CN106929480A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，该病毒株具有序列表SEQ NO.2所示的GP5蛋白，或进一步具有序列表SEQ NO.3所示核苷酸序列编码的GP2蛋白和序列表SEQ NO.4所示核苷酸序列编码的Nsp2蛋白。本发明还提供了该病毒株制备的疫苗组合物，本发明制备的疫苗组合物能有效预防新的流行PRRV病毒的感染，能够刺激机体快速地产生免疫力，有效地保护猪群。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用
技术领域
本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒株、其制备的疫苗组合物、制备方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。该病最早发现于美国的北卡罗来纳州(1987年)，此后相继在加拿大(1998年)、德国(1990年)、英国(1991年)发现此病。1992年国际兽医局(OIE)将此病命名为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。我国于1996年也报道了此病的流行，2006年更是爆发了变异的PRRSV引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征，给养猪业造成了巨大的经济损失。
近一年来，多地区流行病学调查发现，有新的PRRSV流行，与以往的流行株相比，其基因序列发生较大改变。而现有的减毒活疫苗在临床上的预防效果不甚理想，灭活疫苗虽然也较早研制出来，其不存在散毒和毒力返强的危险，但对于新的PRRSV预防效果不是很理想，而且，PRRSV经常与其他病原混合感染，造成临床上病情的复杂性，因此，需要研发出针对我国最新流行的毒株的疫苗组合物，以有效防止我国PRRSV相关疾病的流行。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，该猪繁殖与呼吸综合征病毒株制得的疫苗组合物可以对流行野毒株提供有效的免疫保护，显示出显著的免疫特性。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述病毒株具有序列表SEQ NO.2所示的GP5蛋白。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述病毒株具有序列表SEQ NO.2所示的GP5蛋白，序列表SEQ NO.3所示核苷酸序列编码的GP2蛋白和序列表SEQ NO.4所示核苷酸序列编码的Nsp2蛋白。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株，保藏号为CCTCC No.V201540。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗。
本发明的一个方面是提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀。
本发明的一个方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒相关的药物中的应用。
本发明采用目前新的猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株，制备混合疫苗或联合疫苗，具有良好的免疫原性，接种猪只后，能够刺激机体快速地产生免疫力，产生较高的中和抗体水平。本发明的混合疫苗或联合疫苗能够有效地保护流行毒株引起的单感染或混合感染的现象，可以有效地保护猪群抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株引起的相关疾病，提高猪群的生产力。
序列表中：
序列1为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP5蛋白核苷酸序列；
序列2为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP5蛋白氨基酸序列；
序列3为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP2蛋白核苷酸序列；
序列4为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株Nsp2基因核苷酸序列。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述病毒株具有序列表SEQ NO.2所示的GP5蛋白。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述病毒株具有序列表SEQ NO.2所示的GP5蛋白，序列表SEQ NO.3所示核苷酸序列编码的GP2蛋白和序列表SEQ NO.4所示核苷酸序列编码的Nsp2蛋白。
本发明的一个方面在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株，保藏号为CCTCC No.V201540。
猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株(Porcine reproductive andrespiratory Syndrome virus,strain HNjz15)，所述HNjz15株生物保藏号为：CCTCC NO.V201540，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年9月21日。
本发明的一个方面在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原、减毒全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原以及药学上可接受的载体。
“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
“疫苗组合物”系指含有猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫反应。
“减毒全病毒抗原”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。
“灭活全病毒抗原”，也称作灭活疫苗，失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
“亚单位抗原”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反应的可能性小。
“合成肽抗原”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的抗原。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原，所述HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前≥106.0TCID50/ml。
作为本发明的一种优选实施方式；所述HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0～108.0TCID50/ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，所述HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml。
当猪繁殖与呼吸综合征病毒以少于106.0TCID50的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经济的。
本发明的一个方面是提供一种包含猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活抗原的混合疫苗或组合疫苗。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物还包括免疫量的选自下列的抗原或其组合：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪流感抗原。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物还包括免疫量的选自下列的抗原中的一种抗原：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪流感抗原。
作为本发明的一种实施方式，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株。
猪瘟兔化弱毒株购自中国兽医药品监察所。
作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒抗原选自猪伪狂犬病病毒JS-2012株抗原、猪伪狂犬病病毒HeN1株抗原、NVDC-PRV-BJ株抗原、NVDC-PRV-HEB株抗原、NVDC-PRV-SD株抗原、PRV TJ株抗原、猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01抗原、猪伪狂犬病病毒变异株HN1201株抗原、猪伪狂犬病病毒变异株HN1201-R株抗原、猪伪狂犬病病毒变异株HN1202株抗原。
猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7；猪伪狂犬病病毒HeN1株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于中国专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于Pathogenic PseudorabiesVirus,Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.China,2012EmergingInfectious Diseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014；PRV TJ strain(PRV TJ株)，公开于Chun-Hua Wang,Jin Yuan,Hua-Yang Qin，et al，A novel gE-deletedpseudorabies virus(PRV)provides rapid andcomplete protection from lethalchallenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swinepopulation in China.Vaccine 32(2014):3379–3385中；猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCC No.8170，公开于中国专利申请CN103627678A；猪伪狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strainHN1201)保藏号为CCTCC NO.V 201311，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日，公开于中国专利申请CN104004774A；猪伪狂犬病病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)保藏号为CCTCC NO.V201335，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日，公开于中国专利申请CN104328090A。
作为本发明的一种实施方式，所述猪圆环病毒抗原选自猪圆环病毒2型ZJ/H株抗原、猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株抗原、猪圆环病毒2型SD株抗原、猪圆环病毒2型ZJ/C株抗原、猪圆环病毒2型毒株PCV2SD株抗原、猪圆环病毒2型SH株抗原、猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株抗原。
猪圆环病毒2型ZJ/H株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6391，公开于中国专利申请CN102787100A；猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.3064，公开于中国专利申请CN101549155A；猪圆环病毒2型SD株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5774，公开于中国专利申请CN102732486A；猪圆环病毒2型ZJ/C株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201251，公开于中国专利申请CN103285385A；猪圆环病毒2型毒株PCV2SD株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7707，公开于中国专利申请CN103421748A；猪圆环病毒2型SH株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.2389，公开于中国专利申请CN101240264A；猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201312，公开于中国专利申请CN103436498A。
作为本发明的一种实施方式，所述副猪嗜血杆菌抗原选自血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JX1002株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌HN1009株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌YBH04株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌YBH05株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌YBH13株抗原、血清1型副猪嗜血杆菌LC株抗原、血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌FJMH10株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LZ-20100109株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LX-5株抗原、副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原或其组合。
血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014125，公开于中国专利申请CN104498384A；血清5型副猪嗜血杆菌JX1002株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014127，公开于中国专利申请CN104388340A；血清4型副猪嗜血杆菌HN1009株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014126，公开于中国专利申请CN104312964A；血清4型副猪嗜血杆菌YBH04株、血清5型副猪嗜血杆菌YBH05株、血清13型副猪嗜血杆菌YBH13株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号YBH04株为CGMCCNO.5479、YBH05株为CGMCC NO.5480、YBH13株为CGMCCNO.5501，公开于中国专利申请CN102499982A；血清1型副猪嗜血杆菌LC株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5257，公开于中国专利申请CN102399724A；血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014261，公开于中国专利申请CN104450556A；血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014260，公开于中国专利申请CN104450557A；血清13型副猪嗜血杆菌FJMH10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014262，公开于中国专利申请CN104450555A；血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2013094，公开于中国专利申请CN103194413A；血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2013095，公开于中国专利申请CN103194412A；血清5型副猪嗜血杆菌LZ-20100109株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5802，公开于中国专利申请CN102851249A；血清5型副猪嗜血杆菌LX-5株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10230，公开于中国专利申请CN104611274A；副猪嗜血杆菌血清4型JS株、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号4型JS株为CCTCC NO.M2011172、5型ZJ株为CCTCC NO.M2011173、12型HeB株为CCTCC NO.M2011174，公开于中国专利申请CN102908615A。
作为本发明的一种实施方式，所述猪肺炎支原体抗原选自勃林格殷格翰公司的M.hyo、哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne、美国先灵葆雅的Myco西班牙海博莱生物大药厂的J株(喜可舒)、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、梅里亚动物保健公司的猪克喘、南京天邦生物科技有限公司的168株活疫苗、猪肺炎支原体HN0613株抗原。
猪肺炎支原体HN0613株(Mycoplasma hyopneumoniae StrainHN0613)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCC No.M2012230，公开于中国专利申请CN103031258A。
作为本发明的一种实施方式，所述猪流感抗原选自SWHN/YIL/10株抗原、A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)株抗原、A/Swine/Shanxin/D5/2011(H1N1)株抗原、猪流感H1N1LN株抗原、猪流感H3N2HLJ株抗原、H1N1亚型猪流感病毒TJ株抗原、H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株抗原、猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株抗原、猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株抗原或其组合。
所述SWHN/YIL/10株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201223，公开于中国专利申请CN102766604A；所述A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201218，公开于中国专利申请CN102899294A；所述A/Swine/Shanxin/D5/2011(H1N1)株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5323，公开于中国专利申请CN102586196A；所述猪流感H1N1LN株、猪流感H3N2HLJ株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号猪流感H1N1LN株为CGMCC NO.4141、猪流感H3N2HLJ株为CGMCCNO.4142，公开于中国专利申请CN102166352A；所述H1N1亚型猪流感病毒TJ株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201107，公开于中国专利申请CN102747045A；所述H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201308，公开于中国专利申请CN103468647A；所述猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株、猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株为CCTCC NO.V201233、猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株为CCTCCNO.V201234，公开于中国专利申请CN103667196A。
作为本发明的一种实施方式，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株；所述猪伪狂犬病毒抗原为灭活抗原；所述猪圆环病毒抗原为灭活抗原；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活抗原；所述猪肺炎支原体抗原为灭活抗原；所述猪流感抗原为灭活抗原。
作为本发明的一种实施方式，所述猪瘟病毒抗原含量为104.0～106.0TCID50/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原含量为灭活前106.0～107.0TCID50/ml；所述猪圆环病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml；所述副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前108.0～1010.0TCID50/ml；所述猪肺炎支原体抗原含量为灭活前108.0～1010.0MHDCE/ml；所述猪流感抗原含量为灭活前104.0～108.0EID50/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述猪瘟病毒抗原含量为105.0TCID50/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml；所述猪圆环病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml；所述副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前109.0TCID50/ml；所述猪肺炎支原体抗原含量为灭活前109.0MHDCE/ml；所述猪流感抗原含量为灭活前106.0EID50/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中的所述载体为佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐；或MontanideTMGel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为兽医药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。
基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中的所述载体还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。
在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。
本发明的一个方面是提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀。
具体地，所述方法为：(1)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；收获细胞培养物；
(2)用甲醛溶液、BPL(β-丙内酯)或BEI(二乙烯亚胺)处理来自步骤(1)的病毒；
所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感细胞包括但不限于，ST细胞系(ATCC编号：CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号：CCL-22)、牛鼻甲骨细胞BT细胞系(ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号：CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系(如：IBRS-2，见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture：susceptibility of the IB-RS-2swine cell line.ArquivosInstitutoBiologica 31：63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞、PAM细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。
所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。
本发明的一个方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒相关的药物中的应用。
可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。
“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。
“猪繁殖与呼吸综合征”指天然的PRRSV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽、母猪繁殖障碍、仔猪生长缓慢等。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
本发明中所述的“TCID50”(50％tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。
DMEM液体培养基(液)用购自美国Life Technologies公司的DMEM干粉培养基按照其说明书配制。
本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
实施例1病毒的采集分离
从来自河南的疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的样本中分离，无菌采集猪扁桃体淋巴组织，以1∶10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，12000r/min离心15min，收集上清液，再经0.22μm滤膜滤器过滤，在PAM细胞上传代37℃培养1h，换加含2％犊牛血清的DMEM培养液，37℃培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2％犊牛血清的DMEM培养液。采用猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外源病毒的检测猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒(猪伪狂犬病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒、猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品)，PCR检测结果均为阴性，表明毒种纯净。
将分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒命名为HNjz15株，提交保藏。
实施例2分离病毒的遗传特性
通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PAM细胞上分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组做模板，反转录成cDNA，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用Primer Premier 5.0来设计用于扩增GP5、GP2、Nsp2基因的引物序列。
PCR扩增体系如下：模板cDNA1μl，PrimerSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，5×PrimeSTARTM Buffer10μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dNTP Mix(2.5mM each)4μl，并用ddH2O将体积补足50μl。进行两步PCR反应：在98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。通过在含有溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。PCR产物进行序列测定。猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP5核苷酸序列如SEQ NO.1所示，GP2核苷酸序列如SEQ NO.3所示，Nsp2核苷酸序列如SEQ NO.4所示。
表1PCR引物序列
实施例3商品化疫苗对猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的免疫保护试验
将43日龄PRRSV抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组，按照表2注射疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头。商品化活疫苗由猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株制备，病毒含量为106.0TCID50/ml；商品化灭活疫苗由猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株制备，病毒含量为灭活前106.0TCID50/ml。
表2商品化疫苗的免疫保护试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
1 商品化活疫苗 2ml/头
2 商品化灭活疫苗 2ml/头
3 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28日攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株病毒105.0TCID50/头，观察临床症状见表3，攻毒后每日测定仔猪体温。
表3商品化疫苗免疫仔猪后的攻毒情况
表3结果显示，用现有的商品化猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗及灭活疫苗免疫仔猪，均不能完全阻断病毒感染，只能提供部分保护作用，而对照组仔猪攻毒后全部出现临床症状；进一步通过剖检发现，免疫商品化活疫苗和灭活疫苗组剖检后依然存在不同程度的肺病变。
实施例4猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的制备
将实施例1中分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株培养物接种于PAM细胞，按照病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PAM细胞培养物中，置37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
实施例5猪瘟病毒抗原的制备
将长成良好单层的对猪瘟病毒兔化弱毒株高敏感的ST细胞(购自ATCC)用含0.125％胰酶和0.03％EDTA的消化液,进行消化分散，细胞计数后接种细胞培养瓶，加入3％犊牛血清的DMEM细胞培养液，同时按照M.O.I.＝0.1接毒剂量加入种毒,置于37℃温箱中进行培养。培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加含1.5％犊牛血清的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，可连续收毒5次。最后收毒后将各批收毒的抗原混合置于-20℃储藏。
实施例6猪伪狂犬病毒抗原的制备
将猪伪狂犬病病毒HN1201株培养物接种于PK-15细胞培养物先形成种子批，然后按病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PK细胞培养物中，置37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。向病毒液中加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
实施例7猪圆环病毒抗原的制备
将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将PCV2毒种按0.1～0.2TCID50的接种量接种于PK15细胞上，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，36～37℃培养4～7日后收获细胞培养物，冻融2-3次后，收毒，测毒价。将病毒液用中空纤维(0.5μm～2μm)滤柱过滤，除去细胞碎片，再加入0.1％～0.2％的甲醛溶液37℃灭活24h，灭活完全后备用。
实施例8副猪嗜血杆菌抗原的制备
一级种子的繁殖：副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD(TSA为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)平板上，置37℃培养18～24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD(TSB为BD公司生产，NAD为Roche公司生产)液体培养基中，37℃培养12～16小时，作为一级种子；
二级种子的繁殖：取副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株一级种子的培养物，按1％的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作为二级种子；
在TSB培养基中，加入0.01～0.05％NAD、5～10％的小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、0.1～5％的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株菌液(二级种子)按1％的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养16～18小时，当菌液的浓度OD600达到2.5以上、DO值开始上升、pH值降低到6.5以下时停止培养。
活菌计数后按总量的0.2％(V/V)加入37％的甲醛溶液(烟台市双双化工有限公司)，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次，灭活完全后备用。
实施例9猪肺炎支原体抗原的制备
一级种子的繁殖
冻干菌种(HN0613株，保藏编号为CCTCC No.M2012230)，用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7d，作为一级种子。
二级种子的繁殖
取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养7d，作为二级种子。
液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH2O(二次蒸馏水)360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)(10倍浓缩)40ml，0.25％酚红10ml，马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25m1。
固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar(纯化琼脂)即可。
将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液以1:10(v/v)接种于液体培养基中。37℃下培养3～6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。
取检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔3～4h搅拌一次，24h后取出，进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。
实施例10猪流感抗原的制备
将SIV H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株毒种分别按病毒感染复数(multiplicity of infection,M.O.I.)为0.001的接种量分别接种于长满单层的MDCK(购自ATCC，型号为ATCC CCL-34TM)细胞上，37℃吸附30分钟，加入含有3％体积比的犊牛血清和2mM D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM液体培养基(用购自美国Life Technologies公司的D-MEM干粉培养基按照其说明书配制)，置37℃继续培养，每日观察2次，细胞生长良好，72h收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒，用中空纤维(0.5μm～2μm)滤柱(购自GE Healthcare Life Sciences)过滤，除去细胞碎片，再加入0.2％～0.3％的甲醛溶液37℃灭活18h，灭活完全后备用。
实施例11猪繁殖与呼吸综合征病毒混合疫苗的制备
实施例5制备的猪瘟病毒抗原加入耐热保护剂(2wt％明胶水溶液与15wt％乳糖水溶液以1:1(v/v)比例配制)以1:1(v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，即为猪瘟病毒活疫苗。用实施例4制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活抗原缓缓加入到水溶性佐剂gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，使用时用猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗稀释猪瘟病毒活疫苗，两种抗原比例如表4中所示。
分别取实施例4制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、实施例6制备的猪伪狂犬病病毒抗原缓缓加入到水溶性佐剂gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪伪狂犬病病毒二联灭活疫苗。疫苗具体配比见表4。
表4猪繁殖与呼吸综合征病毒混合疫苗成分配比
实施例12猪繁殖与呼吸综合征病毒联合疫苗的制备
分别取实施例4制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、实施例7制备的猪圆环病毒抗原、实施例8制备的副猪嗜血杆菌抗原、实施例9制备的猪肺炎支原体抗原、实施例10制备的猪流感病毒抗原缓缓加入到水溶性佐剂gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪流感的联合灭活疫苗。
疫苗具体配比见表5。
表5猪繁殖与呼吸综合征病毒联合疫苗成分配比
组分 疫苗3 疫苗4 疫苗5 疫苗6
PRRSV抗原(TCID50/ml) 107.0 107.0 107.0 107.0
PCV2抗原(TCID50/ml) 106.0 — — —
4型HPS抗原(CFU/ml) — 109.0 — —
5型HPS抗原(CFU/ml) — 109.0 — —
M.hyo抗原(MHDCE/ml) — — 109.0 —
H1N1亚型SIV抗原(EID50/ml) — — — 106.0
H3N2亚型SIV抗原(EID50/ml) — — — 106.0
gel佐剂(V/V％) 10 10 10 10
实施例13猪繁殖与呼吸综合征病毒混合疫苗的免疫原性试验
实验用健康仔猪40头，分为八组，每组5头。所用的健康仔猪中，猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟及猪伪狂犬病的抗原、抗体都呈双阴性。第1组、第2组免疫实施例11制备的疫苗1；第3组、第4组免疫实施例11制备的疫苗2；第5组、第6组、第7组为攻毒对照组；第8组为阴性对照组。疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗2ml，单次免疫。具体分组情况将表6。
表6猪繁殖与呼吸综合征病毒混合疫苗的免疫原性试验分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
1 疫苗1 2ml/头
2 疫苗1 2ml/头
3 疫苗2 2ml/头
4 疫苗2 2ml/头
5 攻毒对照 —
6 攻毒对照 —
7 攻毒对照 —
8 阴性对照 —
疫苗免疫后28天，第1组、第3组、第5组攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株病毒105.0TCID50/头，第2组、第6组攻毒剂量为猪瘟石门系血毒1ml(105最小致死量)，第4组、第7组攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株猪伪狂犬病病毒2×108.0TCID50/头，观察临床症状见表7。
表7猪繁殖与呼吸综合征病毒混合疫苗的免疫原性试验结果
结果表明，本发明制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒混合疫苗接种实验动物后，对猪繁殖与呼吸综合征流行株的攻击、猪瘟强毒攻击及猪伪狂犬流行株攻击均可产生良好的保护作用，攻毒对照组均发病，表现明显临床症状。
实施例14猪繁殖与呼吸综合征病毒联合疫苗的免疫原性试验
实验用健康仔猪70头，分为14组，每组5头。所用的健康仔猪中，猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体及猪流感的抗原、抗体都呈双阴性。第9组、第10组免疫实施例12制备的疫苗3；第11组、第12组免疫实施例12制备的疫苗4；第13组、第14组免疫实施例12制备的疫苗5；第15组、第16组免疫实施例12制备的疫苗6；第17组、第18组、第19组、第20组、第21组为攻毒对照组；第22组为阴性对照组。疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗2ml，单次免疫。具体分组情况将表8。
表8猪繁殖与呼吸综合征病毒联合疫苗的免疫原性试验分组
疫苗免疫后28天，第9组、第11组、第13组、第15组、第17组攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株病毒105.0TCID50/头，第10组、第18组攻毒剂量为猪圆环病毒SH株2×106.0TCID50/头，第12组、第19组攻毒剂量为副猪嗜血杆菌4型JS株和5型ZJ株混合菌液6×109.0CFU/头，第14组、第20组攻毒剂量为猪肺炎支原体CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，第16组、第21组攻毒剂量为H1N1亚型猪流感病毒ZJS株和H3N2亚型猪流感病毒WX株混合液2ml(106.0EID50/0.1ml),观察临床症状见表9。
表9猪繁殖与呼吸综合征病毒联合疫苗的免疫原性试验结果
结果表明，本发明制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒联合疫苗接种实验动物后，对猪繁殖与呼吸综合征流行株的攻击、猪圆环病毒强毒攻击、副猪嗜血杆菌攻击、猪肺炎支原体攻击及猪流感攻击均可产生良好的保护作用，攻毒对照组均发病，表现明显临床症状及剖检变化，与免疫保护组差异明显。
实施例15猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的制备
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆载体的构建
在生长良好的PAM细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其不同代次的培养物，收获病毒后用TAKARA公司MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取PRRSV基因组RNA，反转录为cDNA，取1μl cDNA作为模板，利用GP5特异性引物(下划线为酶切位点)：
GP5-F(5’-3’):CGCGGATCCTTGGGGAAATGCTTGACCG(BamHI)
GP5-R(5’-3’):CCCAAGCTTCTATGGACGACCCCATTGTTC(HindШ)
进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶HS DNAPolymerase，扩增条件为：98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。PCR产物命名为GP5。其核苷酸序列见SEQ NO.1，推导其氨基酸序列为SEQ NO.2。
PCR扩增GP5基因后，胶回收目的片段后，用BamHI和HindШ分别双酶切胶回收产物和pFastBacTMHTA载体(购自Invitrogen公司，货号10584-027)，37℃反应2h，胶回收酶切片段，将回收的GP5连接到pFastBacTMHTA载体上。酶切体系：10×FD Green Buffer 5μL，DNA/载体1-2μg，FD BamHI2μL，FD HindШ2μL，补ddH2O至50μl，37℃反应1h。于1％琼脂糖凝胶电泳回收载体和目的片段。建立10μL连接体系：10×T4DNA Ligase buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL，载体酶切胶回收产物2μL，目的片段酶切胶回收产物6μL，于22℃连接1h，连接产物转化入DH5α感受态细胞。挑取单克隆进行扩大培养后进行PCR鉴定和测序鉴定，鉴定为阳性的质粒，命名为pFastBacHT-GP5。
2.重组Bacmid的获取及鉴定
pFastBac HT-GP5质粒转化DH10Bac感受态细胞(Invitrogen，货号：10361-012)，pFastBac HT-GP5和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLinkTM HiPure Plasmid DNAMiniprep Kit提取获得的重组质粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鉴定GP5的插入，阳性重组穿梭质粒Bacmid命名为Bacmid-GP5。
3.转染获得重组杆状病毒
按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted ExpressionSystem的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×105个sf9细胞，待细胞贴壁后按照CellfectinⅡ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μl CellfectinⅡ和1μg Bacmid-GP5DNA到100μl SF-900Ⅱ培养基中，激烈振荡混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的CellfectinⅡ(总体积～210μl),混合均匀室温孵育15～30min，逐滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-GP5。P0代重组病毒vBac-GP5以0.1MOI感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-GP5用于重组蛋白表达。
4.重组杆状病毒感染Sf9细胞获得重组蛋白
将P3代重组杆状病毒vBac-GP5接种Sf9细胞。在500ml三角瓶中悬浮培养Sf9细胞，至细胞密度达到7.0×105cell/ml后，按照5MOI的量接种病毒，感染后72h-96h，5000g离心10min，收集细胞沉淀。按5-10ml/克菌体量加入Bind buffer(20Mm磷酸钠、500mM氯化钠、20mM咪唑)重悬细胞沉淀，超声裂解细胞，10000g，离心15min，上清按照GE公司His纯化试剂盒(GE healthcare，货号：28-4013-51)说明书进行。SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为200μg/ml。
实施例16猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5亚单位疫苗的制备
将实施例15制备的亚单位抗原，用PBS液(pH 7.4)稀释至表10的蛋白含量，与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比50:50混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。
表10猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗的制备
组别 蛋白含量(μg/ml) 206佐剂含量(V/V％)
疫苗7 25 50
疫苗8 100 50
实施例17猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5亚单位疫苗的免疫原性试验
将43日龄PRRSV抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组，按照表11的设定注射实施例16制备的疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头。
表11亚单位疫苗免疫原性试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
23 疫苗7 2ml/头
24 疫苗8 2ml/头
25 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28日攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株病毒105.0TCID50/头，观察临床症状见表12，攻毒后每日测定仔猪体温见表13。
表12猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒情况
表13猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位疫苗免疫仔猪攻毒后体温变化
天数 23组 24组 25组
攻毒后1天 39.4 39.5 39.5
攻毒后2天 39.4 39.7 41.4
攻毒后3天 39.6 39.6 41.2
攻毒后4天 39.7 39.6 41.5
攻毒后5天 39.6 39.5 41.4
攻毒后6天 39.5 39.3 41.3
攻毒后7天 39.5 39.6 41.3
表12和表13的结果显示，猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株亚单位疫苗免疫仔猪，能阻断病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后全部出现临床症状，因此，猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株亚单位疫苗具有很好的保护力。
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。

Claims (10)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述病毒株具有序列表SEQNO.2所示的GP5蛋白；优选地，所述病毒株进一步具有序列表SEQ NO.3所示核苷酸序列编码的GP2蛋白和序列表SEQ NO.4所示核苷酸序列编码的Nsp2蛋白。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒株，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株，保藏号为CCTCC No.V201540。
3.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原、减毒全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原以及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原，所述HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前≥106.0TCID50/ml；优选地，所述HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0～108.0TCID50/ml；更优选地，所述HNjz15株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml。
5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括免疫量的选自下列的抗原或其组合：猪瘟病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪流感抗原。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株；
所述猪伪狂犬病毒抗原选自猪伪狂犬病病毒JS-2012株抗原、猪伪狂犬病病毒HeN1株抗原、NVDC-PRV-BJ株抗原、NVDC-PRV-HEB株抗原、NVDC-PRV-SD株抗原、PRV TJ株抗原、猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01抗原、猪伪狂犬病病毒变异株HN1201株抗原、猪伪狂犬病病毒变异株HN1201-R株抗原、猪伪狂犬病病毒变异株HN1202株抗原；
所述猪圆环病毒抗原选自猪圆环病毒2型ZJ/H株抗原、猪圆环病毒Ⅱ型DBN-SX07株抗原、猪圆环病毒2型SD株抗原、猪圆环病毒2型ZJ/C株抗原、猪圆环病毒2型毒株PCV2SD株抗原、猪圆环病毒2型SH株抗原、猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株抗原；
所述副猪嗜血杆菌抗原选自血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JX1002株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌HN1009株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌YBH04株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌YBH05株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌YBH13株抗原、血清1型副猪嗜血杆菌LC株抗原、血清12型副猪嗜血杆菌SHCM10株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株抗原、血清13型副猪嗜血杆菌FJMH10株抗原、血清4型副猪嗜血杆菌FS0307株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LZ-20100109株抗原、血清5型副猪嗜血杆菌LX-5株抗原、副猪嗜血杆菌血清4型JS株抗原、副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株抗原、副猪嗜血杆菌血清12型HeB株抗原或其组合；
所述猪肺炎支原体抗原选自勃林格殷格翰公司的M.hyo、哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne、美国先灵葆雅的Myco西班牙海博莱生物大药厂的J株(喜可舒)、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、梅里亚动物保健公司的猪克喘、南京天邦生物科技有限公司的168株活疫苗、猪肺炎支原体HN0613株抗原；以及
所述猪流感抗原选自SWHN/YIL/10株抗原、A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)株抗原、A/Swine/Shanxin/D5/2011(H1N1)株抗原、猪流感H1N1LN株抗原、猪流感H3N2HLJ株抗原、H1N1亚型猪流感病毒TJ株抗原、H3N2亚型猪流感病毒HuN-1株抗原、猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株抗原、猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株抗原或其组合。
7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株；所述猪伪狂犬病毒抗原为灭活抗原；所述猪圆环病毒抗原为灭活抗原；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活抗原；所述猪肺炎支原体抗原为灭活抗原；所述猪流感抗原为灭活抗原。
8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述猪瘟病毒抗原含量为104.0～106.0TCID50/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原含量为灭活前106.0～107.0TCID50/ml；所述猪圆环病毒抗原含量为灭活前105.0～107.0TCID50/ml；所述副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前108.0～1010.0TCID50/ml；所述猪肺炎支原体抗原含量为灭活前108.0～1010.0MHDCE/ml；所述猪流感抗原含量为灭活前104.0～108.0EID50/ml；优选地，所述猪瘟病毒抗原含量为105.0TCID50/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml；所述猪圆环病毒抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml；所述副猪嗜血杆菌抗原含量为灭活前109.0TCID50/ml；所述猪肺炎支原体抗原含量为灭活前109.0MHDCE/ml；所述猪流感抗原含量为灭活前106.0EID50/ml。
9.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述载体为佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及其他动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐；或MontanideTM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。
10.权利要求3～9任一项所述的疫苗组合物在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107753942A (zh) * 2017-09-30 2018-03-06 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种pcv2、prrsv、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法
CN112458115A (zh) * 2020-10-21 2021-03-09 天津农学院 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用
CN113521271A (zh) * 2021-05-27 2021-10-22 杭州佑本动物疫苗有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1951882A2 (en) * 2005-12-01 2008-08-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acids encoding tgev and prrsv sequences for improved expression of prrsv sequences
US20100267929A1 (en) * 2005-06-24 2010-10-21 Faaberg Kay S PRRS Viruses, Infectious Clones, Mutants Thereof, and Methods of Use
WO2013189004A1 (zh) * 2012-06-20 2013-12-27 Han Jianbao 猪繁殖与呼吸综合征病毒的肽核酸及其应用
CN104388399A (zh) * 2014-08-18 2015-03-04 张澍 一种能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体且具有广谱免疫原性的prrsv减毒株及其疫苗

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100267929A1 (en) * 2005-06-24 2010-10-21 Faaberg Kay S PRRS Viruses, Infectious Clones, Mutants Thereof, and Methods of Use
EP1951882A2 (en) * 2005-12-01 2008-08-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acids encoding tgev and prrsv sequences for improved expression of prrsv sequences
WO2013189004A1 (zh) * 2012-06-20 2013-12-27 Han Jianbao 猪繁殖与呼吸综合征病毒的肽核酸及其应用
CN104388399A (zh) * 2014-08-18 2015-03-04 张澍 一种能诱导猪体较早产生干扰素和中和抗体且具有广谱免疫原性的prrsv减毒株及其疫苗

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107753942A (zh) * 2017-09-30 2018-03-06 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种pcv2、prrsv、猪肺炎支原体三联灭活疫苗制备方法
CN112458115A (zh) * 2020-10-21 2021-03-09 天津农学院 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用
CN112458115B (zh) * 2020-10-21 2022-06-07 天津农学院 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用
CN113521271A (zh) * 2021-05-27 2021-10-22 杭州佑本动物疫苗有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗及制备方法

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