JP6446274B2

JP6446274B2 - 口蹄疫ウイルスと反応する抗体

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Publication number: JP6446274B2
Application number: JP2015007239A
Authority: JP
Inventors: 森岡　一樹; 一樹森岡; 吉田　和生; 和生吉田; 徹菅野; 克彦深井; 麗子山添; 理恵北野
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2018-12-26
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: JP2016132628A

Description

本発明は、口蹄疫ウイルスと反応する抗体に関する。より詳細には、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する抗体に関する。

口蹄疫ウイルス（foot and mouth disease virus：ＦＭＤＶ）は、家畜の伝染病の１つである。口蹄疫ウイルスは、鯨偶蹄目（例えばウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギなど）に属する動物を主な宿主としており、日本ではその感染疾患が家畜伝染病予防法において家畜伝染病（旧法定伝染病）に指定されている。口蹄疫ウイルスは、周囲環境において容易に不活性化しないため伝播性が高く、感染した家畜の生産性を著しく低下させ、感染した幼獣において高い致死率を示す。特に高い伝播性に起因して、口蹄疫ウイルスに感染した家畜は、感染が確認され次第、日本内では家畜伝染病予防法に基づいて殺処分に処される。また、口蹄疫ウイルスに感染した家畜が発見された地域、国家には家畜の移動制限が加えられるため、口蹄疫ウイルスは、畜産業に非常な経済的打撃を与え得る病原体として、世界的に認識されている。

日本では口蹄疫ウイルスに感染した個体は、２０００年までおよそ１世紀にわたって確認されていなかった。しかし、２０００年および２０１０年に、口蹄疫ウイルスに感染した個体が確認された。このため、口蹄疫の流行に対する対処法を確立することの重要性が明らかに高まっている。上記対処法として最も重要なのは、感染の疑いのある家畜が、口蹄疫ウイルスに感染しているか否かを決定することである。

一般的な決定方法としては、ＲＴ−ＰＣＲによって口蹄疫ウイルスの遺伝子を検出する方法である。この方法では、遺伝子の増幅が認められれば、陽性（口蹄疫ウイルスに感染している）と決定されるが、迅速かつ正確に決定するという点では、単独にＲＴ−ＰＣＲを利用する方法は好ましくない。そこで、他の抗原検出法（ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーなど）を利用（併用）して口蹄疫ウイルスの検出する方法が検討されている（例えば、本発明者らによる非特許文献１）。

口蹄疫ウイルスは、７つの血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）に分類される。非特許文献１には、血清型Ａと特異的に反応する抗体が記載されている。

K. Morioka et al., Journal of Clinical Microbiology, Vol.47, No.11, p.3663-3668 (2009)

本発明者らが調べたところ、非特許文献１に記載の血清型Ａと特異的に反応する抗体は、血清型Ａのウイルス株のいくつかに対する検出感度が非常に低いことが判明した。そのため、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと反応する新たな抗口蹄疫ウイルス抗体の開発が望まれる。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、口蹄疫ウイルスの血清型Ａのいくつかの株を特異的に認識することができる抗口蹄疫ウイルス抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供する。
（１）口蹄疫ウイルスの血清型ＡのＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株と反応し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応しない、抗体。
（２）受託番号NITE P−01971で特定されるハイブリドーマによって産生される、上記（１）に記載の抗体。
（３）受託番号NITE P−01971で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
（４）口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、上記（１）または（２）に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体と、上記（１）または（２）に記載の抗体とを含む、組成物。
（５）上記（１）または（２）に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
（６）口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、上記（１）または（２）に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、上記（５）に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
（７）口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、上記（５）または（６）に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
（８）上記（１）または（２）に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
（９）被験体から採取した試料と、上記（１）または（２）に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程；および抗原抗体反応物を検出する工程を含む、上記（８）に記載の検出方法。
（１０）さらに、上記試料と、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、上記（１）または（２）に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体とを接触させる、上記（９）に記載の検出方法。

本発明に係る抗体は、口蹄疫ウイルスの血清型ＡのＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株を高感度で検出することができる。

本発明の実施例におけるスクリーニングの結果を示す図である。本発明の実施例におけるイムノクロマトグラフィーの結果を示す図である。本発明の実施例における間接サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

〔１．抗体〕
本発明に係る抗体は、口蹄疫ウイルスの血清型ＡのＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株（文献：http://www.wrlfmd.org/fmd_genotyping/2011/WRLFMD-2011 00010%20A%20Iran%202011.pdf）と反応し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応しない。なお、「反応する」とは、抗体が口蹄疫ウイルス（抗原）と抗原抗体反応することをいい、「結合する」または「認識する」と表現することもできる。

本発明に係る抗体は、２価の抗体であってもよいし、１価の抗体であってもよい。また、本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。交差反応性を示すおそれの少なさという観点から、本発明に係る抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明に係る抗体の一態様は、受託番号NITE P−01971で特定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（「２Ａ１」と名付けた）である。２Ａ１抗体は、口蹄疫ウイルスの血清型ＡのＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株（文献：ARROWSMITH, A. E. M. (1975). Variation among strains of type A foot-and-mouth disease virus in the Eastern Mediterranean region 1964-1972. Journal of Hygiene 75, 387-397）およびＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株を強く認識することができ、血清型Ａ以外の血清型とは反応しない。２Ａ１抗体は、受託番号NITE P−01971で特定されるハイブリドーマを、例えば、１０％胎児血清を含む培地中でまたは無血清培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養し、産生された２Ａ１抗体を公知の方法に従って回収・精製することによって、製造することができる。

〔２．ハイブリドーマ〕
本発明はまた、受託番号NITE P−01971で特定される抗体産生用ハイブリドーマも提供する。本発明に係るハイブリドーマは、ウシから分離された口蹄疫ウイルスＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株を抗原として、マウスに免疫し、免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞由来株とを融合させて作成されたハイブリドーマ（抗口蹄疫ウイルス血清型Ａｈｙｂｒｉｄｏｍａ２Ａ１（受託番号NITE P−01971））である。ハイブリドーマ２Ａ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８１２２号室）に寄託されている。

〔３．組成物〕
本発明はさらに、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する（すなわち、他の血清型と反応しない）、本発明に係るに記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体と、本発明に係る抗体とを含む、組成物を提供する。口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、本発明に係る抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体は、モノクローナル抗体であり得る。また、そのような別の抗口蹄疫ウイルス抗体は、Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株と反応しない抗体であり得る。Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株と反応しない抗体と本発明に係る抗体とを組み合わせることにより、網羅的に血清型Ａを検出することができる。また、そのような別の抗口蹄疫ウイルス抗体は、Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株と反応する抗体であり得る。Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株と反応する抗体と本発明に係る抗体とを組み合わせることにより、より網羅的に血清型Ａを検出することができる。

そのような別の抗口蹄疫ウイルス抗体としては、例えば、非特許文献１に記載された１６Ｃ６抗体等が挙げられる。１６Ｃ６抗体は、血清型Ａに分類されるＡ／ＴＡＩ／１０／２０１１株およびＡ１５／ＴＡＩ／１／６０株を強く認識することができる一方で、Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株を認識することができない（後述の実施例を参照）。そのため、本発明に係る抗体と１６Ｃ６抗体とを組み合わせることによって、より網羅的に血清型Ａを検出することができる。

本発明に係る組成物における本発明に係る抗体と本発明に係る抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体との比は、特に限定されないが、例えば、１：１とすることができる。

〔４．口蹄疫ウイルス検出キット〕
本発明はさらに、本発明に係る抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キットを提供する。本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、または免疫拡散測定法等を利用したキットであり得る。

本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、本発明に係る抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含んでいてもよい。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体は、モノクローナル抗体であり得る。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体については、上記〔３．組成物〕で説明したとおりである。

また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を含んでいてもよい。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体は、モノクローナル抗体であり得る。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体としては、例えば、非特許文献１に記載された１Ｈ５抗体、および後述の実施例に記載されている１６Ｄ６抗体等が挙げられる。本発明に係る抗体と７つ全ての血清型と反応する抗口蹄疫ウイルス抗体とを組み合わせる場合、ＥＬＩＳＡにおいては、７つ全ての血清型と反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を捕捉抗体として用いることによって、血清型毎に抗体７種類を用意する必要がない。また、エピトープが競合しないという利点もある。また、同一血清型間でも抗原性が異なる、すなわちサブタイプあるいはトポタイプがヘテロの場合、保存性の高い領域を認識している７つ全ての血清型と反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を用いることによって、検出漏れを低減することができる。

また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れかと特異的に反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を含んでいてもよい。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体は、モノクローナル抗体であり得る。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体としては、例えば、非特許文献１に記載された７０Ｃ４抗体（血清型Ｏ特異的）、および６５Ｈ６抗体（血清型Ｏ特異的）、ならびに、特開２０１３−４９６４５号に記載された１２Ｃ７抗体（血清型Ａｓｉａ１特異的）、および１３Ｆ１抗体（血清型Ｃ特異的）等が挙げられる。これらの抗体と反応性を比較することで、一度の検査で、被験体の検体中に含まれる口蹄疫ウイルスの血清型を判別することができる。

また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れか２つ以上と特異的に反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を含んでいてもよい。

上述した本発明に係る抗体以外の抗体のうちの複数が、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットに含まれていてもよい。また、本発明に係る抗体と本発明に係る抗体以外の抗体とは、混合されて使用されてもよいし、混合されずに使用されてもよい。混合して使用した場合であっても、阻害されずに、相補的に複数の血清型または株を網羅的に検出することができる。

また、本発明に係る抗体および／または上述の本発明に係る抗体以外の抗体は、標識に結合されていてもよい。標識としては、例えば、酵素、酵素基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、ビオチンおよび着色物質等が挙げられる。酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素等が挙げられる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。酵素基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）およびＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）等を、また酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）の混合基質等を用いることができる。

放射性同位元素としては、^１２５Ｉ、^３Ｈまたは^１４Ｃ等の通常のラジオイムノアッセイで用いられているものが挙げられる。抗体への放射標識は公知の方法を用いて行うことができる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートおよびフィコエリスリン等の通常の蛍光抗体法に用いられるものが挙げられる。また、発光物質としては、イソルミノール、アクリジンエステルおよびルシゲニン等が挙げられる。この際、標識の方法は、公知の方法を用いることができる。また、着色物質としては、例えば、着色ラテックス粒子および金コロイド等が挙げられる。

また、本発明に係る抗体および／または上述の本発明に係る抗体以外の抗体は、基材に固定されていてもよい。この場合、基材も口蹄疫ウイルス検出キットの構成要素である。基材としては、ニトロセルロースメンブレン、シリカメンブレン、ガラスフィルター、ポリスチレン粒子、ポリスチレンプレート、またはシリカ磁性粒子等の公知のものを使用することができる。一例において、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、基材に固定された本発明に係る抗体および標識された本発明に係る抗体以外の抗体を含んでいる。他の一例において、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、基材に固定された本発明に係る抗体以外の抗体および標識された本発明に係る抗体を含んでいる。

本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、標識を検出するための試薬をさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、およびウエスタンブロット法等の免疫反応を行うために必要な部材（二次抗体、発色試薬、ブロッキング試薬等）、プレート（９６ウェルプレート等）およびチューブ等が含まれていてもよい。また、本発明に係る抗体を検出するための二次抗体および二次抗体に結合させた標識酵素の基質等を備えていてもよい。

また、本発明に係る検出キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプルおよびビンなど）を備えていてもよい。また、本発明に係る検出キットにおいて使用する検出方法について詳細が記載された使用説明書をさらに備えていてもよい。当該検出方法としては、後述する〔５．口蹄疫ウイルスの検出方法〕で説明される検出方法が挙げられる。

〔５．口蹄疫ウイルスの検出方法〕
本発明はさらに、本発明に係る抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法を提供する。被験体としては、ウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、イノシシ、およびカモシカ等が挙げられる。被験体から採取した試料としては、血液、水疱液、糞、尿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、水疱上皮乳剤、病変部拭い液、種々の組織・器官などが挙げられる。本発明に係る検出方法を用いて、試料中の口蹄疫ウイルスを検出することで、この試料が由来する被験体が口蹄疫ウイルスによる感染症に罹患しているか否かを迅速、容易かつ確実に診断できる。

本発明に係る検出方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ法（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等）、イムノクロマトグラフィー法、または免疫拡散測定法等に基づくことができる。

本発明に係る検出方法の一態様は、被験体から採取した試料と、本発明の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程；および抗原抗体反応物を検出する工程を含む。

抗原抗体反応させる工程では、試料と抗体とをインキュベートすればよい。抗原抗体反応物を検出する工程は、例えば、予め標識された上記抗体を検出する等の公知の方法を用いて行うことができる。

本発明に係る検出方法の一態様では、さらに、試料と、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、本発明の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体とを接触させてもよい。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体については、上記〔３．組成物〕で説明したとおりである。本発明に係る抗体と別の抗口蹄疫ウイルス抗体とは、混合されて使用されてもよいし、混合されずに使用されてもよい。混合して使用した場合であっても、阻害されずに、口蹄疫ウイルスの血清型Ａを網羅的に検出することができる。

また、本発明に係る検出方法は、上記〔４．口蹄疫ウイルス検出キット〕に記載された、血清型Ａ以外の血清型と反応する抗口蹄疫ウイルス抗体と、試料とを接触させる工程を含んでいてもよい。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

〔モノクローナル抗体の作製〕
口蹄疫ウイルスＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株をＩＢ−ＲＳ−２細胞に接種し、一晩回転培養した。回収した培養液を１５００Ｇで１０分間遠心した後、上清を回収した。上清を飽和硫酸アンモニウム溶液と等量混和し、一晩４℃で撹拌することによってウイルスを析出させた。析出させたウイルスを、５０００Ｇで３０分間遠沈し、上清を除去してから適量のＰＢＳに懸濁した。再び５０００Ｇで３０分間遠心し、上清を除去し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。スクロース密度勾配（１５〜４５％）ウイルスの懸濁液を添加し、２００００ｒｐｍで２時間遠心を行い、目的のバンドを回収することによって、１４６Ｓの完全粒子を精製した。

８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、上述のように精製した口蹄疫ウイルスＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株をそれぞれ接種した。初回免疫ではフロイントコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）と精製したウイルス液との等量混合物、追加接種ではフロイントインコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）と精製したウイルス液との等量混合物を、連結針を用いてミセル化させた。最終免疫後にマウスの脾臓から回収したリンパ球とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とをポリエチレングリコール４０００（メルク社製）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジン、２０％ＦＣＳ、および１０％ＢＭＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて９６ウェルプレートにおいて培養した。２週間後からはＨＴ選択培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、１６μＭのチミジン、および２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて培養した。

上述のように培養することによって、ハイブリドーマのコロニーを形成させ、ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和試験および口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって目的のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングの詳細は以下の通りである。

ＥＬＩＳＡでは、ウサギ抗口蹄疫ウイルス抗体を、固相に吸着させ、Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株ウイルスと反応させた。次いで、ウイルスを取り除いてからハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた。そして、培養上清を取り除いてからＨＲＰ標識したマウス抗ＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させて、吸光度を測定した。

口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色では、複数のウェルを有しているプレートにＩＢ−ＳＲ−２細胞を播種した後に口蹄疫ウイルスを血清型に分けて接種した。感染後の適当な時間（感染細胞がはがれない程度）に培養液を捨て、冷却したアセトンを用いて感染細胞を固定した。スクリーニングの各タイムポイントにおいて使用するまで、各プレートを−８０℃に保存しておいた。つまり、スクリーニング対象のハイブリドーマの１つに対して４種類の血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１）に必要な分だけ感染細胞を準備した。保存しておいたプレートにスクリーニングするハイブリドーマの培養上清を加えてインキュベートした。上清を捨ててからＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させ、顕微鏡下において抗体の有無を判定した。

培養上清に抗体が存在しているハイブリドーマをＥＬＩＳＡによって特定し、さらに、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングの結果が非特異的な反応ではないことを確認するために、口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって再度スクリーニングした。

スクリーニングによって選択したハイブリドーマを、標準的な方法に従ってクローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を安定して産生している１種類のハイブリドーマを確立した。このハイブリドーマを抗口蹄疫ウイルス血清型Ａｈｙｂｒｉｄｏｍａ２Ａ１と名づけた。また、このハイブリドーマを独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号NITE P−01971）。このハイブリドーマによって産生されているモノクローナル抗体を、２Ａ１と名づけた。

ウイルス中和試験では、感染用の細胞としてＩＢ−ＳＲ−２細胞を使用した。定法に従って、ハイブリドーマの培養上清もしくは増殖用の培地のみ、およびウイルス液の混合液をインキュベートした後に、細胞に接種した。感染後５日目に細胞変性効果を確認して、培養上清とのウイルス液の混合およびインキュベーションによって、ウイルスの増殖を抑制したか否かを評価した。

CellTram/vario（エッペンドルフ社）を用いたマニピュレーション法により、クローニングしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、２０％ＦＣＳおよび１０％ＢＭＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＲＰＭＩ培地を用いて培養した。

なお、血清型Ａとして、Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株、Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株およびＡ１５／ＴＡＩ／１／６０株を用いた。血清型Ｏとして、Ｏ／Ｍａｎｉｓａ株を用いた。血清型Ａｓｉａ１として、Ａｓｉａ１Ｓｈａｍｉｒ（ＩＳＲ３／８９）株を用いた。血清型Ｃとして、Ｃ／ＰＨＩ／７／８４株を用いた。血清型ＳＡＴ１として、ＳＡＴ１／ＫＥＮ／１１７／２００９株を用いた。血清型ＳＡＴ２として、ＳＡＴ２／ＳＡＵ／６／２０００株を用いた。血清型ＳＡＴ３として、ＳＡＴ３／ＺＩＭ／３／８３株を用いた（http://www.wrlfmd.org/等を参照）。また、他のウイルスとの交差反応性を調べるために、豚水胞病ウイルス（swine vesicular disease virus；ＳＶＤＶ）を用いた。

結果を図１に示す。図１に示すように、２Ａ１抗体は、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株およびＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株に対する反応性が高く、Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株およびＡ１５／ＴＡＩ／１／６０株ならびに血清型Ａ以外の血清型に対する反応性が低かった。１Ｃ１抗体および３Ｈ２抗体（何れも上記スクリーニングで選択されなかったハイブリドーマから産生された抗体）は、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株およびＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株に対する反応性が高かったが、血清型Ｏ、Ａｓｉａ１およびＣに対する反応性も高かった。一方、血清型Ａに対する公知の抗体１６Ｃ６は、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株およびＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株に対する反応性が低く、Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株およびＡ１５／ＴＡＩ／１／６０株に対する反応性は高かった。なお、上記スクリーニングで選択されなかったハイブリドーマ２Ｈ５はスクリーニングの途中で抗体産生能が脱落したが、２Ｈ５抗体は、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株およびＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株に対する反応性が低く（＜０．３）、また、血清型Ａ型以外の型とは反応しなかった（図示せず）。

このように、２Ａ１抗体は、１６Ｃ６抗体では検出感度が低い株に対する反応性が高い一方で、血清型Ａ以外の血清型とは反応しないという有用な特性を有している。この結果から、２Ａ１抗体は１６Ｃ６抗体では検出感度が低い株の検出を補強することができ、この２つの抗体を併用することにより、血清型Ａの検出に広く応用され得ることが期待された。

〔モノクローナル抗体を用いたイムノクロマトグラフィー〕
（抗体の精製）
使用するモノクローナル抗体（２Ａ１、１６Ｃ６および１Ｈ５）をプロテインＧアフィニティーカラム（MAb Trap Kit; GE Healthcare 17-1128-01）にかけて、アッセイに使用するためのＩｇＧ画分のみを精製した。

（抗体懸濁液における緩衝液の置換）
抗体の精製によって得られたＩｇＧ画分を含んでいる抗体懸濁液における緩衝液を、Amicon ultra Centrifugal filter units（Millipore社、商品コード：UFC805024）を用いて置換した。５ｍＭのリン酸バッファー（ＰＢ）（ｐＨ７．５）に置換したものを、２Ａ１抗体および１６Ｃ６抗体のそれぞれについて準備し、５ｍＭのＰＢ（ｐＨ８．０）に置換したものを１Ｈ５抗体について準備した。

（抗体が塗布されているメンブレンの作製）
３％のエタノールを含んでいる５ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．５）を用いて、２Ａ１抗体および１６Ｃ６抗体のそれぞれの濃度を約１５００μｇ／ｍＬに調整した。濃度を調整した２Ａ１抗体および１６Ｃ６抗体を、約１ｍｍ幅の線状として５ｍｍの間隔をあけて、イムノライナー２００（システムバイオティクス社）を用いてニトロセルロースメンブレン（Millipore社、HF135XSS）上に塗布した。上流から順に抗マウスＩｇＧコントロール抗体、血清型Ａに対するモノクローナル抗体（２Ａ１抗体単独、２Ａ１抗体と１６Ｃ６抗体との等量混合物、１６Ｃ６抗体単独）が並ぶように塗布した。また、抗体の濃度（混合物では合計）は１５００μｇ／ｍＬ、塗布抗体量は０．８μＬ／ｃｍとした。

上記のメンブレンを５０℃で３０分間乾燥させた後、ブロッキングバッファー（０．５％のカゼインを含んでいる５０ｍＭのホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））に室温で３０分間浸した。次いで、洗浄バッファー（０．５％のスクロースを含んでいる５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））に室温で３０分間浸した後、室温で風乾させた。

（検出用ストリップの組み立て）
バッキングシート（ARcare 7815 : Adhesives Research社）を用いて、乾燥させたメンブレンの上流側にサンプルパッド（セルロースファイバーメンブレン（Millipore社、CFSP223000））を貼り付け、下流側に吸収パッド（CF6（グラスファイバーとコットンとの混合物）、Whatman社）を貼り付けた。４０％以下の湿度の条件下で、シリカゲルが収められている密封容器内に検出用ストリップを保存した。

（金コロイドによるモノクローナル抗体の標識化）
５ｍＭのＰＢ（ｐＨ８．０）を用いて１Ｈ５抗体の濃度を２０μｇ／１００μＬに調整した。金コロイド（直径４０〜５０ｎｍ）（ワインレッドケミカル社、WRGH2（ＯＤ_５２０＝１２））を十分にソニケーションした後、１ｍＭのＫ_２ＣＯ_３を用いてｐＨ８．０に調整した。次にシリコンコーティングチューブ内において、１：８の割合で抗体液および金コロイド液を混合した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％のＰＥＧを加えて混和した後、１００００ｒｐｍ、室温で３０分間遠心した。遠心上清を除去し、ソニケーションした後、ＰＢＳに０．５％のＢＳＡおよび０．０５％ＰＥＧを加えた溶液（溶液Ａ）を用いて懸濁した。再び１００００ｒｐｍ、室温で３０分間遠心した後、遠心上清を除去し、ソニケーションによって懸濁させ、溶液Ａを用いてＯＤ_５２０＝２．０に調整した。２０％のスクロースを含んでいる１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を等量加えた後、金コロイド標識した抗体を含んでいる懸濁液を１００μＬずつ２ｍＬのチューブに分注した。各チューブの口をパラフィルムで覆ってからパラフィルムに数カ所の穴を空け、−８０℃で１時間凍結させた。真空乾燥機を用いて一晩真空乾燥させた後、パラフィルムを剥がし、チューブのキャップを閉めて４℃で保存した。

（ラテラルフローアッセイの評価）
口蹄疫ウイルスの血清型Ａ（Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株、Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株、Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株およびＡ１５／ＴＡＩ／１／６０株）の量をＰＢＳで１０倍、１００倍および４００倍に希釈した。次に、凍結乾燥させた金コロイド標識１Ｈ５抗体を１００μＬの各ウイルス希釈液で溶解した後、ストリップを漬けて、１０分間反応させた。イムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社）を用いてｍＡＢＳを測定した。

結果を図２に示す。図２に示すとおり、２Ａ１抗体と１６Ｃ６抗体とを組み合わせると、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株、Ａ／ＩＲＮ／１／２０１１株、Ａ／ＴＡＩ／１０／２０１１株およびＡ１５／ＴＡＩ／１／６０株の何れにおいても、高感度で検出することができた。

〔参考：７つの血清型全てと反応する抗体の取得〕
（モノクローナル抗体の作製）
口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株をＩＢ−ＲＳ−２細胞に接種し、一晩回転培養した。回収した培養液を１５００Ｇで１０分間遠心した後、上清を回収した。上清を飽和硫酸アンモニウム溶液と等量混和し、一晩４℃で撹拌することによってウイルスを析出させた。析出させたウイルスを、５０００Ｇで３０分間遠沈し、上清を除去してから適量のＰＢＳに懸濁した。再び５０００Ｇで３０分間遠心し、上清を除去し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。スクロース密度勾配（１５〜４５％）ウイルスの懸濁液を添加し、２００００ｒｐｍで２時間遠心を行い、目的のバンドを回収することによって、１４６Ｓの完全粒子を精製した。

８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、上述のように精製した口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株の完全粒子を接種した。初回免疫ではフロイントコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）と精製したウイルス液との等量混合物、追加接種ではフロイントインコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）と精製したウイルス液との等量混合物を、連結針を用いてミセル化させた。最終免疫後にマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とをポリエチレングリコール４０００（メルク社製）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジン、および２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて９６ウェルプレートにおいて培養した。２週間後からはＨＴ選択培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、１６μＭのチミジン、および２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて培養した。

上述のように培養することによって、ハイブリドーマのコロニーを形成させ、ＥＬＩＳＡおよび口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって目的のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングの詳細は以下の通りである。

ＥＬＩＳＡでは、ウサギ抗口蹄疫ウイルス抗体を、固相に吸着させ、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株の完全粒子と反応させた。次いで、ウイルスを取り除いてからハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた。そして、培養上清を取り除いてからＨＲＰ標識したマウス抗ＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させて、吸光度を測定した。

口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色では、複数のウェルを有しているプレートにＩＢ−ＳＲ−２細胞を播種した後に口蹄疫ウイルスを血清型に分けて接種した。感染後の適当な時間（感染細胞がはがれない程度）に培養液を捨て、冷却したアセトンを用いて感染細胞を固定した。スクリーニングの各タイムポイントにおいて使用するまで、各プレートを−８０℃に保存しておいた。つまり、スクリーニング対象のハイブリドーマの１つに対して７種類の血清型に必要な分だけ感染細胞を準備した。保存しておいたプレートにスクリーニングするハイブリドーマの培養上清を加えてインキュベートした。上清を捨ててからＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させ、顕微鏡下において抗体の有無を判定した。

スクリーニングによって選択したハイブリドーマを、標準的な方法に従ってクローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を安定して産生している１種類のハイブリドーマを確立した。このハイブリドーマを抗口蹄疫ウイルスｈｙｂｒｉｄｏｍａ１６Ｄ６と名づけた。また、このハイブリドーマを独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号NITE P−01972）。このハイブリドーマによって産生されているモノクローナル抗体（７種類全ての血清型の口蹄疫ウイルスと反応するモノクローナル抗体）を、１６Ｄ６と名づけた。

CellTram/vario（エッペンドルフ社）を用いたマニピュレーション法により、クローニングしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、BriClone Hybridoma Cloning Medium（キューイーディーバイオサイエンス社）を用いて培養した。

（モノクローナル抗体の性能比較のための間接サンドイッチＥＬＩＳＡ）
モノクローナル抗体１６Ｄ６の性能を確かめるために、間接サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。比較として、７種類全ての血清型の口蹄疫ウイルスと反応する既知のモノクローナル抗体１Ｈ５を用いた。１Ｈ５抗体については、非特許文献１を参照すればよい。

捕捉抗体として各血清型の抗口蹄疫ウイルスウサギ抗体を０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で×８００に希釈し、５０μＬずつ９６ウェルプレート（Immulon II HB Thermo）に４℃で一晩固相化した。３００μＬ／ｗｅｌｌの０．００２ＭＰＢＳで３回洗浄した後、口蹄疫ウイルス（抗原）を含むサンプルを５０μＬずつウェルに加え、１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間反応させた。このとき、陰性検体として０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５%（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加えたＡ液を使用した。同様に洗浄した後、Ａ液に５％のスキムミルクを加えＢ液とし、３７℃で３０分間ブロッキングした。Ｂ液を捨てた後、洗浄せずに、Ａ液で１μｇ〜０．００００６４μｇの５倍階段希釈を行ったモノクローナル抗体１Ｈ５および１６Ｄ６をそれぞれ加えた。３７℃で１時間反応させた後、Ｂ液で×３０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンヤギ抗体を５０μＬずつ加え、室温で４５分間反応させた。８回洗浄した後、発色基質ＴＭＢを５０μＬずつ加え、暗所にて室温で１５分間反応させた。５０μＬの１．２５Ｍ硫酸で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長を測定した。

なお、血清型ＯとしてＯ／ＪＰＮ／２０００株、血清型ＡとしてＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株およびＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株、血清型Ａｓｉａ１としてＡｓｉａ１Ｓｈａｍｉｒ（ＩＳＲ３／８９）株、血清型ＣとしてＣ／ＰＨＩ／７／８４株、血清型ＳＡＴ１としてＳＡＴ１／ＫＥＮ／１１７／２００９株、血清型ＳＡＴ２としてＳＡＴ２／ＳＡＵ／６／２０００株、血清型ＳＡＴ３としてＳＡＴ３／ＺＩＭ／３／８３株を用いた。

結果を図３に示す。図３に示すように、１６Ｄ６抗体では８種類の株のうち７種類の株において１Ｈ５抗体よりも反応性が高かった。特に、１Ｈ５抗体では反応性が比較的低いＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株、ＳＡＴ１／ＫＥＮ／１１７／２００９株、ＳＡＴ２／ＳＡＵ／６／２０００株、およびＳＡＴ３／ＺＩＭ／３／８３株において、顕著に反応性が高くなっている。このように、１６Ｄ６抗体は１Ｈ５抗体と比較して非常に優れた反応性を示すことがわかった。

本発明は、口蹄疫ウイルスの検出に利用することができる。

NITE P−01971
NITE P−01972

Claims

口蹄疫ウイルスの血清型ＡのＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株と反応し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応しない、受託番号NITE P−01971で特定されるハイブリドーマによって産生される、抗体。
受託番号NITE P−01971で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、請求項１に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体と、請求項１に記載の抗体とを含む、組成物。
請求項１に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、請求項１に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、請求項４に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、請求項４または５に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
請求項１に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
被験体から採取した試料と、請求項１に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程；および
抗原抗体反応物を検出する工程を含む、請求項７に記載の検出方法。
さらに、上記試料と、口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に反応する、請求項１に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体とを接触させる、請求項８に記載の検出方法。