CN109395099B - 一种提高结核菌素bcg-ppd皮试诊断试剂稳定性的方法 - Google Patents

一种提高结核菌素bcg-ppd皮试诊断试剂稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种提高结核菌素BCG‑PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，采用吐温对BCG‑PPD原液进行分散，分散所用的吐温的体积为BCG‑PPD原液体积的0.8％～6％。本发明还提供了一种含有结核分枝杆菌疫苗BCG组分的PPD体内诊断试剂的制备方法。本发明的试剂组合对结核病的检测灵敏度高，具有良好的物理和化学稳定性，具有广阔的市场前景和应用价值。采用本发明所述方法生产的结核菌素BCG‑PPD皮试诊断试剂，效期可以提高到36个月。

Description

一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法。
技术背景
结核病是危害人类健康的主要传染病之一，结核病是一种由结核分枝杆菌造成的、严重的细菌传染病，通常影响肺部。此病通过活动性呼吸道疾病患者咽喉和肺部产生的飞沫在人际传播。在健康人身上，结核分枝杆菌感染通常不引发症状，因为其免疫系统会发挥作用阻挡细菌。活动性肺结核的症状是咳嗽,有时有痰或血，胸痛，虚弱、体重减轻，发烧和盗汗。结核病可以通过六个月抗生素疗程得到治疗。结核病是全球第九大死因，也是因单一病原体造成的主要死因，高于艾滋病毒/艾滋病。据估计，2016年，在艾滋病毒阴性者中，130万人死于结核病(低于2000年的170万人)，在艾滋病毒阳性者中，37.4万人死于结核病。2016年，据估计，全球结核病新发病例数为1040万例，其中成人占90％，男性占65％，艾滋病毒携带者占10％(74％在非洲)，印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦等5个国家的新发病例占56％。持续面临耐药结核病威胁。2016年，新增60万例利福平耐药结核病，其中49万例是耐多药结核病。这些病例的几乎一半发生在印度、中国和俄罗斯。在全球范围内，结核病死亡率每年下降约3％，发病率每年下降约2％，16％的结核病患者死于该病。到2020年，这些数据必须每年分别下降4％-5％和10％，这样才能达到终止结核病战略确定的2020年第一个里程碑。
早期诊断和适当治疗可避免大多数的结核病死亡病例。每年有数以百万计的人得救，他们被诊断出结核病并获得成功治疗(2000-2016年间共挽救了5300万人生命)。尽管如此，在检测和治疗方面仍存在很大差距。
2016年报告的结核病新发病例数为630万例(高于2015年的610万)，相当于1040万例估计发病数的61％。最新治疗结果数据显示，全球结核病治疗成功率为83％，与近年水平相似。艾滋病毒阳性者的结核病例报告数为476774例(占估测发病数的46％)，其中85％患者正在接受抗逆转录病毒治疗。共有129689人开始接受耐药结核病治疗，略高于2015年的125629人，但仅为估测发病人数的22％，且治疗成功率仍较低，在全球为54％。为大幅度缩小这些差距，必须在一组结核病高负担国家中取得更大进展。在结核病新发病例数与报告病例数之间仍存在缺口，10个国家占缺额的76％，居于前3位的国家分别是印度、印度尼西亚和尼日利亚。在耐药结核病发病率与治疗病例数之间存在的缺口上，10个国家占了75％，印度和中国共占39％。在与艾滋病相关结核病的缺口上，世卫组织非洲区域占一半以上。
2016年各国结核病新发病例数与人口总数比例相差很大。大多数高收入国家每10万人口结核病新发病例低于10例，在30个结核病高负担国家中，大多数国家每10万人口结核病新发病例在150-300例之间，少数几个国家每10万人口超过500例。
结核传染病的严重程度与引起结核病的结核分枝杆菌持续无症状感染能力有关。近一个世纪以来，结核菌素皮试试验被应用于鉴别感染结核分枝杆菌的人。早在1890年Robert Koch提出结核杆菌甘油提取物能够治愈和预防结核病。虽然Koch的旧结核菌素(OT)作为治疗剂最终失败，他的发现促使现代皮试试剂(TST)的开发，TST是迄今为止鉴别潜在的结核病例最重要的工具。TST试验也被称为芒图试验，名字来源于法国医生CharlesMantoux(1877–1947)，他建立了读取TST的诊断标准。由美国胸科协会和美国疾控中心支持的芒图试验是现行的用于确认个体感染结核菌的金标准。该免疫试验由两部分构成。第一部分将结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试剂皮内注射于前臂；第二部分是测量注射部位硬结(炎性红肿)直径的毫米数监测注射后48至72小时引起的迟发型过敏反应(Delayed-typehypersensitivity)。通常PPD注射24小时以内出现可见的红疹，由于不能指示感染状态，无须测量。解读芒图试验结果的操作必须有经过训练的专业人员完成，他们能够依据测量的阳性反应程度解释感染的风险因素。
TST除了用作结核分枝杆菌感染指示剂，还可用于流行病学调查工具评估结核菌潜伏感染流行情况。全球三分之一人口感染结核菌的推测部分基于TST阳性的频率。
首次结核菌素皮试试验在1907年由Von Pirquet(1874–1929)引入，他是奥地利科学家和儿科医师。在他的研究中，使用了Koch的旧结核菌素，旧结核菌素是一种加热的细菌培养物，由结核杆菌的蛋白质和其他大分子物质构成，是未经纯化的、组分不清的混合粗提物。旧结核菌素制备过程是通过浓缩过滤结核分枝杆菌生长6-8周的甘油蛋白胨培养基而成。旧结核菌素和类似产品因为未纯化，效价和特异性波动，以及未充分标化，而没有在美国用作TST试剂。1930年生产了一种叫MA-100的无多糖配方试剂，由结核分枝杆菌培养物滤液制备而成。MA-100比OT具有更高的效价，然而MA-100的应用受到局限，主要由于重复注射在皮内观察到致敏效应。1934年一个更稳定的、均一的试剂由美国宾夕法尼亚大学生物化学家Florence B.Seibert(1897–1991)开发出来。最初以生产方式命名为SOTT，SOTT首字母来自synthetic medium old tuberculin trichloroacetic acid precipitate。该产品后来被命名为纯化蛋白衍生物或者PPD。它是在阿诺德灭菌器里蒸汽处理结核菌培养物，然后硫酸铵多次沉淀纯化蛋白质。与以前的结核菌素试剂比较，PPD制备方法显著地减少多糖、核酸和脂类成分，得到富含蛋白质的试剂。1944年，大批量的改进PPD(lot49608)重新命名为PPD-S(PPD-Standard)，被提供作为美国参考品。PPD-S含有大约92.9％蛋白，5.9％多糖和1.2％核酸。因为高效价和高纯度，1952年PPD-S被WHO采纳为结核菌素国际标准品。从1978开始，美国FDA规定所有批次的PPD都要通过生物化学方法检定，必须与PPD-S效价一致。PPD国际单位IU被定义为效价单位，1个IU等于0.028μgPPD-S的生物学活性(0.02μgPPD和0.008μg盐)。然而，在美国和加拿大，PPD效价被表述为结核菌素单位TU而不是IU。1个TU被定义为0.02μgPPD-S。5个TU是基于流行病学研究的标准皮内诊断使用剂量。PPD-S2是现行的美国PPD结核菌素标准品，预期最终取代PPD-S(Villarino,et al.,2000)。当前，
Figure BDA0001904784840000031
和
Figure BDA0001904784840000032
是两个广泛应用的、商业化的、以PPD-S2为标准的产品，皮试结果与最初的PPD-S标准一致。然而相互转换使用
Figure BDA0001904784840000033
和
Figure BDA0001904784840000034
皮试结果出现偏差，确切原因尚不清楚。除了PPD-S，还有其他几种PPD配方在美国和加拿大以外的国家使用,这些产品中的几个包括PPD RT23是由丹麦血清所生产。当前，WHO和IUATLD推荐2TU含有吐温80的PPD-RT23。RT23是全球使用最广泛的产品。全世界有几项研究使用了PPD RT23评估结核分枝杆菌感染流行水平，包括印度、加纳、也门、南非、尼泊尔、巴西、印度尼西亚。此外也被用于荷兰的大人群的肺结核接触者评估。
在我国的免疫规划中规定，新生儿出生24小时内接种一剂卡介疫苗(BCG)，这种接种程序是结合中国人群疫病流行特点做出的，并不是每个国家均执行类似的接种程序。为了评估卡介菌接种后的效果及筛选接种对象，依据TB-PPD的制备方法，我国研制出来了卡介菌纯蛋白衍生物(BCG-PPD)。BCG-PPD是由卡介菌培养滤液提取蛋白制成的。TB-PPD和BCG-PPD抗原组分不同，决定了两种诊断试剂有不同的应用方案，具体两者差异见图1。
BCG-PPD能在机体上引起迟发型变态反应，对于考察卡介菌接种效果方面，BCG-PPD反应高于TB-PPD。TB-PPD更适用于流行病学调查，结核密切接种者筛查和结核病患者辅助诊断。机体接种卡介苗4-12周产生免疫反应，此时做结核菌素皮试试验，试验部位的皮肤局部在48-72小时出现红肿硬结现象。目前新生儿和婴幼儿接种卡介苗，如出生时没有接种卡介苗，其补种原则是：出生未接种卡介苗小于3月龄儿童可直接补种卡介苗；3月龄-3岁儿童需要进行结核菌素皮肤试验，结果为阴性者补种卡介苗。
卡介苗接种实际上是一次减毒活菌的人工感染，如果接种成功，就会产生免疫力和过敏性。免疫力和过敏性产生及其强弱在固定菌株活力情况下，与接种到人体内的活菌数有关。为此，为了了解卡介苗接种效果，卡介苗接种后2-3个月(一般定为12个星期)，可做结核菌素试验。如果反应阳性且有适当的强度(即适当的平均直径)，表示接种良好，阴性表示接种不够好。
BCG-PPD虽然更适合于卡介苗接种效果评估，但是同TB-PPD一样，如果BCG-PPD生物活性强，皮肤试验就更加灵敏，数据更加可靠。BCG-PPD粉剂比较稳定，可以保持10年以上，但是一经稀释就易变质，稀释度越大越不易保存，而且结核菌素有吸附到玻璃包装上的特点，通常在结核菌素中加入表面活性剂tween80(聚山梨醇酯80)，后可以减少吸附。但是当前稀释后稳定性最高可以保持18个月，实践应用中18个月效期仍不能满足实际市场需求，产品的货架期相对较短。因此，生产高质量的BCG-PPD组合物是一项具有挑战的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种解决BCG-PPD稳定性问题的方法，采用本发明所述方法生产的结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂，效期可以提高到36个月。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，采用吐温对BCG-PPD原液进行分散，分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8％～6％。
在实际生产中，本发明所述的BCG-PPD原液通常为冻干原液。
在一种具体的实施方式中，本发明所述的吐温的体积优选为BCG-PPD原液体积的1％～5％，更优选为3％～5％。
本发明所述吐温选自吐温20、吐温60或吐温80，优选为吐温80。
进一步的，本发明所述的方法，采用吐温分散后的原液可以进行后续的稀释和分装。
在一种具体的实施方式中，本发明提供一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂的稳定性方法，采用吐温对BCG-PPD原液进行分散静置60分钟-120分钟，再进行后续的稀释和分装，分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8％～6％。
本发明还提供一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，采用吐温对BCG-PPD原液分散后进行稀释和分装，稀释和分散后的溶液中，吐温的最终体积含量为0.0005％-0.005％，优选为0.001％-0.005％，更优选为0.002％-0.003％，最优选为0.0025％。
本发明所述的方法稀释和分装可以包含或者不包含传统的防腐剂，如苯酚，即使不包含传统的防腐剂，也不会对BCG-PPD稳定性产生影响。
在一种具体的实施方式中，本发明提供一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂的稳定性方法，采用吐温对BCG-PPD原液分散静置后进行稀释和分装，稀释和分散后的溶液中，吐温的最终体积含量为0.0005％-0.005％；分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8％～6％。
在本发明中，吐温对BCG-PPD原液分散静置的时间一般优选是在60分钟以上即可，为了节省时间成本，一般在60分钟-120分钟。
本发明所述的稀释和分装可以采用现有技术常用的方法和辅料，如pH6.8-7.4的磷酸缓冲液进行稀释分装，可以稀释时仅选用缓冲液，并不会对稳定性造成影响。
本发明还提供了一种高含量BCG-PPD原液的制备方法，该方法所制备的BCG-PPD原液中，活性成分高，可用于本发明所述的提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法中。
本发明所述的高含量BCG-PPD原液的制备方法，包括菌培、灭活、沉淀和冻干；所述菌培具体工艺为：工作种子菌种首先培养发育为干皱成团呈浅黄色的菌苔，菌苔镜检状态为短粗杆菌，微弯曲两端圆；然后再进行2代培养至多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时传代进行3代培养，3代培养至形成多皱微黄的菌膜后进行4代培养8-10周。
进一步的，本发明所用的工作种子菌种为卡介菌D2PB302菌株，该菌株是我国皮内注射用卡介苗生产用菌种，是丹麦国立血清研究所BCG-823株的子代菌株，可从中国食品药品检定研究院获得。优选的工作种子菌种制备为：原始种子制备主种子批传代不超过3代；主种子复苏传代制备工作种子菌种传代不超过3代。自工作种子批开启制备菌体收集，传代应不超过12代。
所述的传代方式可以采用本领域常规的传代方式，开启原始种子接种于罗氏鸡蛋培养基，制备主种子，传代不超过3代，冻干保存于-70℃以下；主种子复苏传代不超过3代制备工作种子批，同样冻干保存。
本发明所述菌培具体工艺中达到相应的生物状态后进行传代培养，可以明显提高最终形成的结核菌素皮试诊断试剂有效成分含量，各生物状态的实现可以采用现有技术的培养条件实现。为了进一步提高最终形成的结核菌素皮试诊断试剂中有效成分含量，本发明还提供了一种更为具体的优选的菌培方法：工作种子菌种1代培养2～3周后传代进行2代培养，培养1～2周后传代进行3代培养，培养1～2周后进行4代培养8-10周。本发明所提供的培养周期可以很好的控制菌株的生长状态，使得最终获得结核菌素皮试诊断试剂中有效成分含量相对于现有技术所述的方法，具有明显的提高。
本发明菌培中所用培养基可以为现有技术常用培养基，例如，在一种优选的实施例中，本发明菌培过程中1代培养所用培养基为罗氏鸡蛋培养基，2代培养使用苏通马铃薯培养基，3代和4代培养使用苏通综合培养基。上述培养基可以直接从购买或按照现有技术所述配比进行自行配置。
进一步的，本发明还提供一种更为具体的菌培方法：生产用工作种子菌种溶解后接种于罗氏鸡蛋培养基中，36～38℃中试管倾斜角6～8度，静置培养2～3周，应发育成干皱成团略呈浅黄色的菌苔。此时可以观察菌苔生长情况：培养结束后每支1代菌种先用5ml氯化钠0.9％溶液混悬菌液，收集所有菌液，取样进行抗酸染色镜检，镜检结果：应为短粗杆菌，微弯曲两端圆，抗酸染色阳性(菌体被染为红色)。生化反应：硝酸盐还原反应为阳性，产生红色；尿素酶反应为阳性，显红色；耐热触酶反应应为阴性，10～20min无气泡产生；聚山梨酯80水解反应，不变色。挑取菌苔接种苏通马铃薯培养基进行2代菌种培养，36～38℃静置培养1～2周，培养成多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时，挑取生长良好的菌膜接种于苏通综合培养基进行3代菌种培养，36～38℃静置培养1～2周，结核菌悬浮于培养基表面，形成多皱微黄的菌膜。挑选生长良好的菌膜，接种克氏瓶进行4代培养，36～38℃静置培养8-10周。
进一步的，本发明所述生产工艺中灭活的具体工艺为100℃～120℃温度下杀菌30～120分钟；优选105℃～120℃杀菌30～90分钟；更优选108℃～118℃杀菌40～80分钟；最优选为110℃～116℃。
发明人发现，采用该温度和时间进行灭活，不仅可以最大限度保留有效成分，可以有效保留DTH反应原，明显提高最终获得结核菌素皮试诊断试剂的效价。
本发明还提供了一种更为具体的灭活方法：菌培终止后，将培养物于100℃～120℃杀菌30～120分钟后，过滤去除菌膜和菌体，收集滤液。过滤可以采用现有技术常用方法，如先用双层纱布再用三层绸布(200目)进行过滤。
进一步的，本发明所述生产工艺中沉淀的具体方法为：用终浓度为3～5％的三氯乙酸进行沉淀，沉淀次数不超过5次；优选3.5～4.5％的三氯乙酸，更优选为4％。采用本发明所述的沉淀方法，可以最大限度保留活性组分。
本发明所述的浓度为终3～5％的三氯乙酸表示100ml中含有3～5g的三氯乙酸。
本发明还提供一种更为具体的沉淀方法，收集灭活过滤后的滤液，加入30～50％的三氯乙酸，使其最终浓度为3～5％，充分摇匀，室温静置1～3小时，离心，收集沉淀；进一步的本发明收集后的沉淀还可以通过0.9％氯化钠溶液溶解后再次经终浓度为3～5％的三氯乙酸进行沉淀，总沉淀次数不超过5次，三氯乙酸沉淀湿重量不低于8g/L。本发明所用的离心方法可以为现有技术常规方法，如于4℃，8000～12000rpm离心20～40min。
进一步的，本发明提供一种更为具体的再次沉淀的方法，首次沉淀的沉淀物按照1:5～1:8比例加入0.9％氯化钠溶液，调节pH7.2～7.5，根据沉淀溶解液的量加入硫酸铵，使其终浓度为58～62％饱和度(即在25℃条件下，60％饱和度指1000ml溶解390g硫酸铵)，2～8℃静置过夜不少于12hr，离心，收集沉淀，硫酸铵沉淀湿重量不少于7g/L。沉淀物按照1:6～1:8比例加入0.9％氯化钠溶液溶解，根据沉淀溶解液的量加入30～50％三氯乙酸，使得三氯乙酸的终浓度为3～5％，充分混匀沉淀物，室温静置沉淀1～3小时，离心，收集沉淀。取离心后上清用蒽酮法检测上清中多糖含量，重复三氯乙酸沉淀步骤，不超过5个循环，直至多糖含量合格(低于10％)。多糖含量合格后，用1:7的体积比例用0.9％氯化钠溶液溶解，离心收集上清，用于后续操作。
进一步的，本发明所述的生产工艺还包括透析和除菌过滤。
进一步的，所述的透析可以为本领域常用方法进行透析，为了更好的保留有效成分，本发明还提供了一种优选的透析方法：将上清液装入分子量为3000D～4000D的透析袋中，纯化水流水透析不少于12小时；换7～9℃的注射用水透析，每25～35min换水一次；换水时可以取透析外液加入氯化钡观察是否有白色沉淀，如果没有沉淀出现，则终止注射用水透析，更换磷酸盐缓冲液透析，每50～70min更换一次磷酸缓冲液，更换次数不低于5次。
进一步的，本发明除菌过滤可以为本领域常用方法，本发明提供了一种优选的除菌过滤方法：将透析液经1.2μm～0.45μm微孔滤膜过滤澄清，过滤后取10ml样品测定微生物限度，再经0.45μm～0.22μm滤膜除菌过滤即为BCG-PPD发酵原液。除菌过滤时间优选的应控制在4小时内。
BCG-PPD发酵原液可以按照使用的规格按常规方法分装冻干保存，如收获的蛋白质按照7-12mg/支规格分装至安瓿瓶冻干，封口备用。
本发明相对于现有技术的优势：
1、本发明所述方法制备的原液，经过取样检测，符合中国药典三部中各项指标，同时按照本发明所述的方法，形成的产品稳定性更好，且可以不含防腐剂。
2、本发明所述方法制备的制剂，对结核病的检测灵敏度高，具有良好的物理和化学稳定性，具有广阔的市场前景和应用价值。
3、本发明使用高浓度吐温处理BCG原液60分钟以上，再稀释BCG-PPD原液，不仅可以保护并阻止有效蛋白质组分吸附到中硼硅玻璃分装瓶表面，还可以有效延长效期，产品效期由18个月延长到36个月。
附图说明
图1为TB-PPD和BCG-PPD抗原组分差异示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1菌培
(1)复苏工作种子1支接种到5支罗氏鸡蛋培养基，静置培养2周，待细菌长成干皱成团略呈浅黄色的菌膜，此时可以观察菌苔生长情况：培养结束后每支1代菌种先用5ml氯化钠0.9％溶液混悬菌液，收集所有菌液，取样进行抗酸染色镜检，镜检结果：应为短粗杆菌，微弯曲两端圆，抗酸染色阳性(菌体被染为红色)。生化反应：硝酸盐还原反应为阳性，产生红色；尿素酶反应为阳性，显红色；耐热触酶反应应为阴性，10～20min无气泡产生；聚山梨酯80水解反应，不变色。每支中管用2ml生理盐水重悬制备菌液，共收集10ml(1代)，取菌液接种苏通马铃薯培养基，共接种20支土豆管(2代)，静置培养1周。
罗氏培养基配制方法如表1：
表1罗氏鸡蛋培养基L-J基质液配制使用量
L-J基质液混匀后置100℃水浴，边加热边振摇，直至呈透明糊状。L-J基质液和2％孔雀绿溶液分别进行121℃、30min高压蒸汽灭菌，在L-J基质液中加入新鲜鸡蛋全液，混匀，再加入2％孔雀绿溶液，混匀后分装至中管中，每管8-10ml，88℃、40min烘烤定型。
(2)待细菌长成多皱、微黄色的菌膜，菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明，挑选生长良好的菌膜接种三角瓶装新鲜苏通综合培养基，培养基50瓶(3代)，细菌浮于培养基表面，37℃继续培养1周，待细菌长成多皱、微黄色的菌膜，挑选生长良好的细菌，再次移种新鲜苏通综合培养基，接种500瓶克式瓶(4代)，继续37℃静置培养10周。
其中，苏通综合培养基配制方法如表2：
表2苏通综合培养基配比
Figure BDA0001904784840000092
Figure BDA0001904784840000101
将上述培养基成分混匀，调节pH7.2-7.4，分装至500ml三角瓶，116℃20min灭菌。
苏通马铃薯培养基是将苏通综合培养基分装至土豆管中，每支土豆管中加入经pH7.2-7.4苏通综合培养基浸泡30min的马铃薯块(直径2cm，长4cm的半圆柱形)，116℃20min灭菌。
实施例2灭活
培养终止，将克式瓶培养物于110℃，60min杀菌，用纱布和绸布过滤除去菌体，收集滤液，加入苯酚3.0g/L保存，每瓶收获100ml，合并收获50L收获液。对照品工艺采用121℃30min灭活。
实施例3沉淀
配制浓度40％三氯乙酸溶液，按照1:10比例加入收获液中，终浓度4％，室温静置2小时。摇匀后4℃、8000rpm离心20min。收集沉淀，称重450g。
沉淀物450g用0.9％氯化钠溶液3150ml溶解，用1M氢氧化钠调节pH值，根据沉淀溶解的量加入硫酸铵，使其浓度达到60％饱和度。加入390g×3.15L＝1228.5g硫酸铵，2～8℃静置过夜(16小时)，4℃8000rpm20min离心，收集沉淀365g。在沉淀中加入0.9％氯化钠溶液2555ml溶解。再加入40％三氯乙酸终浓度为4％，沉淀蛋白质，8000rpm离心，收集沉淀，称重310g。重复氯化钠融合三氯乙酸沉淀操作3次，最终获得沉淀270g蛋白质。将270g蛋白沉淀溶解于0.9％氯化钠1890ml溶液中，进行下步操作。
实施例4透析
将实施例3中溶解液装入截留分子量为3500D的透析袋中，纯化水透析过夜16小时，换预冷的8℃注射用水透析，每30min换水1次。注射用水用量为20L/次。每次更换透析液时取透析外液5ml加入1ml1％氯化钡溶液，观察是否有白色絮状沉淀，如果没有絮状沉淀出现，则终止注射用水透析。更换磷酸缓冲液继续透析。每小时更换缓冲液，不得少于5次。
实施例5除菌过滤
将透析液经1.2μm～0.45μm微孔滤膜过滤澄清，过滤后取10ml样品测定微生物限度，再经0.45μm～0.22μm滤膜除菌过滤即为原液，共收获1800ml。除菌过滤时间应控制在4小时内。按照蛋白质浓度9mg/ml/支配制成原液，然后冻干保存。
实施例6稀释配制
取实施例5冻干保存的原液15支分为三组，详见表3。
表3实验分组信息
最终稀释后各组吐温80的体积份数可以为：B-T-1：0.0005％，B-T-2和T-80：0.0025-0.005％，苯酚体积含量0.3％。
在本实施例中：
T-80稀释液配方如下：吐温80浓度0.0025％；PBS，0.01mol/l；pH 7.2～7.4。将实施例5制备的原液按照浓度0.1μg/0.1ml用稀释液配制成成品。
B-T-1稀释液配方如下：吐温80 0.0005％；苯酚防腐剂0.3％；PBS，0.01mol/l；pH7.2～7.4。将实施例5制备的原液按照浓度0.1μg/0.1ml用稀释液配制成成品。
B-T-2稀释液配方如下：吐温80 0.0025％；苯酚防腐剂0.3％；PBS，0.01mol/l；pH7.2～7.4。将实施例5制备的原液按照浓度0.1μg/0.1ml用稀释液配制成成品。
具体工艺为：将冻干品用1％吐温80溶解，室温静置60分钟以上，期间轻微震荡助溶，然后转移至2000ml稀释液，稀释液配方见表4，依据PPD浓度定容在最终体积。然后分装至安瓿瓶1ml/支。
表4稀释液配方
Figure BDA0001904784840000112
Figure BDA0001904784840000121
实施例7稳定性考察
(1)效价测定
BCG-PPD分别按照实施例6T-80所用的稀释液稀释成每1ml含有25μg、12.5μg、5μg、2.5μg，对照品为50IU/ml的PPD，选取体重400～600g豚鼠，用结核杆菌致敏，于豚鼠背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射BCG-PPD0.1ml，测量过敏DTH反应强度，用双盲法分别记录注射后24hr和48hr局部硬结的纵径和横径，计算出平均硬结(纵横直径相加除2)，计算2天的总和，并计算累计值，求其比值。
每个稀释度原液与相应浓度标准品的比值应为0.8-1.2，如不符合上述要求，可调整稀释度后再测定效价，直至符合要求；稀释度的选择应能使原液注射后24hr所产生的局部硬结反应直径为8-25mm，原液与标准品的硬结反应直径大小应相似，且原液和标准品三个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。
(2)稳定性评价
实施例6配制的产品B-T-1、B-T-2和T-80的储存条件为6±2℃及37±2℃，各个规定考察时间点的检测结果详见表5和6。
表5 6±2℃条件下各个时间点的检测结果
表6 37±2℃条件下各个时间点的检测结果
Figure BDA0001904784840000141
通过表5和表6的数据可知，低剂量对照组B-T-1在6±2℃条件下放置24个月pH升高，超过上限，37℃热加速试验，5周和6周时pH上升，超过合格线，而高剂量组均表现了稳定性。

Claims (20)

1.一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，其特征在于，采用吐温对BCG-PPD原液进行分散，分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8%～6%，分散静置时间60分钟-120分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的1%～5%；所述吐温选自吐温20、吐温60或吐温80。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的3%～5%。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述吐温为吐温80。
5.一种提高结核菌素BCG-PPD皮试诊断试剂稳定性的方法，其特征在于，采用吐温对BCG-PPD原液分散后进行稀释和分装，稀释和分散后的溶液中，吐温的最终体积含量为0.0005%-0.005%；采用吐温对BCG-PPD原液分散的分散静置时间为60分钟-120分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，吐温的最终体积含量为0.001%-0.005%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，吐温的最终体积含量为0.002%-0.003%。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，吐温的最终体积含量为0.0025%。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分散所用的吐温的体积为BCG-PPD原液体积的0.8%～6%。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述BCG-PPD原液的制备方法包括菌培、灭活和沉淀；所述菌培具体工艺为：工作种子菌种首先培养发育为干皱成团呈浅黄色的菌苔，菌苔镜检状态为短粗杆菌，微弯曲两端圆；然后再进行2代培养至多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时传代进行3代培养，3代培养至形成多皱微黄的菌膜后进行4代培养8-10周。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述菌培方法具体为：工作种子菌种1代培养2～3周后传代进行2代培养，培养1～2周后传代进行3代培养，培养1～2周后进行4代培养8-10周。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述菌培方法具体为：生产用工作种子菌种溶解后接种于罗氏鸡蛋培养基中，36～38℃中试管倾斜角6～8度，静置培养2～3周，应发育成干皱成团略呈浅黄色的菌苔；挑取菌苔接种苏通马铃薯培养基进行2代菌种培养，36～38℃静置培养1～2周，培养成多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时，挑取生长良好的菌膜接种于苏通综合培养基进行3代菌种培养，36～38℃静置培养1～2周，结核菌悬浮于培养基表面，形成多皱微黄的菌膜；挑选生长良好的菌膜，接种克氏瓶进行4代培养，36～38℃静置培养8-10周。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述灭活的具体工艺为100℃～120℃温度下杀菌30～120分钟。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述灭活的具体工艺为105℃～120℃杀菌30～90分钟。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述灭活的具体工艺为108℃～118℃杀菌40～80分钟。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述灭活的具体工艺为110℃～116℃杀菌40～80分钟。
17.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述沉淀的具体方法为：用终浓度为3～5%的三氯乙酸进行沉淀，沉淀次数不超过5次。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述沉淀的具体方法为：用终浓度为3.5～4.5%的三氯乙酸进行沉淀。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述沉淀的具体方法为：用终浓度为4%的三氯乙酸进行沉淀。
20.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述BCG-PPD发酵原液的制备方法还包括透析和除菌过滤。
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