CN109053904A - Appv-e2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种APPV‑E2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域。该APPV‑E2融合蛋白将非典型猪瘟病毒的E2基因中抗原性好，易高表达的区域进行串联，包括主要由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达的区段A和主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达的区段B，该APPV‑E2融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。该APPV‑E2融合蛋白可应用于制备疫苗、抗体和用于检测非典型猪瘟病毒的试剂盒。包含该APPV‑E2融合蛋白的疫苗具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较高滴度的抗体，使动物获得较好的保护效果。

Description

APPV-E2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种APPV-E2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
背景技术
猪瘟(hog cholera，HC)，又称古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒(HCV，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，由于造成的经济损失巨大，是受世界各国关注的传染病之一，至今仍然是我国发病最多、危害最大、流行最广的猪传染病之一。
随着对猪瘟免疫防御的工作开展，尤其在规模化猪场对猪瘟的疫苗接种取得了明显的效果，典型性猪瘟发明日益减少。但是近年来，由于带猪瘟病毒母猪的存在、流行毒株发生较大的变异、动物无需流动、疫苗质量不稳定、免疫程序不合理及各种干扰因素的影响，我国出现非典型猪瘟，并呈扩散的趋势，而且出现继发感染的趋势也更加普遍，严重损害了经济效益。
非典型猪瘟在发病特点上表现为散发性流行，病程较长。临床症状不典型，主要表现消化道症状，在没有继发感染的情况下体温一般正常，在38.5℃-39.5℃；食量明显下降，病程稍长者流口水，拉黄色稀粪，渐进性消瘦，后期衰竭死亡，病理特征不明显；仔猪易出现震颤情况，断奶前死亡率达到30％左右。给养殖户造成巨大损失，目前尚无有效方法进行预防。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种APPV-E2融合蛋白，该APPV-E2融合蛋白串联了APPV的E2基因的抗原表位，具有较好的免疫原性。
本发明的第二目的在于提供一种上述APPV-E2融合蛋白的制备方法，该制备方可以表达出上述APPV-E2融合蛋白。
本发明的第三目的在于提供上述APPV-E2融合蛋白、上述APPV-E2融合蛋白的制备方法或上述APPV-E2融合蛋白制备方法制备得到的融合蛋白的应用，可应用于制备疫苗、抗体和病毒检测等多个方面。
本发明的第四目的在于提供一种包含上述APPV-E2融合蛋白的疫苗，该疫苗免疫原性好，保护效力高。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种APPV-E2融合蛋白，包括区段A和区段B：所述区段A主要由SEQID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述区段B主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。
优选地，区段A和区段B的排列顺序为A-B，通过Linker连接；
优选地，所述Linker具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
优选地，所述APPV-E2融合蛋白的N端和/或C端连接有标签。
本发明还提供了一种上述APPV-E2融合蛋白的制备方法，包括将所述APPV-E2融合蛋白的基因在宿主中表达；
优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述APPV-E2融合蛋白的基因；
优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述APPV-E2融合蛋白的基因。
优选地，提供包含表达所述APPV-E2融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行加压筛选，再将加压筛选出的CHO细胞驯化成悬浮培养的细胞株，使所述悬浮培养的细胞株表达所述APPV-E2融合蛋白；
优选地，使用谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统筛选表达所述APPV-E2融合蛋白的CHO细胞株；
优选地，所述谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统中使用的表达载体为pcDNA3、pEE6.4或pEE12.4。
优选地，采用逐渐驯化的方法传代至少6代获得悬浮培养的表达所述APPV-E2融合蛋白的CHO细胞株。
本发明还提供了上述APPV-E2融合蛋白、上述制备方法或由上述制备方法制备得到的蛋白的应用，包括如下(x1)-(x5)中的至少一种：
(x1)制备非典型猪瘟疫苗；
(x2)制备非典型猪瘟病毒的抗体；
(x3)制备非典型猪瘟病毒诊断抗原；
(x4)制备检测非典型猪瘟病毒的试剂和/或试剂盒；
(x5)制备检测非典型猪瘟病毒抗体的试剂和/或试剂盒。
本发明还提供了一种包含上述APPV-E2融合蛋白的疫苗。
优选地，所述疫苗中所述融合蛋白的浓度为100-200μg/ml，优选120-180μg/ml，更优选150μg/ml；
优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂，优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA201VG佐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的APPV-E2融合蛋白，在非典型猪瘟病毒(Atypical porcinepestivirus，APPV)的E2基因中选取了抗原性好，易高表达的区域进行串联，包括区段A和区段B，其中区段A主要由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，区段B主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达，得到具有良好免疫原性的APPV-E2融合蛋白。
本发明提供的上述APPV-E2融合蛋白的制备方法，通过将上述APPV-E2融合蛋白的基因在宿主中表达即可。
本发明提供的上述APPV-E2融合蛋白、上述APPV-E2融合蛋白的制备方法或上述APPV-E2融合蛋白制备方法制备得到的融合蛋白的应用，可以用以制备非典型猪瘟疫苗，免疫动物后可产生较高的抗体的滴度。使用APPV-E2融合蛋白制备的非典型猪瘟病毒的抗体可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，以用于检测非典型猪瘟病毒的抗体，例如使用含有非典型猪瘟病毒的抗体的ELISA试剂盒以检测非典型猪瘟病毒，或者使用含有该APPV-E2融合蛋白的胶体金免疫层析试纸检测待测血清样品中的非典型猪瘟病毒抗体含量。
本发明提供的包含上述APPV-E2融合蛋白的疫苗，具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较高滴度的抗体滴度，使动物获得较好的保护效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的APPV-E2基因的PCR结果；
图2为本发明实施例2提供的PEE6.4-APPV-E2质粒图谱；
图3为本发明实施例2提供的PEE6.4-APPV-E2重组质粒的双酶切鉴定结果；
图4为本发明实施例6提供的细胞发酵后表达的蛋白SDS-PAGE的结果；
图5为本发明实施例6提供的细胞发酵后表达的蛋白Werstern-Blotting检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种APPV-E2融合蛋白，包含区段A和区段B：所述区段A主要由SEQID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述区段B主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。
非典型猪瘟病毒(Atypical porcine pestivirus，APPV)为RNA病毒，其基因组约为12.3kb，属于黄病毒科(Flaviviridae)。可引起猪的非典型猪瘟。本发明将APPV的E2基因中主要的抗原表位串联，以增强APPV-E2融合蛋白的免疫原性。
在一些可选的实施方式中，区段A和区段B的排列顺序为A-B，通过Linker连接，本发明优选使用具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的Linker。在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
在一些可选的实施方式中，所述APPV-E2融合蛋白的N端和/或C端连接有标签，以便于后续蛋白的分离、纯化和鉴定，所述标签例如可以为但不限于为His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、NusA标签、SUMO标签。
本发明还提供了上述APPV-E2融合蛋白的制备方法，该制备方法通过将所述APPV-E2融合蛋白的基因在宿主中表达即可，例如可以为但不限于为在大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或者哺乳动物表达系统均可，由于哺乳动物细胞表达的蛋白经翻译加工后，其结构与生物学特性更接近于天然蛋白，因此本发明优选使用哺乳动物表达系统表达APPV-E2融合蛋白的基因，更优选使用CHO细胞表达系统表达APPV-E2融合蛋白的基因。CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，CHO细胞表达系统具有如下优点：
(1)具有准确的翻译后折叠及修饰功能，表达的蛋白在分子结构，理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。
(2)具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化。
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力。
(4)具有贴壁生长特性，具有较高的耐受剪切力和渗透压能力。也可以进行悬浮培养，表达水平较高。
(5)CHO属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白质，利于外源蛋白的分离。
在一些优选的实施方式中，本发明对CHO表达系统进行加压筛选，以获得高表达APPV-E2融合蛋白的CHO细胞株。可选地，可以选择谷氨酰胺合成酶基因筛选扩增系统或者二氢叶酸还原酶基因筛选系统进行加压筛选，这两种系统可以单独使用，也可以结合使用，本发明对此不做限制。
选择标记和基因扩增CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase，dhfr)，谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase，GS)。当携带GS基因的表达质粒转染CHO细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，GS可被甲硫氨酸亚枫(MSX)所抑制，在极少数幸存下来的抗性细胞中，GS基因均得以扩增，结果会导致与GS基因串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消MSX的抑制效应。
使用谷氨酰胺合成酶基因筛选扩增系统时，先将表达所述融合蛋白的基因克隆到具有GS筛选标记的表达载体上得到重组载体，然后将重组载体导入CHO细胞中，然后通过使用含有MSX的培养基培养CHO细胞对CHO细胞进行加压，以筛选出高表达目的基因。在一些优选的实施方式中，具有GS筛选标记的表达载体使用pcDNA3、pEE6.4或pEE12.4。
悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快、产量高、培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。由于CHO细胞具有既可以贴壁生长，也可以进行悬浮培养的特性，因此本发明优选将表达APPV-E2融合蛋白的CHO细胞进行驯化，使其能够悬浮培养。并且优选采用逐渐驯化的方法传代至少6代获得悬浮培养的表达APPV-E2融合蛋白的细胞株，以使悬浮细胞株细胞表达量高，且传代稳定。
在一个优选的实施方式中，所述制备方法参考如下方案：
先将优化的APPV-E2基因扩增后通过酶切连接到真核表达载体pcDNA3、pEE6.4或pEE12.4，通过鉴定获得含有APPV-E2基因的阳性质粒，然后通过扩大培养，提取阳性质粒，转染至CHO细胞内。
加压筛选，转染至少24h后开始加压，加压7天；加压至阴性对照细胞死亡90％以上，开始单克隆筛选。
细胞株驯化成悬浮培养，每隔24h计数细胞及活力，当第一代细胞活率达到94％左右时，进行第二代培养；第二代、第三代至第六代培养后得到的细胞活率达到95％，7周后细胞接种3天后繁殖3代，密度达到细胞活率达到1×106个/ml，认为适应悬浮培养。
收集细胞培养液，离心取上清，过滤膜，然后纯化，得到APPV-E2融合蛋白。
本发明提供的APPV-E2融合蛋白、上述制备方法或上述制备方法制备得到的蛋白的应用，包括如下(x1)-(x5)中的至少一种：(x1)制备非典型猪瘟疫苗；(x2)制备非典型猪瘟病毒的抗体；(x3)制备非典型猪瘟病毒诊断抗原；(x4)制备检测非典型猪瘟病毒的试剂和/或试剂盒；(x5)制备检测非典型猪瘟病毒抗体的试剂和/或试剂盒。
由于本发明提供的APPV-E2融合蛋白具有较好的免疫原性，可以用以制备非典型猪瘟疫苗，优选制备APPV-E2亚单位疫苗，免疫动物后可产生较高的抗体的滴度。使用APPV-E2融合蛋白制备的非典型猪瘟病毒的抗体可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，以用于检测非典型猪瘟病毒的抗体，例如使用含有非典型猪瘟病毒的抗体的ELISA试剂盒以检测非典型猪瘟病毒，或者使用含有该APPV-E2融合蛋白的胶体金免疫层析试纸检测待测血清样品中的非典型猪瘟病毒抗体含量。
本发明还提供了一种包含上述APPV-E2融合蛋白的疫苗，该疫苗具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较高滴度的抗体滴度，使动物获得较好的保护效果。
在一些优选的实施方式中，疫苗中所述融合蛋白的浓度为100-200μg/ml，优选120-180μg/ml，更优选150μg/ml。优选地，所述疫苗还包括辅料，例如可以为但不限于为疫苗佐剂、稳定剂或抗生素。优选包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂例如可以为但不限于为氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂，优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA201VG佐剂。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果，其中本发明试剂及药品来源如下：中华仓鼠卵巢细胞(CHO)购自美国ATCC公司；细胞培养基和血清均购自美国gibcom公司；真核表达载体PEE6.4购自美国ThermoFisher公司；Lipofectamine LTX购自北京索莱宝科技有限公司；氨甲基喋呤(mnethotrexate MTX)购自Sigma公司；甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine MSX)购于Sigma公司；BCA蛋白质定量试剂盒购自美国ThermoFisher公司；ISA201VG购自法国赛比克公司，其他试剂、试剂盒及耗材均为常规市售产品。
需要说明的是，实施例中的反应体系和反应条件仅是一种举例。实施例中各步骤中的反应体系和反应条件均可以在可接受的范围内进行调整，以优化反应条件，本发明对此不做限制。
实施例1：APPV-E2融合蛋白基因设计及合成
APPV-E2基因(GenBank:LT594521.1)经优化后分为区段A和区段B；区段A由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列表达，区段B由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达；区段A和区段B通过具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的Linker连接。连接后的APPV-E2基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，长度567bp。APPV-E2基因合成由上海生工生物公司完成。
实施例2：PEE6.4-APPV-E2重组质粒构建
2.1添加酶切位点：通过PCR扩增在APPV-E2基因序列的上游和下游分别添加酶切位点：HindⅢ、XmaI，PCR扩增上游引物如SEQ ID NO.5所示，PCR扩增下游引物如SEQ IDNO.6所示，PCR结果如图1所示，其中泳道1为APPV-E2基因，泳道M为marker。
2.2APPV-E2基因及载体双酶切反应
2.2.1构建50μL反应体系，按照下表将各组分混合均匀后37℃水浴2h。
10×buffer 5μL
DNA样品 2μg
HindⅢ 2.5μL
XmaI 2.5μL
dd H<sub>2</sub>0 38μL
2.2.2目的DNA片段回收：采用DNA凝胶回收试剂盒(购自北京莱宝科技有限公司)，回收酶切目的片段，步骤如下：
(1)琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中用刀片小心切下，放入1.5mL EP管中，称取重量。
(2)向EP管中加入3倍体积溶胶液，50-55℃水浴10min，期间小心翻转离心管，确保胶块充分溶解。
(3)将上一步所得溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(4)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
(5)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
(6)12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置2min。
(7)将吸附柱放入1.5mL EP管中，向吸附膜中央悬空滴加适量经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。
2.3APPV-E2基因载体连接反应，构建10μL反应体系，然后将连接反应体系混合均匀后置于16℃冷水浴中10-16h，后放入65℃水浴15min，最后4℃保存。
10×T4buffer 1μL
DNA片段 6μL
载体 2μL
T4连接酶 1μL
2.4转化反应
将10μL连接反应液加入到100μL DH5α感受态细胞中，混匀后冰浴30min，42℃水浴100s，再冰浴2min。然后取出EP管，加入600μL LB培养液，置于37℃恒温摇床，240rpm培养1h后取出EP管，室温离心8000rpm，2min，吸除500μl上清液，重悬吹匀菌体，将重悬的菌液滴到转化平板上，用涂菌棒将菌液均匀铺开。然后将转化平板置于恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h，培养完毕后观察转化结果。
2.5质粒抽提与双酶切鉴定
2.5.1质粒提取，使用美国OMEGA质粒提取试剂盒，提取方法按照试剂盒使用说明书进行提取。
(1)挑取转化板中单个菌落至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h。
(2)取菌液1.5ml至EP管中，室温条件下离心10000rpm1min，弃上清，然后加入250μL溶液I，振荡混匀；再加入250μL溶液II，小心颠倒EP管4-6次，室温静置2min，至澄清，然后加入350μL溶液III，小心颠倒离心管4-6次，直至出现白色絮状沉淀，10000rpm室温离心10min。
(3)小心吸取上清溶液，并移至吸附柱中心，10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中液体后加入500μL Buffer HB，10000rpm离心1min，弃滤液，然后加如700μL WashBuffer，10000rpm离心1min，弃滤液；重复1次。
(4)室温离心空吸附柱，10000rpm，2min，将吸附柱放入干净的1.5ml EP管中，加30μL去离子水在滤膜上，室温静置5min，10000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
2.5.2双酶切鉴定，构建20μL反应体系：
补ddH20至20μL后混合均匀，37℃水浴2h后进行凝胶电泳检测，并将插入DNA片段送公司测序。PEE6.4-APPV-E2质粒图谱如图2所示。双酶切鉴定结果如图3所示，其中，泳道1为APPV-E2基因，泳道M为Marker。
2.6去内毒素质粒大提，采用去内毒素质粒大量提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)
(1)将测序正确的克隆接种至100ml含氨苄抗性的培养基中，240rpm，37℃恒温培养15h后，取50ml细菌培养物至50ml离心管中，11000rpm离心1min，吸除上清。
(2)加4ml溶液P1，振荡器悬浮细菌细胞沉淀，然后加4ml溶液P2，温和颠倒6-8次使菌体充分裂解，最后再加4ml溶液P3，立即温颠倒6-8次，充分混匀，至出现白色絮状沉淀，11000rpm离心10min后，将上清移到另一个干净的离心管中。
(3)加上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，冰浴2min至溶液变清亮，然后37℃水浴5min，不时振荡。
(4)11000rpm室温离心5min，溶液分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素，将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相；重复三次。
(5)加入12ml的结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，11000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)然后加入8ml漂洗液，11000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中，再加入6ml漂洗液，11000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。然后11000rpm离心3min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置4-5min。
(7)最后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜滴2ml经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心2min，-20℃保存。
实施例3：PEE6.4-APPV-E2重组质粒转染CHO-K1细胞
(1)取出细胞，弃去上清培养基，用预温的8ml PBS洗一次，弃去PBS，然后每个培养皿加入2ml 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，镜下观察细胞变圆，呈单个细胞。加入4mlDMEM/F12(含10％血清，1％氨苄-链霉素双抗)终止消化反应，用移液器将细胞吹散后转移至15ml离心管中，200rpm离心5min。
(2)DMEM/F12(含10％血清，1％氨苄-链霉素双抗)重新悬浮细胞，计数后，稀释细胞至2×105个/ml，取2ml混匀的细胞加入到六孔培养皿，置37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育过夜。
(3)观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时开始转染，转染前将培养基换DMEM/F12(无血清无双抗)，2mL/孔。
(4)用OPTI-MEM稀释质粒，125μl OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μlplus，混合均匀后室温静置5min。
(5)稀释Lipofectamine LTX：125μl OPTI-MEM中加入9μl Lipofectamine LTX，然后加入2.5μl plus，轻轻混匀，室温静置5min。
(6)将稀释质粒和稀释Lipofectamine LTX混合混匀，室温放置5min，然后逐滴加入六孔培养皿中均匀分布。
(7)将六孔培养皿置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4-6h后换液：弃掉上清培养基，加入2ml DMEM/F12(含10％血清1％氨苄-链霉素双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
实施例4：单克隆细胞株筛选
(1)转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔培养皿，弃去上清，加入2mlDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，期间镜下观察，死细胞多换液。
(2)加压筛选至阴性对照细胞死亡至少90％以上时，开始单克隆筛选；
(3)取出六孔培养皿，弃培养基，用PBS洗一次，加入300μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，加2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，用移液器将细胞吹散，然后将细胞转移至15ml离心管中，200rpm离心5min。
(4)DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数，然后将细胞稀释至5个/ml，取200μL加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h后标记出单个细胞的孔。
(5)96孔板中单个细胞的孔长满时，弃培养基，PBS洗一次，加入100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，加入2ml DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止反应，用移液器将细胞吹散，然后将细胞液转移至12孔板，细胞长满时，取上清，ELISA检测，高效表达的继续培养、冻存。
(6)经过筛选，共收获2株细胞株，编号为08株、22株。
实施例5：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养细胞株
(1)从37℃培养箱中取出细胞培养皿，弃去上清，用8ml PBS洗细胞一次，并弃去PBS，然后向培养皿加入2ml 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min，镜下观察细胞由皱变圆，呈单个细胞。然后加入4ml DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，用移液器将细胞吹散。然后将细胞液转移至15ml离心管中，200rpm离心5min。
(2)使用100％ DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数后稀释细胞至5×105个/ml，接种30ml培养基于125ml摇瓶中，置37℃、5％ CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上130rpm孵育过夜，并且每隔24h计数1次，观察细胞密度及活力。
(3)当第一代细胞培养一次后细胞活率达到94％-97％时，进行第二代培养，将第一代细胞转移至50ml离心管中，200rpm离心5min，然后将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL302按1：1混合同时加入对应浓度嘌呤霉素后混匀，重新悬浮细胞，计数后稀释细胞至5×105个/ml，接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中，置37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm孵育过夜，并且每隔24h计数1次，观察细胞密度及活力。
(4)当第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％，第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×106个/ml，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养，接种密度降低到3×105个/ml。经过驯化，编号22株的细胞系满足要求，表明驯化成功。
实施例6：细胞发酵
(1)配制培养基：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell302置于37℃水浴锅中预热；
(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，计数后稀释细胞至3.0×105个/ml，接种30ml培养基于125ml摇瓶中，置37℃、5％CO2恒温摇床中，100rpm过夜培养。
(3)每隔24h细胞计数，观察密度及活力，监测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1ml样品上清，检测蛋白表达情况。
(4)补料：约第4天，70g/L CB5，添加基础培养基的10％；第5天，将CO2培养箱温度调整至32℃；第9天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％；第12天，收获细胞。
(5)SDS-PAGE和Werstern-Blotting检测，结果如图4和图5所示，其中图4和图5的泳道1为APPV-E2融合蛋白，泳道M为Marker。
实施例7：蛋白纯化
(1)收集细胞培养液，4℃，10000rpm离心30min，取上清后过滤膜(0.45μm)，准备上样。
(2)柱平衡：用超纯水平衡3个柱体积，排出乙醇保存液；加入BufferA(20mMNaH2PO4，500mM NaCl)4-8ml/min，平衡3个柱体积。
(3)上样：用5ml预装柱，1ml/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)。
(4)洗涤：4％bufferB(20mM NaH2PO4、500mM NaCl、100mM imidazole)洗柱，流速为4ml/min，至OD280nm基线平稳为止。
(5)洗脱：50％bufferB(20mM NaH2PO4、500mM NaCl、100mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平，2ml/min，收集5ml/管。
(6)洗涤：100％bufferB(20mM NaH2PO4、500mM NaCl、500mM imidazole)4ml/min，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平，超纯水平衡3柱体积。
(7)透析：Millipore 10KD PBS(pH7.4)4℃透析，次换液咪唑稀释倍数为2，换液次数为10次。
(8)除菌过滤：用0.22μm滤器过滤，蛋白样品溶液-80℃冰箱保存。
(9)蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，其中22株蛋白得率为500mg/L，08株得率200mg/L左右；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到95％以上。
实施例8：疫苗制备与免疫接种
疫苗制备：将表达的APPV-E2融合蛋白与ISA201VG佐剂按体积比45:55混合，乳化，蛋白终浓度为150μg/ml；
疫苗免疫及抗体检测：1ml非典型猪瘟亚单位疫苗(150μg/ml)免疫接种头胎怀孕母猪，免疫后三周取血，分离血清检测抗体效价，结果显示检测到抗体效价均不低于1：32。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
&lt;110&gt; 天康生物股份有限公司
&lt;120&gt; APPV-E2融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
&lt;160&gt; 6
&lt;170&gt; PatentIn version 3.5
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 288
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 非典型猪瘟病毒（Atypical porcine pestivirus）
&lt;400&gt; 1
ctagttaaaa tatcaaaggg gaacctgatt ggcgctatac tatggtgcct attgttatca 60
ggggctgaag gctcttgcca caaaagacaa gactattaca atatccagct agttgttgaa 120
gaaaatacag gcgtagaaaa acgatctata atgggcaagt ggactgtgat aaccaaggaa 180
ggtagggaac caagattaat ggagcaaata aacatggtgt caaataatag cctgtcagag 240
acttactgct ataataggct aaataccagc agttggaggc ggcaaccg 288
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 249
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 非典型猪瘟病毒（Atypical porcine pestivirus）
&lt;400&gt; 2
ccctattggc ctggtgacaa tgtcctagag gaacaatact atagcacagg ttactgggtg 60
aacgcaacag gtggttgtca gctgagggaa ggcgtatggc tatcaagaaa gggcaatgta 120
cagtgccagc gtaacggctc atccttgatg ctgcaattgg cgataaaaga agaaaatgac 180
actatggaaa taccatgcga cccggtggaa acagaaagca tgggtccagt tgcacagggc 240
acttgcgtg 249
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 30
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 3
ggaggaggag gatctggagg aggaggatct 30
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 567
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 4
ctagttaaaa tatcaaaggg gaacctgatt ggcgctatac tatggtgcct attgttatca 60
ggggctgaag gctcttgcca caaaagacaa gactattaca atatccagct agttgttgaa 120
gaaaatacag gcgtagaaaa acgatctata atgggcaagt ggactgtgat aaccaaggaa 180
ggtagggaac caagattaat ggagcaaata aacatggtgt caaataatag cctgtcagag 240
acttactgct ataataggct aaataccagc agttggaggc ggcaaccggg aggaggagga 300
tctggaggag gaggatctcc ctattggcct ggtgacaatg tcctagagga acaatactat 360
agcacaggtt actgggtgaa cgcaacaggt ggttgtcagc tgagggaagg cgtatggcta 420
tcaagaaagg gcaatgtaca gtgccagcgt aacggctcat ccttgatgct gcaattggcg 480
ataaaagaag aaaatgacac tatggaaata ccatgcgacc cggtggaaac agaaagcatg 540
ggtccagttg cacagggcac ttgcgtg 567
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 30
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 5
ccaagcttct agttaaaata tcaaagggga 30
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 30
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 6
cccccgggca cgcaagtgcc ctgtgcaact 30

Claims (10)

1.一种APPV-E2融合蛋白，其特征在于，包括区段A和区段B：所述区段A主要由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述区段B主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。
2.根据权利要求1所述的APPV-E2融合蛋白，其特征在于，区段A和区段B的排列顺序为A-B，通过Linker连接；
优选地，所述Linker具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的APPV-E2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的APPV-E2融合蛋白，其特征在于，所述APPV-E2融合蛋白的N端和/或C端连接有标签。
5.一种权利要求1-4中任一项所述的APPV-E2融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：将所述APPV-E2融合蛋白的基因在宿主中表达；
优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述APPV-E2融合蛋白的基因；
优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述APPV-E2融合蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，提供包含表达所述APPV-E2融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行加压筛选，再将加压筛选出的CHO细胞驯化成悬浮培养的细胞株，使所述悬浮培养的细胞株表达所述APPV-E2融合蛋白；
优选地，使用谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统筛选表达所述APPV-E2融合蛋白的CHO细胞株；
优选地，所述谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统中使用的表达载体为pcDNA3、pEE6.4或pEE12.4。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，采用逐渐驯化的方法传代至少6代获得悬浮培养的表达所述APPV-E2融合蛋白的CHO细胞株。
8.权利要求1-4中任一项所述的APPV-E2融合蛋白、权利要求5-7中任一项所述的制备方法或由所述制备方法制备得到的蛋白的应用，其特征在于，包括如下(x1)-(x5)中的至少一种：
(x1)制备非典型猪瘟疫苗；
(x2)制备非典型猪瘟病毒的抗体；
(x3)制备非典型猪瘟病毒诊断抗原；
(x4)制备检测非典型猪瘟病毒的试剂和/或试剂盒；
(x5)制备检测非典型猪瘟病毒抗体的试剂和/或试剂盒。
9.一种包含权利要求1-4中任一项所述的APPV-E2融合蛋白的疫苗。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中所述融合蛋白的浓度为100-200μg/ml，优选120-180μg/ml，更优选150μg/ml；
优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；
优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂，优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA201VG佐剂。
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