JP4472298B2 - 不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質のエピトープに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に関する。
ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)、最初は、ネコＴ細胞向性のレンチウイルスが、まず、Pederson et al., Scienceにより (1987) 235:790-793に報告され、飼いネコおよびチーターにおいて同定された。該感染は世界中のネコに特有のものである。ＨＩＶ同様、ＦＩＶは国際的に関心を持たれている。アメリカネコ開業医協会(American Association of Feline Practitioners)によれば、１２匹のネコの１匹までがＦＩＶに関してテスト結果が陽性であり得る。感染後、熱、リンパ腺腫、および好中球減少症の一過性の期間がある。ほとんどのネコはこの段階から回復し、そして免疫不全を発症する前の数ヶ月または数年間は正常に見える。免疫不全のこの潜在的徴候のために、ＦＩＶの治療または予防のための生ウイルスワクチンを利用することは極めて危険である。ＦＩＶコード化抗原または抗原性タンパク質のエピトープに特異的なモノクローナル抗体は公知であるが(即ち、US5,177,014およびUS5,219,725)、これらの抗体は不活性化ＦＩＶの認識能を有していない。これは、現在通用している市販のＦＩＶワクチン(これらすべては不活性化ＦＩＶを利用するものである)に関して、ワクチン組成物中のウイルス配合量または不活性化ＦＩＶ成分の効能の決定に有用な公知のモノクローナル抗体はないことを意味する。
それゆえ、不活性化ＦＩＶ糖タンパク質のエピトープに特異的なモノクローナル抗体を提供することが、本発明の目的である。
不活性化ＦＩＶの量を決定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
不活性化ＦＩＶワクチンの効能を決定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
不活性化ＦＩＶの量を決定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
不活性化ＦＩＶワクチンの効能を決定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
本発明のモノクローナル抗体が、不活性化ＦＩＶ糖タンパク質のエピトープに特異的であり、そして生ＦＩＶ糖タンパク質、タンパク質または抗原のエピトープを認識しないことが本発明の態様である。
本発明のさらなる目的および態様は、以下に示す詳細な記載からより明らかとなろう。
本発明のさらなる目的および態様は、以下に示す詳細な記載からより明らかとなろう。
発明の概要
本発明により、不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に独特なエピトープに特異的なモノクローナル抗体が提供される。
本発明により、サンプル中の不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に独特なエピトープの検出のための方法であって、該サンプルを、不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に独特なエプトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させて複合体を形成させること、および当該複合体を検出することを含む方法が提供される。
本発明により、不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に独特なエピトープに特異的なモノクローナル抗体が提供される。
本発明により、サンプル中の不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に独特なエピトープの検出のための方法であって、該サンプルを、不活性化ネコ免疫不全ウイルスコード化糖タンパク質に独特なエプトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させて複合体を形成させること、および当該複合体を検出することを含む方法が提供される。
発明の詳細な記載
ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)エンベロープ糖タンパク質は、細胞とのレセプター相互作用に関与しており、この相互作用により、該ウイルスに対する細胞の感受性が決定される。ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質は、ウイルスの侵入およびシンシチウムの形成にも関与しており、体液性および細胞性免疫反応の主要な標的である。(Bendinelli, M., et al., Clinical Microbiology Review, (1995) 8:87-112)。当該エンベロープ糖タンパク質は、その大部分がグルコシル化され、９５，０００−１００，０００の見かけの分子量を有する表面(ＳＵ)タンパク質、およびあまりグルコシル化されておらず、そして３５，０００−４０，０００の見かけの分子量を有する膜貫通(ＴＭ)タンパク質の、ビリオンにおける非共有結合している２つの成分から成る。(Pacino, G. et al., Virology, (1995) 206: 796-806)。種々の試験により、ＦＩＶエンベロープタンパク質が、ネコにおいて予防ＦＩＶ免疫化を誘導できることが示唆されている。それゆえ、ＦＩＶエンベロープタンパク質の相対量または純度を測定する酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)は、ＦＩＶワクチンの効能を決定するのに最も有用である。しかし、現在市販入手可能な全ＦＩＶワクチンは、不活性化または死滅ウイルスを利用するものであり、ＦＩＶまたはＦＩＶ糖タンパク質と反応するか、もしくはそれらを認識することが公知のモノクローナル抗体は、不活性化ＦＩＶまたはＦＩＶ糖タンパク質と反応せず、またはそれらを認識しない。当該ウイルスの不活性化により、ＦＩＶエンベロープタンパク質の構造が変化する可能性があることが提案される。
ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)エンベロープ糖タンパク質は、細胞とのレセプター相互作用に関与しており、この相互作用により、該ウイルスに対する細胞の感受性が決定される。ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質は、ウイルスの侵入およびシンシチウムの形成にも関与しており、体液性および細胞性免疫反応の主要な標的である。(Bendinelli, M., et al., Clinical Microbiology Review, (1995) 8:87-112)。当該エンベロープ糖タンパク質は、その大部分がグルコシル化され、９５，０００−１００，０００の見かけの分子量を有する表面(ＳＵ)タンパク質、およびあまりグルコシル化されておらず、そして３５，０００−４０，０００の見かけの分子量を有する膜貫通(ＴＭ)タンパク質の、ビリオンにおける非共有結合している２つの成分から成る。(Pacino, G. et al., Virology, (1995) 206: 796-806)。種々の試験により、ＦＩＶエンベロープタンパク質が、ネコにおいて予防ＦＩＶ免疫化を誘導できることが示唆されている。それゆえ、ＦＩＶエンベロープタンパク質の相対量または純度を測定する酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)は、ＦＩＶワクチンの効能を決定するのに最も有用である。しかし、現在市販入手可能な全ＦＩＶワクチンは、不活性化または死滅ウイルスを利用するものであり、ＦＩＶまたはＦＩＶ糖タンパク質と反応するか、もしくはそれらを認識することが公知のモノクローナル抗体は、不活性化ＦＩＶまたはＦＩＶ糖タンパク質と反応せず、またはそれらを認識しない。当該ウイルスの不活性化により、ＦＩＶエンベロープタンパク質の構造が変化する可能性があることが提案される。
意外にも、ｍＡｂ １Ｄ９と称されるモノクローナル抗体が、不活性化ＦＩＶのみを特異的に認識し、生ＦＩＶは認識しないことが今回見出された。さらに、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降実験により、本発明のモノクローナル抗体がＦＩＶエンベロープ糖タンパク質の表面タンパク質成分と特異的に反応することが立証される。
明細書および請求の範囲に用いられるように、モノクローナル抗体なる用語は、クローン化されて抗体産生細胞株を生じる単一抗体産生細胞から産生される抗体を示す。エピトープなる用語は、抗体により認識される特定のアミノ酸配列、修飾アミノ酸配列、またはタンパク質二次または三次構造を示す。不活性化ウイルスなる用語は、「生きていない」または「死滅」ウイルスを示す。
本発明のモノクローナル抗体は、当該分野で公知の常套手段を用いて調製してよい。例えば、マウスを、ＦＩＶ−Ｓｈｉｚ、ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａなど、好ましくはＦＩＶ−Ｓｈｉｚなどの、部分的に精製された、不活性化ウイルスで免疫化してもよく、マウスの尻尾からの採血を次いで抗体反応に関してスクリーニングし、融合のために選択する。クローン化したハイブリドーマ細胞を次いで選択し、そして、不活性化ＦＩＶとの特異的反応に関してスクリーニングする。こうして得られた単一の安定なクローンのためのハイブリドーマはバイオリアクター中で増殖させてよく、そして抗体の多様な採取物をプールして、所望のモノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９を作製してよい。
当該抗体は、アメリカタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)に寄託され、その番号がＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８３７番に帰属する細胞株により産生されてよい。
ウイルスの不活性化は、常套の不活性化手段、例えば、バイナリーエチレンイミン、フェノール、α−ラクトプロピアネート、β−プロピオラクトン、ホルマリン、メルチオレート、グルテルアルデヒド、ナトリウムドデシルスルフェートなど、またはそれらの混合物、好ましくはホルマリンなどの化学的不活性化剤を用いる化学的不活性化により達成してよい。該ウイルスは、紫外線の存在下での加熱またはソラレンにより不活性化してもよい。
ウイルスの不活性化は、常套の不活性化手段、例えば、バイナリーエチレンイミン、フェノール、α−ラクトプロピアネート、β−プロピオラクトン、ホルマリン、メルチオレート、グルテルアルデヒド、ナトリウムドデシルスルフェートなど、またはそれらの混合物、好ましくはホルマリンなどの化学的不活性化剤を用いる化学的不活性化により達成してよい。該ウイルスは、紫外線の存在下での加熱またはソラレンにより不活性化してもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、不活性化ＦＩＶに特異的であり、そして、不活性化ウイルスの量の測定または不活性化ＦＩＶワクチンの効能に関するアッセイに有用な、不活性化ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質、ｇｐ９５またはｇｐ１３０などに独特なエピトープと十分強い相互作用を形成する。従って、本発明により、サンプル中の不活性化ＦＩＶコード化糖タンパク質に独特なエピトープの検出のための方法であって、当該サンプルを不活性化ＦＩＶコード化糖タンパク質に独特なエピトープに特異的なモノクローナル抗体と接触させて複合体を形成させること；および、当該複合体を検出することを含む方法が提供される。
本発明の方法における使用に適したサンプルには、培地またはワクチン組成物中に不活性化ウイルスまたは不活性化ウイルス感染細胞を含むものが含まれる。
本発明の方法における使用に適した複合体を検出する方法には、酵素−、蛍光色素−、またはビオチン標識化抗マウス抗体による検出、タンパク質Ａによる検出などの、モノクローナル抗体タンパク質複合体を検出するのに一般に用いられるあらゆる常套手段が含まれる。実際の実施において、本発明の方法は、モノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９を検出抗体として含むＥＬＩＳＡまたは免疫沈降アッセイにおいて実行されてよい。
本発明のより明確な理解のために、以下の実施例を以下に示す。これらの実施例は単なる例示であって、いずれにしても本発明の範囲または基本的な原理を制限するものと理解されるべきでない。実際、本明細書中に示すものおよび記載するものに加えて、本発明の種々の変更が、以下に示す実施例および前記の記載から当該分野の専門家に明らかとなろう。そのような変更も、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
他を示さない限り、全部分は重量部である。
他を示さない限り、全部分は重量部である。
不活性化ＦＩＶコード化糖タンパク質のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の調製
細胞およびウイルス
ＦＩＶ−シズオカ(ＦＩＶ-Ｓｈｉｚ、サブタイプＤ ＦＩＶ)を、ＦＩＶ-シズオカおよびＦｅＴ−Ｊ(ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１１９６７)由来の、Ｓｈｉｚと称されるＩＬ−２非依存細胞株である持続感染させたリンパ球細胞株にて増殖させた。ＦＩＶ−シズオカ持続感染細胞株も、ＡＴＣＣに受入番号ＣＲ０１１９７６の下に寄託されている。抗原ストックを作製するために、ウイルス流体を、ホルマリンを用いて不活性化し、そして限外濾過を用いて濃縮した。
細胞およびウイルス
ＦＩＶ−シズオカ(ＦＩＶ-Ｓｈｉｚ、サブタイプＤ ＦＩＶ)を、ＦＩＶ-シズオカおよびＦｅＴ−Ｊ(ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ１１９６７)由来の、Ｓｈｉｚと称されるＩＬ−２非依存細胞株である持続感染させたリンパ球細胞株にて増殖させた。ＦＩＶ−シズオカ持続感染細胞株も、ＡＴＣＣに受入番号ＣＲ０１１９７６の下に寄託されている。抗原ストックを作製するために、ウイルス流体を、ホルマリンを用いて不活性化し、そして限外濾過を用いて濃縮した。
抗原ストックは、適当に感受性のある細胞株およびＩＬ−２依存性または非依存性ネコＴ−細胞株、ＰＭＢＣ、ＣＲＦＫ、ＮＹＡ-１(ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ-２４１７)、Ｆｅｔ-１Ｍ(ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ-１０７７５)、ＦｅＴ-２Ｄ(ＡＴＣＣ受入番号１０７７４)、ＦｅＴ-１Ｃ(ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ-１１９６８)、ＦＬ-４(ＡＴＣＣ受入番号１０７７２)、ＦＬ-６(ＡＴＣＣ受入番号１０７７３)などにおいて増殖させた、または、それから誘導されるＦＩＶ持続感染細胞株、ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ-１３１２を有するＦＩＶ-ＣＲＦＫ細胞株、ＡＴＣＣ受入番号１１９７５下に寄託されているＦＩＶ−Ｂａｎｇｓｔｏｎ感染細胞株、および例えば米国特許第6,254,872号に開示されているものなどにおいて増殖させたフィールド単離物、ＦＩＶ株ＮＣＳＵ１(ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ-２３３３)、ＦＩＶ株ＵＣ２４８１８(ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ-２６１９)、ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａ(サブタイプＡ、ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ-２１８６)、ＦＩＶ-Ｄｉｘｏｎ(サブタイプＡ)、ＦＩＶ−ＵＫ８(サブタイプＡ)、ＦＩＶ−Ｂａｎｇｓｔｏｎ(サブタイプＢ)、ＦＩＶ−Ａｍｏｒｉ-１(サブタイプＢ)、ＦＩＶ−Ａｍｏｒｉ-２(サブタイプＢ)などの種々の他のＦＩＶ株およびサブタイプからも同様に調製される。
モノクローナル抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスをグリセロール勾配法を用いて精製したホルマリン処理したＦＩＶ−Ｓｈｉｚウイルスで２回免疫化した。注射部位は両注射に関して皮下におけるものであった。マウスの尻尾からの採血を、抗体反応に関してスクリーニングする。高ＦＩＶ特異的抗体力価を示す１匹のマウスを融合のために選択した。これらのマウスから集めた脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞へと融合した。ハイブリドーマ細胞を、Cold Spring Harbor PressのEd HarlowおよびDavid Laneによる「抗体：研究室マニュアル」に記載されているように選択した。一次ハイブリドーマクローンをホルマリン処理したＦＩＶ−Ｓｈｉｚとの特異的反応に関してスクリーニングした。１の安定なクローン、ｍＡｂ １Ｄ９を得た。ｍＡｂ １Ｄ９に関するハイブリドーマを、Heraeus miniPERMバイオリアクター中で増殖させた。抗体の多数の採取物を得、そしてプールして、大量のｍＡｂ １Ｄ９を作製した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスをグリセロール勾配法を用いて精製したホルマリン処理したＦＩＶ−Ｓｈｉｚウイルスで２回免疫化した。注射部位は両注射に関して皮下におけるものであった。マウスの尻尾からの採血を、抗体反応に関してスクリーニングする。高ＦＩＶ特異的抗体力価を示す１匹のマウスを融合のために選択した。これらのマウスから集めた脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞へと融合した。ハイブリドーマ細胞を、Cold Spring Harbor PressのEd HarlowおよびDavid Laneによる「抗体：研究室マニュアル」に記載されているように選択した。一次ハイブリドーマクローンをホルマリン処理したＦＩＶ−Ｓｈｉｚとの特異的反応に関してスクリーニングした。１の安定なクローン、ｍＡｂ １Ｄ９を得た。ｍＡｂ １Ｄ９に関するハイブリドーマを、Heraeus miniPERMバイオリアクター中で増殖させた。抗体の多数の採取物を得、そしてプールして、大量のｍＡｂ １Ｄ９を作製した。
酵素結合免疫吸着アッセイにおける検出抗体としてのモノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９の使用
この評価では、ガランサス・ニバリス免疫凝集素(ＧＮＡ)を用いて糖タンパク質を捕獲する。このＧＮＡ ＥＬＩＳＡは、ＧＮＡの結合の高い選択性と、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＦＩＶの糖タンパク質とのその広範な反応性を合わせ持つ。まず、９６穴のマイクロウェルプレートを、５０ｍＭの炭酸塩、ｐＨ９．６中１０μｇ／ｍＬのＧＮＡで１時間３７℃にてコートした。ウェルをＰＢＳ−１０％ＦＢＳで２時間３７℃でブロックした後、１％のエンピゲン(Empigen)ＢＢ(Calbiochem)にて１時間３７℃にて処理したサンプルを添加し、そして２時間３７℃にてインキュベートした。非結合抗原を３回、０．１％トウィーン２０を含んでいるＰＢＳで洗浄することにより除去した。１：８，０００に希釈した実施例１のモノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、１：１，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Kirkegaard & Perry Laboratories (KPL)を添加し、次いでプレートを３７℃にて１時間インキュベートし、次いで洗浄して、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質(KPL)を用いて展開した。プレートを５分間の反応期間後、６５０ｎｍマイナス４９０ｎｍにて記録した。
この評価では、ガランサス・ニバリス免疫凝集素(ＧＮＡ)を用いて糖タンパク質を捕獲する。このＧＮＡ ＥＬＩＳＡは、ＧＮＡの結合の高い選択性と、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＦＩＶの糖タンパク質とのその広範な反応性を合わせ持つ。まず、９６穴のマイクロウェルプレートを、５０ｍＭの炭酸塩、ｐＨ９．６中１０μｇ／ｍＬのＧＮＡで１時間３７℃にてコートした。ウェルをＰＢＳ−１０％ＦＢＳで２時間３７℃でブロックした後、１％のエンピゲン(Empigen)ＢＢ(Calbiochem)にて１時間３７℃にて処理したサンプルを添加し、そして２時間３７℃にてインキュベートした。非結合抗原を３回、０．１％トウィーン２０を含んでいるＰＢＳで洗浄することにより除去した。１：８，０００に希釈した実施例１のモノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、１：１，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Kirkegaard & Perry Laboratories (KPL)を添加し、次いでプレートを３７℃にて１時間インキュベートし、次いで洗浄して、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質(KPL)を用いて展開した。プレートを５分間の反応期間後、６５０ｎｍマイナス４９０ｎｍにて記録した。
免疫沈降アッセイにおける検出抗体としてのモノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９の使用
本評価では、ホルマリンで不活性化ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａウイルス(５％未満がＦＩＶタンパク質である０．３８ｍｇのトータルのタンパク質)に富むウイルスストックを、２ｍＬのＰＢＳ中５ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce)と共に氷上で１時間インキュベートした。組み込まれていないビオチン試薬を透析により除去した後、ウイルスを含んでいるサンプルを１時間、１２ｍＬのＰＢＳ中１％のトライトンＸ−１００で抽出し、そして１００，０００ｇにて２時間遠心分離した。上清を回収し、そして免疫沈降のために用いた。免疫沈降は、６００μＬの抽出物を８０μＬのｍＡｂ １Ｄ９またはｍＡｂ Ｈ５３３２のいずれかと共に４℃にて１時間インキュベートすることにより行った。ボレリアＯｓｐＡタンパク質に対して特異性を有するｍＡｂ Ｈ５３３２を無関係な抗体対照として用いた。免疫複合体を免疫化タンパク質Ｇ(Pierce)上に回収し、４回冷ＰＢＳ−１％ＮＰ−４０で洗浄し、Laemmliバッファー中に再懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに供した。ブロットを６０分間スーパーブロック(Pierce)でブロックし、そして次いで４５分間、１：４００，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン(ＫＰＬ)と共にインキュベートした。膜を４回ＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０で洗浄し、そしてビオチン−ストレプトアビジン複合体をスーパーシグナル化学ルミネセンス検出キット(Pierce)を用い、その後Ｘ線フィルムに曝すことにより検出した。
本評価では、ホルマリンで不活性化ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａウイルス(５％未満がＦＩＶタンパク質である０．３８ｍｇのトータルのタンパク質)に富むウイルスストックを、２ｍＬのＰＢＳ中５ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce)と共に氷上で１時間インキュベートした。組み込まれていないビオチン試薬を透析により除去した後、ウイルスを含んでいるサンプルを１時間、１２ｍＬのＰＢＳ中１％のトライトンＸ−１００で抽出し、そして１００，０００ｇにて２時間遠心分離した。上清を回収し、そして免疫沈降のために用いた。免疫沈降は、６００μＬの抽出物を８０μＬのｍＡｂ １Ｄ９またはｍＡｂ Ｈ５３３２のいずれかと共に４℃にて１時間インキュベートすることにより行った。ボレリアＯｓｐＡタンパク質に対して特異性を有するｍＡｂ Ｈ５３３２を無関係な抗体対照として用いた。免疫複合体を免疫化タンパク質Ｇ(Pierce)上に回収し、４回冷ＰＢＳ−１％ＮＰ−４０で洗浄し、Laemmliバッファー中に再懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに供した。ブロットを６０分間スーパーブロック(Pierce)でブロックし、そして次いで４５分間、１：４００，０００に希釈したペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン(ＫＰＬ)と共にインキュベートした。膜を４回ＰＢＳ−０．０５％トウィーン−２０で洗浄し、そしてビオチン−ストレプトアビジン複合体をスーパーシグナル化学ルミネセンス検出キット(Pierce)を用い、その後Ｘ線フィルムに曝すことにより検出した。
モノクローナル抗体、ｍＡｂ １Ｄ９の特異性の評価
細胞およびウイルス
ＦＩＶ−シズオカ(ＦＩＶ-Ｓｈｉｚ)およびＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａを、それぞれＳｈｉｚおよびＦＬ−６と指定する持続感染させたリンパ球細胞株中で増殖させた。ネコ白血病ウイルス(ＦｅＬＶ)を長期的に感染させた細胞株中で増殖させた。ネコカリシウイルス(ＦＣＶ)、ネコウイルス性ライノ鼻気管炎ウイルス(ＦＶＲ)およびネコ全白血病減少症ウイルス(ＦＰＶ)を、Crandellネコ腎臓細胞において増殖させた。抗原ストックを作製するために、ウイルス流体をホルマリンで不活性化させ、そして超濾過を用いて遠心分離した。
細胞およびウイルス
ＦＩＶ−シズオカ(ＦＩＶ-Ｓｈｉｚ)およびＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａを、それぞれＳｈｉｚおよびＦＬ−６と指定する持続感染させたリンパ球細胞株中で増殖させた。ネコ白血病ウイルス(ＦｅＬＶ)を長期的に感染させた細胞株中で増殖させた。ネコカリシウイルス(ＦＣＶ)、ネコウイルス性ライノ鼻気管炎ウイルス(ＦＶＲ)およびネコ全白血病減少症ウイルス(ＦＰＶ)を、Crandellネコ腎臓細胞において増殖させた。抗原ストックを作製するために、ウイルス流体をホルマリンで不活性化させ、そして超濾過を用いて遠心分離した。
評価
この評価において、ｍＡｂ １Ｄ９の特異性を、前記実施例２および３に記載するＥＬＩＳＡおよび免疫沈降法の両方を用いて測定した。
Ａ−ＧＮＡ ＥＬＩＳＡ
種々の抗原サンプルを、実施例２に記載するアッセイを用いて試験した。結果を以下の表Ｉに示す。
この評価において、ｍＡｂ １Ｄ９の特異性を、前記実施例２および３に記載するＥＬＩＳＡおよび免疫沈降法の両方を用いて測定した。
Ａ−ＧＮＡ ＥＬＩＳＡ
種々の抗原サンプルを、実施例２に記載するアッセイを用いて試験した。結果を以下の表Ｉに示す。
観察
１：８０００希釈で用いる場合、ｍＡｂ １Ｄ９は、不活性化ＦＩＶ−Ｓｈｉｚおよび不活性化Ｐｅｔａｌｕｍａサンプルの両方とよく反応した。これに対して、ｍＡｂ １Ｄ９は、それを生ＦｅＬＶ、ＦＣＶ、ＦＶＲおよびＦＰＶ、またはこれら種々のウイルスのための不活性化抗原ストックのいずれかのサンプルを用いて試験した場合には、反応を示さなかった。都合よくはｍＡｂ １Ｄ９は、不活性化ＦＩＶ−Ｓｈｉｚおよび不活性化ＦＩＶ−Ｓｈｉｚの両方のサンプルとはよく反応するにも関わらず、生ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａまたは生ＦＩＶ−シズオカのサンプルとは反応しない。表ＩのＥＬＩＳＡデータは、モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｄ９に基くＧＮＡ ＥＬＩＳＡを用いて、ＦＩＶ糖タンパク質を特異的に検出し得ることを示した。ｍＡｂ １Ｄ９が、生ＦＩＶでなくホルマリンで不活性化ＦＩＶと反応したという観察は、ｍＡｂ １Ｄ９により認識されるエピトープが、ＦＩＶのホルマリン処置により生成する独特なエピトープであることを示す。
１：８０００希釈で用いる場合、ｍＡｂ １Ｄ９は、不活性化ＦＩＶ−Ｓｈｉｚおよび不活性化Ｐｅｔａｌｕｍａサンプルの両方とよく反応した。これに対して、ｍＡｂ １Ｄ９は、それを生ＦｅＬＶ、ＦＣＶ、ＦＶＲおよびＦＰＶ、またはこれら種々のウイルスのための不活性化抗原ストックのいずれかのサンプルを用いて試験した場合には、反応を示さなかった。都合よくはｍＡｂ １Ｄ９は、不活性化ＦＩＶ−Ｓｈｉｚおよび不活性化ＦＩＶ−Ｓｈｉｚの両方のサンプルとはよく反応するにも関わらず、生ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａまたは生ＦＩＶ−シズオカのサンプルとは反応しない。表ＩのＥＬＩＳＡデータは、モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｄ９に基くＧＮＡ ＥＬＩＳＡを用いて、ＦＩＶ糖タンパク質を特異的に検出し得ることを示した。ｍＡｂ １Ｄ９が、生ＦＩＶでなくホルマリンで不活性化ＦＩＶと反応したという観察は、ｍＡｂ １Ｄ９により認識されるエピトープが、ＦＩＶのホルマリン処置により生成する独特なエピトープであることを示す。
Ｂ−免疫沈降
不活性化ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質に関するｍＡｂ １Ｄ９の特異性をさらに確認するために、不活性化ＦＩＶに富むストックをビオチン化し、次いで、ｍＡｂ １Ｄ９または無関係のモノクローナル抗体であるｍＡｂ Ｈ５３３２を用いて実施例３に記載するように免疫沈降した。図１に示すように、ｍＡｂ １Ｄ９は、広い９５−１００Ｋｄのバンドにより示されるように、ＳＵタンパク質と特異的に反応した。高分子量(約１６０Ｋｄ)を有するバンドは、ホルマリン処理により架橋した他のタンパク質とのＳＵの複合体である可能性がある。
不活性化ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質に関するｍＡｂ １Ｄ９の特異性をさらに確認するために、不活性化ＦＩＶに富むストックをビオチン化し、次いで、ｍＡｂ １Ｄ９または無関係のモノクローナル抗体であるｍＡｂ Ｈ５３３２を用いて実施例３に記載するように免疫沈降した。図１に示すように、ｍＡｂ １Ｄ９は、広い９５−１００Ｋｄのバンドにより示されるように、ＳＵタンパク質と特異的に反応した。高分子量(約１６０Ｋｄ)を有するバンドは、ホルマリン処理により架橋した他のタンパク質とのＳＵの複合体である可能性がある。
結論
ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降実験の結果は、モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｄ９が、ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質の表面タンパク質成分と特異的に反応し、そして、不活性化ＦＩＶワクチンの効能試験または不活性化ウイルスサンプルまたは不活性化ウイルス感染細胞サンプルの量を決定するのに適していることを示した。
ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降実験の結果は、モノクローナル抗体ｍＡｂ １Ｄ９が、ＦＩＶエンベロープ糖タンパク質の表面タンパク質成分と特異的に反応し、そして、不活性化ＦＩＶワクチンの効能試験または不活性化ウイルスサンプルまたは不活性化ウイルス感染細胞サンプルの量を決定するのに適していることを示した。
Claims (4)
- アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受入番号ＰＴＡ−４８３７として寄託された細胞株から産生されるモノクローナル抗体。
- サンプル中の不活性化ＦＩＶコード化糖タンパク質のエピトープの検出方法であって、該サンプルを不活性化ＦＩＶまたは不活性化ＦＩＶ糖タンパク質のエピトープと特異的に反応するかまたはそれを認識するが、生ＦＩＶまたは生ＦＩＶ糖タンパク質と反応せずまたはそれらを認識しない、アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受入番号ＰＴＡ−４８３７として寄託された細胞株から産生されるモノクローナル抗体またはそのクローンと接触させて複合体を形成させること、ならびに該複合体を検出することを含む方法。
- 部分的に精製された、不活性化ＦＩＶで適当な宿主を免疫化すること、該宿主を高ＦＩＶ特異的抗体反応に関してスクリーニングすること、該宿主からの脾細胞を適当な骨髄腫細胞株と融合すること、およびハイブリドーマを不活性化ＦＩＶとの特異的反応に関してスクリーニングすることにより調製される不活性化ＦＩＶコード糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を得るのに適当な、アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受入番号ＰＴＡ−４８３７として寄託されたハイブリドーマ細胞株であって、生ＦＩＶと反応せずまたはそれらを認識しないところの、ハイブリドーマ細胞株。
- アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受入番号ＰＴＡ−４８３７として寄託された細胞株。
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