NO319698B1 - Hestearteritt-virus peptid eller peptidkonjugat omfattende en eller flere epitoper i stand til a fremkalle en immunrespons i dyr - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et peptid eller peptidkonjugat omfattende én eller flere epitoper istand til å fremkalle en immunrespons i dyr som produserer antistoffer som er nøytraliserende for hestearteritt-virus.

Oppfinnelsen vedrører også et vaksinepreparat, rekombinant DNA, rekombinant RNA, plasmid og celle transformert ved nevnte rekombinante DNA eller plasmid.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å fremstille et diagnostisk middel for deteksjon av EAV mediert sykdom, en fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen eller mengden av antistoffer mot hestearteritt-virus tilstede i en prøve samt en fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen av hestearteritt-virus i en prøve.

Endelig vedrører oppfinnelsen et analysekit for å detektere tilstedeværelsen av antistoffer mot hestearteritt-virus i en prøve.

Viral hestearteritt, en sykdom for hvilken hester og esler er de eneste rapporterte verter, har vært kjent i omtrent 40 år og manifesterer seg selv med en rekke varierende kliniske tegn. I sin mest alvorlige form bevirker EAV-infeksjon abort som gjør den til en potensiell signifikant kommersiell trus-sel mot bl.a. veddeløpshest-avlsindustrien. Tidligere vete-rinærartikler refererer til den som epidemisk cellulitus pinkeye eller hesteinfluensa. Sykdomsutbrudd identifiseres ikke ofte og feltisolater av enkelttrådet DNA-virus er sjelden. ■

Viruset overføres gjennom de respiratoriske og veneriske ruter, idet 30% av bærerne er seropositive hingster, noe som gjør den sistnevnte rute til en særlig grunn til bekymring da disse avlshingster følgelig kan infisere avlshopper. På bak-grunn av den potensielle økonomiske viktighet av viruset og dets avlshestbærer-medierte infeksjonsevne, er der et behov for både profylaktisk behandling og pålitelig diagnose av

EAV.

Identiteten og tallrikheten av forskjellige strukturelle proteiner av EAV er omtalt av de Vries et al (1992, J Virol 66, 11:6294-6303). På grunnlag av deres data, ble EAV tillagt en distinkt taksonomisk posisjon sammenlignet med koronarviruser og toroviruser.

Laboratorieforsøk basert på ELISA, virusnøytraliserings (VN) og komplementfikserings (CF) formater er blitt utviklet (se Chirnside (1992), Br. vet. J. 148 side 181). Den kjente ELISA er relativt ufølsom når den anvendes for vev, f.eks. serum, fra hester som tidligere er vaksinert for andre syk-dommer som influensa og herpesvirus, mens VN- og CF-formatene har begrenset tidsmessig sensitivitet, idet VN-testen ikke er istand til å skjelne mellom vaksinasjon og naturlig infeksjon.

Vaksinasjonsprosedyrer har vært konsentrert om sikkerhet <p>g effektivitet av vaksine omfattende hele inaktiverte virus og svekkede levende virus. Den levende vaksine kan indusere utbredning ("shedding") av virus fra nasofarynks og forhind-rer ikke at dette bevirker infeksjon i vanlig beskyttede dyr som ikke er blitt behandlet således. Den kjente formalini-serte vaksine tilveiebringer ikke pålitelig beskyttelse.

Forsøk på å tilveiebringe forbedringer for både de diagnos-tiske tester og for vaksiner har omfattet studier av grupper av antistoffer dannet mot forskjellige EAV-proteiner. Et 2 9K kappeprotein er særlig blitt identifisert som antigenisk og istand til å gi produksjon av nøytraliserende antistoffer i mus (Balasuriya et al (1993) Journal of General Virology, 74, side 2525-2529) . Identiteten til dette protein er ukjent, men arbeid rapportert etter prioritetsdagen for den foreliggende søknad av Deregt et al (J. General Virology 75, side 2439-2444) har vist at enkelte monoklonale antistoffer dannet mot GL protein er EAV nøytraliserende, som dem mot nukleokap-sid N proteinet er. Resultater av forsøk i hester har enda ikke blitt rapportert.

Ved den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det således et peptid eller peptidkonjugat, et vaksinepreparat, et' rekombinant DNA, et rekombinant RNA, et plasmid, en celle transformert ved rekombinant DNA eller et plasmid, en fremgangsmåte for å fremstille et diagnostisk middel for deteksjon av EAV mediert sykdom, en fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen eller mengden av antistoffer mot hestearteritt-virus tilstede i en prøve, en fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen av hestearteritt-virus i en prøve samt et analysekit slik de er definert med de i kravene anførte trekk.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nå isolerte peptider som danner en potent nøytraliserende immunrespons mot EAV når de administreres til dyr, særlig hester, og disse peptider tilveiebringer sensitiv deteksjon av EAV antistoffer når de anvendes som bindingsmiddel i bindingsanalyser. DNA som koder for disse peptider er videre tilveiebragt.

I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et peptid eller peptidkonjugat som omfatter én eller flere epitoper istand til å fremkalle en immunrespons i dyr som danner antistoffer som virker nøytraliserende på hestearteritt-virus, og som er kjennetegnet ved at épitopene er valgt fra dem tilstede i aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 19 til 137 (SEQ ID NO 3) i hestearteritt-virus (EAV) GL proteinsekvensen (SEQ ID NO 2), idet peptidet ikke består av hele hestearteritt-virus GL proteinet (SEQ ID NO 2) .

Foretrukne peptider eller peptidkonjugater i henhold til oppfinnelsen omfatter épitopene tilstede i aminosyresekvensen svarende til aminosyrer 28 til 137 (SEQ ID NO 4) , mere foretrukket 75 til 97 {SEQ ID NO 5) og mest foretrukket 85 til 97 (SEQ ID NO 7) i EAV GL. Foretrukne peptider eller peptidkonjugat er omfatter aminosyresekvensen svarende til aminosyrer 75 til 97 eller en sekvens som har minst 90% homologi dermed, foretrukket omfattende en aminosyresekvens som er minst 90% homolog med sekvensen av aminosyrer 2 8 til 13 7 i hestearteritt-virus GL protein (SEQ ID NO 4), men inkluderende oven-nevnte 85 til 97, eller mere foretrukket 75 til 97 sekvensen, eller en sekvens som er minst 90% homolog dermed. Andre ønskelige eventuelle epitoper som er identifisert er i 33 til 44 og 53 til 64.

Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et peptid eller peptidkonjugat omfattende én eller flere epitoper som er istand til å fremkalle en immunrespons i dyr som danner antistoffer som er nøytraliserende for hestearteritt-virus, som er kjennetegnet ved at épitopene er valgt fra dem tilstede i aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 19 til 137 (SEQ ID NO 3)i hestearteritt-virus GL protein, for anvendelse som et diagnostisk middel for deteksjon av EAV. Et slikt aspekt omfatter selvfølgelig hestearteritt-virus GL protein som sådan for slik anvendelse. Peptider eller konjugater omfattende SEQ ID NO 2 er foretrukne, idet GL protein ér inkludert for slik anvendelse, men peptider eller konjugater omfattende en aminosyresekvens som svarer til en sekvens som er minst 90% homolog med sekvensen av aminosyrer 19 til 13 7 i hestearteritt GL protein (SEQ ID NO 3) eller med SEQ ID NO 4, mens aminosyrene 75 til 97 (SEQ ID NO 5) bibeholdes og mens aminosyrene 85 til 97 (SEQ ID NO 7) av, eller med minst 90% homologi med, SEQ ID NO 2 mest foretrukket bibeholdes, kan anvendes.

Det er også tilveiebragt preparater omfattende isolerte peptider eller peptidkonjugater som beskrevet i det oven-nevnte per se, inkluderende GL, særlig for anvendelse for å fremkalle nøytraliserende antistoffresponser, f.eks. for for-målet med profylakse eller diagnose. Slike preparater vil typisk omfatte et peptid eller konjugat i henhold til oppfinnelsen sammen med henholdsvis en farmasøytisk tålbar bærer eller en bærer som er egnet for anvendelse i bindingsstudier.

I et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt rekombinant DNA, eller RNA avledet derfra, som koder for peptider eller konjugater i henhold til oppfinnelsen. Det er videre tilveiebragt plasmider og celler transformert dermed omfattende dette DNA slik at de er istand til å uttrykke peptidene eller konjugatene. Dette DNA har sekvenser til SEQ ID NO 3 til 7 og dem indikert i den etter-følgende tabell l, og kan innlemmes i cellene i form av vektorer slik som plasmider eller de kan anvendes som en "naked vaccine" gjennom kromosomal integrering, idet begge teknikker er godt kjent av de fagkyndige på området.

I et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen av antistoffer mot hestearteritt-virus som omfatter anvendelse av et peptid eller peptidkonjugat i henhold til oppfinnelsen, eller GL protein, som et spesifikt bindingsmiddel. En slik test er foretrukket i ELISA format, men kan anvende peptidet eller konjugatet som immobilisert bindingsmiddel eller som merket sekundært bindingsmiddel i en såkalt sandwich analyse.

I bindingsanalysen hvor peptidet eller peptidkonjugatet er immobilisert kan denne metode passende gjennomføres ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige analyseplater hvorpå peptidet eller konjugatet er belagt, ved passende inkubasjon på kjent måte. Por det formål å analysere en prøve som skal screenes for EAV antistoffer, blir f.eks. en serumprøve typisk inkubert i kontakt med platen i f.eks. brønner, hvor-etter ethvert EAV antistoff tilstede deri identifiseres ved eksponering for f.eks. et anti-hest IgA, IgG eller IgM konjugert til en reportergruppe. En slik reportergruppe kan være i form av en radioaktiv markør, en kjemisk markør eller en biologisk markør. En typisk biologisk markør er et enzym eller kofaktor, f.eks. biotin, og påvises ved eksponeringen derav for alle de reaktanter som er nødvendige for å oppnå en reporterreaksjon avhengig av tilstedeværelsen av reporter-gruppen. I tilfellet med biotin kan brønnen eksponeres for streptavidin-peroksidase og deretter for o-fenylendiamindihydroklorid og platens absorbans kan bestemmes ved 490 nm.

I et ytterligere eksempel kan et immobilisert anti-hest IgA, IgM eller IgG antistoff dannet i et annet dyr anvendes til å binde en spesifikk gruppe av hesteantistoff og deretter kan det immobiliserte hesteantistoff som er tilveiebragt eksponeres for en oppløsning som inneholder merket peptid eller konjugat i henhold til oppfinnelsen hvorved tilstedeværelse av anti-EAV antistoff indikeres ved bestemmelse av mengden av tilstedeværende markør. Andre analyseformater som konkurre-rende analyser ved anvendelse av enten bundet eller ubundet peptid eller konjugat vil finnes for de fagkyndige på området, og disse vil inkludere enkel observasjon av aggluti-nering mellom peptid eller konjugat og antistoffet i en enkel fortynningstest.

I et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et analysekit for å anvende i gjennomføring-en av analysen i henhold til oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at de omfatter et peptid eller peptidkonjugat i henhold til oppfinnelsen sammen med eventuelle midler og elementer som er nødvendige for å utføre slike analyser. Slike midler og elementer kan omfatte andre bindingsmidler eller fargedannende midler som merkede antistoffer, f.eks. biotinylert anti-hest IgG, pepperrotperoksidase, streptavidin-peroksidasekonjugat og o-fenylendiamindihydroklorid. Det skal forståes at betegnelsen peptid og peptidkonjugat som anvendt heri vil omfatte oligopeptider, polypeptider og proteiner så lenge de oppfyller kriteriene i henhold til oppfinnelsen når det gjelder immunologisk aktivitet og innhold av epitopiske sekvenser. Betegnelsen "konjugat" angir konju-gering til enhver fysiologisk tålbar entitet.

Peptidene, peptidkonjugatene og bindingsanalysene i henhold til oppfinnelsen skal nå beskrives ved hjelp av eksempler under henvisning til de etterfølgende sekvenslister, figurer og eksempler.

Sekvensliste:

SEQ ID NO 1: er DNA sekvensen som er ekvivalent med hele EAV genomet minus de første 18 baser og polyA halen.

SEQ ID NO 2: er aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 1 til 137 i EAV GL proteinet (inkluderende en hvilken som helst signalsekvens).

SEQ ID NO 3: er aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 19 til 137 i EAV GL proteinet.

SEQ ID NO 4: er aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer

28 til 137 i EAV GL proteinet.

SEQ ID NO 5: er aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer

75 til 97 i EAV GL proteinet.

SEQ ID NO 6: er aminosyresekvensen som er fusjonert med GST i FpS.Rsal og anvendt i ELISA i eksempel 3.

SEQ ID NO 7: er aminosyresekvensen som svarer til epitopen i GL 85 til 97.

Figurer

Figur 1: viser et diagram som relaterer A490 verdier oppnådd ved anvendelse av en FpS.Rsal fusjonsprotein ELISA gjennom-ført som beskrevet i eksempel 3 med VN avledede resultater på prøver fra de samme hester. Figur 2: viser et diagram som relaterer A490 verdier oppnådd ved anvendelse av en Sp25 ELISA gjennomført som beskrevet i eksempel 3 med VN avledede resultater på prøver fra de samme hester.

Eksempel 1:

Fremstilling av peptider og konjugater i henhold til oppfinnelsen og DNA og vektorer som koder derfor.

cDNA omfattende EAV åpne leserammer (ORFer) 2 til 7 (som omtalt av De Vries et al, 1992) svarende til EAV proteiner Gs, 3, 4, GL, M og N ble klonet inn i bakterieekspresjons-vektorer pGEX-3X og pGEX-2T (tabell 1) og konstrukter ble screenet for fusjonsproteinekspresjon ved anvendelse av PAGE med kloning bekreftet ved RE spaltingsanalyser og sekvense-

ring over plasmid/innskudd forbindelsene. Affinitetsrenset glutation-S-transferase (GST) fusjonsproteiner ble screenet for reaktivitet ved indirekte ELISA med en gruppe av virus-nøytraliserende hesteserum. Av de seks fusjonsproteiner (Fp2.0 - Fp7.0) screenet ved hjelp av denne ELISA reagerte kun Fp5.0 {se SEQ ID NO 2 for EAV peptidinnhold), svarende til aminosyrer 2 8 - 13 7 i EAV GL pluss GST, sterkt med de nøytraliserende serumer. En gruppe på 96 nøytraliserende og 96 ikke-nøyt-raliserende serumer ble deretter testet ved indirekte ELISA mot Fp5.0. Blant de virusnøytraliserende serum som ble testet gav 96/96 en A4g0 som var større enn 0,4 mot FpS.O i ELISA, med absorbans-avlesninger som utviser en lineær korrelasjon til virus-nøytraliserende antistoff titere (figur 1). 12/96 av de nøytraliserende hesteserumer testet positivt overfor Fp5.o i denne ELISA.

Ytterligere kloningsforsøk ble utført med ORF 5 til å gi

fusjonsprodukter 5.1, 5.2 og 5.4 som ble affinitetsrenset før testing med ELISA. Skjønt Fp5.2 fra denne serie av konstrukter var over-uttrykt under dyrking, viste det seg vanskelig å affinitetsrense, slik at en ytterligere kloningsrunde ble

gjennomført for å danne FpS.Rsal.

Peptid Sp25 (SEQ ID NO 5) ble også direkte syntetisert svarende til aminosyresekvensen av hestearteritt-virus GL protein aminosyrer 75 til 97 og dette og FpS.Rsal produktet ble testet med ELISA som beskrevet i eksempel 3 (se figur 1 og 2). FpS.Rsal ble deretter anvendt i ELISA forsøk under UK EAV utbruddet i juni 1993 for raskt å screene serumer (tabell 2) og anvendt for å teste 12 64 hesteserumer fra en serounder-søkelse gjennomført på italienske hingster (tabell 3}.

Eksempel 2:

Immuniseringsstudier.

Fp5.0, FpS.Rsal og Sp25 ble anvendt til å immunisere kaniner og viste seg istand til å indusere nøytraliserende antistoff-respons. Påfølgende immunisering utført på tre grupper av tre hester bekreftet at Sp25 og FpS.Rsal induserer nøytrali-serende antistoffer i en dose på 60 [ ig av EAV-spesifikt peptid/konj ugat-middel for begge grupper. Peptidet ble levert som et middel bestående av Sp2 5 koblet til albueskjell-hemo-cyanin (KLH) og alle vaksinedoser fikk tilsatt Duphar poly-meradjuvans til 0,5%. Doser ble gitt ved dag 0, 51 og 114, idet Sp2 5 og Rsal gav sterk antistoffproduksjon etter hver dose.

Eksempel 3 :

ELISA ved anvendelse av FpS.Rsal eller Sp25 som bindingsmiddel.

Dynatech Immulon 3 mikrotiterplate-brønner ble belagt med FpS.Rsal eller Sp25 antigen ved eksponering for 100 ( il 5/ig/ml antigen i 0,05 M karbonatbuffer ved pH 9,6 (Sigma kat. nr. C3041) ved 4°C over natten.

Plater ble vasket tre ganger med fosfatbufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 0,05% Tween 20 (deretter PBST) og deretter blokkert med 100 fil PBST inneholdende 5% normalt geiteserum (Seralab) (deretter PBSTG) i 1 time ved 37°C. Platene ble igjen vasket tre ganger med PBST for å gjøre dem klar til bruk.

Prøveserumer ble fortynnet l : 10 0 i PBSTG og 10 0 fil av denne oppløsning ble tilsatt til brønnene fremstilt som angitt i det foregående og inkubert i 90 min. ved 3 7°C. Platene ble igjen vasket tre ganger med PBST og en oppløsning ble fremstilt ved å fortynne 100 fil geit anti-hest IgG biotinkonjugat (KPL katalog nr. 162102) 1 : 1000 i PBSTG og med tilsetning derav til hver brønn før inkubasjon i 90 min. ved 37°C. Platene ble vasket tre ganger med PBST og en oppløsning ble fremstilt ved å fortynne 100 yil streptavidin-peroksidase konjugat (KPL katalog nr. 14 - 30 - 00) 1 : 1000 i PBSTG og med tilsetning derav til hver brønn før inkubasjon ved romtemperatur i 3 0 min. Platene ble deretter vasket tre ganger med PBST og 100 ^1 o-fenylendiamindihydroklorid (Sigma kat. nr. P8287) (0,5 mg/ml i 0,05 fosfatcitratbuffer, pH 5,0, Sigma kat. nr. P4922) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 10 min. ved romtemperatur. 50 jil 4 M H2S04 ble tilsatt for å stanse reaksjonen og absorbansen ble avlest ved 490 nm. Da hesteserum kan binde nativ GST ved en 1 : 100 fortynning, er det nødvendig å subtrahere absorbansavlesninger oppnådd for serum mot GST fra GST-fusjonsproteinabsorbansen. Hver serum-prøve testes i to brønner mot hvert antigen. I hver ELISA test ble 8 EAV VN positive serumer og 8 EAV VN negative serumer kjørt som interne kontroller.

Prøver ble betegnet som ELISA positive dersom A490 er over 0,15.

16/21 av de ELISA negative VN positiver hadde VN titre under 1/16

Claims (23)

1. Peptid eller peptidkonjugat omfattende én eller flere epitoper istand til å fremkalle en immunrespons i dyr som produserer antistoffer som er nøytraliserende overfor hestearteritt-virus, karakterisert ved at épitopene er valgt fra dem tilstede i aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 19 til 137 (SEQ ID NO 3) i hestearteritt-virus GL proteinsekvensen (SEQ ID NO 2), idet peptidet ikke består av hele hestearteritt-virus GL proteinet (SEQ ID NO 2).

2. Peptid som angitt i krav 1, karakterisert ved at épitopene er dem som er tilstede i aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 28 til 137 (SEQ ID NO 4) i GL proteinet.

3. Peptid eller peptidkonjugat som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter épitopene tilstede i en aminosyresekvens som svarer til aminosyrer 75 til 97 i hestearteritt-virus GL proteinet (SEQ ID NO 5).

4. Peptid eller peptidkonjugat som angitt i krav l eller 2, karakterisert ved at det omfatter épitopene tilstede i en aminosyresekvens som svarer til aminosyrer 8 5 til 97 i hestearteritt-virus GL proteinet (SEQ ID NO 7).

5. Peptid eller peptidkonjugat som angitt ett eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som svarer til aminosyrer 85 til 97 i hestearteritt-virus GL proteinet (SEQ ID NO 7) eller en sekvens med minst 90% homologi dermed.

6. Peptid eller peptidkonjugat som angitt i krav 5, karakterisert ved at épitopene er tilveiebragt i form av et peptidfragment av aminosyresekvensen som svarer til aminosyrer 28 til 137 (SEQ.ID NO 4) i hestearteritt-virus GL proteinet, eller en sekvens med minst 90% homologi dermed.

7. Peptid eller peptidkonjugat omfattende én eller flere epitoper istand til å danne en immunrespons i dyr som er nøytraliserende for hestearteritt-virus, karakterisert ved at épitopene er valgt fra dem tilstede i peptidet med aminosyresekvens som svarer til aminosyrer 19 til 137 (SEQ ID NO 3) i hestearteritt-virus GL proteinet, for anvendelse som et diagnostisk middel for deteksjon av hestearteritt-virus.

8. Peptid eller peptidkonjugat som angitt i krav 7, karakterisert ved at épitopene er dem tilstede i peptidet med aminosyresekvens som svarer til aminosyrer .28 til 137 (SEQ ID NO 4) i GL proteinet.

9. Peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at peptidet er konjugert til et ytterligere peptid, protein eller annet fysiologisk tålbart molekyl.

10. Peptid eller peptidkonjugat, karakterisert ved at det har en aminosyresekvens svarende til SEQ ID NO 3, 4, 5, 6 eller 7 konjugert til glutation-S-transferase.

11. Peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som svarer til en hestearteritt-virus-aminosyresekvens konjugert til et peptid eller protein, idet dette peptid eller protein er istand til å øke immunresponsen til aminosyresekvensen ved administrering til dyr.

12. Vaksinepreparat, karakterisert ved at det omfatter et iso-lert peptid eller peptidkonjugater som angitt i ett eller flere av de foregående krav sammen med en farmasøytisk tålbar bærer.

13. Rekombinant DNA eller RNA, karakterisert ved at det koder.for et peptid eller peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 11.

14. Rekombinant DNA, karakterisert ved at det omfatter en sekvens svarende til basene 11210 til 11538, 11114 til 11291,

11240 til 11475, 11739 til 11876 eller 11292 til 11423 i SEQ ID NO 1.

15. Rekombinant RNA, . karakterisert ved at det omfatter en sekvens som svarer til DNA som angitt i krav 14.

16. Plasmid, karakterisert ved at det omfatter DNA som angitt i ett eller flere av kravene 12 til 15.

17. Celle transformert ved rekombinant DNA eller et plasmid som angitt i ett eller flere av kravene 13, 14, 15 eller 16, karakterisert ved at den er istand til å uttrykke et peptid eller peptidkonjugater som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 11.

18. Fremgangsmåte for å fremstille et diagnostisk middel for deteksjon av EAV mediert sykdom, karakterisert ved at den omfatter trinnet med å produsere antiserumer eller antistoffer mot et peptid eller peptidkonjugat eller preparat som angitt i ett eller flere av kravene l til 11.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at antistoffene er oppnådd ved affinitetskromatografi av antiserumene ved anvendelse av en kolonne omfattende immobilisert peptid eller peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av kravene l til 11, eller GL protein som bindingsmiddel.

20. Fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen eller mengden av antistoffer mot hestearteritt-virus tilstede i en prøve, karakterisert ved at det anvendes et peptid eller peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av kravene l til 11 som et spesifikt bindingsmiddel.

21. Fremgangsmåte for å teste for tilstedeværelsen av hestearteritt-virus i en.prøve, karakterisert ved at den omfatter anvendelse av antistoffer dannet mot et peptid eller peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 11 som et spesifikt bindingsmiddel.

22. Analysekit for å detektere tilstedeværelsen av antistoffer mot hestearteritt-virus i en prøve, karakterisert ved at det omfatter et peptid eller peptidkonjugat som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 11 sammen med én eller flere andre substanser som kreves for utførelse av en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 20 til 21.

23. Analysekit som angitt i krav 22, karakterisert ved at det er et ELISA analysekit hvor én eller flere andre substanser er valgt fra bindingsmidler eller fargedannende midler.