下孵育1小时后记录活CFU的数目。亲本菌株和同胞菌株均用作对照。数据点表示CFU/mL的平均值±标准偏差(n＝3)。
图7示出了Rev1Δwzm菌株比16MΔwzm更易受到多粘菌素B的有害影响。此外，两个Δwzm突变体都比Rev1和16M的亲本菌株和同胞菌株更易受影响。实际上，在相同的实验条件下，在最低测试浓度(0.188mg/mL)下孵育后，Rev1Δwzm未能生长，而16MΔwzm在直到0.750mg/mL的多粘菌素B浓度下没有被完全抑制(图7)。相比之下，Rev1亲本菌株和同胞菌株在3mg/mL时被抑制，而即使在如此高的浓度下，强毒16M也能抵抗。这些结果与在小鼠中观察到的Rev1Δwzm和16MΔwzm在体内的持久性不同一致(图9)。
实施例11：Rev1Δwzm和16MΔwzm比Rev1和16M的亲本菌株更易受常规绵羊血清和牛血清影响。
将指数相中的细菌调整为在PBS中浓度为≈104CFU/mL，并通过与正常或去补体(1小时，56℃)绵羊血清或牛血清(90μL/孔)混合而分配在微量滴定板中(45μL/孔)。孵育(18h，37℃)后，将65μL的TSB分配到每个孔中，将混合的细菌悬浮液以50μL/孔铺板到BAB上，孵育平板(5天，37℃)，以确定CFU/mL的数目和细菌存活率。使用具有最小核心的马尔他布鲁氏菌突变体作为对正常血清高易感性的阳性对照(C+)。结果表示为存活百分比的平均值±标准偏差(n＝3)。平均值的统计比较通过ANOVA和PLSD检验进行。
从图8中可以看出，Rev1Δwzm和16MΔwzm菌株比Rev1或16M的亲本菌株更易受到绵羊和奶牛正常血清的杀菌作用的影响。
实施例12：在BALB/c小鼠中，Rev1Δwzm比16MΔwzm减毒更多
将7周龄的雌性BALB/c小鼠(查尔斯河实验室，西班牙巴塞罗那)圈养在农业生物技术研究所(Instituto de Agrobiotecnología)(注册号ES/31-2016-000002-CR-SU-US)的动物楼内，自由摄取食物和水。实验开始前，将动物随机分配并适应1-2周。动物处理和实验程序符合欧洲(DOCE 86/609/EEC)国家(RD 1201/2005)和区域(Ley 11/2003)指令，并受到该机构的道德委员会的监督。
对小鼠进行≈108CFU/小鼠的Rev1Δwzm、Rev1Δwzm::gfp、16MΔwzm或16MΔwzm::gfp(R-LPS菌株)和106CFU/小鼠的Rev1同胞菌株或16M同胞菌株(S-LPS菌株)的腹腔内接种。另另外的小鼠组接种了≈108CFU/小鼠的S19Δwzm或2308Δwzm流产布鲁氏菌突变体，并使用106CFU/小鼠的S19同胞菌株或2308同胞菌株来以比较该突变在不同布鲁氏菌背景中的作用。如先前报道的那样(Grilló et al.,2012.Veterinary Research,43(1):29)，在选定的时间间隔，对5只小鼠的组进行尸检，以确定存在于脾脏中的活细菌的数量以及脾脏重量。在BAB平板上鉴定出活菌。脾脏分离物的大致身份通过草酸结晶紫染色方法以及通过PCR来证实。结果表示为个体log CFU/脾脏或克/脾脏的平均值±标准偏差(n＝5)。平均值的统计比较通过单向方差分析随后进行Fisher保护最小显著差数(Protected LeastSignificant Differences，PLSD)测试来进行。
从图9A和图9C中可以看出，与相应的Rev1同胞菌株或16M同胞菌株相比，wzm基因的部分缺失导致小鼠脾脏中存在的马尔他布鲁氏菌数量减少。然而，对于Rev1Δwzm或16MΔwzm，由于分别在第4周或第12周之前完全清除了脾脏感染，因此Rev1Δwzm比16MΔwzm减毒的多得多。与马尔他布鲁氏菌相比，流产布鲁氏菌2308Δwzm和S19Δwzm突变体都相似地在脾脏中持续存在，即分别稍微超过8周或少于9周(图9E和图9G)。这些发现表明，两种流产布鲁氏菌突变体均比16MΔwzm突变体减毒得多，但比Rev1Δwzm减毒得少。
出乎意料的是，Rev1Δwzm的更高减毒伴随着瞬时脾肿大的诱导，该诱导在感染后第2周达到峰值(图9B)。该发现通常与有效免疫应答的触发有关(Conde-
Figure BDA0002601623360000181
etal.2012.PLoS Pathog.8(5):e1002675)。在16MΔwzm(图9D)未观察到这种脾脏反应，在流产布鲁氏菌2308Δwzm和S19Δwzm突变体(图9F和9H)中也未观察到这种脾脏反应。
Rev1Δwzm::gfp和16MΔwzm::gfp菌株分别显示出与Rev1Δwzm和16MΔwzm相似的毒力和脾肿大(图9A-图9D)，表明在基因组中插入mini-Tn7-gfp确实不会影响Rev1Δwzm和16MΔwzm的生物学特性。
实施例13：Rev1Δwzm不感染妊娠小鼠的胎盘或胎儿
使妊娠4.5天的CD1雌性小鼠(n＝7)腹膜内感染≈7×106CFU/小鼠的Rev1Δwzm或16MΔwzm或感染≈7×105CFU/小鼠的Rev1或16M。足月妊娠时处死所有小鼠以评估尸检时的内眼可见的病变以及脾脏、胎盘和胎儿样品的细菌学。通过在BAB上铺板来确定每个组织中的活细菌数(log CFU/器官)。此外，还记录了妊娠雌性、感染胎盘和携带感染胎儿的母畜的数量。
从表5中可以看出，所有小鼠均显示出明确的在各组之间相似的脾脏感染水平(≈4log-5log)。然而，与Rev1亲本菌株和16M亲本菌株相比，Rev1Δwzm和16MΔwzm在孕畜中产生的脾肿大分别是中等或较低的(表5)。出人意料的是，在第2周，Rev1(以及延伸更短的16M)在妊娠小鼠中(表5)诱导的脾肿大高于未妊娠小鼠(图9)。然而，Rev1Δwzm和16MΔwzm突变体在妊娠小鼠和未妊娠小鼠中诱发了相似的脾肿大，在第2周时显示出Rev1Δwzm比16MΔwzm的脾脏重量高(0.30克/脾脏vs 0.16克/脾脏，表5)。在用Rev1Δwzm或16MΔwzm进行疫苗接种的大多数小鼠以及用Rev1进行疫苗接种的小鼠中均观察到了足月妊娠，但只有少数感染16M亲本的母畜实现了足月妊娠。此外，虽然Rev1Δwzm和16MΔwzm几乎不能在所施用的剂量下定殖在胎盘和胎儿上，但用少一个对数的Rev1感染就能够以非常高的水平(感染6log-8log)定殖在所有母畜中的这些组织中(表5)。
这些水平的感染在Rev1和16M感染的胎盘中伴随有肉眼可见的病变，但在用Rev1Δwzm或16MΔwzm突变体接种的母畜中则没有(图10)。所有这些结果表明，在妊娠小鼠中Rev1Δwzm或16MΔwzm突变体比强毒株和疫苗参考菌株都更安全。
表5.在妊娠4.5天时用RevlΔwzm、16MΔwzm、Revl或16M感染CD1小鼠，15天后屠宰，其脾脏、胎盘和胎儿感染及足月妊娠。
Figure BDA0002601623360000191
IP：腹膜内；a：p＜0.001vs.16M(强毒)或Rev1(疫苗)感染的小鼠；检测极限★＝1.52logs(即无法分离CFU)
实施例14：Rev1Δwzm和16MΔwzm赋予针对小鼠中的抗S和R强毒感染的坚实保护，等效于或优于Rev1所赋予的。
通过用≈108CFU/小鼠的相应突变体进行腹膜内或皮下接种疫苗，评估了8-10周龄的雌性BALB/c小鼠(n＝5)中布鲁氏菌Δwzm突变体的疫苗效力。分别使用皮下接种疫苗2×105CFU/小鼠Rev1或S19的小鼠(n＝5)作为抗马尔他布鲁氏菌H38和绵羊布鲁氏菌PA或流产布鲁氏菌感染的参考接种疫苗对照。在相应的实验中，将接种了0.1mL无菌PBS的三组小鼠(n＝5)用作未经接种疫苗的对照。接种疫苗后四周，使用≈1×104CFU/小鼠的马尔他布鲁氏菌H38::Gmr、2×105CFU/小鼠的绵羊布鲁氏菌BoPA::Gmr或5×104CFU/小鼠的流产布鲁氏菌2308::Gmr、对15μg/mL庆大霉素(Gm15)具有抗性的攻击菌株对所有小鼠进行腹膜内攻击。最后，在攻击后第2周(H38::Gmr和2308::Gmr)和第3周(BoPA::Gmr)，通过将每个脾脏铺在BAB-S-Gm15上来确定脾脏中的毒性细菌的数目。
从表6A中可以看出，通过腹膜内进行疫苗接种和通过皮下进行疫苗接种，Rev1Δwzm和16MΔwzm::gfp突变体均显示出与Rev1参考疫苗株所显示的相似的抗马尔他布鲁氏菌强毒感染的保护程度。此外，两种马尔他布鲁氏菌Δwzm突变体均赋予了比Rev1菌株赋予的抗绵羊布鲁氏菌感染更优越的保护(p＜0.001)。相比之下，令人惊讶的是，流产布鲁氏菌2308Δwzm和S19Δwzm菌株中的Δwzm突变均没有对小鼠赋予抗流产布鲁氏菌强毒感染的足够保护(表6B)。
Figure BDA0002601623360000201
表6B.用2308Δwzm或S19Δwzm进行疫苗接种对流产布鲁氏菌2308::GmR(S-LPS强毒株)强毒感染的效力
Figure BDA0002601623360000202
Figure BDA0002601623360000211
IP：腹膜内；SC：皮下；*＜5CFU/脾脏；**保护单位＝未接种疫苗对照中的log CFU/脾脏-测试组中的log CFU/脾脏；a：p＜0.001；b：通过PLSD检验，相对于PBS对照，p＜0.05
实施例15：Rev1Δwzm::gfp或16MΔwzm::gfp相比Rev1::gfp接种的羔羊的血清学应答
这些实验使用了出生在阿拉贡政府(del Gobierno de Aragón)(萨拉戈萨，西班牙)的农业食品研究与技术中心(Centro de Investigación y TecnologíaAgroalimentaria，CITA)的实验群中的3-4个月龄的拉莎阿拉贡(Rasa Aragonesa)雄性和雌性养殖羔羊。将这些动物圈养在CITA的授权设施(注册号ES/50-2970-12005)中，并根据FELASA(www.felasa.eu)和ARRIVE(Kilkenny et al.,2010.PLoS Biology,8:e1000412)的建议进行处理和操纵。
通过皮下接种含有1×1010CFU至2×1010CFU的Rev1Δwzm::gfp(n＝14)或16MΔwzm::gfp(n＝8)的悬浮液为羔羊接种疫苗。使用未接种疫苗(n＝13)的羔羊的组或用1×109CFU至2×109CFU的Rev1::gfp(n＝12)进行疫苗接种的羔羊的组作为对照。此后，在接种疫苗1个月后，通过临床检查(直肠体温和接种部位触诊)并通过在整个实验过程中定期检查附睾和睾丸来评估无害性。此外，就在接种疫苗之前通过使用
Figure BDA0002601623360000212
(Terumo)真空管通过颈静脉穿刺采集血液样品，之后每周或每两周采集一次。在室温下沥干24小时后，将血液样品以3500rpm离心10分钟，并将所得血清在-20℃保存直至对其进行分析。
使用WHO/OIE建议的标准玫瑰红测试(sRBT)和补体固定测试(CFT)来测量抗LPS应答。另外，对R-LPS抗原进行了凝胶扩散测试(GDT)，以便通过血清转化来评估接种疫苗是有效的。在世界动物卫生组织(OIE，2016年)的“陆生动物诊断测试和疫苗手册(Manual ofdiagnostic tests and vaccines for terrestrial animals)”中可以找到这些血清学测试的详细信息。还对从接种了16MΔwzm::gfp的羔羊血清中获得的样品进行了血清中抗GFP抗体的ELISA。
图11A和11B显示出，与Rev1::gfp相比，在S-LPS布鲁氏菌测试中，用Rev1Δwzm::gfp或16MΔwzm::gfp进行疫苗接种诱导如果有)的血清学干扰最小。实际上，Rev1Δwzm疫苗接种诱导的血清学应答没有在sRBT中产生任何干扰(图11A)，并且只有三只羔羊引发了由CFT可检测到的抗S/LPS抗体。相反，三只用16MΔwzm::gfp进行疫苗接种的动物呈的sRBT阳性(图11A)，并且这三只动物中有一只也呈CFT阳性。无论如何，这四只用Δwzm突变体进行疫苗接种的CFT阳性的羔羊显示出非常低的抗S/LPS滴度，接种疫苗后坚持不到6周(图11B)。100％的GDT-R/LPS呈阳性的动物(图11C)显示出所有羔羊均正确用Rev1Δwzm::gfp或16MΔwzm::gfp突变体进行了疫苗接种，表明了S/LPS反应的缺乏将归因于Δwzm突变体中积累的O-PS的性质。
图11D示出了接种16MΔwzm::gfp的羔羊也产生了与GFP结合的抗体。这些抗体可用于血清学测试，以区分接种疫苗的羔羊和感染的羔羊。此外，这种测试还可以用来区分接种了Rev1Δwzm::gfp的羔羊和感染的羔羊。
实施例16：Rev1Δwzm::gfp疫苗接种对公羊中绵羊布鲁氏菌PA实验性感染的效力。
这些实验使用了出生在阿拉贡政府(萨拉戈萨，西班牙)的农业食品研究与技术中心(CITA)的实验群中的3-4个月龄的拉莎阿拉贡雄性和雌性养殖羔羊。将这些动物圈养在CITA的授权设施(注册号ES/50-2970-12005)中，并根据FELASA(www.felasa.eu)和ARRIVE(Kilkenny et al.,2010.PLoS Biology,8:e1000412)的建议进行处理和操纵。
通过皮下注射1×1010CFU至2×1010CFU的Rev210Δwzm::gfp对羔羊(n＝14)进行疫苗接种。使用一组保持未接种疫苗的组(n＝13)作为对照。此后，在接种疫苗1个月后，通过临床检查(直肠体温和接种部位触诊并通过在整个实验过程中定期检查附睾和睾丸)来评估无害性。出于细菌学目的，在接种疫苗后8个月，通过结膜和包皮途径(30μL/每条途径)用2×109CFU的绵羊布鲁氏菌PA对所有羔羊进行实验性攻击并在2个月后屠宰。采集脾脏、附睾、精囊和颅、肩胛骨前、股、髂和阴囊淋巴结的样品，在无菌PBS中匀浆，并在CITA培养基中以一式两份进行培养(De Miguel et al.2011.Journal of Clinical Microbiology.49(4):1458–1463)。如先前所述(Grillóet al.2009.Vaccine,27:187-191)，确定了感染动物和样品的数量和百分比，并根据对每个样品指定的感染水平的总和除以来自每个组的处理的所有样品计算平均感染指数。感染水平指定如下：1(1-5CFU)；2(6-25CFU)；3(26-125CFU)；4(126-300CFU)；5(＞300CFU)。百分比和平均值的统计比较分别通过卡方(Chi-square)检验和克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验进行。
如表7所示，就发现的被感染动物的数量以及检测到的被绵羊布鲁氏菌PA感染的样品的数量而言，对3-4月龄的羔羊进行Rev1Δwzm::gfp疫苗接种使得在11-12月龄时引起对绵羊布鲁氏菌PA攻击感染的显著保护。此外，在两个疫苗组中观察到的感染水平均低于未接种疫苗的对照组中观察到的感染水平。
表7.在3-4个月大时用Rev1Δwzm::gfp进行疫苗接种的公羊对绵羊布鲁氏菌PA感染的效力。
Figure BDA0002601623360000221
2×1010CFU的Rev1Δwzm::gfp对3-4个月大的公羊羔1进行皮下疫苗接种，接种后8个月进行攻击，并在攻击后2个月进行细菌学分析；2平均感染指数＝对每个样品指定的感染水平的总和除以来自每个组的处理的所有样品；统计比较：ap＝0.002；bp＜0.0001。
实施例17：来自用Rev1Δwzm进行疫苗接种的羔羊的免疫血清对马尔他布鲁氏菌H38和流产布鲁氏菌2308S-LPS强毒株是有效的。
在PBS中将指数生长的马尔他布鲁氏菌H38、流产布鲁氏菌2308和绵羊布鲁氏菌PA调节至104CFU/mL，并将其在微量滴定板(45μL/孔)中以一式三份与90μL/孔的正常或热处理(1h，56℃)的这样的血清混合：提取自在Rev1Δwzm接种的2周后在GDT-R/LPS中显示出抗R/LPS抗体(其中之一在CFT中也呈阳性)的羔羊。将绵羊布鲁氏菌在10％CO2、37℃下孵育18h，然后将65μL的TSB分配到每个孔中，混合细菌悬浮液，并将50μL以一式三份铺在BAB上。结果表示为接种物中细菌计数相对于初始计数的标准化百分比。从图12中可以看出，来自用Rev1Δwzm处理的羔羊的免疫血清能够杀死马尔他布鲁氏菌H38、流产布鲁氏菌2308或绵羊布鲁氏菌PA。
序列表
<110> 高等科学研究委员会(CSIC)
纳瓦拉公立大学
<120> 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株
<130> 903 756
<160> 9
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wzm 基因
<400> 1
atgatatcgt atatggctaa tgtctggaag gtacgccact tctggtggca cctttcaatg 60
tctgatttac gtgggcgctt caggcggtcc tccttgggaa tattatgggc agttatacag 120
ccactagcgc tcacgctgct actgtctttc gtgttttcta aattgttgaa tcaaagtata 180
tctgcatatg ccccctatat tctatctggg attattatct gggaatacat atcatttaca 240
gtggttggtg gctcaacagc gcttgtgcaa gccgatgcat atataaagca aaccagaaat 300
cctcttgcaa tttacacgct taggaacact gtttctggct tggtcgtatt atccgtagca 360
agtatctccc tattcgggtg ggtacttatc atgtttcctg aaaacttctc gctttcatgg 420
ttagcaatac caactttgct acccatcctt gctttgatag tttggccgct tgccacaatc 480
gtcggctaca tcggcgcaag atttcgagat ctgccgaatg ctctggcgct cgtgttacag 540
gcagcttggt ttgtttcgcc ggtctatttt aaagaatcga tgttcaggca gggtggattg 600
aatgcattcg ttgattataa ccctatttac cacgtgatgc agattctaag agcccctgtc 660
ctttatgggg aatggcctac ggctaccaat tacatttggt gcttaggtgt gagcctcctc 720
ctaacctgcg tggcagtagc tgtggggatg cgtgcggaga agagagccat tttttaccta 780
tga 783
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F1
<400> 2
gcaaattgaa atggcagatg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R4
<400> 3
atgaaacgtg gcgttagtcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R5
<400> 4
gcgtgtaaat tgcaagagga 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R2
<400> 5
agcgcccacg taaatcag 18
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F3
<400> 6
ctgatttacg tgggcgctta acctgcgtgg cagtagc 37
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F9
<400> 7
atgatatcgt atatggctaa tg 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rrnBP1-F
<400> 8
gttgcgcggt cagaaaatta tttta 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gfp_F-R2
<400> 9
ttatttgtat agttcatcca tgcca 25

Claims (10)

1.经修饰的用于预防布鲁氏菌病的用途的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株，其中wzm基因已被灭活。
2.根据权利要求1所述的用途的菌株，其特征在于，已使所述wzm基因部分缺失。
3.根据权利要求2所述的用途的菌株，其特征在于，缺失了SEQ ID NO:1的至少50％。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用途的菌株，其特征在于，对所述菌株进行了进一步修饰以表达荧光蛋白。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用途的菌株，其特征在于，所述菌株已被冻干。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的菌株，其特征在于，引起布鲁氏菌病的感染剂选自由流产布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌、田鼠布鲁氏菌、鲸型布鲁氏菌和鳍型布鲁氏菌组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途的菌株，其特征在于，所述菌株用于预防人、牛、山羊、绵羊、猪和/或狗的布鲁氏菌病。
8.用于预防布鲁氏菌病的用途的试剂盒，包括：
(i)经修饰的马尔他布鲁氏菌Rev1菌株，其中wzm基因已被灭活，和
(ii)药学上可接受的载体或稀释剂。
9.根据权利要求8所述的用途的试剂盒，其特征在于，已使所述wzm基因部分缺失。
10.根据权利要求9所述的用途的试剂盒，其特征在于，缺失了SEQ ID NO:1的至少50％。
CN201880087729.3A 2017-11-24 2018-11-26 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 Pending CN111867622A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17382798.1 2017-11-24
EP17382798 2017-11-24
PCT/EP2018/082539 WO2019101993A1 (en) 2017-11-24 2018-11-26 A modified brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111867622A true CN111867622A (zh) 2020-10-30

Family

ID=60661889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880087729.3A Pending CN111867622A (zh) 2017-11-24 2018-11-26 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株

Country Status (10)

Country Link
US (2) US11298416B2 (zh)
EP (1) EP3713598A1 (zh)
CN (1) CN111867622A (zh)
BR (1) BR112020010316A2 (zh)
CL (1) CL2020001358A1 (zh)
CO (1) CO2020007601A2 (zh)
EA (1) EA202091308A1 (zh)
MX (1) MX2020005373A (zh)
PE (1) PE20201285A1 (zh)
WO (1) WO2019101993A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117187146A (zh) * 2023-11-07 2023-12-08 中国兽医药品监察所 一株无耐药性的粗糙型布鲁氏菌病保护菌株及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2555790B1 (es) 2014-06-05 2016-10-13 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Método de obtención de un array de micropartículas planares con multiplexado molecular superficial, array obtenido y su uso
CN110699312B (zh) * 2019-11-28 2022-08-12 西北农林科技大学 一种猪种布鲁氏菌bi-1基因缺失菌株及其构建方法和应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102327606A (zh) * 2011-09-06 2012-01-25 中国兽医药品监察所 一种布鲁氏菌活疫苗及其生产方法
CN102781468A (zh) * 2009-12-03 2012-11-14 西班牙高等科研理事会 用于鉴别接种对抗布鲁氏菌的疫苗的动物的方法
CN103981139A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 中国兽医药品监察所 一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗
CN104004697A (zh) * 2014-06-03 2014-08-27 中国兽医药品监察所 一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌及其疫苗的生产方法
CN104031874A (zh) * 2014-06-03 2014-09-10 中国兽医药品监察所 一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法
CN104845916A (zh) * 2015-05-28 2015-08-19 中国兽医药品监察所 一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗
CN105039233A (zh) * 2015-08-25 2015-11-11 内蒙古华希生物科技有限公司 一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
CN105112349A (zh) * 2015-08-25 2015-12-02 内蒙古华希生物科技有限公司 一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
CN106574235A (zh) * 2014-07-10 2017-04-19 国家医疗保健研究所 用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2555790B1 (es) 2014-06-05 2016-10-13 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Método de obtención de un array de micropartículas planares con multiplexado molecular superficial, array obtenido y su uso
WO2017108515A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Universidad De Navarra Modified gram negative bacterial strains and uses thereof
ES2965961T3 (es) 2016-03-07 2024-04-17 Centro Nac De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii F S P Uso de inhibidores selectivos de INOS para el tratamiento de aneurismas de la aorta torácica (TAA) en un sujeto
EP3458584B1 (en) 2016-05-18 2021-07-07 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Fusion proteins comprising an aldolase enzyme joined to a maltose binding protein
EP3703756B1 (en) 2017-11-02 2022-04-20 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Use of statins in overcoming resistance to beta-lactam antibiotics in bacterial species synthetizing isoprenoids using the mevalonate synthetic pathway
US20210330662A1 (en) 2018-10-10 2021-10-28 Isquaemia Biotech, S.L. Quinolylnitrones for the treatment and prevention of a cerebral stroke or ischaemia
ES2780274A1 (es) 2019-02-15 2020-08-24 Consejo Superior De Investig Científicas (Csic) Cortistatina o un análogo de la misma como agente farmacéuticamente activo en forma latente

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102781468A (zh) * 2009-12-03 2012-11-14 西班牙高等科研理事会 用于鉴别接种对抗布鲁氏菌的疫苗的动物的方法
CN102327606A (zh) * 2011-09-06 2012-01-25 中国兽医药品监察所 一种布鲁氏菌活疫苗及其生产方法
CN103981139A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 中国兽医药品监察所 一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗
CN104004697A (zh) * 2014-06-03 2014-08-27 中国兽医药品监察所 一种单基因缺失粗糙型布鲁氏菌及其疫苗的生产方法
CN104031874A (zh) * 2014-06-03 2014-09-10 中国兽医药品监察所 一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法
CN106574235A (zh) * 2014-07-10 2017-04-19 国家医疗保健研究所 用于针对布鲁氏菌病的改进疫苗的改性细菌
CN104845916A (zh) * 2015-05-28 2015-08-19 中国兽医药品监察所 一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗
CN105039233A (zh) * 2015-08-25 2015-11-11 内蒙古华希生物科技有限公司 一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
CN105112349A (zh) * 2015-08-25 2015-12-02 内蒙古华希生物科技有限公司 一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARLOS CHACÓN-DÍAZ等: "The use of green fluorescent protein as a marker for Brucella vaccines" *
DAVID GONZÁLEZ等: "Brucellosis Vaccines Assessment of Brucella melitensis Lipopolysaccharide Rough Mutants Defective in Core and O-Polysaccharide Synthesis and Export" *
IGNACIO MORIYÓN等: "Rough vaccines in animal brucellosis structural and genetic basis and present status" *
P M MUÑOZ等: "Efficacy of several serological tests and antigens for diagnosis of bovine brucellosis in the presence of false-positive serological results due to Yersinia enterocolitica O:9" *
R ADONE等: "Evaluation of Brucella melitensis B115 as rough-phenotype vaccine against B. melitensis and B. ovis infections" *
XIURAN WANG等: "Effects of partial deletion of the wzm and wzt genes on lipopolysaccharide synthesis and virulence of Brucella abortus S19" *
XIURAN WANG等: "Immunogenic response induced by wzm and wzt gene deletion mutants from Brucella abortus S19" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117187146A (zh) * 2023-11-07 2023-12-08 中国兽医药品监察所 一株无耐药性的粗糙型布鲁氏菌病保护菌株及其应用
CN117187146B (zh) * 2023-11-07 2024-01-26 中国兽医药品监察所 一株无耐药性的粗糙型布鲁氏菌病保护菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20220273785A1 (en) 2022-09-01
EA202091308A1 (ru) 2020-09-11
WO2019101993A1 (en) 2019-05-31
US20210077609A1 (en) 2021-03-18
BR112020010316A2 (pt) 2020-10-20
CL2020001358A1 (es) 2021-02-26
CO2020007601A2 (es) 2020-08-31
MX2020005373A (es) 2020-10-19
US11298416B2 (en) 2022-04-12
US11707515B2 (en) 2023-07-25
EP3713598A1 (en) 2020-09-30
PE20201285A1 (es) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11707515B2 (en) Modified Brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis
JP2640525B2 (ja) 無毒の微生物とその使用
US6656478B1 (en) Cross-protective salmonella vaccines
US20080274139A1 (en) Attenuated microorganisms for the treatment of infection
US20080069843A1 (en) Salmonella vaccine
KR20150027836A (ko) 마이코플라스마 히오뉴모니아를 형질전환하기 위한 벡터, 형질전환된 ｍ. 히오뉴모니아 균주, 및 그것의 용도
KR20160095185A (ko) 마이코플라즈마 보비스 백신
US9358283B2 (en) Diatom-based vaccines
JP2004337175A (ja) 無毒性微生物及びその使用：サルモネラ
Bhuyan et al. The construction of recombinant Lactobacillus casei expressing BVDV E2 protein and its immune response in mice
US8993302B2 (en) Mutants of Francisella tularensis and uses thereof
AU711915B2 (en) Plasmid vaccine against pseudorabies virus
US20050249755A1 (en) Mutant strains of Brucella melitensis and immunogenic compositions
WO2021073778A1 (en) Compositions and methods for vaccinating piglets against streptococcus
AU3935300A (en) Live attenuated bacteria for use in a vaccine
WO2019008272A1 (fr) Nouvelles souches attenuees d&#39;apicomplexes et leur utilisation comme vecteurs d&#39;antigene pour la prevention de maladies infectieuses
JP2001525375A (ja) 弱毒化細菌を含むワクチン
JP4881733B2 (ja) アルドラーゼ陰性弱毒細菌生ワクチン
US6770273B1 (en) Vaccine based on attenuated Haemophilus somnus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201030

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication