CN117187146B - 一株无耐药性的粗糙型布鲁氏菌病保护菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种粗糙型羊种布鲁氏菌株及其应用。所述布鲁氏菌株，命名为RM，其保藏编号为：CGMCC No.27411。由本发明粗糙型羊种布鲁氏菌RM制成的布鲁氏病活菌制剂具有良好的遗传稳定性、安全性、免疫原性和效力，且无抗生素耐药性，本发明的菌株可通过微量凝集试验实现鉴别诊断，解决现有布鲁氏菌病疫苗无法实现临床区分疫苗免疫和野菌感染的鉴别诊断的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种无耐药性的粗糙型（R型）布鲁氏菌病保护菌株及其应用。
背景技术
布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌引起的以感染牛、羊等家畜为主的人畜共患传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为多种动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
我国与人类布病有关的传染源主要是患病的牛、羊和鹿等。感染动物可从乳汁、精液和流产分泌物中排出病原菌，长期或终身带菌，当患病母畜流产时，大量病菌随着流产胎儿、胎衣和子宫分泌物一起排出，成为最危险的传染源。
根据菌株表型的不同，制备布鲁氏菌病疫苗的菌株可分为光滑（Smooth，S）型菌株和粗糙（Rough，R）型菌株，国际上动物布病疫苗有：用于羊的布鲁氏菌活疫苗（Rev.1 株），用于牛的布鲁氏菌活疫苗（S19株）及极少数地方在使用的布鲁氏菌活疫苗（RB51株）。Rev.1株为S型疫苗，但具有链霉素耐药性。RB51株为R型疫苗，但具有利福平耐药性，疫苗株均有一定的残余毒力，存在感染职业人员的风险，而链霉素和利福平均为治疗人布病常用的抗生素，如果使用具有耐药性的布病疫苗，对于由于耐药性疫苗株感染人的治疗造成较大困难。
本发明通过用阳性血清生长凝集培养方法选育出的羊种粗糙型菌种无耐药性，免疫动物后能实现自然感染抗体与免疫抗体的完全鉴别诊断，还具有良好的安全性和免疫保护的有效性，为预防布鲁氏菌病提供一种新型疫苗的候选菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供了一种无耐药性的粗糙型布鲁氏菌病保护菌株。
所述布鲁氏菌病保护菌株命名为RM，已于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.27411。
本发明还提供了一种制剂，其特征在于，所述制剂的菌株包含布鲁氏菌病保护菌株；
进一步地，所述的布鲁氏菌病保护菌株为保藏编号为CGMCC NO.27411的菌株；
进一步地，本发明的布鲁氏菌病保护菌株及其制剂可以是用于全身施用的形式。
更进一步地，本发明的布鲁氏菌病保护菌株及其制剂的施用方法包括将所述菌株或制剂施用于动物。
优选地，本发明的布鲁氏菌病保护菌株及其制剂施用方法包括将所述菌株或制剂施用于羊。
更优选地，本发明的布鲁氏菌病保护菌株及其制剂可以配制和/或包装用于单一剂量或多剂量方案施用。
更优选地，本发明的布鲁氏菌病保护菌株及其制剂的布鲁氏菌病保护菌株浓度不低于1.0×1010CFU/mL，具体可以为1.0×1010CFU/mL、1.5×1010CFU/mL、2.0×1010CFU/mL、2.5×1010CFU/mL、3.0×1010CFU/mL、3.5×1010CFU/mL、4.0×1010CFU/mL、4.5×1010CFU/mL、5.0×1010CFU/mL、5.0×1010CFU/mL、6.0×1010CFU/mL、6.5×1010CFU/mL、7.0×1010CFU/mL、7.5×1010CFU/mL、8.0×1010CFU/mL、8.9×1010CFU/mL、9.0×1010CFU/mL、9.5×1010CFU/mL、10.0×1010CFU/mL及以上任意值。
本发明提供的布鲁氏菌病保护菌株对抗生素无耐药性；
优选地，所述的抗生素为庆大霉素、四环素、多西环素、新诺明、利福平、链霉素等一种或多种抗生素。
本发明提供的布鲁氏菌病保护菌株制备得到的制剂接种动物后可产生粗糙型（R型）抗体。
本发明还提供了所述的布鲁氏菌病保护菌株在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用
本发明还提供了所述的布鲁氏菌病保护菌株在制备防治布鲁氏菌所致疾病的药物中的用途。
本发明还提供了所述的布鲁氏菌病保护菌株在制备鉴别诊断布鲁氏菌所致疾病的试剂中的应用。
本发明还提供了一种用于在动物中引发针对布鲁氏菌的保护性免疫应答的方法，其包括将布鲁氏菌病保护菌株及其制剂施用于动物。
本发明还提供了一种用于在动物中引发针对布鲁氏菌的保护性免疫应答的方法，其包括将布鲁氏菌病保护菌株及其制剂施用于羊。
优选地，所述菌株及其制剂中的布鲁氏菌病保护菌株浓度不低于1.0×1010CFU/mL，具体可以为1.0×1010CFU/mL、1.5×1010CFU/mL、2.0×1010CFU/mL、2.5×1010CFU/mL、3.0×1010CFU/mL、3.5×1010CFU/mL、4.0×1010CFU/mL、4.5×1010CFU/mL、5.0×1010CFU/mL、5.0×1010CFU/mL、6.0×1010CFU/mL、6.5×1010CFU/mL、7.0×1010CFU/mL、7.5×1010CFU/mL、8.0×1010CFU/mL、8.9×1010CFU/mL、9.0×1010CFU/mL、9.5×1010CFU/mL、10.0×1010CFU/mL及以上任意值。
本发明具有的有益效果如下：
本发明通过生长凝集试验方法，成功筛选出一株具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌病保护菌株RM。
本发明通过抗生素敏感性实验，证实了布鲁氏菌病保护菌株RM为无布鲁氏菌病常用抗生素耐药性菌株。
本发明将布鲁氏菌病保护菌株RM菌株制备成制剂后免疫羊，150d免疫期内，用布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原均未检测到光滑型抗体，解决了布鲁氏菌病监测中与布鲁氏菌野毒感染区分的鉴别诊断难题。
本发明将布鲁氏菌病保护菌株RM菌株制备成制剂免疫动物后用布鲁氏菌强毒株（M28株）的攻击，未在强毒攻击的动物体内分离到布鲁氏菌强毒株，具有较好的免疫保护效果。
保藏说明
分类命名：羊种布鲁氏菌Brucella melitensis
菌株编号： CGMCC No.27411
菌株编号：RM
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期： 2023年5月22日
保藏中心登记入册编号： CGMCC No. 27411
附图说明
图1粗糙型布鲁氏菌（RM）菌落结晶紫染色图
图2粗糙型布鲁氏菌（RM）菌悬液吖叮黄染色图
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
应注意，在本公开内容中且特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等等可以具有中国专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等等；例如，它们允许未明确叙述的元素，但排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新型特性的元素。
布鲁氏菌病保护菌株RM已于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏登记入册编号为CGMCC No. 27411。
实施例1、菌株的筛选与培养
1）试验方法
选择具有光滑型抗体的羊布病阳性血清（购买于北京中海生物科技有限公司，货号为16），用胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（购买于青岛海博生物技术有限公司，货号为HB4114）稀释比例分别为1：100和1：500的培养液，将本实验室临床分离的被选育原始菌株接种于胰胨大豆琼脂斜面（TSA琼脂，购买于青岛海博生物技术有限公司，货号为HB4138），37℃培养箱中培养2~3d,长成单层菌落后，用TSB洗下的新鲜培养物，配制成OD600值为1.0的活菌悬液。取1mL活菌悬液加入TSB培养液100mL，在37℃培养箱中培养，取上清液接种胰胨大豆琼脂斜面（TSA琼脂，购买于青岛海博生物技术有限公司，货号为HB4138），37℃培养箱中培养2~3d,长成单层菌落后，用TSB洗下的新鲜培养物，配制成OD600值为1.0的活菌悬液，与培养液等量混合进行培育，按照上述方法反复传代111代，用菌落结晶紫染色（GB/T18646-2018）和吖啶黄染色法（孙浩杰,任小侠,秦玉明等.一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定[J].中国畜牧兽医,2020,47(11):3445-3453）鉴定菌落表型，鉴定为粗糙型的菌落作为候选菌株。
2）试验结果
成功筛选出一株粗糙表型的布鲁氏菌菌株，命名布鲁氏菌RM，菌落结晶紫染色结果为紫色，菌落着色，边缘不整齐，粗糙，个别菌有裂纹（结果见图1）。吖啶黄染色法鉴定粗糙型布鲁氏菌菌液有明显的凝集作用（结果见图2）。结果显示，布鲁氏菌RM为粗糙表型。该布鲁氏菌RM已于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏登记入册编号为CGMCC No.27411。
实施例2、菌株在豚鼠体内遗传稳定性测定
1）试验方法
将粗糙型布鲁氏菌RM按照实施例1中的方法制备成浓度为1.0×109CFU/mL的活菌悬液，皮下注射接种豚鼠2只，注射剂量为1.0 ml/只，喂养15d后进行扑杀，解剖后取脾脏，称重，离心管中加入1ml无菌水和1g脾脏，组织研磨仪充分研磨，取0.1ml 组织研磨液，涂TSA平板，37℃培养箱中培养3-5d，长出的细菌用结晶紫染色，鉴定粗糙表型。再将剩余脾脏研磨混悬液继续皮下接种豚鼠2只，注射剂量为1.0 ml/只，喂养15d后扑杀解剖后取脾脏研磨后分离细菌鉴定，并按照上述方法连续传代5次，取每代培养物进行菌落粗糙表型鉴定。
2）试验结果
第1代活菌悬液接种豚鼠，解剖后，用脾脏混悬液继续在豚鼠体内传代，按照这样的方法连续传代4次，第5代后豚鼠脾脏中未分离到RM菌株，1-4代中每次传代进行脾脏菌落分离，结晶紫染色均为粗糙型菌落，分离菌表型没有变化，稳定在体内传代4代，粗糙表型没有恢复或者突变为光滑表型。结果显示，粗糙型布鲁氏菌RM具有较好的遗传稳定性，粗糙表型菌落在豚鼠体内连续传代后未发生表型变异。
表1 不同代次豚鼠脾脏分菌结果
实施例3、抗生素敏感性试验
1）试验方法
严格按照苛养菌/慢生长M45-A2 CLSI 实验指南E-test试验进行6种常用抗生素（庆大霉素、四环素、多西环素、新诺明、利福平、链霉素）对布鲁氏菌的最小抑菌浓度（MIC）实验。取生长48小时的菌液待配制成1×107CFU/mL菌悬液，在无菌条件下均匀涂布于平皿上，将药敏条垂直插入培养基中，确保试纸条均匀插入培养基，放置后不可再移位，置37℃温箱孵育，在 48～72小时长出单菌落后判读结果。试验样品达到培养时间且布鲁氏菌已有均匀显著的生长时，读取抑菌圈边与试纸条相交处的值，统计每种药物的MIC分布范围，确定菌株对抗生素耐药情况。按照上述方法同时设立布鲁氏菌病活疫苗（Rev.1株）（购买自金宇保灵生物药品有限公司）对照。
2）试验结果
结果表明: RM菌株和对6种常见的抗生素敏感性较高，均不耐药。Rev.1株对链霉素耐药，有链霉素抗性。结果见表2。结果显示，Rev.1株和RM株均为羊用的布鲁氏菌保护性菌株，Rev.1株对治疗人布病常用的链霉素不敏感，如果Rev.1株感染人，将影响临床治疗效果。
表2 不同菌株耐药性试验结果
实施例4、粗糙型布鲁氏菌（RM株）羊的免疫
1.粗糙型抗体测定
1）试验方法
选取10只绵羊，其中空白对照组为5只，其余5只为试验组，将粗糙型布鲁氏菌（RM株）制成2.5×1010CFU/mL～5.0×1010CFU/mL活菌数的菌悬液皮下注射接种5只试验组绵羊，接种后0d、7d、15d、30d、60d、90d、120d和150d采血，用R型（购买于北京中海生物科技有限公司，货号为1）和S型布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原试剂盒（购买于北京中海生物科技有限公司，货号为13）测定R型和S型抗体。
2）试验结果
R型和S型布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原与绵羊的血清进行虎红平板凝集试验（RBT），结果表明：空白对照羊5/5只没有S型和R型抗体反应，用R型抗原进行的RBT试验，免疫后第7天开始产生抗体，持续到第120天仍能检测到粗糙型抗体。用S型抗原进行的RBT试验，免疫监测期150天内均没有检测到S型抗体。结果显示，布鲁氏菌病常规监测中使用的S型RBT抗原无法检测到针对粗糙型布鲁氏菌RM产生的抗体，较好地解决了无法与布鲁氏菌强毒感染相区分的鉴别诊断难题。
表3绵羊的粗糙型血清免疫抗体反应结果
2.攻毒保护试验
1）试验方法
1.1免疫：将试验羊分为3组，分别为布鲁氏菌RM低剂量免疫组、高剂量免疫组和空白对照组。
第1组，布氏菌病RM低剂量免疫组，取5只羊，每只羊左侧颈部皮下注射菌悬液1.0mL，含1.0×1010CFU/mL活菌。
第2组：布氏菌病RM高剂量免疫组，取5只羊，每只羊左侧颈部皮下注射菌悬液1.0mL，含2.5×1010CFU/mL活菌。
第3组：空白对照组5只羊，不接种，相同条件隔离饲养。
1.2攻毒：免疫后60d，将3个试验组所有羊只转移至生物安全三级动物房，全部右侧腿部内侧皮下接种含1.0×108CFU/mL的羊种布鲁氏菌强毒M28株（购自中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC920）。
1.3组织分菌：攻毒后40d，将试验羊全部解剖，观察各脏器（脾脏及颌下、腹股沟各两侧淋巴结）病理变化。同时采集脾脏及颌下、肩前、腹股沟各两侧淋巴结等组织，称重，取0.1g/个脾脏组织，加入1.0mL生理盐水，研磨，混悬液取0.1mL接种平皿，置37℃培养3～5d后进行菌落计数。
2）试验结果
试验羊攻毒后40d全部进行解剖分菌，对照组5/5只羊分离出强毒布鲁氏菌，2.5×1010CFU/mL高剂量组对强毒的攻击4/5只羊能提供有效保护，1.0×1010CFU/mL低剂量组对强毒的攻击对5/5只羊能未能提供有效保护，活菌计数结果详见表4。
表4 攻毒后组织分菌活菌计数结果（个/皿）
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1. 一种羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis），其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 27411。
2.权利要求1所述的羊种布鲁氏菌在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的羊种布鲁氏菌在制备预防布鲁氏菌病的药物中的用途。
4.权利要求1所述的羊种布鲁氏菌在制备鉴别诊断布鲁氏菌病的试剂中的应用。
5.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述羊种布鲁氏菌。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述制剂中的羊种布鲁氏菌浓度不低于1.5×1010CFU/mL。
7.根据权利要求5-6任一所述的制剂，其特征在于，所述制剂中的羊种布鲁氏菌浓度不低于2.5×1010CFU/mL。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012131128A1 (es) * | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Universidad De Navarra | Método diva de diferenciación de animales vacunados frente a la brucelosis |
| AR084605A1 (es) * | 2010-12-23 | 2013-05-29 | Univ Minas Gerais | Cepa atenuada de brucella sp., composicion vacunal y uso |
| CN104845916A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-08-19 | 中国兽医药品监察所 | 一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗 |
| CN105899228A (zh) * | 2013-10-11 | 2016-08-24 | 加利西亚健康服务(Sergas) | 减毒活疫苗 |
| CN111867622A (zh) * | 2017-11-24 | 2020-10-30 | 高等科学研究委员会（Csic） | 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004054508A2 (en) * | 2002-12-12 | 2004-07-01 | Walter Reed Army Institute Of Research Department Of The Army | Immunogenic compositions including rough phenotype brucella host strains and complementation dna fragments |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR084605A1 (es) * | 2010-12-23 | 2013-05-29 | Univ Minas Gerais | Cepa atenuada de brucella sp., composicion vacunal y uso |
| WO2012131128A1 (es) * | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Universidad De Navarra | Método diva de diferenciación de animales vacunados frente a la brucelosis |
| CN105899228A (zh) * | 2013-10-11 | 2016-08-24 | 加利西亚健康服务(Sergas) | 减毒活疫苗 |
| CN104845916A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-08-19 | 中国兽医药品监察所 | 一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗 |
| CN111867622A (zh) * | 2017-11-24 | 2020-10-30 | 高等科学研究委员会（Csic） | 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 |
| CN116218707A (zh) * | 2022-12-14 | 2023-06-06 | 北京科牧丰生物制药有限公司 | 一种粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的生物学特性研究;辛凌翔等;《中国人兽共患病学报》;第38卷(第8期);第693-697页 * |
| A rapid and sensitive triplex-recombinase polymerase amplification for simultaneous differentiation of Brucella abortus, Brucella melitensi s, and Brucella suis in sera and foods;Chang J等;《FEMS Microbiol Lett》;第370卷;doi: 10.1093/femsle/fnad056 * |
| Rough brucella strain RM57 is attenuated and confers protection against Brucella melitensis;Feng Y等;《Microb Pathog》;第107卷;第270-275页 * |
| 一株羊种变异布鲁氏菌分离株遗传特征分析;杨晓雯等;《中国人兽共患病学报》;第36卷(第11期);第894-899页 * |
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