CN112458115B - 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PRRSV GP5片段、表位预测序列GRE及PRV gB基因三联表位基因重组真核表达质粒pEGFP‑GRE‑GP5gB，其构建步骤如下：⑴GRE基因序列的设计与合成，PRV gB基因的偏好性密码子优化；⑵构建重组穿梭载体pEGFP‑GRE‑GP5gB；⑶在Marc145及PK15细胞中转染重组质粒pEGFP‑GRE‑GP5gB，能表达目的蛋白，即得重组真核表达质粒pEGFP‑GRE‑GP5gB。本发明旨在构建可以预防针对多株PRRSV，同时可以预防PRV的重组真核质粒，为畜牧业两种疾病的防治提供一定的试验依据。
Description
技术领域
本发明属于基因生物工程技术领域，尤其是一种PRRSV GP5片段、表位预测序列GRE 及PRV gB基因三联表位基因重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)和猪伪狂犬病(PR)一直困扰着我国养猪业的健康发展。PRRSV是畜牧业中广泛发生的一种猪病毒病，隐性感染亦可造成免疫抑制从而引起继发感染。猪繁殖与呼吸障碍综合征PRRS破坏生猪免疫系统的完整性，进而引起其他疾病继发感染，猪伪狂犬PR能够引起妊娠母猪流产、死胎，初生仔猪的大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞、公猪不育等症状，亦是危害全球养猪业的重大传染病之一。
PRRSV变异性较大，传统疫苗作用不甚理想。表位疫苗具有安全性好、保护力强和应答类型可调控等优点，可以通过在细胞内持续表达抗原的表位多肽，从而激活体内的特异性免疫细胞。GP5蛋白是一种是糖基化的囊膜蛋白，含有多个抗原表位，gB蛋白是PRV中最保守的蛋白，能介导病毒在细胞间的传播，诱导动物体内产生补体依赖和补体非依赖两种中和抗体。
目前，畜牧业上能够预防多株PRRSV的基因工程疫苗尚未见报道。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种PRRSV GP5片段、表位预测序列GRE及PRV gB基因三联表位基因重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种PRRSV GP5片段、表位预测序列GRE及PRV gB基因三联表位基因重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB，其构建步骤如下：
⑴GRE基因序列的设计与合成，PRV gB基因的偏好性密码子优化；
⑵构建重组穿梭载体pEGFP-GRE-GP5gB；
⑶在Marc145及PK15细胞中转染重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB，能表达目的蛋白，即得重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB。
而且，其构建步骤如下：
⑴生物信息学分析并筛选出PRRSV GP5蛋白序列的保守区域，获得具备免疫原性的 PRRSV GP5重组表位基因序列，优化获得适合哺乳动物细胞表达的GRE基因序列；
⑵GRE-GP5gB基因的PCR扩增：以SEQ ID NO.3序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ IDNO.11：GRE-GP5gB基因序列；
⑶重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB，转染Marc145及PK15细胞能表达目的蛋白，即得重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB。
而且，其构建步骤如下：
⑴首先针对NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a： AAK44216.1；JXA1：ABL60902.1；NADC30：AFP43978.1；VR2332：ABU87666.1；JL580：AKZ66195.1；NADC30 Like：AHB29375.1；通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段保守区作为目的区域，NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a：AAK44216.1；JXA1：ABL60902.1；NADC30：AFP43978.1；VR2332：ABU87666.1；JL580：AKZ66195.1；NADC30 Like： AHB29375.1；通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段保守区作为目的区域，对所筛选的保守区域进行B cell、Th cell及CTL cell 表位预测；根据预测所得结果选择B cell评分最高的两个表位片段、Th cell及CTL cell评分最高的一个表位片段的序列，通过刚性连接肽连接，串联序列末端添加His标签使其能够纯化表达，最终序列命名为GRE序列，即GP5 RecombinantEpitopes sequence，并通过生物信息学软件对GRE序列的二级结构、跨膜结构域及亲水性进行分析；PRV保守，gB基因选取文献中已预测出的片段GI：AEM63980.1；以SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.2序列扩增SEQ ID NO.7：GP5基因序列；以SEQ ID NO.3序列、SEQ ID NO.4序列扩增SEQ ID NO.8：GRE 基因序列：以SEQ ID NO.5序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.9：gB基因序列：以SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.10：GP5gB基因序列；以SEQ ID NO.3序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.11：GRE-GP5gB基因序列；
⑵分别构建重组穿梭质粒PMD-GP5、PMD-GRE、PMD-gB、PMD-GP5gB、PMD-GRE- -GP5gB，双酶切验证后对产物进行胶回收，T4连接酶过夜链接产物至真核表达载体 pEGFP-N1，重组真核表达质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、 pEGFP-GRE-GP5gB；将重组真核表达质粒运用冷热交替法导入感受态细胞XL-10Glod；
⑶重组真核表达质粒成功转染Marc145和PK15细胞，通过RT-PCR及WesternBlotting 验证其在细胞水平的表达情况，合格即得重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB。
而且，所述步骤⑴中AEM63980.1为231aa。
而且，所述步骤⑵的具体步骤为：按照天根无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取质粒，将重组穿梭质粒PMD-GP5、PMD-GRE、PMD-gB、PMD-GP5gB、PMD-GRE-GP5gB，经双酶切验证后对产物进行胶回收，T4连接酶过夜链接产物至真核表达载体pEGFP-N1，重组真核表达质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB；将重组真核表达质粒运用冷热交替法导入感受态细胞XL-10Glod，构建重组感受态细胞XL/ pEGFP-GP5、XL/pEGFP-GRE、XL/pEGFP-gB、XL/pEGFP-GP5gB以及XL/ pEGFP-GRE-GP5gB。
如上所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在大鼠免疫水平评价方面中的应用。
如上所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在作为畜牧业上能够预防多株PRRSV 的基因工程疫苗方面中的应用。
如上所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在构建能够预防针对多株PRRSV且时能够预防PRV的三联表位预测疫苗方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、PRRSV变异程度较高，目前畜牧业上能预防多株PRRSV且预防PRV的基因工程疫苗未见报道，本发明通过重组pEGFP-GRE-GP5gB真核质粒，能促进动物产生免疫应答，为我国畜牧业PRRSV及PRV的预防提供策略。
2、本发明涉及猪繁殖与和呼吸障碍综合征(PRRSV)GP5蛋白的优势B/T细胞表位的预测与设计合成，及和猪伪狂犬病(PRV)gB基因构建重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB，具体说，是一种利用生物信息学获得PRRSV GP5基因表位预测序列(GRE)与PRV gB基因片段真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用。本发明旨在构建可以预防针对多株PRRSV，同时可以预防PRV的重组真核质粒，为畜牧业两种疾病的防治提供一定的试验依据。
3、本发明公开了猪繁殖与呼吸障碍综合征GP5片段表位预测序列GRE及猪伪狂犬病 PRVgB基因三联表位基因重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB及其应用。猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)是全世界养猪业很常见的一种病毒性传染病，可导致不同年龄、品种的猪被感染，主要表现为厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产以及产死胎等症状，给全球养猪产业造成了极为严重的经济损失。猪伪狂犬病(PR)是一种由猪伪狂犬病病毒(PRV)所引起的猪急性传染病，该病在猪群中呈暴发性流行状态，能够引起妊娠母猪流产、死胎，初生仔猪的大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞，公猪不育等症状，亦是危害全球养猪业的重大传染病之一。本发明从NCBI查找到我国流行的6株PRRSV GP5蛋白序列，进行同源性比较，确定较长的保守区域，通过ABCpred Prediction Server；BepiPred 2.0Server；MHC Class-IBinding Peptide Prediction Server；MHC Class-II Binding Peptide PredictionServer分别预测获得每种蛋白的2个优势B细胞表位，1个优势CTL细胞表位和1个优势Th细胞表位，将所得优势表位进行连接获得GRE序列。GeneBank上得到PRV gB序列并进行哺乳动物细胞偏好性密码子优化，构建含有目的基因片段的pMD-18T载体；酶切及测序鉴定后，将GRE与GP5gB 基因克隆到真核表达质粒pEGFP-N1上；利用LipoFiterTM脂质体转染法将重组真核质粒 pEGFP-GRE-GP5gB转染至Marc145及PK15细胞；利用荧光显微法、RT-PCR法和Western Blotting法检测目的蛋白在Marc145及PK15细胞中的表达。将pEGFP-GRE-GP5gB对分娩后一周内的SD大鼠进行免疫，并评价其效果。
附图说明
图1为本发明中6株PRRSV GP5蛋白同源性比较及保守区筛选图；
图2为本发明中GP5保守区域片段特异性验证图；
图3为本发明中PCR扩增目的基因片段图；其中，M：DNAMarker，1：GP5 gene，2： GREgene，3：gB gene，4：GP5gB gene，5：GRE-GP5gB gene；
图4为本发明中重组质粒双酶切结果图；其中，M：DNAMarker，1：GP5 gene，2：GREgene，3：gB gene，4：GP5gB gene，5：GRE-GP5gB gene；
图5为本发明中重组质粒转染Marc145细胞结果图；
图6为本发明中重组质粒转染PK15细胞结果图；
图7为本发明中RT-PCR检测目的基因在细胞中的表达情况图；其中，M：DNAMarker， 1：GP5 gene，2：GRE gene，3：gB gene，4：GP5gB gene，5：GRE-GP5gB gene；
图8为本发明中重组质粒在Marc145及PK15细胞中的蛋白表达情况图；
图9为本发明中重组质粒免疫大鼠后对各脏器的影响图；
图10为本发明中淋巴细胞分型流式结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种PRRSV GP5片段、表位预测序列GRE及PRV gB基因三联表位基因重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB，其构建步骤如下：
⑴GRE基因序列的设计与合成，PRV gB基因的偏好性密码子优化；
⑵构建重组穿梭载体pEGFP-GRE-GP5gB；
⑶在Marc145及PK15细胞中转染重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB，能表达目的蛋白，即得重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB。
较优地，其构建步骤如下：
⑴生物信息学分析并筛选出PRRSV GP5蛋白序列的保守区域，获得具备免疫原性的 PRRSV GP5重组表位基因序列，优化获得适合哺乳动物细胞表达的GRE基因序列；
⑵GRE-GP5gB基因的PCR扩增：以SEQ ID NO.3序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ IDNO.11：GRE-GP5gB基因序列；
⑶重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB，转染Marc145及PK15细胞能表达目的蛋白，即得重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB。
较优地，其构建步骤如下：
⑴首先针对NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a： AAK44216.1；JXA1：ABL60902.1；NADC30：AFP43978.1；VR2332：ABU87666.1；JL580：AKZ66195.1；NADC30 Like：AHB29375.1；通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段保守区作为目的区域，NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a：AAK44216.1；JXA1：ABL60902.1；NADC30：AFP43978.1；VR2332：ABU87666.1；JL580：AKZ66195.1；NADC30 Like： AHB29375.1；通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段保守区作为目的区域，对所筛选的保守区域进行B cell、Th cell及CTL cell 表位预测；根据预测所得结果选择B cell评分最高的两个表位片段、Th cell及CTL cell评分最高的一个表位片段的序列，通过刚性连接肽连接，串联序列末端添加His标签使其能够纯化表达，最终序列命名为GRE序列，即GP5 RecombinantEpitopes sequence，并通过生物信息学软件对GRE序列的二级结构、跨膜结构域及亲水性进行分析；PRV保守，gB基因选取文献中已预测出的片段GI：AEM63980.1；以SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.2序列扩增SEQ ID NO.7：GP5基因序列；以SEQ ID NO.3序列、SEQ ID NO.4序列扩增SEQ ID NO.8：GRE 基因序列：以SEQ ID NO.5序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.9：gB基因序列：以SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.10：GP5gB基因序列；以SEQ ID NO.3序列、SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.11：GRE-GP5gB基因序列；
⑵分别构建重组穿梭质粒PMD-GP5、PMD-GRE、PMD-gB、PMD-GP5gB、PMD-GRE- -GP5gB，双酶切验证后对产物进行胶回收，T4连接酶过夜链接产物至真核表达载体 pEGFP-N1，重组真核表达质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、 pEGFP-GRE-GP5gB；将重组真核表达质粒运用冷热交替法导入感受态细胞XL-10Glod；
⑶重组真核表达质粒成功转染Marc145和PK15细胞，通过RT-PCR及WesternBlotting 验证其在细胞水平的表达情况，合格即得重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB。
较优地，所述步骤⑴中AEM63980.1为231aa。
较优地，所述步骤⑵的具体步骤为：按照天根无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取质粒，将重组穿梭质粒PMD-GP5、PMD-GRE、PMD-gB、PMD-GP5gB、PMD-GRE-GP5gB，经双酶切验证后对产物进行胶回收，T4连接酶过夜链接产物至真核表达载体pEGFP-N1，重组真核表达质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB；将重组真核表达质粒运用冷热交替法导入感受态细胞XL-10Glod，构建重组感受态细胞XL/ pEGFP-GP5、XL/pEGFP-GRE、XL/pEGFP-gB、XL/pEGFP-GP5gB以及XL/pEGFP-GRE-GP5gB (重点保护重组感受态细胞pEGFP-GRE-GP5gB)。
如上所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB能够应用在大鼠免疫水平评价方面中。
如上所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在作为畜牧业上能够预防多株PRRSV 的基因工程疫苗方面中的应用。
如上所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在构建能够预防针对多株PRRSV且时能够应用在预防PRV的三联表位预测疫苗方面中。
具体地，相关制备及检测如下：
本发明GRE基因和GP5、gB基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB，其制备包括以下步骤：
1)GRE基因序列的设计与合成，gB基因的偏好性密码子优化；
2)构建重组穿梭载体pEGFP-GRE-GP5gB；
3)在Marc145及PK15细胞中转染重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB；
4)重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB免疫大鼠，评价其免疫效果。
具体包括步骤如下：
1)首先针对NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a: AAK44216.1；JXA1:ABL60902.1；NADC30:AFP43978.1；VR2332:ABU87666.1；JL580:AKZ66195.1；NADC30 Like:AHB29375.1。如图1所示，通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段较长的保守区作为目的区域NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a:AAK44216.1； JXA1:ABL60902.1；NADC30:AFP43978.1；VR2332:ABU87666.1；JL580:AKZ66195.1； NADC30 Like:AHB29375.1。通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段较长的保守区作为目的区域，对所筛选的保守区域进行B cell、Thcell及CTL cell表位预测。根据预测所得结果选择评分较高的序列通过刚性连接肽连接，串联序列末端添加His标签使其能够纯化表达，最终序列命名为GRE序列(GP5RecombinantEpitopes sequence)，并通过生物信息学软件对GRE序列的二级结构、跨膜结构域及亲水性进行分析。PRV较保守，gB基因选取文献中已预测出的含有较多表位的片段GI: AEM63980.1(231aa)；以F1(GP5)SEQ ID NO.1序列及R1(GP5)SEQ ID NO.2序列扩增SEQID NO.7：GP5基因序列(98bp)；以F2(GRE)SEQ ID NO.3序列及R2(GRE)SEQ ID NO.4序列扩增SEQ ID NO.8：GRE基因序列(260bp)；以F3(gB)SEQ ID NO.5序列及 R3(gB)SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.9：gB基因序列(716bp)；以F4(GP5gB)SEQ ID NO.1序列及R4(GP5gB)SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.10：GP5gB基因序列(794bp)；以F5(GRE-GP5gB)SEQ IDNO.3序列及R5(GRE-GP5gB)SEQ ID NO.6序列扩增SEQ ID NO.11：GRE-GP5gB基因序列(1091bp)。
2)分别构建重组穿梭质粒PMD-GP5、PMD-GRE、PMD-gB、PMD-GP5-gB、 PMD-GRE-GP5gB，双酶切验证后对产物进行胶回收，T4连接酶过夜链接产物至真核表达载体pEGFP-N1，重组真核表达质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5-gB、 pEGFP-GRE-GP5gB；将重组真核表达质粒运用“冷热交替法”导入感受态细胞XL-10Glod；
3)重组真核表达质粒成功转染Marc145和PK15细胞，通过RT-PCR及WesternBlotting 验证其在细胞水平的表达情况；
4)动物试验：提取重组质粒，隔周肌肉免疫质粒100μg，每次免疫后两周进行断尾采血，共免疫5次，对照组注射PBS。通过流式细胞术试验对大鼠外周血CD3+、CD4+及CD8+细胞分群进行检测。
也就是说：设计GRE基因序列，将GP5、gB经偏好性密码子优化后由T-2A剪切肽相连，合成并连接至到pMD-18T上；经酶切及测序鉴定后与真核表达载体pEGFP-GRE-GP5gB连接；利用LipoFiterTM脂质体转染法将重组真核质粒pEGFP-GRE-GP5gB转染Marc145及PK15细胞；用荧光显微法、RT-PCR法和Western Blotting法检测目的蛋白在Marc145及PK15细胞中的表达。将pEGFP-GRE-GP5gB对分娩后一周内的SD大鼠进行免疫，并评价其效果。
下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
1材料与方法
1.1 GRE序列的设计与合成
利用生物信息学软件ABCPred、BepiPred 2.0对B细胞表位进行预测，选择评分较高的2 个作为B细胞表位预测结果；利用MHC ClassⅠBinding Peptide Prediction Server预测细胞毒性T细胞表位，选择HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205五种预测类型，综合预测结果确定CTL细胞最佳预测方案；利用ProPred.MHCⅡBindingPeptide Prediction Server预测辅助性T细胞表位，选择DRB1-0101、DRB1-0102和DRB1-0301三种预测类型，综合预测结果选择最优方案作为Th细胞预测结果。
将上述获得的B细胞及T细胞表位序列串联，相同类型细胞间表位连接选择短肽GPGPG，促进其二、三级结构的形成，不同类型细胞间的表位连接选择刚性短肽GPLS，借此增强B细胞和T细胞表位各自的独立性，构建合成GP5重组表位预测序列(GP5 RecombinantEpitopes Sequence，GRE)。
1.2重组质粒PMD-GRE-GP5gB的鉴定
分别用限制性内切酶Bgl II和Hind III进行双酶切；利用限制性内切酶HindIII和EcoR Ⅰ分别对质粒PMD-GRE-GP5gB和pEGFP-N1进行双酶切，酶切反应体系见表1。
表1 酶切反应体系
表2 T4连接酶连接体系
表3 本发明中所使用的引物
注：“—”为引物保护性序列；斜体为酶切位点。
1.3 pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB的制备与鉴定
表4 PCR反应体系
注：反应程序：95℃，预变性5min；{95℃，30s；60℃，30s；73℃，1min}35个循环；73℃延伸15min。4℃保存备用。
反应结束后，利用1.0％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳，检测目的片段。需做5个 PCR体系，分别为pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB和 pEGFP-GRE-GP5gB。
1.4重组质粒免疫大鼠
将56只大鼠随机分为7组，每组8只，体重200±20g，适应性喂养1周。正常饲料喂养，均自由采食及饮水。实验前随机分为7组，分别为pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB及pEGFP-N1组，PBS组作为对照组。
1.5流式细胞术检验重组质粒对大鼠CD3+、CD4+、CD8+水平的影响
取大鼠外周血500μL，使用红细胞裂解液进行裂解，离心收集白细胞；使用淋巴细胞标记抗体CD3+、CD4+、CD8+与细胞结合，经处理后置于流式管中，使用流式细胞仪及进行分选检测。
2结果与分析
2.1原核表达质粒PMD-GRE-GP5gB PCR结果
经PCR试验验证，结果得到与目的片段大小相符的条带。表明重组质粒pMD-GP5、pMD-GRE、pMD-gB、pMD-GP5gB、pMD-GRE-GP5gB构建成功，可以用于下一步试验。
从NCBI上筛选出6株PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列，登录号分别为：CH-1a:AAK44216.1；JXA1:ABL60902.1；NADC30:AFP43978.1；VR2332:ABU87666.1；JL580:AKZ66195.1；NADC30 Like:AHB29375.1。通过生物信息学软件Clustal X 2.0对6株病毒的GP5蛋白氨基酸序列进行同源性比较，获得一段较长的保守区作为目的区域。如图1所示。
使用NCBI中Protein Blast在线工具对筛选到的GP5目的片段进行特异性验证，结果如图2所示，结果显示，该目的片段为PRRSV GP5特异性蛋白，可以作为表位预测目的片段。
将目的片段的三种表位进行预测后的结果，按照评分标准高低进行选择和组合(表5)，不同表位序列之间加入连接肽，序列末端添加His标签便于后续蛋白纯化和表达，最终所得 GRE预测序列为FPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGPLSVIFPVLTHIVSYGALTTSHFLDTVGPGPGFVIFPVLTHIVSYGALTTHHHHHH。
表5 GP5保守区B细胞及T细胞表位预测结果
注：B细胞及T细胞表位预测结果依照评分高低排序
2.2重组真核质粒pEGFP-GRE-GP5gB PCR、双酶切结果
经PCR、双酶切试验，如图3、图4所示，图3是使用原核表达质粒PMD-18T扩增GP5(98bp)、GRE(260bp)、gB(716bp)、GP5gB(794bp)及GRE-GP5gB(1091bp)的基因，图4是双酶切试验，结果得到与目的片段大小相符的条带。表明重组质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB构建成功，可以用于下一步试验。
2.3重组真核质粒转染Marc145及PK15细胞
用重组真核质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB及pEGFP-N1转染Marc145及PK15细胞，荧光显微镜下通过蓝光激发，可看到细胞中绿色荧光蛋白得到表达，12h时开始表达荧光，随时间推移荧光强度逐渐加大并于48h时荧光表达最强，结果表明pEGFP-N1(图5、图6)，pEGFP-GP5(图5、图6)、 pEGFP-GRE(图5、图6)、pEGFP-gB(图5、图6)、pEGFP-GP5gB(图5、图6)、pEGFP-GRE -GP5gB(图5、图6)各重组质粒均成功在两种细胞中表达。
图6是用重组真核质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、 pEGFP-GRE-GP5gB及pEGFP-N1转染PK15细胞，荧光显微镜下通过蓝光激发，可看到细胞中绿色荧光蛋白，48h荧光表达最强，结果表明，pEGFP-N1，pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、 pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB各重组质粒均成功在细胞中表达。
2.4 RT-PCR检验重组质粒在Marc145及PK15细胞中的表达情况
经pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB转染48 h后的Marc145细胞，提取总RNA，按照逆转录试剂盒逆转录为cDNA后，分别利用F1/R1， F2/R2为引物，PCR扩增目的基因。pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、 pEGFP-GRE-GP5gB重组质粒在Marc145及PK15细胞中转录，并成功表达(图7)。
2.5 Western Blotting检测重组质粒在Marc145及PK15细胞中的表达情况
Western Blotting法检测经重组质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、 pEGFP-GRE-GP5gB转染的Marc145细胞与PK15细胞中与GFP融合表达的GP5蛋白、GRE蛋白、gB蛋白、GP5gB蛋白、GRE-GP5gB蛋白以及GFP蛋白表达情况，各组均在29kDa 处出现特异性条带，与预期GFP融合表达的目标蛋白分子质量大小相当(图8)。表明 pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB在转染组，融合蛋白GP5蛋白、GRE蛋白、gB蛋白、GP5gB蛋白、GRE-GP5gB蛋白和GFP蛋白成功得到表达。
2.6大鼠脏器切片检测结果
取大鼠心脏、肾、肺、肝脏、脾脏，制备病理组织切片，显微镜下观察拍照记录。试验结束后处死大鼠，摘取心脏、肾、肺、肝脏、脾脏。通过观察，pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、 pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB、pEGFP-N1及PBS各试验组，未见明显的病理变化(图9)。
2.7流式细胞术检验重组质粒对大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+水平的影响
大鼠五免后，流式细胞试验结果如表6和图10所示，pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB及pEGFP-N1免疫组CD3+CD4+细胞所占 CD3+细胞的比例较对照组有不同程度的升高，均显著高于PBS组，pEGFP-GRE-GP5gB达到最高，pEGFP-gB仅低于pEGFP-GRE-GP5gB；CD3+CD8+占比较对照组显著降低(P<0.05)， CD3+CD4+/CD3+CD8+比值可以得出pEGFP-GRE-GP5gB组、pEGFP-GRE组极显著高于PBS 组(P<0.01)，重组质粒疫苗能够显著激发大鼠增加免疫力。
表6 淋巴细胞分型实验结果
3结论
1)本发明通过生物信息学在线软件分析，获得了具备良好免疫原性的PRRSV重组表位基因序列，针对偏好性密码子进行优化后，获得了适合哺乳动物细胞表达的GRE基因序列。
2)成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB，并重组了感受态细胞pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、 pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB。
3)重组真核质粒转染Marc145及PK15细胞均能成功表达荧光，经RT-PCR及WesternBlotting试验证明目的蛋白成功表达。
4)重组质粒免疫大鼠后，对大鼠的生长状态及脏器无显著影响，疫苗安全性较高，经淋巴细胞分型试验结果，试验质粒疫苗能够显著激发大鼠免疫力的增加，pEGFP-GRE-GP5gB 组、pEGFP-GRE组CD3+CD4+/CD3+CD8+比值极显著高于PBS组(P<0.01)。
5)本发明的创新之处在于，PRRSV变异程度较高，传统疫苗无法有效地控制该病，首次设计了畜牧业上能够预防多株PRRSV的基因工程疫苗，本发明旨在构建可以预防针对多株PRRSV，同时可以预防PRV的三联表位预测疫苗，为畜牧业两种疾病的防治提供一定的参考依据。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物1(Unknown)
<400> 1
ggatcttcca gagatgaatt cgccaccatg ttcgt 35
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物2(Unknown)
<400> 2
ctgccgttcg acgatggatc ccggacggtg tcg 33
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物3(Unknown)
<400> 3
ggatcttcca gagatgaatt cgccaccatg ttccc 35
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物4(Unknown)
<400> 4
ctgccgttcg acgatggatc ccggtggtgg tgg 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物5(Unknown)
<400> 5
ggatcttcca gagatgaatt cgccaccatg gcc 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物6(Unknown)
<400> 6
ctgccgttcg acgatggatc ccgggcctcc acc 33
<210> 7
<211> 98
<212> DNA
<213> GP5基因(Unknown)
<400> 7
gaattcgcca ccatgttcgt gatcttccct gtgctgaccc acatcgtgtc ttacggcgct 60
ctcacaacca gccacttcct cgacaccgtc cgggatcc 98
<210> 8
<211> 260
<212> DNA
<213> GRE基因(Unknown)
<400> 8
gaattcgcca ccatgttccc agtgctgacc cacatcgtca gctacggcgc tctcacaacc 60
tctcacttcc tcgacacagt cggccctctc agcgtgatct tccctgtgct cacccacatc 120
gtgtcttacg gagccctgac aacaagccac ttcctggaca ccgtcggacc tggccccgga 180
ttcgtcatct tcccagtgct gacccacatc gtgtcctacg gcgccctgac aacacaccac 240
caccaccacc accgggatcc 260
<210> 9
<211> 716
<212> DNA
<213> gB基因(Unknown)
<400> 9
gaattcgcca ccatggccgc tgtgaccaga gctgcttcag cttccccagc tcccggcacc 60
ggcgccaccc cagacggctt ctctaccgag gagtctctcg aagagatcga cggcgccgtg 120
tcccctggcc ctagcgacgc tcctgacggc gagtacggcg acctcgacgc taggacagcc 180
gtgagagctg ctgctaccga gcgggacaga ttctacgtgt gccctcctcc atctggctct 240
acagtggtga gactagagcc tgagcaggct tgccctgagt actctcaggg cagaaacttc 300
accgagggca tcgccgtgct gttcaaggag aacatcgctc ctcacaagtt caaggcccac 360
atctactaca agaacgtgat cgtgacaaca gtgtggtctg gcagcacata cgccgctatc 420
accaaccgct tcaccgaccg ggtgccagtg cctgtgcagg agatcaccga cgtgatcgac 480
agaagaggca agtgcgtgtc taaggctgag tacgtgcgga acaaccacaa ggtgacagct 540
ttcgacaggg acgagaaccc agtggaggtg gacctgcggc catccagact caacgctctg 600
ggcactcgcg gctggcacac aaccaacgac acatacacaa agatcggcgc cgctggcttc 660
taccacacag gcacctctgt gaactgcatc gtggaggagg tggaggcccg ggatcc 716
<210> 10
<211> 794
<212> DNA
<213> GP5gB基因(Unknown)
<400> 10
gaattcgcca ccatgttcgt gatcttccct gtgctgaccc acatcgtgtc ttacggcgct 60
ctcacaacca gccacttcct cgacaccgtc atggccgctg tgaccagagc tgcttcagct 120
tccccagctc ccggcaccgg cgccacccca gacggcttct ctaccgagga gtctctcgaa 180
gagatcgacg gcgccgtgtc ccctggccct agcgacgctc ctgacggcga gtacggcgac 240
ctcgacgcta ggacagccgt gagagctgct gctaccgagc gggacagatt ctacgtgtgc 300
cctcctccat ctggctctac agtggtgaga ctagagcctg agcaggcttg ccctgagtac 360
tctcagggca gaaacttcac cgagggcatc gccgtgctgt tcaaggagaa catcgctcct 420
cacaagttca aggcccacat ctactacaag aacgtgatcg tgacaacagt gtggtctggc 480
agcacatacg ccgctatcac caaccgcttc accgaccggg tgccagtgcc tgtgcaggag 540
atcaccgacg tgatcgacag aagaggcaag tgcgtgtcta aggctgagta cgtgcggaac 600
aaccacaagg tgacagcttt cgacagggac gagaacccag tggaggtgga cctgcggcca 660
tccagactca acgctctggg cactcgcggc tggcacacaa ccaacgacac atacacaaag 720
atcggcgccg ctggcttcta ccacacaggc acctctgtga actgcatcgt ggaggaggtg 780
gaggcccggg atcc 794
<210> 11
<211> 1091
<212> DNA
<213> GRE-GP5gB基因(Unknown)
<400> 11
gaattcgcca ccatgttccc agtgctgacc cacatcgtca gctacggcgc tctcacaacc 60
tctcacttcc tcgacacagt cggccctctc agcgtgatct tccctgtgct cacccacatc 120
gtgtcttacg gagccctgac aacaagccac ttcctggaca ccgtcggacc tggccccgga 180
ttcgtcatct tcccagtgct gacccacatc gtgtcctacg gcgccctgac aacacaccac 240
caccaccacc acggctccgg cgagggcaga ggctctctgc tgacatgcgg cgacgtggag 300
gagaaccctg gcccattcgt gatcttccct gtgctgaccc acatcgtgtc ttacggcgct 360
ctcacaacca gccacttcct cgacaccgtc gccgctgtga ccagagctgc ttcagcttcc 420
ccagctcccg gcaccggcgc caccccagac ggcttctcta ccgaggagtc tctcgaagag 480
atcgacggcg ccgtgtcccc tggccctagc gacgctcctg acggcgagta cggcgacctc 540
gacgctagga cagccgtgag agctgctgct accgagcggg acagattcta cgtgtgccct 600
cctccatctg gctctacagt ggtgagacta gagcctgagc aggcttgccc tgagtactct 660
cagggcagaa acttcaccga gggcatcgcc gtgctgttca aggagaacat cgctcctcac 720
aagttcaagg cccacatcta ctacaagaac gtgatcgtga caacagtgtg gtctggcagc 780
acatacgccg ctatcaccaa ccgcttcacc gaccgggtgc cagtgcctgt gcaggagatc 840
accgacgtga tcgacagaag aggcaagtgc gtgtctaagg ctgagtacgt gcggaacaac 900
cacaaggtga cagctttcga cagggacgag aacccagtgg aggtggacct gcggccatcc 960
agactcaacg ctctgggcac tcgcggctgg cacacaacca acgacacata cacaaagatc 1020
ggcgccgctg gcttctacca cacaggcacc tctgtgaact gcatcgtgga ggaggtggag 1080
gcccgggatc c 1091
Claims (3)
1.一种重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB，其特征在于：所述重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB是将SEQ ID NO.11所示GRE-GP5gB基因序列构建到pEGFP载体上获得。
2.如权利要求1所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在构建畜牧业上能够预防多株猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRSV）的基因工程疫苗方面中的应用。
3.如权利要求1所述的重组真核表达质粒pEGFP-GRE-GP5gB在构建能够预防针对多株猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRSV）且同时能够预防猪伪狂犬病（PRV）的疫苗方面中的应用。
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