CN114167055B - 一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒 - Google Patents

一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其包括检测抗体、包被板以及包被在所述包被板上的检测抗原；其中，所述包被检测抗原为p72蛋白，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶标记的抗p72蛋白单克隆抗体。本发明提供的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其检测方法简单，检测成本低，检测灵敏度高，特异性好。

Description

一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟病毒(Africa swine fevervirμs，ASFV)是引起家猪和野猪发病的一种急性、和高传染性的疾病，ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40％-85％之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90-100％；中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20％-40％之间，在幼年动物的死亡率在70％-80％之间；低致病性毒株死亡率在10％-30％之间。
世界动物卫生组织主要采用分子生物学方法检测非洲非洲猪瘟病毒，主要是各种PCR的方法，包括荧光PCR、等温介导的PCR等。PCR的方法灵敏度高，特异性好，但是需要专门的PCR仪、专业的实验人员以及专门的实验室。很多时候会因为气溶胶的污染导致全部待测样品假阳性结果的出现。
综上，目前对猪瘟病毒的检测方法，容易出现假阳性，检测仪器复杂，操作繁琐，亟待研发一种新型的对猪瘟病毒的检测方法。
发明内容
为此，本发明提供一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其包括检测抗体、包被板以及包被在所述包被板上的检测抗原；
其中，所述包被检测抗原为p72蛋白，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶标记的抗p72蛋白单克隆抗体。
本发明的一个实施例中，所述抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
本发明的一个实施例中，所述酶联免疫试剂盒中，还含有如下中的至少一种：酶标板、包被液、辣根过氧化物酶标记的亲和素、样品稀释液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。
本发明的一个实施例中，所述包被液为0.05M碳酸盐缓冲液；
所述样品稀释液为PBS缓冲液；
所述显色液为四甲基联苯胺；
所述封闭液为用PBS溶液配制5％酪蛋白溶液；
所述终止液为1M硫酸。
本发明的一个实施例中，所述检测抗原的包被浓度为0.33μg/ml。
本发明的一个实施例中，所述检测抗原的包被温度为4℃，包被时间为 16-18h；
或所述检测抗原的包被温度为37℃，包被时间为1-2h。
本发明的一个实施例中，所述试剂盒还包括阳性血清和阴性血清。
上述所述的抗p72蛋白单克隆抗体，也属于本发明的保护范围。
上述所述的抗p72蛋白单克隆抗体在所述的酶联免疫试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明具有如下优点：
试验证明：本发明的用于检测血清中抗非洲猪瘟抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其检测方法简单，检测成本低，检测灵敏度高，特异性好。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，PBST洗涤液(1X)：氯化钠8g，氯化钾0.2g，Na2HPO4 12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，吐温-20 500μL，补足水至1000mL。
样品稀释液为PBS液：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠12H2O 2.9g，磷酸二氢钾0.2g，补足水至1000mL。
终止液：2M硫酸溶液，取浓硫酸178.3mL，补足浓硫酸至200mL。
包被液：0.05M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6：Na2CO3 0.795g，NaHCO3 1.47g，溶于蒸馏水定容至500mL。
洗涤液：NaH2PO4·12H2O 68.8g,Na2HPO4 6.9g，NaCl 45g，Tween-20 500 μL，加双蒸水至1000mL，pH值7.4。
封闭液：用PBS溶液配制5％酪蛋白溶液，4℃保存。
实施例1、鼠抗非洲猪瘟病毒p72蛋白的单克隆抗体的制备
1、腹水的制备
本实施例采用的杂交瘤细胞，抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
对8-12周龄Balb/c雄性小鼠进行腹腔注射适量(500μL-1mL)的弗氏不完全佐剂，1周后，将处理好的阳性杂交瘤细胞按照106-108个/ml比例进行腹腔注射，500μL/只。每日观察小鼠状态，待小鼠腹部出现明显的膨胀后，注射器吸取小鼠腹水，并进行4℃，10000g离心5-10min，-20℃保存备用。
2、鼠抗p72蛋白单克隆抗体的纯化
因链球菌蛋白A(Protein A)能与抗体的Fc区发生特异性的结合，该亲和介质可以用于抗体的分离纯化。因此，采用Protein A试剂盒说明书，对上述制备的腹水进行IgG抗体的纯化，得到鼠抗p72蛋白单克隆抗体。
实施例2、非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA检测条件优化
将实施例1制备的抗p72蛋白单克隆抗体用HRP酶标记，得到抗p72蛋白单克隆抗体-HRP(货号ld089，山东绿都生物科技有限公司)。
将包被板用检测抗原为p72蛋白抗原(货号LD-DW-123，山东绿都生物科技有限公司)，采用方阵滴定法确定最佳的抗原包被浓度和鼠抗非洲猪瘟单克隆抗体的最佳稀释度及阴阳性血清的最佳稀释度。
将不同浓度的p72蛋白抗原包被于酶标板上，经4℃包被过夜后，用PBST 洗涤3次，每次300μL/孔，甩干后，经1％酪蛋白封闭处理后，加入经PBS 稀释的抗p72蛋白单克隆抗体-HRP，分别于37℃作用一段时间后，洗板5次，每次300μL/孔。最后加入显色液，室温显色一定时间后，确定最优反应条件。如表1所示，竞争ELISA检测条件的优化结果。
表1
如表1结果显示，当抗原浓度为0.33μg/mL，单抗稀释倍数1：2000倍稀释，血清工作浓度为1:80倍稀释时，N/P最大为7.36，故选择原浓度为0.33 μg/mL，单抗稀释倍数1：2000，血清工作浓度为1:80为最佳条件。
实施例3、非洲猪瘟病毒抗体竞争酶联免疫检测试剂盒的制备
非洲猪瘟抗体检测试剂盒包括以下组分：包被检测抗原、抗原包被板、鼠抗p72蛋白单克隆抗体-HRP、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、 TMB显色液和终止液，包被板用抗原为p72蛋白抗原(货号LD-DW-123，山东绿都生物科技有限公司)
1、阳性对照、阴性对照的制备
阴性对照：为非洲猪瘟抗体检测试剂盒、非洲猪瘟中和免疫荧光试验法测定非洲猪瘟病毒抗体为阴性的猪只，无菌获取血清后，加入0.05％叠氮钠， -80℃保存备用。
阳性对照：选取非洲猪瘟抗体检测试剂盒、非洲猪瘟中和免疫荧光试验法检测非洲猪瘟病毒抗体均为阴性的35-40日龄断奶仔猪，多次免疫非洲猪瘟病毒后，经非洲猪瘟抗体检测试剂盒检测为阳性、非洲猪瘟中和免疫荧光试验检测抗体水平大于28的猪只，无菌采血，获取血清，经56℃水浴灭活30 min，加入0.05％叠氮钠，-80℃保存备用。
2、抗原包被板的制备
将检测抗原p72蛋白按照0.33μg/mL的浓度稀释后，用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被酶标板，50-100μL/孔，4℃作用16-18h，或37℃作用1-2h， PBST洗涤3次，300μL/孔；1％酪蛋白对酶标板进行封闭，37℃作用1-3h或者4℃作用16-18h后，PBST洗涤5次，300μL/孔；加入适量的酶标板稳定剂 37℃作用30-60min或者4℃16-18h后，抽真空或风干处理，4℃保存备用。
3、鼠抗p72蛋白单克隆抗体及鼠抗p72蛋白单克隆抗体-HRP的制备
将抗原p72蛋白作为免疫用抗原。通过Balb/c小鼠免疫、细胞融合、阳性克隆株的筛选及亚克隆、鉴定，以及腹水制备等流程获取。
动物免疫：将抗原p72蛋白与完全弗氏佐剂按照1:1的比例进行乳化后，免疫8-12周龄雄性Balb/c小鼠，150μg/只。皮下多点注射。每隔2周用不完全佐剂处理后，采用相同方式免疫，最后一次用非洲猪瘟病毒进行加强免疫，待抗体水平达到相应的比例后，进行细胞融合。
细胞融合：无菌制备免疫后小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0按照5:1的比例进行混匀离心沉淀后置37℃水浴中，缓慢加入适量的浓度的PEG，静置片刻后，立即加入37℃预温的DMEM培养基，加入适量的 HAT培养液，轻轻混匀后，铺于已经含有一定量的饲养细胞的细胞培养板中， 100μL/孔，置37℃，5％CO2培养箱内培养。
阳性杂交瘤细胞株的筛选与亚克隆：采用间接ELISA方法，向包被抗原 p72蛋白的酶标板中加入一定稀释倍数的培养基上清，于37℃作用30min后，弃去孔中液体，洗板3次后，加入一定稀释倍数的羊抗鼠IgG-HRP，37℃作用 45min后，TMB显色15min，酶标仪进行OD450nm的测定。
采用该方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。同时设置SP2/0细胞培养液做阴性对照，当待测培养液上清OD450nm/阴性对照大于2.1时判定为阳性。并对检测结果为阳性的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，并进行标记、储存。
本实施例采用的杂交瘤细胞，抗非洲猪瘟病毒蛋白p72单克隆抗体的杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
单克隆抗体的制备：主要采用的是小鼠体内培养的方法进行制备，对8-12 周龄Balb/c雄性小鼠进行腹腔注射适量(500μL-1mL)的弗氏不完全佐剂，1 周后，将处理好的阳性杂交瘤细胞按照106-108个/mL比例进行腹腔注射，500 μL/只。每日观察小鼠状态，待小鼠腹部出现明显的膨胀后，注射器吸取小鼠腹水，并进行4℃，10000g，离心5-10min，-20℃保存备用。
鼠抗p72蛋白单克隆抗体-HRP的制备：将鼠抗p72蛋白单克隆抗体用HRP 酶进行标记，得到鼠抗p72蛋白单克隆抗体-HRP。
实施例4、非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA临界值的确定及特异性检测
本实施例采用本发明实施例3制备的非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒对临床采集的已知阴性的100份血清样本进行测定，计算样品的阻断率。
1、将包被有p72蛋白的抗原包被板充分回温，用PBS按1:80稀释倍数对待检样品进行稀释，50μL/孔，同时，设置阴性和阳性对照，每个对照做2个重复。37℃作用30min后，加入用PBS按1:2000倍稀释的HRP-鼠抗p72蛋白单克隆抗体，50μL/孔，37℃继续作用30min；
2、弃去孔中的液体，用PBST洗涤5次，300μL/孔，最后一次甩干酶标板；
3、加入TMB显色液，100μL/孔，室温作用10min；
4、加入2M H2SO4终止液，5min内用酶标仪读取OD450nm值。
判定标准：当阴性对照的OD450nm>0.6；阳性对照阻断率>50％时判定试验条件成立。PI＝(阴性对照-样品)/阴性对照×100％≥40％为阳性；PI≤30％为阴性；30％<PI<40％可疑。出现可疑的情况经重复测定后仍为可疑的判定为阴性。样品的阻断率计算结果如表2所示。
表2
如表2所示，显示采用本发明建立的ELISA方法对非洲猪瘟病毒阳性血清、阴性血清、牛病毒性腹泻病毒阳性血清、猪流行性腹泻阳性血清进行测定结果显示特异性非常好。
实施例5、非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒敏感性与符合率的检测
采用本发明实施例3制备的检测试剂盒对100份已知的血清样本进行测定，并与非洲猪瘟中和免疫荧光试验做对比分析，比较其敏感性和符合率情况。
通过对已知非洲猪瘟中和免疫荧光试验结果的血清样本进行测定，对其敏感性情况进行分析，测定结果如表3所示。
表3
项目 67份(阳性) 33份(阴性)
本发明试剂盒 67 33
非洲猪瘟抗体检测试剂盒(IDEXX) 67 33
符合率 100％ 100％
本发明实施例试剂盒测定出67份对应样本号全部是阳性的样本，非洲猪瘟抗体检测试剂盒(IDEXX)测定也全部为阳性。
自建试剂盒测定出33份对应样本号全部是阴性的样本，非洲猪瘟抗体检测试剂盒(IDEXX)测定也全部为阴性；符合率(％)为100％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种用于检测血清中抗非洲猪瘟病毒抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括检测抗体、包被板以及包被在所述包被板上的检测抗原；
其中，所述检测抗原为非洲猪瘟病毒p72蛋白，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶标记的抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体；
所述抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ASFV8G10分泌，所述杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021 年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
2.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟病毒抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，
所述酶联免疫试剂盒中，还含有如下试剂：包被液、样品稀释液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。
3.如权利要求2所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟病毒抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，
所述包被液为0.05M碳酸盐缓冲液；
所述样品稀释液为PBS缓冲液；
所述显色液为四甲基联苯胺；
所述封闭液为用PBS溶液配制5%酪蛋白溶液；
所述终止液为1M硫酸。
4.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟病毒抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，
所述检测抗原的包被浓度为0.33 μg/ml。
5.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟病毒抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，
所述检测抗原的包被温度为4℃，包被时间为16-18h；
或所述检测抗原的包被温度为37℃，包被时间为1- 2h。
6.如权利要求1所述的用于检测血清中抗非洲猪瘟病毒抗体的竞争酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的酶联免疫试剂盒还包括阳性血清和阴性血清。
7. 一种抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ASFV8G10分泌，所述杂交瘤细胞株ASFV8G10于2021 年07月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021173，保藏地址为：中国武汉-武汉大学。
8.权利要求7所述的抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体在制备权利要求1-6中任一所述的酶联免疫试剂盒中的应用。
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