CN110124023A - 鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫组合物，其包含采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。所述免疫组合物可应用为鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗，其抗原表达水平较高，能够自发组装成病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)，免疫原性强，对鹅没有致病性，并且本发明的鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

Description

鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及动物免疫药物技术领域，具体而言，涉及一种鹅星状病毒病毒样颗粒新型基因工程亚单位疫苗。

背景技术

星状病毒(Astroviridae，AstV)是一类无囊膜、呈球形、直径为28-30nm的单股正链RNA病毒。星状病毒科分为两个属，哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽 星状病毒属(Avastrovirus)，禽星状病毒可以引起禽类发生多种疾病。鹅星状病毒(Goose AstV,GAstV)属于禽星状病毒3型，该病毒的感染具有一定的流行性，主要侵害幼龄雏 鹅，以5-20日龄为主。鹅感染GAstV后，发病率高达80-90％，病程持续7-10天，主 要症状为雏鹅痛风，死亡率20-70％，对肉鹅养殖业造成严重经济损失。

目前鹅星状病毒使用抗病毒和抗菌治疗方法无效，并且尚无疫苗可以进行预防；常规弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险，灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱、灭活 不完全、造成散毒的风险，因此，现有技术亟需一种安全高效能预防鹅星状病毒的新 型基因工程疫苗，本发明因此而来。

发明内容

本发明旨在提供一种免疫组合物，其可以应用为鹅星状病毒病毒样颗粒基因工程亚单位疫苗，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。

本发明进一步的技术方案是：所述的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序 列。

本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱 导针对鹅星状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防鹅星状病毒 感染的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种核酸分子，其可以用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％ 以上相同的顺序核苷酸序列。

本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导 针对鹅星状病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鹅星状 病毒感染的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种蛋白，其选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的蛋白。

本发明的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对鹅星状病毒的免 疫反应的免疫组合物，包含：

所述的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白，和佐剂。

本发明的又一目的在于提供所述的蛋白用于制备鹅星状病毒病毒样颗粒基因工程 亚单位疫苗方面的应用。

本发明的又一目的在于提供一种产生所述的蛋白的方法，其包括以下步骤：

S1.制备用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的核酸分子；

S2.构建重组载体，将步骤S1所述的核酸转入重组质粒载体中；

S3.将重组质粒载体与Sf9细胞混合，在转染试剂存在的条件下进行细胞转染；

s4.在有利于表达所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的条件下培育所述Sf9细胞；进而重组表达产生所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。

所述方法还包括：

S5、将S4步骤中重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白加入到药学上可接受的载体中，得到所述免疫组合物。

所述转移载体选自pFastBac1、pVL1393中的任意一种。

步骤S3中，所述转染试剂为转染培养基稀释的Cellfectin。

本发明目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的鹅星状病毒基因工程亚单位疫苗，为达到以上目的，本发明使用Sf9细胞表达重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白Cap 蛋白(capsidprotein)，该结构蛋白能够自发的形成VLPs(Virus like particles)，形成 的VLPs具有极好的免疫原型以及安全性，然后将VLPs制作疫苗，激发更强更全面的 抗体保护。

本发明公开了一种Sf9细胞表达的鹅星状病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鹅体内产生较强的体液免疫，免疫后的鹅能够抵御星状病毒 的感染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业 化生产的鹅星状病毒重组亚单位疫苗的制备方法：1)重组杆状病毒构建：包含将GAstV Cap蛋白的编码基因克隆到穿梭载体pFastBac1载体上得到重组穿梭载体，再将重组 穿梭质粒转化到含有杆状病毒基因组Bacmid的DH10Bac菌中，重组穿梭载体中目的 基因表达框定向插入bacmid中，获得含有目的基因表达框的重组Bacmid，将重组 bacmid转染Sf9细胞获得重组杆状病毒；2)重组病毒的检测：包括转染收获产物的蛋 白SDS-PAGE、WB检测，电镜检测以及病毒继代的免疫荧光检测、病毒滴度检测；3) 重组蛋白大规模的生产：包括将获得的重组杆状病毒接种Sf9细胞在反应器中大规模 生产目的蛋白并使用Elisa定量以及琼扩检测；4)疫苗制备以及疫苗效力检测。

本发明提供的方法能够通过无血清全悬浮培养制备抗原蛋白，生产方便，也大大降低了疫苗生产成本。

采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：

本发明的免疫组合物生产过程不涉及全病毒，通过Sf9细胞进行蛋白表达，表达的Cap蛋白能够自发的组装成VLPs，产品的抗原性、免疫原性强，表达水平较高。 悬浮培养，易于大规模生产。

本发明使用Sf9细胞表达Cap蛋白，产品的抗原性、免疫原性强，表达水平较高， 对鹅没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备， 也大大降低了疫苗生产成本。本发明的亚单位疫苗可以大规模生产，供量充足，质控 容易，安全性高，稳定性好，生产成本低。

本发明使用了优化的Cap蛋白序列，使用悬浮培养Sf9细胞进行表达，表达水平 较高，蛋白免疫原性好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为将Cap蛋白基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个2.1kbp的条带；其中1为AstV-Cap基因，2为阴性对照，M为分子量标记；

图2为多个Cap蛋白基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳 的结果，2.1kbp条带出现为阳性样品。其中1～5均为Cap蛋白基因转化的菌落样品 PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；

图3为构建的含有目的基因的转移载体pF-Cap图谱；

图4为实施例3中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果， rBac-Cap细胞培养物在分子量约106kDa附近出现目的条带；其中1为实施例3中收 获的细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；

图5为实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物Western Blot检测结果；其中1为组 杆状病毒表达样品，2为阴性对照，M为分子量标记；

图6为GAstV的Cap蛋白病毒样颗粒电镜图；

图7为使用本发明疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组雏鹅解剖的对比结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技 术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单 数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含” 和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明提供了一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。

本发明也涉及一种诱导针对鹅星状病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的疫苗。

本发明也涉及一种保护受试动物免受鹅星状病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。

本发明还包括适用于诱导针对鹅星状病毒的免疫反应的疫苗。本发明的疫苗可为包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。 佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、 TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、 IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或 RANTES。

本发明的疫苗还包含蛋白分子。本说明书提供选自由以下组成的组的蛋白：包含SEQ ID NO:2的蛋白；在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白； SEQ IDNO:2的片段；与SEQ ID NO:2的片段95％相同的蛋白。

本说明书还提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2；(b)在如SEQIDNO:2所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:2 的包含SEQ ID NO:2的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2 的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性 片段。

本发明的疫苗还包含核酸分子。本还提供包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的 序列：SEQ ID NO:1；在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序 列；SEQID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段95％相同的核苷酸序列。

本发明一些方面提供诱导针对鹅星状病毒的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用鹅星状病毒抗原和/或其组合物。

本发明另外的方面提供保护个体免受鹅星状病毒感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所 述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护 性免疫反应。

本发明的一些方面提供一种诱导针对鹅星状病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的核酸分子。

本发明的一些方面提供一种保护受试动物免受鹅星状病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。

在另一方面，本发明提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2；(b)在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:2的包含 20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长 度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。

本发明的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对鹅星状病毒的免疫反应 的疫苗，所述疫苗包含：本发明的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表 皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33 或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本发明的疫苗可还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸 分子编码的蛋白。

1.定义.

本说明书所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一 种”和“所述”包括复数形式。

对于本说明书所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的 范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本说明书所用的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述 编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

如本说明书所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、 其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、 双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆 抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足 够的结合特异性。

如本说明书所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核 酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起 始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表 达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本说明书所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷 酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。

如本说明书所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定鹅星状病毒抗原的一队 列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定鹅星状病毒抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包 含编码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。

如本说明书可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用 跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本说明书所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株 鹅星状病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株鹅星状病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少 80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少 20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个 氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸 或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更 多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、 至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至 少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少 210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240 个氨基酸或更多。

如本说明书所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述 调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化 信号。如本说明书所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操 作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞 中时，编码序列将表达。

如本说明书所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用 功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时， 如本说明书所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序 列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本说明书所用的术语“基本上同源”是指探针 可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。

在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本说明书所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比： 最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位 置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数 量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或 者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单 一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧 啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列 算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本说明书所用的“免疫反应”意指响应于抗原如鹅星状病毒共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反 应或两者的形式。

如本说明书所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少 两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链 的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖 了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的 探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧 核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟 嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过 化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本说明书所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子 的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所 控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动 子功能的情况下进行调整。

如本说明书所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便 进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强 子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子 可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对 于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激 如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启 动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵 子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本说明书可互换使用并且是指可以被连接在本说明书所 述的鹅星状病毒蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本说明书所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽 /前导序列常常从蛋白的剩余部分裂解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋 白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。

如本说明书所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。 严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离 子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以 是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的 50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的 探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的 钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短 的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核 苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择 的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条 件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％ SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

如本说明书所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区 域内与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。

如本说明书所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸 或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、 98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补， 则第一序列和第二序列也这样相同。

“亚型”或“血清型”：如本说明书交换使用的并且关于鹅星状病毒，意指鹅星状病毒的基因变体，以使得一个亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。

本说明书就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参 考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者 (iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基 酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保 守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替 换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化 可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的 考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。 在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示 会产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述 肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测 量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例 如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲 疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是， 与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是 那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。

如本说明书所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可 以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

2.疫苗

本发明的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种鹅星状病毒血清型的免 疫反应的程度或强度。疫苗可包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可为编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。本发明的疫苗可 包含鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。鹅星状病毒外衣壳结构蛋白是通过诱导1)细胞毒 性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上 提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。

所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗鹅星状病毒免疫反应。鹅星状病毒抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片 段或其组合。

一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码序列具有96％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书核酸编码 序列具有97％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本说明书 核酸编码序列具有98％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与 本说明书核酸编码序列具有99％同源性的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本说 明书所公开的蛋白的编码序列同源的本说明书所公开的编码序列的核酸分子包含编码 IgE前导序列的连接至编码本说明书所公开的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序 列。

在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至 少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至 少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1。 片段可与SEQ ID NO:1的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％ 相同。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至 少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至 少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前 导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一 些实施方案中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如 SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及 与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案 涉及与如SEQ IDNO:2中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％相同的氨基酸序 列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基 酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方 案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上 90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中 所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫 原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ IDNO:2中所述的全长共有氨基酸序列的 整个氨基酸序列长度上92％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具 有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同 的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全 长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。 一些实施方案涉及具有在如SEQ IDNO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸 序列长度上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序 列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基 酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方 案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上 98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中 所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨基酸序列的免疫 原性蛋白。

在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至 少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至 少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至 少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2的免疫原性片段。免疫 原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、 至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、 至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、 至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如 像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一 些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、 至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、 至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:295％同源的蛋白。一些实施方案 涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施 方案涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些 实施方案涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。 一些实施方案涉及与本说明书蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性 片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE 前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导 序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、 至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、 至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的整个长度 上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相 同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE 前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导 序列，例如像IgE前导物。

3.疫苗构建体和质粒

疫苗可包括编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白、鹅星状病毒抗原以及鹅星状病毒外衣壳结构蛋白/抗原的组合的核酸构建体或质粒。本说明书提供可以包含编码本说明 书所公开的鹅星状病毒抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、 与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外， 本说明书提供可包含编码本说明书公开的鹅星状病毒表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白 序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗 传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体 可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。

所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微 生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编 码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来 转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。

编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终 止密码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列 的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启 动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病 毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV) 启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr) 病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启 动子，所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋 白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动 子。

所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在鹅星状病毒核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、 LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚 腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是 来自pCEP4载体(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。

载体也可包含在共有鹅星状病毒核心蛋白编码序列或共有鹅星状病毒表面抗原蛋 白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以 是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、 HA、RSV或者EBV的一种增强子。

载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或 者pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，这可以 在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者 pVax1变体，如本说明书所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒 pVAX1(Invitrogen，Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基 137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811 处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是 在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。

所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli) 中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母 的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可以具有 MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆 虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNAI或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，其可用于在动物细胞如Sf9细胞系中产生蛋白。所述载体可以是通过常规技术 和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括Sambrook 等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor(1989)。

本发明用于编码鹅星状病毒重要抗原蛋白外衣壳结构蛋白的核苷酸序列优选是原 始序列，增加以及截短的序列，Capsid蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列；重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达系统转移载体包括但不限于pFastBac1， pVL1393等，例如可以优选采用pFastBac1。昆虫细胞系可以是为Sf9、High Five、S2 或Sf21细胞，优选的用Sf9。

实施例1转移载体pF-Cap构建与鉴定

1.Cap蛋白基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的GAstV Cap蛋白基因(SEQ ID NO:1)并克隆到pUC17质粒上，得到pUC-Cap质粒载体。以 pUC-Cap质粒作为模板，Cap-F、Cap-R作为上下游引物进行PCR扩增(Cap-F、Cap-R 的基因序列如SEQ IDNO.3、4所示)，扩增体系见表1。

表1 Cap蛋白基因扩增体系

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1 分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在2.1kbp的位置出现 目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切与纯化将pFastBac 1质粒和Cap蛋白基因PCR扩增产物使用BamHⅠ、 HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac 1质粒 以及Cap蛋白基因PCR产物。

表2 Cap蛋白基因PCR产物酶切反应体系

表3 pFastBac 1质粒酶切反应体系

3.连接将双酶切的pFastBac 1质粒和Cap蛋白基因PCR产物酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表4。

表4 Cap蛋白基因PCR酶切产物与pFastBac 1质粒酶切产物连接体系

4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟， 42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃ 培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃ 培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培 养2小时，以菌液作为模板，Cap-F和、Cap-R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR 产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图2所示，出现2.1kbp条带的样品为阳性 样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含 有目的基因的转移载体pF-Cap其示意图如图3。

实施例2重组杆状病毒基因组Bac-Cap构建

1.DH10Bac菌转化分别取实施例1中1μl pF-Cap质粒加入100μl的DH10Bac感 受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl 不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100μl菌液稀释81倍后，取100μl 稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培 养基上，37℃培养48小时。

2.挑选单克隆使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌 落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质 粒。获得重组质粒Bacmid-Cap质粒。

实施例3重组杆状病毒转染

六孔板中每个孔接种0.8×10⁶个Sf9细胞，细胞汇合度为50～70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基T1稀释4μl的Cellfectin转染试剂，短暂 的漩涡震荡；用100μl转染培养T1基稀释3μg实施例2中的重组Bacmid-Cap质粒， 分别将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入 上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2ml SF-SFM新鲜培养基，27℃ 培养4～5日收获上清。获得重组杆状病毒rBac-Cap，对收获的P1代重组杆状病毒使 用MTT相对效力法检测病毒滴度，rBac-Cap P1种毒病毒滴度为3.4×10⁷pfu/mL。扩 增重组杆状病毒rBac-Cap作为种毒备用。

实施例4 SDS-PAGE检测

将实施例3中收获的细胞培养物进行SDS-PAGE检测，同时使用感染空杆状病毒 的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loadingbuffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝 胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

如图4所示，rBac-Cap细胞培养物在分子量约106kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例5 Western Blot鉴定

分别将实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用 5％脱脂牛奶封闭2小时，鹅源抗AstV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗 鹅多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学 发光成像仪拍照。如图5所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目 的条带，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例6间接免疫荧光检测

向96孔细胞培养板中加入转染过rBac-Cap的Sf9细胞悬液，100μl/孔(细胞浓 度为2.5×10⁵～4.0×10⁵个/ml)，接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板 底壁，然后每孔加入10μl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃ 恒温培养箱中培养72～96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先与鹅源抗 AstV多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗鹅IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。 接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察 到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。

实施例7表达产物电镜检测

将重组杆状病毒细胞培养物超声破碎，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩10倍。每个离心管加入 浓度为40％的蔗糖溶液10ml，然后加入2.0ml超滤浓缩样品，29000r/min超速离心2 小时，弃上清，沉淀用2.0ml PBS重悬。然后将悬液经过浓度分别为50％、60％、70％、 80％的梯度浓度蔗糖离心，29000r/min超速离心2小时，然后收集位于60％～70％浓 度交界处的条带。将少量的纯化浓缩后的GAstV病毒样颗粒样品滴加到有碳膜的铜网 上，自然风干后，滴加2％磷钨酸钠溶液进行负染，负染后进行电镜观察。如图6所示， GAstV的Cap蛋白能够自发的组装成直径大小约20nm病毒样颗粒。

实施例8昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及Cap蛋白的表达定量以及琼 扩效价测定

在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cell/mL，活力大于95％时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cell/mL。当细 胞浓度达到3-5.5×10⁶cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度 为3-5.5×10⁶cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-8.5×10⁶cell/mL时， 接种重组杆状病毒rBac-Cap，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧 30-80％、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培 养阶段温度设定27℃、溶氧50％、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9 天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na₂S₂O₃终止 灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。

制备的上述疫苗抗原中Cap蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包 被缓冲液稀释鹅抗鹅星状病毒多抗血清至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗 涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过粒子交换层析，疏水层析， 分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔 加入检测抗体-Cap蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗- 即HRP标记的羊抗鹅IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Cap蛋白的量。

按照实施例7，大规模制备的Cap蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中蛋白的 平均含量分别约165mg/L。

制备的疫苗抗原中，使用琼扩效价法检测Cap蛋白：在5块琼脂糖凝胶板上打梅 花孔，在梅花孔中间加入鹅星状病毒抗血清，5块板周围分别加入稀释了2的0、1、2、 3、4、5次方的5种疫苗原液。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释 比例为其琼扩效价琼扩效价检测结果。疫苗原液中Cap蛋白的琼扩效价为1∶64。

实施例9疫苗的制备

取实施例7中表达疫苗原液，使得抗原蛋白的浓度达到50mg/mL，然后将疫苗原 液与油佐剂按照2：3的比例配置成油乳剂疫苗。具体的，每1L的疫苗原液加入白油 1429g，司本70.2g，硬脂酸铝8.43g以及吐温53.3g。然后用乳化破碎机破碎乳化制 备成油乳佐剂灭活苗。

实施例10安全性检验

取7日龄雏鹅20只，随机分为2组，每组10只。第一组为实验组，第二组为对 照组。实验组腿部肌肉注射实施例8制备的灭活疫苗，0.3ml/只；对照组腿部肌肉注射 等量灭菌白油佐剂。每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位的局部炎症反应， 持续10日，10日后对实验组动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况。

结果显示，实验组与对照组动物均生长发育正常，精神状态良好；剖检后发现疫苗注射部位吸收良好，无红肿组织坏死等炎症反应。说明本发明制备的灭活疫苗安全 性好，对动物生长无影响。

实施例11效力评价实验

将实施例8中制备好的鹅星状病毒灭活疫苗分别以0.3ml腿部肌肉注射7日龄雏鹅15只，另设阴性对照只免疫白油佐剂组15只。免疫后21日，各组试验鹅均用鹅星 状病毒SD-WM株进行腿部肌肉注射攻毒，每只0.2ml，隔离饲养。观察14日后，发 现免疫组雏鹅均未见明显的临床症状，无死亡，免疫保护率为100％；对照组陆续出现 死亡，死亡12只。解剖死亡和未死亡的对照组鹅，死亡的鹅心脏，肝脏，肺脏，肾脏 甚至整个内脏器官均有尿酸盐沉积，个别雏鹅肝脏有大小不一的白色坏死点(图7)， 未死亡的鹅未出现明显病变。结果证明，本发明制备的灭活疫苗免疫效力合格。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的 任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 鹅星状病毒新型基因工程亚单位疫苗

<130> 2019.04.04

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2154

<212> DNA

<213> 鹅星状病毒(Goose astrovirus)

<400> 1

ggatccatgc atcaccatca ccatcacgaa ttcatggctg atcgagccgt ggctccacga 60

gagaaggtga ccaagaaggt gaccaaggtg gtgaccgtga agaagaagca ccccaagaag 120

aagcccaagc agaaggtgta caagccccag aagctgccaa tgaaggccga gcgaaagctg 180

gagaaggagg tcaagggcct gaagaagcga gtggccggac caccagtgaa cgacaagatg 240

accaccacca tcaccctggg ccagattacc ggaaacagca ccgacaccct ggatcgcaag 300

cacaagtact tcaccaaccc cctgatgatg aagaaccagg agaacggaca gaccgccaca 360

ccactgagca tccgagccag ccagtacaac ctgtggcgca tccgcaagct gcacattcga 420

ctggtgccat tggccggacg agccaatatc ctgggcagcg tggtgttcct ggacatcgag 480

caggaagcca ataccgccgg accagagagc atcgatacca tcaaggcccg cccacatctg 540

gagctgccaa ttggcagcaa gcacctgtgg cgagtgcagc cacgattgat gcagggacca 600

cgacagggtt ggtggaacgt ggaccccggc gatagcccaa ccgatagtct gggaccagcc 660

atcaacatgt ggacctacct gaagaccgtg aacgccctga gcgctcaagc tcaagctcag 720

caagtgccct acaccagcgc tctgtttctg gtggaggcca ccgtgaccta cgagttcagc 780

aactacggac caaagccagg cctgagcctg atgacaagcg agacactgag cgccagcgga 840

aagacagcta ccctggtgaa cacccaggac ggagctttgg ctctgacagt gtcgggagct 900

ctgcagcgtt tcctggacga gaaggagcag caccgtcgag tgtccaacgc tcagacaagc 960

ggagtgggag aggtcttttg ggccgtgtcc acagaggtgg tggaaacagt ggccagcgct 1020

ttgggaggat ggggttggct gttgaaggga ggttggttcg tgatccgcaa gctgttcgga 1080

gccgccagca atagcggcag cacctacctg atctacagca gcgtgtccga cgcccagatc 1140

gatagccgca tctaccagac cgtgccaacc aacacaccac tgcagctggc cgctaacaca 1200

gtgaagctgg tgcagctgac ccagccaaac gtcaatacca ccggccaggg aacaaccgtg 1260

ctgagtcgag acgccgatta cctgccactg ccagtggctc caatccaagt gaccccaagc 1320

ctggtgtaca acttccaagg cgagcgacag agcaccaccg agagctgcag cttcctggtg 1380

ttcggcatcc cccaggccga gagtcgcagt cgttacaacg ccgccatcac cttcaacgtg 1440

ggctatcgcg gacgcacaag caccagcttc accctgggaa cccacaattg gtgggccgtg 1500

atgaccctga gccagaccgg agtgatcttc gctccaccag ccgtgggaac aggagtgtgc 1560

aataccctgg ccaccgctat ccagcacctg aatccagagc tggaaacagc cgtgttgcga 1620

gtgaatacca gcaccaccag caccggagga ctgattaccg agctgcgcaa ccgcctgaac 1680

atcgccgacg gagattacgt gatcagcatg ggcgatcccc agggaaatcg tagcgccctg 1740

tacttccgca actccgacca gaagtgggtg tggttgtggg ccggagatag cgatccagga 1800

gagaccttcc aaaacttcaa gatgcccgtg ctgatcaatt ggagcgtgtc cgacagccag 1860

ggccaataca acgcccgcgt gcgaatggtg cagtacgcta acgcccagca gcagacactg 1920

accgatccag aggaggacga cgatccactg tccgatgtga ccagcctgtt cgatccaacc 1980

gccgaggacg agaccgattt ccatctggcc gtgtccctga agaccagcga ctacctgaag 2040

gaggaggccg agtattggaa ggccaaggct caggccctgc tgatggaaaa ggccttgagc 2100

gctccacaag ccggagccgt gcgatttgag aagggaggac acgaataaaa gctt 2154

<210> 2

<211> 713

<212> PRT

<213> 鹅星状病毒(Goose astrovirus)

<400> 2

Met His His His His His His Glu Phe Met Ala Asp Arg Ala Val Ala

1 5 10 15

Pro Arg Glu Lys Val Thr Lys Lys Val Thr Lys Val Val Thr Val Lys

20 25 30

Lys Lys His Pro Lys Lys Lys Pro Lys Gln Lys Val Tyr Lys Pro Gln

35 40 45

Lys Leu Pro Met Lys Ala Glu Arg Lys Leu Glu Lys Glu Val Lys Gly

50 55 60

Leu Lys Lys Arg Val Ala Gly Pro Pro Val Asn Asp Lys Met Thr Thr

65 70 75 80

Thr Ile Thr Leu Gly Gln Ile Thr Gly Asn Ser Thr Asp Thr Leu Asp

85 90 95

Arg Lys His Lys Tyr Phe Thr Asn Pro Leu Met Met Lys Asn Gln Glu

100 105 110

Asn Gly Gln Thr Ala Thr Pro Leu Ser Ile Arg Ala Ser Gln Tyr Asn

115 120 125

Leu Trp Arg Ile Arg Lys Leu His Ile Arg Leu Val Pro Leu Ala Gly

130 135 140

Arg Ala Asn Ile Leu Gly Ser Val Val Phe Leu Asp Ile Glu Gln Glu

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ala Gly Pro Glu Ser Ile Asp Thr Ile Lys Ala Arg Pro

165 170 175

His Leu Glu Leu Pro Ile Gly Ser Lys His Leu Trp Arg Val Gln Pro

180 185 190

Arg Leu Met Gln Gly Pro Arg Gln Gly Trp Trp Asn Val Asp Pro Gly

195 200 205

Asp Ser Pro Thr Asp Ser Leu Gly Pro Ala Ile Asn Met Trp Thr Tyr

210 215 220

Leu Lys Thr Val Asn Ala Leu Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln Gln Val

225 230 235 240

Pro Tyr Thr Ser Ala Leu Phe Leu Val Glu Ala Thr Val Thr Tyr Glu

245 250 255

Phe Ser Asn Tyr Gly Pro Lys Pro Gly Leu Ser Leu Met Thr Ser Glu

260 265 270

Thr Leu Ser Ala Ser Gly Lys Thr Ala Thr Leu Val Asn Thr Gln Asp

275 280 285

Gly Ala Leu Ala Leu Thr Val Ser Gly Ala Leu Gln Arg Phe Leu Asp

290 295 300

Glu Lys Glu Gln His Arg Arg Val Ser Asn Ala Gln Thr Ser Gly Val

305 310 315 320

Gly Glu Val Phe Trp Ala Val Ser Thr Glu Val Val Glu Thr Val Ala

325 330 335

Ser Ala Leu Gly Gly Trp Gly Trp Leu Leu Lys Gly Gly Trp Phe Val

340 345 350

Ile Arg Lys Leu Phe Gly Ala Ala Ser Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Leu

355 360 365

Ile Tyr Ser Ser Val Ser Asp Ala Gln Ile Asp Ser Arg Ile Tyr Gln

370 375 380

Thr Val Pro Thr Asn Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Asn Thr Val Lys

385 390 395 400

Leu Val Gln Leu Thr Gln Pro Asn Val Asn Thr Thr Gly Gln Gly Thr

405 410 415

Thr Val Leu Ser Arg Asp Ala Asp Tyr Leu Pro Leu Pro Val Ala Pro

420 425 430

Ile Gln Val Thr Pro Ser Leu Val Tyr Asn Phe Gln Gly Glu Arg Gln

435 440 445

Ser Thr Thr Glu Ser Cys Ser Phe Leu Val Phe Gly Ile Pro Gln Ala

450 455 460

Glu Ser Arg Ser Arg Tyr Asn Ala Ala Ile Thr Phe Asn Val Gly Tyr

465 470 475 480

Arg Gly Arg Thr Ser Thr Ser Phe Thr Leu Gly Thr His Asn Trp Trp

485 490 495

Ala Val Met Thr Leu Ser Gln Thr Gly Val Ile Phe Ala Pro Pro Ala

500 505 510

Val Gly Thr Gly Val Cys Asn Thr Leu Ala Thr Ala Ile Gln His Leu

515 520 525

Asn Pro Glu Leu Glu Thr Ala Val Leu Arg Val Asn Thr Ser Thr Thr

530 535 540

Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Glu Leu Arg Asn Arg Leu Asn Ile Ala

545 550 555 560

Asp Gly Asp Tyr Val Ile Ser Met Gly Asp Pro Gln Gly Asn Arg Ser

565 570 575

Ala Leu Tyr Phe Arg Asn Ser Asp Gln Lys Trp Val Trp Leu Trp Ala

580 585 590

Gly Asp Ser Asp Pro Gly Glu Thr Phe Gln Asn Phe Lys Met Pro Val

595 600 605

Leu Ile Asn Trp Ser Val Ser Asp Ser Gln Gly Gln Tyr Asn Ala Arg

610 615 620

Val Arg Met Val Gln Tyr Ala Asn Ala Gln Gln Gln Thr Leu Thr Asp

625 630 635 640

Pro Glu Glu Asp Asp Asp Pro Leu Ser Asp Val Thr Ser Leu Phe Asp

645 650 655

Pro Thr Ala Glu Asp Glu Thr Asp Phe His Leu Ala Val Ser Leu Lys

660 665 670

Thr Ser Asp Tyr Leu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Trp Lys Ala Lys Ala

675 680 685

Gln Ala Leu Leu Met Glu Lys Ala Leu Ser Ala Pro Gln Ala Gly Ala

690 695 700

Val Arg Phe Glu Lys Gly Gly His Glu

705 710

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 3

ataggatcca tgcatcacca tcaccatcac gaattcatgg 40

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 4

ataaagcttt tattcgtgtc ctcccttctc aaatcgc 37

Claims (10)

1.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、制备用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的核酸分子，所述核酸分子为序列入SEQID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子；

S2、构建重组载体，将步骤S1的所述核酸分子克隆到转移载体中，得到含有目的基因的重组质粒载体；

S3、将所述重组质粒载体与Sf9细胞混合，在转染试剂存在的条件下进行细胞转染；

S4.在有利于表达所述鹅星状病毒外衣壳结构蛋白的条件下培育所述Sf9细胞，进而重组表达产生鹅星状病毒外衣壳结构蛋白；

S5、将所述重组鹅星状病毒外衣壳结构蛋白加入到药学上可接受的载体中，得到所述免疫组合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转移载体选自pFastBac1、pVL1393中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述转染试剂为转染培养基稀释的Cellfectin。

4.一种免疫组合物，其特征在于包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白。

5.根据权利要求4所述的免疫组合物，其特征在于，所述的鹅星状病毒外衣壳结构蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

6.根据权利要求4所述的免疫组合物，其特征在于还包括药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自MONTANIDE ISA 15、MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE GEL 01中的任意一种佐剂或两种以上佐剂的组合。

8.权利要求4～7中任一项所述的免疫组合物用于生产预防和/或治疗鹅星状病毒的药物中的应用。

9.一种核酸分子，其可以用于编码鹅星状病毒外衣壳结构蛋白，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。

10.一种蛋白，其选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。