CN111289751A - 鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法和应用，该试剂盒包括：包被鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅星状病毒Capsid重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液以及终止液；同时，本发明还公开了一种采用所述试剂盒准确定量检测样品中的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原的方法，该试剂盒中含有抗原标准品，可以检测到样品中鹅星状病毒Capsid蛋白的准确含量，适用于鹅星状Capsid基因亚单位疫苗的定量检测。

Description

鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法和 应用

技术领域

本发明属于检测试剂盒领域，具体涉及一种鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法和应用。

背景技术

近年来我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群暴发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病，该病主要发生于5-20日龄的雏鹅,病鹅内脏器官及关节腔发生严重的尿酸盐沉积,死亡率最高可达50％,给养鹅业造成了巨大的经济损失，检测大量样本显示,禽星状病毒阳性检出率达96.5％(138/143)，对山东平原分离株(SDPY株)ORF1b基因进行了遗传进化分析,结果表明该分离株与已报道的鸡源、火鸡源、鸭源及鹅源星状病毒亲缘关系较远,核苷酸同源性仅为49.5％-67.7％，动物回归试验结果显示,1日龄健康雏鹅于接种SDPY株24h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏、肺脏、肾脏等内脏器官及关节腔的尿酸盐沉积与肾脏的出血肿大,与自然发病症状一致，由此确定,导致雏鹅痛风病的病原为新型鹅星状病毒。目前，此病每年都有不同程度地流行，仍为养鹅业最主要的传染病之一，对水禽养殖业造成严重损失；

目前虽然有不少的检测方法，例如琼脂扩散试验和琼脂扩散抑制试验，中和试验和动物保护试验，直接免疫荧光诊断法，免疫酶斑点法，但是普遍应用仅有琼脂扩散实验法，此法存在操作繁琐，使用不方便，耗时长以及不易普及等缺陷，中国发明专利CN109456391B公开了一种预防鹅星状病毒感染的VLP疫苗及其制备方法和应用，该发明采用构建重组杆状病毒rBac-GoAsV-Capsid，表达Capsid蛋白，将此Capsid蛋白大量表达而制成疫苗，为此急需研究一种高效、精准且定量检测鹅星状病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鹅星状病毒抗原性定量检测试剂盒及其检测方法和应用，针对传统试剂盒的缺点进行改进，本发明试剂盒中含有抗原标准品，可以检测到样品中鹅星状病毒Capsid蛋白的准确含量，适合用于鹅星状Capsid基因亚单位疫苗的定量检测。

本发明要解决的技术问题：

1、传统的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒对于鹅星状病毒Capsid蛋白的检测，检测灵敏度不高，检测消耗时间较长；

2、传统的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒，无法检测到样品中鹅星状病毒Capsid蛋白的准确含量，无法对鹅星状Capsid基因亚单位疫苗的定量检测。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：包被鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅星状病毒Capsid重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液以及终止液。

进一步，所述的包被鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板中鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的包被量为0.01μg-0.5μg/孔；所述的封闭液为质量浓度为1-10％的牛血清自蛋白和质量浓度为1-10％的脱脂奶粉中的一种或任意比例混合；所述的样品稀释液质量浓度为0.1-10％BSA和含有0.01-1％proclin300的磷酸盐缓冲液组成，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2-7.4；所述的纯化的鹅星状病毒Capsid重组蛋白抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒的鹅星状病毒Capsid蛋白；所述的洗涤液为配制的纯化水；所述的酶底物A溶液为含有质量浓度为0.016％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，乙酸钠溶液的浓度为10g/L，pH为5.3；所述的酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液；所述的终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液。

进一步，适用于鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的加测方法，具体实施步骤如下：

步骤S1：将待检样品用样品稀释液按梯度稀释，将稀释后的待检样品加入包被抗鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板中，每孔加入量为100μL，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔，加样完成后，在温度为37℃的条件下，孵育1小时后，用洗涤液洗板3-5次后甩干；

步骤S2：向步骤S1中的酶标板每个板孔内加入100μLHRP标记的抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体，在温度为37℃的条件下，孵育1小时后，用洗涤液洗涤液洗板3-5次后甩干；

步骤S3：向步骤S2中的酶标板每个板孔内加入100μL显色液，避光显色5-10分钟后，再向酶标板板孔内加入50μL终止液后，将酶标板置于酶标仪中，在波长为450nm的条件下，测定酶标板光吸收值OD_450nm；

步骤S4：结果计算与判定。

进一步，步骤S1所述的待检样品为鹅星状病毒病毒感染的泄殖腔拭子、细胞适应毒、新鲜组织病料、鹅胚尿囊液、鹅星状病毒疫苗抗原中的任意一种。

进一步，步骤S1所述的空白对照组为样品稀释液。

进一步，步骤S1所述的阴性对照组为用样品稀释液100倍稀释不含鹅星状病毒的鹅胚尿囊液配制而成。

进一步，步骤S3所述的显色液为等体积酶底物A溶液和酶底物B溶液混合，现用现配。

进一步，步骤S4所述的结果计算与判定包括定性结果的判定和定量结果的判定，定性结果的判定：Cutoff值＝阴性对照光吸收值OD_450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值OD_450nm/CO值，样品值>1为阳性，样品值≤1为阴性；定量结果的判定：以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的浓度为Y轴，利用“EXCEL”软件获得线性曲线及方程式，参考品和样品OD值的代入RelPot4.0计算出样品的浓度。

本发明还提供了一种鹅星状病毒Capsid蛋白ELISA抗原检测试剂盒用于检测鹅群鹅星状病毒感染或者小鹅瘟疫苗产品的应用，将鹅星状感染的泄殖腔拭子或者新鲜组织病料加入800μL样品稀释液中，反复冻融2次，使用之前瞬离10s，取上清使用；细胞适应毒，反复冻融细胞，使用之前瞬离10s，取上清使用；鹅胚尿囊液或者鹅星状亚单位疫苗抗原直接取样检测。

除非另有说明，本发明所述液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明所述液体与固体之间的百分比时，所述的百分比为体积/重量百分比；本发明所述固体与液体之间的百分比时，所述的百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的试剂盒采用杆状病毒表达的病毒样颗粒(VLPs)的鹅星状病毒Capsid蛋白研制的多克隆抗体包被酶标板作为捕获抗体、HRP标记的抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体做显色抗体，进而组成用双夹心法酶联免疫吸附实验检测鹅星状病毒以及鹅星状病毒Capsid重组蛋白，该试剂盒检测灵敏度高，检测速度快；

2、本发明试剂盒中含有抗原标准品，可以检测到样品中鹅星状病毒Capsid蛋白的准确含量，特别适合用于鹅星状Capsid基因亚单位疫苗的定量检测，能够规模化生产并应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中纯化表达的鹅星状病毒Capsid蛋白(VLPs)电镜图片；

图2为实施例4中试剂盒的制备工艺流程图；

图3为实施例4中HRP酶标记抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体与制得的鹅星状病毒Capsid重组蛋白westernblot分析图，其中M为预染蛋白质Marker；1为HRP标记抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体；

图4实施例7中标准品绘制的标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

Capsid蛋白的大量表达

步骤S1：将重组杆状病毒rBacmid-GoAsV-capsid株接种昆虫细胞Sf9中，在温度为27℃的条件下，进行培养4天，收集培养物，离心取上清即获得F2代重组杆状病毒；

步骤S2：将步骤S1获得的F2代重组杆状病毒以MOI值为10的接种量接入昆虫细胞Sf9中，在温度为27℃的条件下，进行培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组Capsid蛋白；

步骤S3：对步骤S2制得的重组Capsid蛋白进行鉴定,将鉴定正确的重组病毒以MOI值5为的接毒量接种Sf9细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组Capsid蛋白。

所述的重组Capsid蛋白为扬州优邦生物药品有限公司研制的重组杆状病毒rBacmid-GoAsV-capsid株，通过培养宿主细胞，接种重组杆状病毒rBacmid-GoAsV-capsid株，表达鹅星状Capsid蛋白后分离纯化重组杆状病毒Capsid蛋白。

实施例2

Capsid蛋白的纯化

步骤S1：将实施例1获得的培养液上清，在转速为12000rpm/min的条件下，进行离心30min后，去除细胞碎片，得到重组Capsid蛋白分子量为10000的上清液，将上清液装入透析袋内，在温度为4℃条件下，使用聚乙二醇6000包埋浓缩4倍，制得Capsid蛋白浓缩液；

步骤S2：将步骤S1制得的Capsid蛋白浓缩液加入30ml离心管中，在转速为30000rpm/min，温度为4℃的条件下，进行离心4h后弃去上清，向离心管中加入PBS至管底沉淀悬起，在温度为4℃的条件下，过夜溶解后，加入氯化铯至沉淀溶解均匀，在转速为40000rpm/min，温度为10℃的条件下，进行离心24h，制得离心后的溶解液；

步骤S3：将步骤S2中离心后的溶解液用注射器分别吸出可见的条带，经SDS-PAGE电泳确定目的条带并鉴定纯度，用BCA定量确定蛋白含量，用电镜扫描分析，得到纯化的Capsid蛋白，结果如图1，将纯化Capsid蛋白分装，在温度为-70℃的条件下保存。

实施例3

鹅星状病毒阳性尿囊液的制备

步骤S1：在无菌条件下，取患鹅的肾脏组织作为病毒分离的材料，将组织按照1:4的比例加入灭菌生理盐水并进行研磨处理，反复冻融3次，以8000×g的离心力，进行离心10min后取上清液，经0.22μm无菌滤器过滤除菌后，将过滤后的上清液于-20℃保存备用；

步骤S2：将步骤S1制得的过滤后的上清液经绒毛尿囊腔途径无菌接种到10日龄鹅胚上，每枚接种0.2mL,并用无菌生理盐水设置阴性对照，在温度为37℃的条件下孵育，每天早晚各照胚1次，弃掉24h内死亡鹅胚，连续观察5d并记录鹅胚死亡情况与胚体变化，无菌收集鹅胚尿囊液，过滤除菌后连续传代3次，以收获的第4代鹅胚尿囊液，无菌检查后分装于-80℃保存备用；

步骤S3：将步骤S2制得的鹅胚尿囊液用灭菌的生理盐水进行10倍梯度稀释，共10-1～10-66组稀释度，每个稀释度按0.2mL/枚的剂量接种9日龄SPF鸡胚5枚，置于在温度为37℃的孵化箱进行孵化，每天早晚各照胚1次，弃去24h内死亡鸡胚，连续观察5天并记录死亡情况，根据死亡数量，按Reed-Muench法计算ELD50。

根据公式LogELD50＝高于50％死亡的稀释倍数对数+稀释系数的对数×距离比，距离比＝(高于50％-50％)/(高于50％-低于50％)，代入数值计算出病原的ELD5010-5.25/0.2mL，为鹅星状病毒阳性尿囊液。

实施例4

鹅星状病毒Capsid蛋白ELISA抗原测试剂盒的制备

ELISA试剂盒的制备流程见图2，具体制备方法包括以下步骤：

A、抗鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

A1：将实施例2制得的纯化的Capsid蛋白常规免疫实验兔，当实验兔血清ELISA效价达到1：10000以上时，采集兔血，离心取得兔血清；

A2：将步骤A1制得的兔血清通过ProteinA柱纯化，制得纯化的抗鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体；

A3：在步骤A2制得的抗鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体中加入50％的中性甘油，测定工作浓度后，在温度为-20℃的条件下，保存备用。

B、用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞的步骤：

B1：将实施例2制得的纯化的Capsid蛋白，进行蛋白浓度测定，用纯化的Capsid蛋白与小鼠鹅星状病毒抗体阳性血清在酶标板上做方阵实验，确定Capsid蛋白的最佳包被浓度为0.5ug/ml；

B2：将包被浓度为0.5ug/ml的Capsid蛋白与碳酸盐包被缓冲液混匀包被后封闭待用；

B3：取杂交瘤细胞上清，在温度为37℃的条件下，进行培养1h，获得样本，设置未免疫鹅星状病毒病毒小鼠血清稀释1000倍作为阴性对照以及免疫鹅星状病毒小鼠血清1000倍作为阳性对照，用洗涤液对样本、阴性对照、阳性对照进行洗涤后，将羊抗鼠IgG酶标二抗使用样品稀释液10000倍稀释后作为二抗加入样本、阴性对照、阳性对照中孵育1h后，用洗涤液洗涤出现显色，对杂交瘤细胞上清效价按降序排列，选择阳性读值高的孔号；

B4：将实施例3获得的鹅星状病毒阳性尿囊液和鹅星状病毒阴性尿囊液分别包被酶标板，与上述方法其他步骤一致，在阴阳性对照成立的情况下，记录能与鹅星状病毒全病毒反应，不与阴性尿囊液反应的孔，记录与纯化的鹅星状病毒Capsid蛋白以及全病毒均反应，不与阴性尿囊液反应的孔号为候选孔。

C、用westernblot方法验证阳性杂交瘤细胞的步骤：

C1：将实施例2制得的纯化的Capsid蛋白进行电泳，转印到NC膜上，按照泳道剪成条，将NC膜条分别放置在皿内，进行封闭洗涤后待用；

C2：将步骤C1制得的NC膜条加入步骤B4的候选孔内，在温度为37℃的条件下，孵育1h后洗去NC膜条，加入羊抗鼠IgG酶标二抗，用洗涤液洗涤后，加入沉淀型TMB显色；

C3：阴阳性成立，记录在80KDa处出现条带的孔号为候选孔，结果如图3所示。

D、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鹅星状病毒Capsid蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

D1：将鹅星状病毒鹅胚尿囊液超速离心取沉淀，用原体积的1/100的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，加入弗氏佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行免疫，当小鼠血清ELISA效价达到1：10000以上时，取脾细胞与SP2/0细胞以5×10⁷：1×10⁷的比例融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法和westernblot进行阳性杂交瘤细胞的筛选，将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及分泌的抗鹅星状病毒Capsid蛋白的单克隆抗体；

D2：将步骤D1制得的单克隆抗体注射致敏过的Balb/c小鼠体内制备腹水后，用ProteinG柱纯化，得到纯化的抗鹅星状病毒Capsid蛋白的单克隆抗体，测定蛋白浓度；

D3：用改良的过碘酸钠氧化法对步骤D2制得的纯化的抗鹅星状Capsid蛋白的单克隆抗体进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗Capsid蛋白的单克隆抗体；

D4：步骤D3制得的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗Capsid蛋白的单克隆抗体与等体积的中性甘油混匀，测定工作浓度后，在温度为-20℃的条件下，保存备用。

E、酶标板孔均匀包被抗鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体，包被量为5ug/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH为9.6，即1L溶液中含1.59gNa₂CO₃和2.93gNaHCO₃。

F、封闭液为质量浓度为10％的BSA或10％的脱脂奶粉中的一种或任意比例混合。

G、试剂盒中其他溶液的配制：

G1、样品稀释液：现配制pH为7.2、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，121℃20min高压灭菌冷却后加入0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin300，即得；

G2、洗涤液：配置的纯化水即可；

G3、酶底物A溶液含有0.016％(质量浓度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其配制称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调pH为5.3，再加入540μL浓度为30％H₂O₂；

G4、酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB·HCl)溶液，其配制称取0.47gTMB·HCl加入到1LpH为3.0的0.01mol/L的柠檬酸缓冲液里，完全溶解；

G5、终止液：取54.3mL浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000mL，制得浓度为1mol/L的H₂SO₄溶液；

G6、抗原标准品：用样品稀释液稀释纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅星状病毒Capsid蛋白，至1μg/mL制成。

实施例5

鹅星状病毒Capsid蛋白ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

步骤S1：将包被缓冲液和纯化的捕获抗体兔抗鹅星状病毒Capsid蛋白多抗混合，制得稀释液，将100μL稀释液加入酶标板的酶标孔内，在温度为4℃的条件下过夜培养后，用洗涤液洗涤3次后甩干；

步骤S2：向步骤S1中的酶标孔内加入1％BSA的PBST封闭液，每孔200μL,在温度为4℃的条件下，过夜封闭，用洗涤液洗涤3次后吹干，再向酶标孔加干燥剂密封避光，在温度为8℃的条件下保存；

步骤S3：向步骤S2中的酶标孔加入内不同稀释度的抗原标准品和不同稀释度的待检样品，例如将待检试样用样品稀释液1:100稀释，每孔加100μL，同时设置阳性对照组，阴性对照组和空白对照组，其中阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样4个孔，在温度为37℃的条件下，孵育1h后洗涤3次甩干；

步骤S4：向步骤S3中的酶标孔内每孔加入检测抗体-HRP标记的抗鹅细小病毒Capsid蛋白的单克隆抗体，在温度为37℃的条件下，孵育1h后洗涤3次甩干；

步骤S5：将显色液酶底物A溶液和酶底物A溶液等体积混匀，制得混合液，将混合液加入步骤S3中的酶标孔中，加入量为100μL/孔，在温度为37℃的条件下显色10min后，向酶标孔中加入终止液，加入量为50μL/孔；

步骤S6：将酶标板置于酶标仪中，在波长为450nm的条件下，测定酶标板光吸收值OD_450nm。

实施例6

ELISA试剂盒定量检测不同感染复数疫苗抗原中所含Capsid蛋白

使用3种不同的MOI值0.01，0.1，1接种两种不同MOI浓度的病毒，分别于接种后7-11天取样定量分析培养上清中的目的蛋白含量，结果见表1。

表1不同感染复数接种两种病毒蛋白表达量(μg/mL)分析

由上表1可知，使用生物反应器无血清悬浮培养表达Capsid蛋白，在最适MOI值为0.1的条件下，Capsid蛋白表达量可达118ug/mL，并在接种重组杆状病毒后9天达到最大值，即可收获。

实施例7

特异性检测

按照实施例5所述的检测方法和实施例4制得的试剂盒分别检测鹅星状病毒感染的尿囊液、ND感染的尿囊液、ALVH9感染的尿囊液、小鹅瘟感染尿囊液、阴性尿囊液、杆状病毒鹅星状Capsid蛋白表达液、杆状病毒其他蛋白表达液；

将待检样品用稀释液1：100稀释，每个稀释度加入包被兔抗鹅星状Capsid蛋白多抗的酶标板孔内，各3孔，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔，检测结果见表2。

表2本发明试剂盒的特异性检测结果

由上表2可知，小鹅瘟感染的尿囊液为阳性，杆状病毒表达的鹅星状病毒Capsid蛋白为阳性；其他为阴性，可见本试剂盒可以特异性区分小鹅瘟、ND和ALVH9。

实施例8

灵敏度检测

按照实施例5所述的检测方法，利用实施例4制得的试剂盒检测不同稀释度的抗原标准品，抗原标准品用样品稀释液稀释至原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列加入包被兔抗鹅星状病毒Capsid蛋白多抗的酶标板孔内，各3孔，每孔加入量100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔，检测结果见表4。

表3不同稀释度的抗原标准品检测结果

由上表3可见，本发明的试剂盒的最低检测到抗原标准品的浓度为0.007ug/mL。

实施例9

ELISA试剂盒检测不同ELD₅₀/0.2mL的鹅星状病毒阳性尿囊液

按照实施例5所述的检测方法，利用实施例4制得的试剂盒检测不同ELD₅₀/0.2mL的鹅星状病毒阳性尿囊液，检验的鹅胚阳性尿囊液使用的梯度分别为10^2.0ELD₅₀/0.2mL、10^4.0ELD₅₀/0.2mL、10^6.0ELD₅₀/0.2mL，鹅胚阳性尿囊液用样品稀释液稀释至原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列加入包被兔抗鹅星状病毒Capsid蛋白多抗的酶标板孔内，各3孔，每孔加入量为100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔，检测结果见表4。

表4本发明试剂盒检测不同ELD₅₀/0.2mL鹅胚尿囊液的结果

由上表4可见，10^2.0ELD₅₀/0.2mL、10^4.0ELD₅₀/0.2mL、10^6.0ELD₅₀/0.2mL三个梯度的鹅胚阳性尿囊液通过本发明测得数据存在极显著的正相关，ELD₅₀/0.2mL越高，检测结果越高，不同ELD₅₀/0.2mL的鹅胚阳性尿囊液的倍比稀释后测的结果有差异，总之，毒价在7812ELD₅₀/0.2mL以上的鹅星状病毒抗原可以被本发明试剂盒测出阳性。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：包被鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅星状病毒Capsid重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液以及终止液。

2.根据权利要求1所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的包被鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板中鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的包被量为0.01μg-0.5μg/孔；所述的封闭液为质量浓度为1-10％的牛血清自蛋白和质量浓度为1-10％的脱脂奶粉中的一种或任意比例混合；所述的样品稀释液质量浓度为0.1-10％牛血清自蛋白和含有0.01-1％proclin300的磷酸盐缓冲液组成，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2-7.4；所述的纯化的鹅星状病毒Capsid重组蛋白抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒的鹅星状病毒Capsid蛋白；所述的洗涤液为配制的纯化水；所述的酶底物A溶液为含有质量浓度为0.016％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，乙酸钠溶液的浓度为10g/L，pH为5.3；所述的酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液；所述的终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液。

3.适用于权利要求1的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下实施步骤：

步骤S1：将待检样品用样品稀释液按梯度稀释，将稀释后的待检样品加入包被抗鹅星状病毒Capsid蛋白的多克隆抗体的酶标板中，每孔加入量为100μL，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔，加样完成后，在温度为37℃的条件下，孵育1小时后，用洗涤液洗板3-5次后甩干；

步骤S2：向步骤S1中的酶标板每个板孔内加入100μLHRP标记的抗鹅星状病毒Capsid单克隆抗体，在温度为37℃的条件下，孵育1小时后，用洗涤液洗涤液洗板3-5次后甩干；

步骤S3：向步骤S2中的酶标板每个板孔内加入100μL显色液，避光显色5-10分钟后，再向酶标板板孔内加入50μL终止液后，将酶标板置于酶标仪中，在波长为450nm的条件下，测定酶标板光吸收值OD_450nm；

步骤S4：结果计算与判定。

4.根据权利要求3所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤S1所述的待检样品为鹅星状病毒病毒感染的泄殖腔拭子、细胞适应毒、新鲜组织病料、鹅胚尿囊液、鹅星状病毒疫苗抗原中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤S1所述的空白对照组为样品稀释液。

6.根据权利要求3所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤S1所述的阴性对照组为用样品稀释液100倍稀释不含鹅星状病毒的鹅胚尿囊液配制而成。

7.根据权利要求3所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤S3所述的显色液为等体积酶底物A溶液和酶底物B溶液混合，现用现配。

8.根据权利要求3所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤S4所述的结果计算与判定包括定性结果的判定和定量结果的判定，定性结果的判定：Cutoff值＝阴性对照光吸收值OD_450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值OD_450nm/CO值，样品值>1为阳性，样品值≤1为阴性；定量结果的判定：以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的浓度为Y轴，利用“EXC EL”软件获得线性曲线及方程式，参考品和样品OD值的代入RelPot 4.0计算出样品的浓度。

9.如权利要求1所述的鹅星状病毒Capsid蛋白抗原ELISA检测试剂盒在检测鹅星状病毒感染或者小鹅瘟疫苗产品的应用。

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