CN113736825B - 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113736825B
CN113736825B CN202111049664.3A CN202111049664A CN113736825B CN 113736825 B CN113736825 B CN 113736825B CN 202111049664 A CN202111049664 A CN 202111049664A CN 113736825 B CN113736825 B CN 113736825B
Authority
CN
China
Prior art keywords
delta
pmt
fusion protein
e2fc
appv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111049664.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113736825A (zh
Inventor
钱平
李祥敏
任旭皎
陈焕春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202111049664.3A priority Critical patent/CN113736825B/zh
Publication of CN113736825A publication Critical patent/CN113736825A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113736825B publication Critical patent/CN113736825B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
    • C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用，属于疫苗技术领域。本发明提供的表达猪非典型瘟病毒E2Fc和E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系S2‑aE2Fc或S2‑aE2ΔFc能够用于制备亚单位疫苗，免疫仔猪后能够产生较强的针对猪非典型瘟病毒的特异性免疫反应。利用本发明所述重组果蝇细胞系S2‑aE2Fc和S2‑aE2ΔFc能够获得二聚体形态的aE2蛋白抗原，制备的亚单位疫苗能够激起机体产生更强的体液免疫和细胞免疫反应，可作为一种很有前景的候选基因工程疫苗预防猪非典型瘟病毒引起的仔猪先天性震颤。

Description

一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用。
背景技术
仔猪先天性震颤(Congenital tremor，CT)俗称“仔猪抖抖病”，是发生于新生仔猪的一种神经系统性疾病。发病仔猪由于中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的低髓鞘化而表现出头部和四肢的颤抖、阵发性痉挛等临床症状。严重病例可能伴发共济失调而导致仔猪吮乳能力下降，进一步因饥饿和初乳摄入不足而死亡。1922年，Kinsley等在美国首次对这种综合征进行描述[1]。在一群猪中爆发了一种不明原因引起的疾病，发病仔猪头部摇晃、四肢颤抖，看起来像是在跳舞，因此被称为“跳舞猪疾病”。此后，该病在欧洲、亚洲等一些国家相继报道，提示其具有全球性[2]。2015年，Hause等通过宏基因组测序，在美国猪群的血清中检测到了一种新病毒，命名为猪非典型瘟病毒(Atypical porcinepestivirus，APPV)[3]。随后的研究表明APPV可能是引发仔猪先天性震颤的病原体[4]。虽然在CT感染仔猪中，通过宏基因组测序检测到了其它一些病毒，如星状病毒(Astrovirus)、LINDA病毒(Lateral-shaking inducing neurodegenerative agent virus)、猪捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)和猪圆环病毒样病毒P1，但是只有APPV在世界范围内得到证明[5-7]。APPV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)病毒，基因组由一条单股正链RNA组成，全长约为11kb，其ORF由3635个氨基酸组成，编码一个多聚蛋白，并被宿主和病毒相应的蛋白酶裂解为4个结构蛋白(C、Erns、E1和E2)8个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[3]。E2蛋白是瘟病毒属病毒中的主要抗原蛋白[8,9]，能够诱导机体产生保护性中和抗体，因此是亚单位疫苗开发的主要靶标。
IgGFc片段可作为一种疫苗分子佐剂，显著刺激机体产生粘膜免疫应答、细胞免疫应答以及体液免疫应答[9]。此外，IgGFc融合蛋白可通过Fc铰链区的二硫键链接形成稳定的二聚体，增加蛋白的稳定性和半衰期[10]。因此，IgGFc片段是一种有效的分子佐剂，在疫苗开发中具有重要的价值。
目前尚无可用的疫苗来防控APPV的感染。因此，开发一种安全有效的APPV疫苗对于仔猪先天性震颤的防控至关重要。
参考文献
1.Kinsley,A.T.,Dancing pigs？.VeterinaryMedicine 1922,17,123.
2.Arruda,B.L.；Arruda,P.H.；Magstadt,D.R.；Schwartz,K.J.；Dohlman,T.；Schleining,J.A.；Patterson,A.R.；Visek,C.A.；Victoria,J.G.,Identification of aDivergent Lineage Porcine Pestivirus in Nursing Piglets with CongenitalTremors and Reproduction of Disease following Experimental Inoculation.PloSone 2016,11,(2),e0150104.
3.Hause,B.M.；Collin,E.A.；Peddireddi,L.；Yuan,F.；Chen,Z.；Hesse,R.A.；Gauger,P.C.；Clement,T.；Fang,Y.；Anderson,G.,Discovery of a novel putativeatypical porcine pestivirus in pigs in the USA.The Journal of generalvirology 2015,96,(10),2994-8.
4.de Groof,A.；Deijs,M.；Guelen,L.；van Grinsven,L.；van Os-Galdos,L.；Vogels,W.；Derks,C.；Cruijsen,T.；Geurts,V.；Vrijenhoek,M.；Suijskens,J.；vanDoorn,P.；van Leengoed,L.；Schrier,C.；van der Hoek,L.,Atypical PorcinePestivirus:A Possible Cause ofCongenital Tremor Type A-II inNewbornPiglets.Viruses 2016,8,(10).
5.Possatti,F.；Headley,S.A.；Leme,R.A.；Dall Agnol,A.M.；Zotti,E.；deOliveira,T.E.S.；Alfieri,A.F.；Alfieri,A.A.,Viruses associated with congenitaltremor and high lethality in piglets.Transboundary and emerging diseases2018,65,(2),331-337.
6.Schwarz,L.；Riedel,C.；S.；Sinn,L.J.；Voglmayr,T.；/>B.；Dinhopl,N.；Rebel-Bauder,B.；/>H.；Ladinig,A.；Rümenapf,T.；Lamp,B.,Congenital infection with atypical porcine pestivirus(APPV)is associated withdisease and viral persistence.Veterinary research 2017,48,(1),1.
7.Wen,L.；Mao,A.；Jiao,F.；Zhang,D.；Xie,J.；He,K.,Evidence of porcinecircovirus-like virus P1 in piglets with an unusual congenitaltremor.Transboundary and emerging diseases 2018,65,(2),e501-e504.
8.Zhang,H.；Wen,W.；Hao,G.；Chen,H.；Qian,P.；Li,X.,A Subunit VaccineBased on E2 Protein of Atypical Porcine Pestivirus Induces Th2-type ImmuneResponse in Mice.Viruses 2018,10,(12).
9.Li,J.；Li,X.；Ma,H.；Ren,X.；Hao,G.；Zhang,H.；Zhao,Z.；Fang,K.；Li,X.；Rong,Z.；Sun,S.；Chen,H.；Qian,P.,Efficient mucosal vaccination of a novelclassical swine fever virus E2-Fc fusion protein mediated by neonatal Fcreceptor.Vaccine 2020,38,(29),4574-4583.
10.Mackness,B.C.；Jaworski,J.A.；Boudanova,E.；Park,A.；Valente,D.；Mauriac,C.；Pasquier,O.；Schmidt,T.；Kabiri,M.；Kandira,A.；Kabiri,M.；Kandira,A.；Qiu,H.,Antibody Fc engineering for enhanced neonatal Fc receptor bindingandprolonged circulationhalf-life.MAbs 2019,11,(7),1276-1288.
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法，可表达稳定的二聚体形态，制备的亚单位疫苗能够激起机体产生更强的体液免疫和细胞免疫反应，可作为一种很有前景的候选基因工程疫苗预防猪非典型瘟病毒引起的仔猪先天性震颤，具有较高的临床应用价值，
本发明提供了一种表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系的制备方法，包括以下步骤：
1)使用引物对pMT-E2-F/E2-Fc’-R，以pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，PCR扩增得到包含IgG3Fc 5’端部分序列的E2-Fc’片段；
2)人工合成猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列，并保留猪源IgG3Fc蛋白的二聚体交互位点和受体结合位点，得到IgG3ΔFc核苷酸序列；
3)使用引物对E2’-Fc-F/pMT-Fc-R，分别步骤2)中IgG3Fc或IgG3ΔFc为模板，PCR扩增得到包含E23’端部分序列的E2’-Fc或E2’-ΔFc片段；
4)以步骤1)中所述E2-Fc’片段与步骤3)中所述E2’-Fc或E2’-ΔFc片段为模板进行重叠PCR，得到的重叠PCR扩增产物为APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段；
5)将果蝇细胞表达质粒pMT-Bip-V5-HisA和APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段用EcoRI/Xho I限制性内切酶进行双酶切，连接，得到pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc；
6)将所述pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc与潮霉素抗性质粒共同转染果蝇细胞系，经筛选，得到表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系；
所述步骤1)与步骤2)～3)之间没有时间顺序限制。
优选的，步骤1)中pMT-E2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述E2-Fc’-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，步骤1)中PCR扩增的反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。
优选的，步骤2)中猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
IgG3ΔFc核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，步骤1)中所述pMT-E2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述E2-Fc’-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，步骤3)中E2’-Fc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
pMT-Fc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明提供了所述制备方法制备得到的表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系。
本发明提供了一种具有猪非典型瘟病毒免疫原性的融合蛋白，由所述重组果蝇细胞系表达得到的E2Fc融合蛋白或E2ΔFc融合蛋白；
所述E2Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述E2ΔFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明提供了所述重组果蝇细胞系或所述融合蛋白在制备预防仔猪先天性震颤的疫苗中的应用。
本发明提供了一种预防仔猪先天性震颤的疫苗，包括所述融合蛋白和佐剂。
本发明提供的表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系的制备方法，本发明使用表达质粒为pMT-Bip-V5-HisA，其本身含有果蝇Bip信号肽序列，极大提升了外源基因的分泌表达能力；此外，本发制备的重组果蝇细胞系相较于其他昆虫细胞表达系统，如Sf9等，无需杆状病毒感染，为稳转细胞系，能够持续高效稳定表达E2Fc或E2ΔFc融合蛋白，且表达的外源蛋白具有复杂的翻译后修饰，更接近蛋白的天然状态。
本发明提供的表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系S2-aE2Fc或S2-aE2ΔFc在制备猪非典型瘟病毒的亚单位疫苗的应用。本发明免疫仔猪后能够产生较强的针对猪非典型瘟病毒的特异性免疫反应。本发明所述方法中，在aE2蛋白的基础上，融合有猪IgG3Fc片段和仅保留IgG3Fc片段的二聚体交互位点和受体结合位点的截断体，获得的融合蛋白S2-aE2Fc和S2-aE2ΔFc能形成稳定的二聚体形态，制备的亚单位疫苗能够激起机体产生更强的体液免疫和细胞免疫反应，可作为一种很有前景的候选基因工程疫苗预防猪非典型瘟病毒引起的仔猪先天性震颤，具有较高的临床应用价值。
附图说明
图1为图1为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白的结构示意图；
图2重组质粒酶切鉴定图；其中，(A)pMT-Bip-aE2重组质粒的双酶切鉴定结果图；M：DL5000 DNAMarker，1：EcoR I/Xho I双酶切产物；(B)pMT-Bip-aE2Fc重组质粒的双酶切鉴定结果图；M：DL5000 DNAMarker，1：EcoR I/Xho I双酶切产物；
(C)pMT-Bip-aE2ΔFc重组质粒的双酶切鉴定结果图；M：DL5000 DNA Marker，1：EcoR I/Xho I双酶切产物；
图3为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白筛选的Westernblotting鉴定结果图；M：蛋白分子质量标准；
图4为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白纯化结果图；其中，(A)为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白Westernblotting鉴定结果图；M：蛋白分子质量标准；
(B)APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白SDS-PAGE鉴定结果图；M：蛋白分子质量标准；
图5为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白二聚体的表征图；其中(A)为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白变性与非变性SDS-PAGE鉴定结果图；M：蛋白分子质量标准；(B)为APPV E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白变性与非变性Westernblotting鉴定结果图；M：蛋白分子质量标准；
图6为仔猪免疫后不同时间点的APPV特异性抗体水平检测结果；
图7为仔猪免疫后42天外周血淋巴细胞增殖试验结果；
图8为疫苗免疫仔猪诱导细胞因子水平检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系的制备方法，包括以下步骤：
1)使用引物对pMT-E2-F/E2-Fc’-R，以pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，PCR扩增得到包含IgG3Fc 5’端部分序列的E2-Fc’片段；
2)人工合成猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列，并保留猪源IgG3Fc蛋白的二聚体交互位点和受体结合位点，得到IgG3ΔFc核苷酸序列；
3)使用引物对E2’-Fc-F/pMT-Fc-R，分别步骤2)中IgG3Fc或IgG3ΔFc为模板，PCR扩增得到包含E23’端部分序列的E2’-Fc或E2’-ΔFc片段；
4)以步骤1)中所述E2-Fc’片段与步骤3)中所述E2’-Fc或E2’-ΔFc片段为模板进行重叠PCR，得到的重叠PCR扩增产物为APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段；
5)将果蝇细胞表达质粒pMT-Bip-V5-HisA和APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段用EcoRI/Xho I限制性内切酶进行双酶切，连接，得到pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc；
6)将所述pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc与潮霉素抗性质粒共同转染果蝇细胞系，经筛选，得到表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系；
所述步骤1)与步骤2)～3)之间没有时间顺序限制。
本发明使用引物对pMT-E2-F/E2-Fc’-R，以pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，PCR扩增得到包含IgG3Fc 5’端部分序列的E2-Fc’片段。
在本发明中，pMT-E2-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6所示；所述E2-Fc’-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8所示。所述PCR扩增的反应程序优选为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。所述pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒在现有技术(Zhang,H.；Wen,W.；Hao,G.；Chen,H.；Qian,P.；Li,X.,ASubunit Vaccine Based on E2 Protein of Atypical Porcine Pestivirus InducesTh2-type Immune Response in Mice.Viruses 2018,10,(12).)中报道。
本发明人工合成猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列，并保留猪源IgG3Fc蛋白的二聚体交互位点和受体结合位点，得到IgG3ΔFc核苷酸序列。
在本发明中，猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。IgG3ΔFc核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。本发明对所述人工合成的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工合成基因片段的方法即可。
获得IgG3Fc或IgG3ΔFc后，本发明使用引物对E2’-Fc-F/pMT-Fc-R，分别步骤2)中IgG3Fc或IgG3ΔFc为模板，PCR扩增得到包含E23’端部分序列的E2’-Fc或E2’-ΔFc片段。
在本发明中，E2’-Fc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；pMT-Fc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。所述PCR扩增的反应程序优选为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。
得到E2-Fc’片段、E2’-Fc或E2’-ΔFc片段后，本发明以所述E2-Fc’片段与所述E2’-Fc或E2’-ΔFc片段为模板进行重叠PCR，得到的重叠PCR扩增产物为APPV E2Fc或APPVE2ΔFc片段。
在本发明中，重叠PCR扩增用引物对优选为pMT-E2-F/pMT-Fc-R。PCR反应优选为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。
得到APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段后，本发明将果蝇细胞表达质粒pMT-Bip-V5-HisA和APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段用EcoR I/Xho I限制性内切酶进行双酶切，连接，得到pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc。
在本发明中，所述双酶切条件优选为：37℃酶切3h。所述双酶切的体系优选为50μL，具体包括以下组分：EcoR I 2.5μL、Xho I 2.5μL、10×H Buffer 5μL、E2Fc或E2ΔFcpMT-Bip-V5-HisA 30μL、灭菌超纯水10μL。所述连接用酶优选为T4 DNA连接酶。所述连接的反应条件优选为16℃连接6h。连接后优选进行转化入大肠杆菌中培养，挑取阳性转化子，提取质粒测序，得到目标片段的质粒为成功插入外源片段的重组载体pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc。
得到pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc后，本发明将所述pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc与潮霉素抗性质粒共同转染果蝇细胞系，经筛选，得到表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系。
在本发明中，所述潮霉素抗性质粒优选为pCoHygro。本发明对所述共同转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的共同转染的方法即可。所述筛选优选采用潮霉素B进行筛选。所述潮霉素B的终浓度为0.5mg/mL。所述筛选的次数优选为4～5轮。筛选后，优选将筛选获得的细胞系进行诱导表达培养。所述诱导表达培养中优选采用CuSO4完成，所述CuSO4终浓度优选为0.5mmol/L。诱导表达后优选采用Westernblotting鉴定蛋白。鉴定得到表达目标蛋白的细胞系后进行扩大培养，所述扩大培养优选至细胞密度生长至2×107cells/mL时，进行细胞冻存。
本发明提供了所述制备方法制备得到的表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系。所述重组果蝇细胞系表达E2Fc和E2ΔFc蛋白。
本发明提供了一种具有猪非典型瘟病毒免疫原性的融合蛋白，由所述重组果蝇细胞系表达得到的E2Fc融合蛋白或E2ΔFc融合蛋白；所述E2Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:4所示；所述E2ΔFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在本发明中，所述融合蛋白的获得方法，优选如下：将扩大培养的重组果蝇细胞系经过诱导表达后，分离上清液，纯化，浓缩，获得融合蛋白。所述纯化方法优选将所述上清液与镍介质4℃结合过夜。然后使用NGC Quest10层析系统(BIO-RAD，USA)对结合在镍介质上的APPV E2Fc和E2ΔFc蛋白进行洗脱纯化。所述浓缩优选将洗脱的蛋白用超滤管浓缩。所述超滤管的过滤规格优选为30kDa。经过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定可知，E2与IgG3Fc或IgG3ΔFc融合表达的蛋白，在二硫键的作用下形成了稳定的二聚体形态。
本发明提供了所述重组果蝇细胞系或所述融合蛋白在制备预防仔猪先天性震颤的疫苗中的应用。
在本发明中，所述仔猪先天性震颤优选由猪非典型瘟病毒引起。
所述疫苗的制备方法，优选包括以下步骤：
从扩大培养的重组果蝇细胞系经过诱导培养，分离上清液，纯化，浓缩得到融合蛋白，将所述融合蛋白与佐剂混合乳化，得到疫苗。
所述疫苗中，所述融合蛋白的浓度优选为35～45μg/mL，更优选为40μg/mL。本发明对所述佐剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的佐剂即可，例如ISA201VG佐剂。
本发明提供了一种预防仔猪先天性震颤的疫苗，包括所述融合蛋白和佐剂。
在本发明中，所述疫苗按照上述制备方法获得，在此不做赘述。所述疫苗属于亚单位疫苗，具有较高免疫安全性。采用所述疫苗免疫动物后，以aE2蛋白制备的疫苗作为对照，结果表明，aE2和aE2ΔFc免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组(p<0.05)，而aE2Fc免疫组与PBS组差异不显著(p>0.05)，说明APPV E2蛋白和aE2ΔFc融合蛋白均能增强T细胞的增殖和激活。此外，细胞因子水平检测结果表明，aE2ΔFc能够诱导更强的细胞免疫应答，且为Th2型主导的细胞免疫反应。
下面结合实施例对本发明提供的一种表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
表达APPV E2、APPV E2Fc和APPV E2ΔFc蛋白重组质粒的构建方法
1、APPV E2、APPV E2Fc和APPV E2ΔFc的PCR扩增
(1)APPV E2序列的扩增
根据APPV_GX-CH 2016株(GenBank accession no.：KY652092)的基因组序列设计E2特异性引物对pMT-E2-F/pMT-E2-R，以实验室保存的pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，扩增删除跨膜区的序列，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
具体的引物序列如表1所示(下划线代表EcoR I/Xho I酶切位点，加粗序列为6×His，斜体表示GS Linker序列)。
表1序列扩增的引物序列
PCR反应体系如表2所示。
表2APPV E2蛋白的编码基因扩增体系
PCR反应参数为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。
将步骤(1)得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳。然后，使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收获得的APPV E2片段(SEQ IDNO:1)保存于4℃备用。
(2)APPV E2Fc和APPV E2ΔFc序列的扩增
人工合成猪源IgG3Fc蛋白(GenBank accession no.：AK405781.1)的核苷酸序列，对猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列进行保守结构域分析，保留其二聚体交互位点和受体结合位点，得到IgG3ΔFc核苷酸序列。使用表1中的引物对pMT-E2-F/E2-Fc’-R，以pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，PCR扩增得到包含IgG3Fc 5’端部分序列的E2-Fc’片段；使用表1中的引物对E2’-Fc-F/pMT-Fc-R，分别以合成的IgG3Fc和IgG3ΔFc为模板，PCR扩增得到包含E23’端部分序列的E2’-Fc和E2’-ΔFc片段。
E2-Fc’片段PCR反应体系见表3。
表3E2-Fc’片段PCR反应体系
PCR反应参数为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃充分延伸10min。
E2’-Fc或E2’-ΔFc片段PCR反应体系见表4。
表4E2’-Fc或E2’-ΔFc片段PCR反应体系
PCR反应参数为：98℃预变性5min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃充分延伸10min。
将步骤(2)得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳。然后，使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，以回收获得的E2-Fc’、E2’-Fc和E2’-ΔFc片段为模板，进行Overlap PCR，反应体系见表5。
表5重叠PCR扩增的反应体系
PCR反应参数为：98℃预变性5min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸90s，35个循环；72℃充分延伸10min。
将Overlap PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳。然后，使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收获得的APPV E2Fc和APPV E2ΔFc片段保存于4℃备用。
2、重组质粒pMT-Bip-aE2、pMT-Bip-aE2Fc和pMT-Bip-aE2ΔFc的构建方法
(1)酶切连接试验
将步骤1中得到的APPV E2、APPV E2Fc和APPV E2ΔFc片段，以及果蝇细胞表达质粒pMT-Bip-V5-HisA(Invitrogen，USA)，用EcoR I/Xho I限制性内切酶进行双酶切，酶切条件为：37℃酶切3h，酶切体系见表6。
表6双酶切体系
使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒，回收酶切产物，再将回收产物进行连接反应。连接反应条件为：16℃连接6h，连接反应体系见表7。
表7连接反应体系
将以上连接反应的产物转化至DH5α感受态细胞，在含有氨苄的LB固体培养基上培养12h，挑选阳性菌落接种于含有氨苄的LB液体培养基中，37℃摇床180r/min培养12～14h后，提取质粒，然后进行双酶切鉴定。
其结果如图2所示，质粒送北京擎科生物科技有限公司测序。测序正确的重组质粒分别命名为：pMT-Bip-aE2、pMT-Bip-aE2Fc和pMT-Bip-aE2ΔFc。
实施例2
表达APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白的重组果蝇细胞系的构建方法
1、pMT-Bip-aE2/aE2Fc/aE2ΔFc与pCoHygro共转染试验
(1)转染前一天，将S2细胞接种至6孔板中(1.0×106cells/mL)，27℃静置培养让其充分贴壁；
(2)配制A液：重组质粒4μg+0.2μg潮霉素B抗性质粒(pCoHygro，淼灵生物)，加入无抗培养基(SF-SFM，苏州沃美生物)至100μL；配制B液：转染试剂(Cellfectin II Reagent，ThermoFisher)10μL+无抗培养基90μL；
(3)静置5min，将B加入A中混匀，静置30min(轻弹瞬离混匀一次)，加入800μL无抗培养基混匀；
(4)弃掉6孔板中旧培养基，加入上述1mL混合液，27℃静置培养6-8h；
(5)更换2mL含10％FBS和1％L-谷氨酰胺和1％双抗的完全培养基，27℃静置培养。
2、稳转细胞系的筛选
(1)24h后加入潮霉素B(终浓度为0.5mg/mL)进行加压筛选，4～5d后更换新的完全培基，并加入潮霉素B(终浓度为0.5mg/mL)进行筛选，如此筛选4～5轮；
(2)筛选4轮后，取1mL细胞到新的6孔板中，加入CuSO4(终浓度为0.5mmol/L)进行诱导表达，同时在旧板中补加培养基和潮霉素B继续进行加压筛选；
(3)诱导表达4d后进行Western blotting鉴定(图3)，鉴定蛋白表达后，将旧板中的培养基更换为新的无血清的培养基，并逐步扩大培养至500mL摇瓶中，待细胞密度生长至2×107cells/mL时，进行细胞冻存，最终保存于液氮罐中。
3、表达APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白的重组果蝇细胞系的鉴定
(1)Westernblotting检测APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白的表达
将筛选获得的稳定表达猪非典型瘟病毒E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系扩大培养至500mL摇瓶中，待细胞密度生长至4×106cells/mL时，加入CuSO4(终浓度为0.5mmol/L)进行诱导表达，诱导表达4d后，取40μL上清样品进行Western blotting检测。SDS-PAGE跑胶后，转入PVDF膜，以His标签鼠源单抗为一抗(MBL公司)，HRP标记的羊抗鼠IgG(武汉博士德生物)为二抗，通过ECL显示液检测APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白表达。结果如附图4中A所示，构建的S2细胞系分泌表达APPV E2、E2Fc和E2ΔFc至培养基上清中。
(2)SDS-PAGE检测纯化的APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白
将筛选获得的稳定表达猪非典型瘟病毒E2蛋白、E2Fc和E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系扩大培养至500mL摇瓶中，待细胞密度生长至4×106cells/mL时，加入CuSO4(终浓度为0.5mmol/L)进行诱导表达，诱导表达4d后，4℃、10000r/min离心10min收集细胞上清，0.22μm滤器过滤上清后，与镍介质4℃结合过夜。然后使用NGC Quest 10层析系统(BIO-RAD，USA)对结合在镍介质上的APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白进行洗脱纯化。将洗脱的蛋白用30kDa大小的超滤管进行浓缩后，再选取20μL样品进行SDS-PAGE检测，结果如附图4中B所示，在目标大小处出现一条特异性条带。
(3)APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白二聚体鉴定
取双份40μL重组果蝇细胞系诱导表达样品，一份加入β-Mercaptoethanol变性剂，另一份不加β-Mercaptoethanol。然后参照以上步骤进行SDS-PAGE和Westernblotting鉴定.
结果如图5所示，E2Fc和E2ΔFc蛋白未加变性剂的条带大小约为加有变性剂条带的2倍，而E2蛋白两者条带大小一致，说明了E2与IgG3Fc/IgG3ΔFc融合表达的蛋白，在二硫键的作用下形成了稳定的二聚体形态。
实施例3
APPV E2、E2Fc和E2ΔFc亚单位疫苗的制备
按照实施例2中方法进行APPV E2、E2Fc和E2ΔFc蛋白的大量表达与纯化，用BCA法对蛋白进行定量，然后与ISA 201VG佐剂以1:1(ω/ο/ω)的比例进行乳化，浓度为40μg/mL。制备好的亚单位疫苗经无菌检测后于4℃保存备用。
实施例4
APPV E2、E2Fc和E2ΔFc亚单位疫苗的仔猪免疫试验
1、免疫程序
选取20只7周龄断奶仔猪，使用基于E2蛋白的间接ELISA检测方法，检测仔猪免疫前的血清抗体水平，以确定无APPV特异性抗体。将仔猪分为4组，每组5只。A组(E2+ISA201VG)；B组(E2Fc+ISA 201VG)；C组(E2ΔFc+ISA 201VG)；D(PBS)。肌肉注射接种疫苗，免疫剂量为80μg/头份。首免后2周，用相同剂量的疫苗进行加强免疫一次。分别采集免疫后第0天、14天、28天和42天血液样品(抗凝血和血清)，运用ELISA检测血清中抗E2蛋白抗体水平，并检测相关细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10)表达情况，比较各亚单位疫苗的免疫原性。
2、基于E2蛋白的间接ELISA检测仔猪血清抗体水平
(1)最佳抗原包被浓度及血清稀释比的确定
采用ELISA方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释比例。抗原稀释比例为0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/mL；血清稀释比例为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800。每个稀释度重复3次。当阳性血清的OD450平均值接近1.0且P/N值最大时，所对应值即为最佳抗原包被浓度及血清稀释度。结果测定的最佳抗原包被浓度为2μg/mL、最佳血清稀释度为1:3200。
(2)APPV E2特异性抗体检测
通过间接ELISA方法检测仔猪免疫后不同时间点血清中APPV特异性抗体滴度，以评估E2Fc或E2ΔFc亚单位疫苗是否可以有效促进仔猪体液免疫应答。以2μg/mL纯化的APPVE2蛋白包被ELISA板，4℃包被过夜。5％BSA 37℃封闭1h，PBST洗涤3次(5min/次)后每孔加入稀释后的待检血清100μL(1:3200)，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后每孔加入稀释后的HRP标记的山羊抗猪IgG二抗100μL(1:10000)(武汉安特捷生物技术有限公司)。PBST洗涤3次，加入TMB底物显色液100μL(北京索莱宝科技有限公司)，室温显色20min。每孔加入2mol/LH2SO4终止溶液50μL终止反应，测定OD450值。
结果如附图6所示，免疫后28天，血清抗体水平显著上升，并且aE2ΔFc免疫组显著高于aE2Fc和aE2组(p<0.05)。在免疫后42天，血清抗体水平达到最高值，且aE2ΔFc免疫组略高于aE2Fc和aE2组，差异不显著(p>0.05)。而PBS对照组没有检测到相应的抗体。以上结果表明本发明所述重组果蝇细胞系表达蛋白所制备的亚单位疫苗能够有效诱导机体产生APPV特异性抗体。并且E2Fc或E2ΔFc的二聚体形态能够更加有效地促进仔猪产生体液免疫应答。
3、细胞免疫反应检测
(1)外周血淋巴细胞增殖试验
为了评价T淋巴细胞的增殖情况，采集各组免疫猪42dpi时的抗凝血(10mL)，运用猪外周血淋巴细胞分离液KIT(天津灏洋生物)分离外周血淋巴细胞。将分离得到的淋巴细胞接种至96孔板中，并用100μL含有10％FBS的RPMI 1640培养基进行培养。以10μg/mL纯化的APPV E2蛋白作为刺激原，进行淋巴细胞增殖试验。同时设置刀豆素(阳性对照)和培养基(阴性对照)组，每组设3个重复。37℃培养72h后，运用CCK-8试剂盒(MedChemExpress，USA)进行细胞增殖检测，并按照式I计算刺激指数。
刺激指数(SI)＝(免疫组OD-空白组OD)/(阴性对照组OD-空白组OD)式I。
结果如附图7所示，aE2和aE2ΔFc免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组(p<0.05)，而aE2Fc免疫组与PBS组差异不显著(p>0.05)，说明了APPV E2蛋白能增强T细胞的增殖和激活。
(2)细胞因子水平检测
将分离得到的外周血淋巴细胞，并用含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬。将细胞密度调整至4×106cells/mL并接种至24孔板中，其中含有10μg/mL纯化的E2蛋白。37℃培养48h后，取细胞培养上清，用猪干扰素ELISA试剂盒(IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10)(欣博盛生物科技)检测细胞因子，并根据标准曲线算出不同细胞因子的浓度。
结果如附图8所示，IFN-γ和IL-2(Th1型细胞因子)和IL-4和IL-10(Th2型细胞因子)水平显著高于阴性对照组(p<0.05)，且aE2ΔFc组中的IL-10水平均显著高于其它细胞因子(p<0.05)。结果表明，aE2ΔFc能够诱导更强的细胞免疫应答，且为Th2型主导的细胞免疫反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 685
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggaattct tcatgccaca aaagagaaga ctattacaat ctccagttag ttgtcgaaga 60
aaagacaggc gtagaaaaac ggtccataat gggcaagtgg gctgtgataa ccggagaagg 120
tcgggaacca aaactaatgg agcaaataaa catagtgtca aatggcagcc tgtcagaaac 180
ttactgctat aatacgctaa atactagcat ttggaggcgg caaccggcaa gacagagagg 240
gtgtggtcag actgtgccct attggcccgg tgacaatgtt ttagaagaac agtattatag 300
ctcaggctac tgggtgaatg cgacgggcgg ttgccagctg agagaaggcg tatggctgtc 360
aagaaagggc aatgtacagt gccaacgcaa tggctcatcc ttgatactgc aattggcgat 420
aaaagaagag aatgacacta tggaaatacc atgtgacccg gtggaaacag aaagcatggg 480
tccagtcgca cagggcactt gcgtgtacag ctgggcattt gccccaaggg ggtggtacta 540
taacaggaaa gatggttact ggctccagta tataaagaaa aacgactacc agtactggac 600
aaaaatgcct accgtctcat ccgctgcaac gatgtaccgt catggatcgg gctctcatca 660
ccatcaccat cactgactcg aggtc 685
<210> 2
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatcgaac cccccacacc catctgtccc gaaatttgct catgcccagc tgcagaggtc 60
ctgggagcac cgtcggtctt cctcttccct ccaaaaccca aggacatcct catgatctcc 120
cggacaccca aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaggaggc tgaagtccag 180
ttctcctggt acgtggacgg cgtacagttg tacacggccc agacgaggcc aatggaggag 240
cagttcaaca gcacctaccg cgtggtcagc gtcctgccca tccagcacca ggactggctg 300
aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac aacaaagacc tcctttcccc catcacgagg 360
accatctcca aggctacagg gccgagccgg gtgccgcagg tgtacaccct gcccccagcc 420
tgggaagagc tgtccaagag caaagtcagc ataacctgcc tggtcactgg cttctaccca 480
cctgacatcg atgtcgagtg gcagagcaac ggacaacaag agccagaggg caattaccgc 540
accaccccgc cccagcagga cgtggatggg acctacttcc tgtacagcaa gctcgcggtg 600
gacaaggtca ggtggcagcg tggagaccta ttccagtgtg cggtgatgca cgaggctctg 660
cacaaccact acacccagaa gtccatctcc aagactcagg gtaaa 705
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacatcgaac cccccacacc catctgtccc gaaatttgct catgcccagc tccgcaggtg 60
tacaccctgc ccccagcctg ggaagagctg tccaagagca aagtcagcat aacctgcctg 120
gtcactggct tctacccacc tgacatcgat gtcgagtggc agagcaacgg acaacaagag 180
ccagagggca attaccgcac caccccgccc cagcaggacg tggatgggac ctacttcctg 240
tacagcaagc tcgcggtgga caaggtcagg tggcagcgtg gagacctatt ccagtgtgcg 300
gtgatgcacg aggctctgca caaccactac acccagaagt ccatctccaa gactcagggt 360
aaa 363
<210> 4
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Cys His Lys Arg Glu Asp Tyr Tyr Asn Leu Gln Leu Val Val Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Ala Val
20 25 30
Ile Thr Gly Glu Gly Arg Glu Pro Lys Leu Met Glu Gln Ile Asn Ile
35 40 45
Val Ser Asn Gly Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Thr Leu Asn
50 55 60
Thr Ser Ile Trp Arg Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln
65 70 75 80
Thr Val Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Ser Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met
130 135 140
Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala
145 150 155 160
Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr
165 170 175
Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp
180 185 190
Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Val Ser Ser Ala Ala Thr Met
195 200 205
Tyr Arg His Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser Cys
225 230 235 240
Pro Ala Ala Glu Val Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Glu Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Gln Leu Tyr Thr Ala Gln Thr Arg Pro Met Glu
290 295 300
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
325 330 335
Lys Asp Leu Leu Ser Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Thr Gly
340 345 350
Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ala Trp Glu Glu
355 360 365
Leu Ser Lys Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro
385 390 395 400
Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr
405 410 415
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Val Arg Trp Gln Arg
420 425 430
Gly Asp Leu Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys Gly Ser Gly Ser
450 455 460
His His His His His His
465 470
<210> 5
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Cys His Lys Arg Glu Asp Tyr Tyr Asn Leu Gln Leu Val Val Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Ala Val
20 25 30
Ile Thr Gly Glu Gly Arg Glu Pro Lys Leu Met Glu Gln Ile Asn Ile
35 40 45
Val Ser Asn Gly Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Thr Leu Asn
50 55 60
Thr Ser Ile Trp Arg Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln
65 70 75 80
Thr Val Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Ser Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met
130 135 140
Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala
145 150 155 160
Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr
165 170 175
Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp
180 185 190
Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Val Ser Ser Ala Ala Thr Met
195 200 205
Tyr Arg His Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Asp Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ala Trp Glu Glu Leu Ser
245 250 255
Lys Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro
260 265 270
Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Gly
275 280 285
Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe
290 295 300
Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Val Arg Trp Gln Arg Gly Asp
305 310 315 320
Leu Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
325 330 335
Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys Gly Ser Gly Ser His His
340 345 350
His His His His
355
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggaattct tcatgccaca aaagag 26
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacctcgagt cagtgatggt gatggtgatg agagcccgat ccatgacggt acatcgttg 59
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagccacctc ctccggaccc acccccgcct gatccatgac ggtacatcgt tgcag 55
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcctaccgt ctcatccgct gcaacgatgt accgtcatgg atcaggcggg ggtgggtc 58
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacctcgagt cagtgatggt gatggtgatg agagcccgat cctttaccct gagtcttgg 59

Claims (6)

1.一种表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）使用引物对pMT-E2-F/E2-Fc'-R，以pEASY-Blunt-APPV E2重组质粒为模板，PCR扩增得到包含IgG3Fc 5'端部分序列的E2-Fc'片段；
所述pMT-E2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述E2-Fc'-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
2）人工合成猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列，并保留猪源IgG3Fc蛋白的二聚体交互位点和受体结合位点，得到IgG3ΔFc核苷酸序列；
所述猪源IgG3Fc蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述IgG3ΔFc核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
3）使用引物对E2'-Fc-F/pMT-Fc-R，分别以步骤2）中IgG3Fc或IgG3ΔFc为模板，PCR扩增得到包含E2 3'端部分序列的E2'-Fc或E2'-ΔFc片段；
所述E2'-Fc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述pMT-Fc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
4）以步骤1）中所述E2-Fc'片段与步骤3）中所述E2'-Fc或E2'-ΔFc片段为模板进行重叠PCR，得到的重叠PCR扩增产物为APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段；
所述重叠PCR的检测用引物为pMT-E2-F和pMT-Fc-R；
5）将果蝇细胞表达质粒pMT-Bip-V5-HisA和APPV E2Fc或APPV E2ΔFc片段用EcoR I/Xho I限制性内切酶进行双酶切，连接，得到pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc；
6）将所述pMT-Bip-aE2Fc或pMT-Bip-aE2ΔFc与潮霉素抗性质粒共同转染果蝇细胞系，经筛选，得到表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系；
所述步骤1）与步骤2）~3）之间没有时间顺序限制。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）中PCR扩增的反应程序为：98℃预变性5 min；98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃充分延伸10 min。
3.权利要求1或2所述制备方法制备得到的表达猪非典型瘟病毒E2Fc或E2ΔFc融合蛋白的重组果蝇细胞系。
4.一种具有猪非典型瘟病毒免疫原性的融合蛋白，其特征在于，由权利要求3所述重组果蝇细胞系表达得到的E2Fc融合蛋白或E2ΔFc融合蛋白；
所述E2Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述E2ΔFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.权利要求3所述重组果蝇细胞系或权利要求4所述融合蛋白在制备预防仔猪先天性震颤的疫苗中的应用。
6.一种预防仔猪先天性震颤的疫苗，其特征在于，包括权利要求4所述融合蛋白和佐剂。
CN202111049664.3A 2021-09-08 2021-09-08 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用 Active CN113736825B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111049664.3A CN113736825B (zh) 2021-09-08 2021-09-08 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111049664.3A CN113736825B (zh) 2021-09-08 2021-09-08 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113736825A CN113736825A (zh) 2021-12-03
CN113736825B true CN113736825B (zh) 2024-02-20

Family

ID=78736957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111049664.3A Active CN113736825B (zh) 2021-09-08 2021-09-08 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113736825B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115073608B (zh) * 2022-03-22 2023-05-02 广东海大集团股份有限公司 一种猪瘟病毒e2的核酸-蛋白复合标记性疫苗

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109053904A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 天康生物股份有限公司 Appv-e2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN110041411A (zh) * 2018-01-15 2019-07-23 浙江海隆生物科技有限公司 稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10555995B2 (en) * 2015-04-30 2020-02-11 Kansas State University Research Foundation Porcine pestvirus, vaccines, and assays

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110041411A (zh) * 2018-01-15 2019-07-23 浙江海隆生物科技有限公司 稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用
CN109053904A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 天康生物股份有限公司 Appv-e2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
CN113736825A (zh) 2021-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105669838B (zh) 来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体
JP6104584B2 (ja) チクングンヤウイルスの新規な分離されかつ精製された株、並びにそのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列、診断及び免疫原性の使用
CN113230395A (zh) 一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用
CN111057145B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体及其应用
CN113943375B (zh) 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
Jiang et al. Hantavirus Gc induces long-term immune protection via LAMP-targeting DNA vaccine strategy
CN114874995B (zh) 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
Krapchev et al. Recombinant Flag-tagged E1E2 glycoproteins from three hepatitis C virus genotypes are biologically functional and elicit cross-reactive neutralizing antibodies in mice
CN113736825B (zh) 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用
Li et al. Efficient mucosal vaccination of a novel classical swine fever virus E2-Fc fusion protein mediated by neonatal Fc receptor
CN113677792A (zh) Csfv亚单位疫苗
Baghbani-Arani et al. Expression and characterization of Escherichia coli derived hepatitis C virus ARFP/F protein
CN117143923A (zh) 一种猪圆环病毒2型和/或3型亚单位疫苗及其建立方法和应用
CN113248608B (zh) 一种基孔肯雅病毒e2蛋白兔单克隆抗体及其用途
Zhang et al. Efficient capture and detection of Zika virion by polyclonal antibody against prokaryotic recombinant envelope protein
WO2010047829A1 (en) Mutant hepatitis c virus e2 polypeptides for hcv treatment
CN110016466B (zh) 特异性检测蓝舌病病毒的单抗及其杂交瘤细胞株和应用
CN115094088A (zh) 一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗
CN114315984A (zh) 一种用于制备prrsv基因ii型表位缺失疫苗毒株的n蛋白表位突变标记及其应用
TWI328039B (zh)
CN107619435B (zh) 一种猪瘟病毒e2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用
CN113248607B (zh) 一种基孔肯雅病毒e2蛋白兔单克隆抗体及其在开发治疗性抗体中的用途
CN114908056B (zh) 一种表达猪PRV gDFc或gBFc融合蛋白的重组CHO细胞系及其构建方法和应用
Feng et al. Immunity of two novel hepatitis C virus polyepitope vaccines
Liao et al. Hepatitis B virus precore protein augments genetic immunizations of the truncated hepatitis C virus core in BALB/c mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant