CN109295014A - 一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种非典型猪瘟病毒e2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC‑4‑APPV E2及其制备方法和应用，属于兽用疫苗技术领域，本发明提供的所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心保藏CCTCC，保藏号为CCTCC NO：V201855。所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC‑4‑APPV E2能够用于制备亚单位疫苗，免疫仔猪后能产生针对APPV的特应性免疫反应。利用本发明所述E2’蛋白重组杆状病毒AC‑4‑APPV E2可获得大量与天然病毒抗原性相似的E2’抗原，作为诊断抗原特异性强，灵敏度高，诊断迅速；作为目的抗原制备的基因工程疫苗高效、安全。

Description

一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于兽用疫苗技术领域，尤其涉及一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用。
背景技术
仔猪先天性震颤(Congenital tremors ofpiglet,CT)，俗称“仔猪抖抖病”、“仔猪跳跳病”，指刚出生仔猪表现为头部或四肢严重震颤的一种疾病，其大脑和脊髓有明显的病理学损伤。目前，该病尚无有效的治疗措施，给养猪生产造成较大的经济损失。1922年Kinsley在美国首次记录此病，命名为仔猪跳舞病，1937年Hindmarsh在澳大利亚报道，以后欧洲、北美洲与南美洲陆续报道了此病。1960年国内首次报道此病，以后山东、江苏、湖南、河南等省都有此病报道，表明此病在我国广泛存在。2015年美国学者Ben M.Hause通过下一代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)发现一种新型的猪源瘟病毒，因不同于猪瘟病毒，该病毒暂时命名为非典型猪瘟病毒(Atypical Porcine Pestivirus，APPV)。随后，2016年另一位美国学者Bailey L.Arruda1在仔猪先天性震颤的样品中使用下一代测序技术验证了APPV的存在，并通过病料回归实验验证APPV是否是仔猪先天性震颤的病原，结果表明，APPV是一种新型的猪源瘟病毒，而且感染APPV导致仔猪先天性震颤。非典型猪瘟病毒(APPV)基因组大小约11500～11276bp，包括4个结构蛋白C、Erns、E1和E2的基因，以及7个非结构蛋白Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B的基因。E2蛋白是APPV的囊膜蛋白，全长241氨基酸。生物信息学分析APPV E2上有多个B细胞表位，被认为是APPV的免疫原性基因。
目前没有治疗APPV的药物和疫苗用于该病毒感染的预防和控制。因此，当务之急是开发一种安全有效的仔猪先天性震颤的疫苗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够有效的应用于仔猪先天性震颤疫苗制备的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒。
为了实现上述目的，本发明提供了一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2，所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心保藏CCTCC，保藏号为CCTCC NO：V201855。
本发明还提供了所述的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2的制备方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增获得跨膜区片段缺失的编码E2’蛋白的核苷酸序列e2'；所述e2'的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
2)将步骤1)中所述e2'与pEASYBLUNT载体连接获得pEASYBLUNT-APPV E2重组载体；
3)以步骤2)中获得的pEASYBLUNT-APPVE2重组载体为模板，用4组引物对分别进行PCR扩增获得连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段；其中第一组引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；第二组引物对的序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；第三组引物对的序列如SEQ IDNo.9和SEQID No.10所示；第四组引物对的序列如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示；
4)将步骤3)中所述的连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段连接到杆状病毒转移载体PFBDHmHNM1P10eEFP中获得第二重组载体，并在所述第二重组载体中的4个e2'目的片段前分别插入HBM信号肽序列，获得杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2；
5)将步骤4)中所述的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2转染昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液获得重组杆状病毒AC-4-APPV E2。
本发明还提供了所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2状病毒AC-4-APPV E2在制备防治仔猪先天性震颤疫苗中的应用。
优选的，所述防治仔猪先天性震颤疫苗为亚单位疫苗。
本发明提供了一种防治仔猪先天性震颤的疫苗，所述疫苗包括所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2表达的E2’蛋白和佐剂。
优选的，所述疫苗中E2’蛋白的浓度为25～35μg/ml。
优选的，所述佐剂为SEPPIC ISA-201佐剂。
本发明提供的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2中的e2'是由PCR扩增获得的我国流行优势毒株的跨膜区缺失的编码E2蛋白的DNA序列；所述e2'编码的蛋白为APPV的囊膜糖蛋白，全长为639个碱基，编码214个氨基酸，跨膜区缺失更利于所述E2蛋白的分泌表达。本发明中将所述e2'以4拷贝形式至于杆状病毒的启动子下，增加了目的基因的拷贝数量，提高了目的基因的表达量。
本发明提供的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2能够用于制备亚单位疫苗，免疫仔猪后能产生针对APPV的特应性免疫反应。由于本发明所述E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2表达产物是APPVE2’蛋白，而非全病毒，因此无病毒扩散的危险。利用本发明所述E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2可获得大量与天然病毒抗原性相似的E2’抗原，作为诊断抗原特异性强，灵敏度高，诊断迅速；作为目的抗原制备的基因工程疫苗高效、安全，具有较大的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1中APPV E2’基因扩增电泳图；
图2为杆状病毒转移载体酶切鉴定图谱；
图3为实施例1中Western blot和SDA-PAGE分析重组杆状病毒AC-4-APPV E2蛋白表达电泳图；
图4为小鼠免疫实施例2中的疫苗后不同时间点抗APPV的抗体水平检测；
图5为实施例2中疫苗免疫小鼠诱导细胞因子水平检测。
生物保藏说明
本发明所述的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2，分类命名：重组杆状病毒AcNPV/pFBD-4-APPVE2，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏CCTCC，保藏号为CCTCC NO：V201855，保藏日期2018年9月28日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
具体实施方式
本发明提供了一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2，所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心保藏CCTCC，保藏号为CCTCC NO：V201855。本发明中，所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2中含有4个拷贝的e2'基因序列，每一个拷贝的e2'基因序列前连接有HBM信号肽序列。在本发明中所述e2'基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述e2'基因的核苷酸序列共有639个碱基，编码214个氨基酸；所述e2'基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。本发明中所述e2'基因为APPV的囊膜糖蛋白E2基因的C端跨膜区缺失后的基因序列，本发明中，所述e2基因全长726个碱基，编码241个氨基酸，所述e2基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述e2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；本发明中使用C端跨膜区缺失的e2'基因的目的是C端跨膜区缺失的e2'基因编码的蛋白质更容易分泌表达。
本发明还提供了所述的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2的制备方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增获得跨膜区片段缺失的编码E2蛋白的核苷酸序列e2'；所述e2'的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
2)将步骤1)中所述e2'与pEASYBLUNT载体连接获得pEASYBLUNT-APPV E2重组载体；
3)以步骤2)中获得的pEASYBLUNT-APPV E2重组载体为模板，用4组引物对分别进行PCR扩增获得连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段；其中第一组引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；第二组引物对的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；第三组引物对的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；第四组引物对的序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
4)将步骤3)中所述的连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段连接到杆状病毒转移载体PFBDHmHNM1P10eEFP中获得第二重组载体，并在所述第二重组载体中的4个e2'目的片段前分别插入HBM信号肽序列，获得杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2；
5)将步骤4)中所述的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2转染昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液获得重组杆状病毒AC-4-APPV E2。
本发明中，PCR扩增获得跨膜区片段缺失的编码E2蛋白的核苷酸序列e2'。本发明中扩增所述e2'基因引物对的设计是以现有公开的APPV-GX-2016分离株中的E2基因序列(公开号KY652092)为模板进行的，在所述引物对的设计过程中，将E2基因C端的跨膜区片段缺失。本发明具体实施过程中，扩增所述e2'基因的引物对的序列如SEQ ID No.13和SED IDNo.14所示。本发明对所述PCR扩增的体系和程序没有特殊要求，采用本领域常规的PCR扩增体系和程序即可。
本发明在扩增获得所述e2'基因后，将所述e2'基因片段通过平末端连入pEASYBLUNT载体中获得pEASYBLUNT-APPV E2载体，将所述pEASYBLUNT-APPV E2载体测序验证上述PCR扩增获得的e2'基因的核苷酸序列是否正确。
本发明以所述测序验证正确的pEASYBLUNT-APPV E2载体为模板，用4组引物对分别进行PCR扩增获得连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段；其中第一组引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；第二组引物对的序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；第三组引物对的序列如SEQIDNo.9和SEQ ID No.10所示；第四组引物对的序列如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示。
本发明将所述的连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段连接到杆状病毒转移载体PFBDHmHNM1P10eEFP(以下简称PFBD)中获得第二重组载体，并在所述第二重组载体中的4个e2'目的片段前分别插入HBM信号肽序列，获得杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2；本发明在获得所述杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2后，优选的使用BamHI和EcoRI，SpeI和NotI,SaIL和HindIII，KpnI和XhoI酶切，根据酶切后的电泳结果，鉴定所述杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2是否构建成功。
本发明优选的将构建成功的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2转入大肠杆菌中进行筛选和鉴定。在本发明具体实施过程中，所述筛选优选为蓝白斑筛选，具体的将杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2转入大肠杆菌感受态细胞后，接种于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素三抗的LB培养基中进行培养，筛选白色单菌落；进行进一步的扩繁后，提取鉴定为阳性的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2。
本发明在获得阳性的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2后，将所述的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2转染昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液获得重组杆状病毒AC-4-APPV E2。本发明中所述转染优选的通过脂质体介导转染法进行，所述转染的昆虫细胞优选为Sf9昆虫细胞。本发明对转染后的细胞培养的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转染细胞培养方法即可。本发明待所述细胞出现病变后，收集上清液获得E2重组杆状病毒AC-4-APPV E2。
本发明还提供了所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2在制备防治仔猪先天性震颤疫苗中的应用。在本发明中，所述防治仔猪先天性震颤疫苗为亚单位疫苗。本发明优选的利用所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2状病毒转染细胞后，大量表达的E2'蛋白，以纯化的E2'蛋白为亚单位疫苗，免疫仔猪后能产生针对APPV的特应性免疫反应，无病毒扩散的危险，高效、安全。
本发明还提供了一种防治仔猪先天性震颤的疫苗，所述疫苗包括所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2表达的E2'蛋白和佐剂。在本发明中，所述疫苗中E2'蛋白的浓度优选为25～35μg/ml，更优选为20μg/ml。本发明中，所述佐剂为SEPPIC ISA-201佐剂。本发明中所述E2'蛋白与佐剂的体积比优选为1:1。本发明所述的疫苗的注射剂量优选为2ml/头；每2ml疫苗中含有E2'蛋白的质量优选为35～45μg，更优选为40μg。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种表达非典型猪瘟病毒E2基因的重组杆状病毒AC-4-APPVE2的构建
(一)重组杆状病毒AC-4-APPVE2的构建
非典型猪瘟病毒E2基因的扩增
参照APPV-GX-2016分离株E2基因序列(序列公开号KY652092)设计引物对，将E2基因C端的跨膜区片段缺失，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SED ID No.14所示。扩增后的电泳结果如图1所示，其中M为2000bpMK；1～4为APPVE2基因扩增。将扩增基因通过平末端连入pEASYBLUNT获得pEASYBLUNT-APPVE2载体，测序验证。
杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2的构建
以质粒pEASYBLUNT-APPVE2为模板，通过带有4对不同的引物扩增目的片段，进而通过BamHI和EcoRI，SpeI和NotI,SaIL和HindIII，KpnI和XhoI将目的基因分别克隆到杆状病毒转移载体PFBDHmHNM1P10eEFP简称PFBD，在此基础上分别插入HBM信号肽序列。本发明中所述载体参见中国专利200910063217.6一种表达扔修饰合成的夹心H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重组杆状病毒。获得的转移载体通过BamHI和EcoRI，SpeI和NotI,SaIL和HindIII，KpnI和XhoI酶切鉴定，结果如图2所示，其中，1为15000bpMK；2为5000bpMK；3为PFBD-4-APPVE2KpnI+XhoI酶切；4为PFBD-4-APPVE2EcoRI+BamhI酶切；5为PFBD-4-APPVE2SpeI+NotI酶切；6为PFBD-4-APPVE2SalI+HindIII酶切。酶切结果显示酶切鉴定片段大小与预期结果一致，表达转移载体构建成功。酶切鉴定结果表明该转移载体PFBD-4-APPVE2含有4个拷贝的APPVE2基因序列。本实施例中所述引物序列见表1。
表1扩增APPVe2’基因所用引物序列
重组杆状病毒AC-4-APPVE2的构建
取1μg杆状病毒转移质粒PFBD-4-APPVE2加入到DHI0Bac大肠感菌感受态细胞中，冰浴30分钟后。于42℃水中热激45秒，然后冰浴2分钟，加900微升SOC液体培养基，37℃振摇培养4h，取100微升涂布于三抗LB平板(Kan、Gen和Tel)，37℃培养24～48h。挑取经过3轮蓝白筛选的单个白菌落于10mL含有适宜浓度卡那霉素、庆大霉素、四环素三抗的LB培养基中，于37℃摇床(180rpm/min)培养16h。离心收集细菌，加入0.3mLSolutionⅠ重悬，加入0.3mLSolutionⅡ轻轻混匀，立即加入0.3mLSoutionⅢ混匀，冰浴10min，4℃12000rpm离心10min，转移上清于另一无菌空白的1.5mLEP管中，加入0.5mL异丙醇混匀后静置10min，4℃12000rpm离心10min，弃掉上清后用75％乙醇洗涤，干燥后加入30-50μLTE溶解，4℃保存。
利用脂质体介导转染法，将鉴定阳性的杆粒转染Sf9昆虫细胞：将Sf9细胞接种于六孔板中，待细胞长到80-90％时进行转染，取两个1.5mL无菌Ep管。A管中加入100μL无血清Grace’s培养基和8μLcellinfection，管B中依次加入100μL无血清Grace’s培养基和1-2ug重组的Bacmid，室温静置5-10min，将管B中的溶液逐渐滴滴加至管A中，室温静置20min，然后补加无血清Grace’s培养基至1mL。将1.5mLEp管中的混合物加至单层细胞上，于27℃培养箱中培养5-6h，更换完全的Grace’s培养液，继续培养2-3d，待出现细胞病变后，收集培养物上清液即获得了重组杆状病毒AC-4-APPVE2。
实施例2
以实施例1中重组杆状病毒AC-4-APPVE2为对象
Westernblot分析检测APPVE2基因的表达
将sf9细胞接种6孔板，待细胞长至90％时，以0.1MOI剂量接种实施例1中的重组杆状病毒AC-4-APPVE2。接种72小时后分别收集细胞培养上清和细胞。SDA-PAGE跑胶后，转入PVDF膜，以商品化His抗体为一抗(MBL,美国)，HRP标记的羊抗鼠IgG(武汉博士德生物)为二抗，通过ECL显示液检测APPVE2蛋白表达。结果显示重组杆状病毒AC-4-APPVE2感染上清和细胞样品中均出现一条35kDa左右的特异性条带。实验结果如图3A所示，其中1为杆状病毒AC-4-APPVE2感染细胞上清；2为杆状病毒AC-4-APPVE2感染；3为正常细胞对照；由此可见重组病毒杆菌AC-4-APPVE2感染昆虫细胞表达E2’蛋白分泌在是上清中。
SDA-PAGE检测纯化的APPVE2蛋白
以0.0001MOI剂量将实施例1中获得的重组杆状病毒AC-4-APPVE2接种HF细胞(1*106/ml)，接种4天或5天后收取，4度保存。收取后也可直接10000rpm，离心10min，收获培养上清。0.45mm或0.22μm滤器过滤上清。取20ml用平衡缓冲液平衡好的His填料，加入到过滤的上清中，4度搅拌过夜。将与His填料结合过夜的APPVE2蛋白放入柱子中，自由滴落，将流穿液再次与His结合，自由滴落。0mm咪唑10mmTris-200mmNaCl缓冲液洗脱2个柱体积，然后20mm咪唑10mmTris-200mmNaCl缓冲液洗脱2个柱体积进行洗杂蛋白。最后200mm咪唑10mmTris-200mmNaCl缓冲液洗脱2个柱体积，进行目的蛋白洗脱。洗脱后蛋白经过脱咪唑处理，取30-50μl样品进行SDS-PAGE检测。结果如图3B所示，其中1-5为不同咪唑浓度洗脱目的蛋白；6为阴性对照；MK为蛋白MK。有图3B所示，在35kDa作左右纯化出特异性条带，条带纯度在95％以上。
实施例3
一种防治仔猪先天性震颤的疫苗
(一)、重组杆状病AC-4-APPVE2亚单位疫苗制备
以实施例1获得重组杆状病毒AC-4-APPVE3，按照以0.0001MOI剂量接种HF细胞(1*106/ml)，培养5天后，离心收获上清，经镍柱纯化，SDS-PAGE检测。计算E2’蛋白含量，以40μg/ml剂量与SEPPIC的ISA-201佐剂进行乳化制备亚单位疫苗，每头份2ml，含有40μg的APPVE2’蛋白。制备好亚单位疫苗经无菌检验后存于4度保存。
(二)、重组杆状病毒AC-4-APPVE2制备的亚单位疫苗的安全性试验
制备3批所述亚单位疫苗，每批分别免疫断奶仔猪和妊娠母猪，每批分别接种10头猪。接种方式为颈部肌肉注射，接种当天测量体温和观察采食状况。试验结果表明，疫苗接种后体温、精神和食欲均正常。证实该疫苗对断奶仔猪和妊娠母猪均是安全的。
(三)、重组杆状病毒AC-4-APPVE2制备的亚单位疫苗在断奶仔猪上免疫原性试验
为了系统评价上述指标的亚单位疫苗的有效性。购买4-6周龄PCR检测APPV阴性仔猪10头，随机分成2组。免疫剂量为1头份，免疫途径为肌肉注射。首次免疫后21天以同样剂量加强免疫一次。免疫前及免疫14，28，42天前腔静脉采血，免疫21天采集抗凝血分离淋巴细胞，通过APPVE2蛋白刺激分离淋巴细胞，收获上清，测定细胞因子含量。
1.机体产生针对APPV的特异性抗体检测
间接ELISA法检测APPV抗体，操作步骤如下：以本发明的重组杆状病毒表达纯化的APPVE2蛋白包被ELISA板，进行方阵滴定，确定每孔包被0.5μg，4℃过夜。然后用1％BSA37℃封闭1h。洗涤后每孔加入50μL100倍稀释的待检血清，孵育1h。洗涤3遍，每孔加入50μL10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠或兔IgG，37度孵育1h。洗涤后加入TMB底物溶液，室温显色10min。每孔加入50μL2mol/LH2SO4终止溶液终止反应，测定OD450值。结果表明，免疫本实施例制备的亚单位疫苗，在免疫后14，28和42天时均能检测到特性性的APPVE2抗体，而且随着加强免疫，抗体水平随着升高，在免疫42天时达到高峰(如图4所示)。而对照组没有检测到相应的抗体。上述结果证实，AC-4-APPVE2制备的亚单位疫苗能有效诱导产生针对APPV的特应性抗体。
2.机体产生特异性细胞免疫反应检测
(1)采集猪前腔静脉血2mL，立即注入无菌的抗凝管中，轻摇匀，使血液抗凝。在超净台中，与2ml的1640在15ml的离心管中混匀。取一只新的15ml离心管加入4ml的淋巴细胞分离液，然后小心的慢慢的加入稀释后的抗凝血。于室温下2000rpm/min离心30min，离心后，管内可分为四层：上层为血浆及大部分血小板，下层为红细胞及粒细胞，中层为细胞分层液，分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。小心吸取淋巴细胞层于新的15ml离心管中，加入6ml的空白1640培养基，室温下2000rpm/min离心20min。重复一次后，加以1ml的含10％胎牛血清的RPMI-1640生长液重悬。在显微镜下计数，调整细胞浓度为1×106/mL。混匀后加入12孔板，每孔500μL。每个样品分别用纯化的APPVE2蛋白，刀豆素(阳性对照)和培养液(阴性对照)刺激，且每种刺激物做3个重复；将12孔细胞培养板放置37℃，5％CO2温箱中培养24h，然后离心收获上清。用商品化猪IFN-γ和IL-4ELISA检测试剂盒分别检测上清中IFN-γ和IL-4蛋白表达水平，试剂盒采用双抗夹心ELISA。
APPVE2亚单位疫苗免疫组产生IFN-γ的量是最高的，含量是150pg/ml，与其对照组相比，差异显著(P<0.05)(如图5所示)。同样的除了阴性对照组，APPVE2亚单位疫苗免疫组IL-4的量是升高的，差异显著(P<0.05)。这些结果说明试验中的亚单位疫苗能很好地诱导细胞免疫反应的应答。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcatgcc acaaaagaga agactattac aatctccagt tagttgtcga agaaaagaca 60
ggcgtagaaa aacggtccat aatgggcaag tgggctgtga taaccggaga aggtcgggaa 120
ccaaaactaa tggagcaaat aaacatagtg tcaaatggca gcctgtcaga aacttactgc 180
tataatacgc taaatactag catttggagg cggcaaccgg caagacagag agggtgtggt 240
cagactgtgc cctattggcc cggtgacaat gttttagaag aacagtatta tagctcaggc 300
tactgggtga atgcgacggg cggttgccag ctgagagaag gcgtatggct gtcaagaaag 360
ggcaatgtac agtgccaacg caatggctca tccttgatac tgcaattggc gataaaagaa 420
gagaatgaca ctatggaaat accatgtgac ccggtggaaa cagaaagcat gggtccagtc 480
gcacagggca cttgcgtgta cagctgggca tttgccccaa gggggtggta ctataacagg 540
aaagatggtt actggctcca gtatataaag aaaaacgact accagtactg gacaaaaatg 600
cctaccgtct catccgctgc aacgatgtac cgtcattaa 639
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Cys His Lys Arg Glu Asp Tyr Tyr Asn Leu Gln Leu Val Val
1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Ala
20 25 30
Val Ile Thr Gly Glu Gly Arg Glu Pro Lys Leu Met Glu Gln Ile Asn
35 40 45
Ile Val Ser Asn Gly Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Thr Leu
50 55 60
Asn Thr Ser Ile Trp Arg Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly
65 70 75 80
Gln Thr Val Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Tyr Ser Ser Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg
100 105 110
Glu Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn
115 120 125
Gly Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr
130 135 140
Met Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val
145 150 155 160
Ala Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp
165 170 175
Tyr Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn
180 185 190
Asp Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Val Ser Ser Ala Ala Thr
195 200 205
Met Tyr Arg His
210
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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ggcgtagaaa aacggtccat aatgggcaag tgggctgtga taaccggaga aggtcgggaa 120
ccaaaactaa tggagcaaat aaacatagtg tcaaatggca gcctgtcaga aacttactgc 180
tataatacgc taaatactag catttggagg cggcaaccgg caagacagag agggtgtggt 240
cagactgtgc cctattggcc cggtgacaat gttttagaag aacagtatta tagctcaggc 300
tactgggtga atgcgacggg cggttgccag ctgagagaag gcgtatggct gtcaagaaag 360
ggcaatgtac agtgccaacg caatggctca tccttgatac tgcaattggc gataaaagaa 420
gagaatgaca ctatggaaat accatgtgac ccggtggaaa cagaaagcat gggtccagtc 480
gcacagggca cttgcgtgta cagctgggca tttgccccaa gggggtggta ctataacagg 540
aaagatggtt actggctcca gtatataaag aaaaacgact accagtactg gacaaaaatg 600
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gctagc 726
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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35 40 45
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50 55 60
Asn Thr Ser Ile Trp Arg Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly
65 70 75 80
Gln Thr Val Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Tyr Ser Ser Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg
100 105 110
Glu Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn
115 120 125
Gly Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr
130 135 140
Met Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val
145 150 155 160
Ala Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp
165 170 175
Tyr Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn
180 185 190
Asp Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Val Ser Ser Ala Ala Thr
195 200 205
Met Tyr Arg His Leu Leu Pro Leu Leu Val Ala Cys Leu Met Gly Gly
210 215 220
Arg Ile Ser Val Trp Ile Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Gln Val Glu
225 230 235 240
Ala Ser
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtaccatgt catgccacaa aagagaag 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgagttaa tgacggtaca tcgttgc 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggatccatgt catgccacaa aagagaag 28
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaattcttaa tgacggtaca tcgttgc 27
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagcttttaa tgacggtaca tcgttgc 27
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actagtatgt catgccacaa aagagaag 28
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcggccgctt aatgacggta catcgttgc 29
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgtcatgcc acaaaagaga ag 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttaatgacgg tacatcgttg c 21

Claims (7)

1.一种非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2，其特征在于，所述非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：V201855。
2.权利要求1所述的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2的制备方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增获得跨膜区片段缺失的编码e2'蛋白的核苷酸序列e2'；所述e2'的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
2)将步骤1)中所述e2'与pEASYBLUNT载体连接获得pEASYBLUNT-APPV E2重组载体；
3)以步骤2)中获得的pEASYBLUNT-APPVE2重组载体为模板，用4组引物对分别进行PCR扩增获得连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；以及连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段；其中第一组引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；第二组引物对的序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；第三组引物对的序列如SEQ IDNo.9和SEQID No.10所示；第四组引物对的序列如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示；
4)将步骤3)中所述的连接有BamHI和EcoRI酶切位点的e2'目的片段，连接有SpeI和NotI酶切位点的e2'目的片段，连接有SaIL和HindIII酶切位点的e2'目的片段；和连接有KpnI和XhoI酶切位点的e2'目的片段连接到杆状病毒转移载体PFBDHmHNM1P10eEFP中获得第二重组载体，并在所述第二重组载体中的4个e2'目的片段前分别插入HBM信号肽序列，获得杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2；
5)将步骤4)中所述的杆状病毒转移载体PFBD-4-APPVE2转染昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液获得重组杆状病毒AC-4-APPV E2。
3.权利要求1所述的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPVE2或权利要求2所述的制备方法制备获得的非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2在制备防治仔猪先天性震颤疫苗中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述防治仔猪先天性震颤疫苗为亚单位疫苗。
5.一种防治仔猪先天性震颤的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括非典型猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒AC-4-APPV E2表达的E2’蛋白和佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中E2’蛋白的浓度为25～35μg/ml。
7.根据权利要求5或6所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为SEPPIC ISA-201佐剂。
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