JP3662927B2 - ウマ動脈炎ウイルスペプチド、該ペプチドに対する抗体、及びこれらの診断検査での使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）及びウマ動脈炎ウイルス媒介疾患に関する組み換えＤＮＡ及び該組み換えＤＮＡによってコードされる、ワクチン製造に用いられるタンパク質並びに診断検査キット及び診断方法に係わる。
ウイルス性ウマ動脈炎は報告されている患者がウマ及びロバのみである疾患で、４０年ほど前から知られており、きわめて様々な臨床徴候を伴って発症する。ＥＡＶ感染はその最も重篤な形態では流産を惹起し、この事実により前記感染は、特に競走馬育種産業にとって潜在的に重大な商業的脅威となる。初期の獣医学論文ではＥＡＶ感染は、流行性化膿性（ｃｅｌｌｕｌｉｔｕｓ）結膜炎またはウマインフルエンザとして言及されている。疾患の発生は希にしか確認されず、一本鎖ＲＮＡウイルスそれ自体の野生単離株はまれである。
上記ウイルスは呼吸経路及び交尾経路によって伝達され、血清反応陽性種牡馬の３０％がキャリヤであると認められることから、交尾経路が特に懸念材料となるが、これはウイルスを放出する（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）前記のような種牡馬は結果的に繁殖用牝馬を感染させかねないからである。上記ウイルス、及び該ウイルスの種牡馬キャリヤが媒介する感染の可能性の潜在的な経済的重要性に照らして、ＥＡＶの予防処置と確実な診断との両方が必要とされている。
ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和（ＶＮ）方式及び補体結合（ＣＦ）方式に基づく室内検査法が開発されている（Ｃｈｉｒｎｓｉｄｅ，Ｂｒ．ｖｅｔ．Ｊ．１４８，ｐ．１８１，１９９２参照）。周知のＥＬＩＳＡは、インフルエンザなど他の疾患及びヘルペスウイルスに関して以前に予防接種を受けたウマに由来する組織、例えば血清等に適用した場合比較的低感度であり、一方ＶＮ及びＣＦ方式は限られた一時的感度しか有しない。ＶＮ検査は予防接種と自然感染とを区別できない。
予防接種操作では、不活化ワクチン及び弱毒生ワクチンの安全性及び効力が専ら求められてきた。生ワクチンは鼻咽腔からのウイルス放出を惹起する恐れが有り、その結果として同じ建物内で飼われている、予防接種処理を受けていない動物が感染しかねない。公知のホルマリン処理（ｆｏｒｍａｌｉｎｉｓｅｄ）ワクチンは確実な防御を実現しない。
診断検査とワクチンとの両方に改良を加える試みには、様々なＥＡＶタンパク質に対する抗体群についての研究が含まれている。特に２９Ｋエンベロープタンパク質は、マウスにおいて抗原性であり、かつ中和抗体の産生を惹起し得ることが確認されている（Ｂａｌａｓｕｒｉｙａ等，Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４，ｐｐ．２５２５−２５２９，１９９３）。このタンパク質の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は未知であるが、本出願の優先権主張日以後にＤｅｒｅｇｔ等によって報告された研究（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，ｐｐ．２４３９−２４４４）は、ＧLタンパク質に対する幾つかのモノクローナル抗体はヌクレオキャプシドＮタンパク質に対する抗体のようにＥＡＶ中和性であることを示している。だが、ウマでの検査結果は報告されていない。
本発明者は、動物、特にウマに投与した時にＥＡＶに対する有効な中和免疫応答を生起する単離ペプチドを提供し、このペプチドは結合アッセイ方式で結合剤として用いた場合高感度のＥＡＶ抗体検出を実現する。本発明者は、上記のようなペプチドをコードするＤＮＡも提供する。
本発明は第一の態様において、動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）であって、前記エピトープがウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）ＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープの中から選択され、ペプチドはＧLタンパク質ではないことを特徴とするペプチドまたはペプチド複合体を提供する。
好ましい本発明のペプチドまたはペプチド複合体はＥＡＶ ＧLのアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号４）中に存在するエピトープを含み、更に好ましくＥＡＶ ＧLのアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号５）、最も好ましくはアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号７）中に存在するエピトープを含む。好ましい本発明のペプチドまたはペプチド複合体はウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列またはこれと少なくとも９０％相同である配列；好ましくはウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７の配列（配列番号４）と少なくとも９０％相同である配列で、ただしアミノ酸８５〜９７、より好ましくは７５〜９７の配列または当該配列と少なくとも９０％相同である配列に対応するアミノ酸配列を含む。場合によっては用い得る他の望ましい同定エピトープに、アミノ酸３３〜４４及び５３〜６４が有る。
本発明の第二の態様は、動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体であって、診断薬としての使用のために前記エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープの中から選択されることを特徴とするペプチドまたはペプチド複合体を提供する。このようなペプチドまたはペプチド複合体は特に、ＥＡＶを検出する診断薬として用いられる。この態様には当然ながら、上記のような用途に充てるものとしてウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質そのものも含まれる。配列番号２を含むペプチドまたはペプチド複合体が好ましい。上記のような用途のためにはＧLタンパク質も包含される。しかし、ウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７の配列（配列番号３）または配列番号４の配列と少なくとも９０％相同である一方で配列番号２のアミノ酸７５〜９７（配列番号５）、最も好ましくはアミノ酸８５〜９７（配列番号７）、またはこれらの配列と少なくとも９０％相同である配列を保持する配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドまたはペプチド複合体が用いられ得る。
本発明は第三の態様において、特に例えば予防または診断目的で中和抗体応答の誘起に用いるＧLを含めた、それ自体前述した単離ペプチドまたはペプチド複合体を含有する組成物を提供する。典型的には、上記のような組成物は本発明のペプチドまたはペプチド複合体を、医薬上許容可能な担体かまたは結合試験の使用に適した担体いずれかと共に含有する。
本発明は第四の態様において、本発明のペプチドまたはペプチド複合体をコードする組み換えＤＮＡ、または該ＤＮＡから誘導されるＲＮＡと、前記ＤＮＡを本発明のペプチドまたはペプチド複合体が発現可能であるように含むプラスミド及び該プラスミドで形質転換された細胞とを提供する。上記ＤＮＡは配列番号３〜７の配列及び下記表１に示した配列を有し、プラスミドなどのベクターの形態で細胞内に導入され得るか、または染色体組み込みにより‘裸の（ｎａｋｅｄ）ワクチン’として用いられ得る。これらの技術はいずれも当業者には十分に理解される。
本発明は第五の態様において、特異的結合剤として本発明のペプチドもしくはペプチド複合体、またはＧLタンパク質を用いることを含む、ウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在を検査する方法を提供する。このような検査は好ましくはＥＬＩＳＡ方式を取るが、いわゆるサンドイッチアッセイにおいては本発明のペプチドまたはペプチド複合体を固定化結合剤として、または標識した二次結合剤として用い得る。
ペプチドまたはペプチド複合体を固定化する結合アッセイでは上記方法は、市販のアッセイプレートを用いることによって都合好く実施でき、その際前記プレートを、公知のように行なう適当なインキュベーションにより本発明のペプチドまたはペプチド複合体で被覆する。アッセイを行なうには、ＥＡＶ抗体に関してスクリーニングするべき試料、例えば血清試料を、典型的には例えばウェル内でプレートとの接触下にインキュベートし、その後試料中に存在するＥＡＶ抗体を、例えばリポーター基に結合した抗ウマＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭへの曝露によって同定する。上記リポーター基は放射ラベル、化学ラベルまたは生物ラベルの形態を取り得る。典型的な生物ラベルは酵素または補因子、例えばビオチンであり、リポーター基の存在に依存してリポーター反応が生起するのに必要なあらゆる反応物への曝露によって検出される。ビオチンの場合、ウェルをストレプトアビジン−ペルオキシダーゼに、次いでｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩に曝露し、４９０ｎｍにおけるプレートの吸光度を測定し得る。
別の一具体例では、別の動物において生成させた抗ウマＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を固定化し、これを用いて特異的なウマ抗体群を結合させ、次にこのようにして得られた固定化ウマ抗体を、標識した本発明のペプチドまたはペプチド複合体を含有する溶液に曝露し得、それによって抗ＥＡＶ抗体の存否を、存在するラベルの量のアッセイによって示す。結合した、及び結合していないペプチドまたはペプチド複合体を用いる競合アッセイなど、他のアッセイ方式も当業者には自明である。そのようなアッセイには、単純な稀釈検査におけるペプチドまたはペプチド複合体と抗体との凝集の単純な観察が含まれる。
本発明は更に別の態様において、本発明のアッセイの実施に用いる検査キットも提供し、このキットは本発明のペプチド、ペプチド複合体または抗体を前記のようなアッセイの実施に必要な任意の薬剤及び物品（ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｅｍｓ）に共に含むことを特徴とする。上記薬剤及び物品には、標識抗体、例えばビオチニル化抗ウマＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩など、他の結合剤または発色剤が含まれ得る。本明細書に用いた‘ペプチド’及び‘ペプチド複合体’という語は、エピトープ配列の免疫活性及び内容に関して本発明の基準を満たすものであれば、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含すると理解される。‘複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）’という語は、生理学的に許容可能な実体（ｅｎｔｉｔｙ）との結合を意味する。
次に本発明のペプチド、ペプチド複合体及び結合アッセイの単なる具体例を、以下の配列表、添付図面及び実施例を参照して説明する。
配列表の説明
配列番号１は、完全ＥＡＶゲノムから最初の１８塩基及びポリＡテールを除いたものに等しいＤＮＡ配列である。
配列番号２は、ＥＡＶ ＧLタンパク質（シグナル配列含む）のアミノ酸１〜１３７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＥＡＶ ＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＥＡＶ ＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＥＡＶ ＧLタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号６は実施例３のＥＬＩＳＡで用いた、Ｆｐ５．ＲｓａＩにおいてＧＳＴと融合したアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＧLの８５〜９７に位置するエピトープに対応するアミノ酸配列である。
図面の説明
第１図は実施例３に述べるように行なったＦｐ５．ＲｓａＩ融合タンパク質ＥＬＩＳＡによって得られたＡ490値を、同じウマから得た試料に関するＶＮから導いた結果と関連させて示すグラフである。
第２図は実施例３に述べるように行なったＳｐ２５ ＥＬＩＳＡによって得られたＡ490値を、同じウマから得た試料に関するＶＮから導いた結果と関連させて示すグラフである。
実施例１
本発明のペプチド及びペプチド複合体並びにこれらをコードするＤＮＡ及びベクターの製造
ＥＡＶタンパク質ＧS、３、４、ＧL、Ｍ及びＮに対応するＥＡＶ読み取り枠（ＯＲＦ）２〜７（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ等，１９９２による呼称）を含むｃＤＮＡを細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ及びｐＧＥＸ−２Ｔ（表１）中へクローニングし、構築物を、ＰＡＧＥを用いて融合タンパク質発現に関してスクリーニングし、その際クローニングはプラスミド−挿入部連結体全体のＲＥ消化分析及び配列決定によって確認した。アフィニティー精製したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、ウイルス中和ウマ血清パネルを用いる間接ＥＬＩＳＡにより反応性に関してスクリーニングした。上記ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした６種の融合タンパク質（Ｆｐ２．０〜Ｆｐ７．０）のうち、ＥＡＶ ＧLのアミノ酸２８〜１３７にＧＳＴを付加したものに対応するＦｐ５．０（ＥＡＶペプチドの内容については配列番号２参照）のみが中和血清と強く反応した。次に、９６の中和血清と９６の非中和血清とからなるパネルをＦｐ５．０に対して、間接ＥＬＩＳＡにより試験した。試験したウイルス中和血清は９６中９６がＥＬＩＳＡにおいてＦｐ５．０に対し０．４より大きいＡ490を現わし、その際吸光度はウイルス中和抗体力価に対して線形の相関関係を示した（第１図）。試験した９６の中和ウマ血清のうちの１２は上記ＥＬＩＳＡにおいてＦｐ５．０に対し陽性であった。
ＯＲＦ５を用いて追加のクローニング実験を行ない、それによって融合生成物５．１、５．２及び５．４を得、これらをアフィニティー精製してからＥＬＩＳＡで試験した。上記一連の構築物のうち、Ｆｐ５．２は培養中に過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）したが、この構築物はアフィニティー精製しにくいことが判明したので更に１ラウンドのクローニングを行ない、Ｆｐ５．ＲｓａＩを製造した。
ウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸７５〜９７のアミノ酸配列に対応するペプチドＳｐ２５（配列番号５）も直接合成し、これと生成物Ｆｐ５．ＲｓａＩとを実施例３に述べるＥＬＩＳＡで試験した（第１図及び第２図参照）。Ｆｐ５．ＲｓａＩは後に、１９９３年６月英国でのＥＡＶ発生の際に血清を迅速にスクリーニングするＥＬＩＳＡ検査に用い（表２）、またイタリア産種牡馬に対して行なわれたセロサーヴェイ（ｓｅｒｏｓｕｒｖｅｙ）に由来する１２６４のウマ血清の検査に用いた（表３）。
実施例２
免疫試験
Ｆｐ５．０、Ｆｐ５．ＲｓａＩ及びＳｐ２５を用いてウサギを免疫し、これらが中和抗体応答を誘起し得ることを証明した。その後３頭ずつ３グループのウマを免疫し、それによってＳｐ２５及びＦｐ５．ＲｓａＩが、これらで免疫したいずれのグループの場合もＥＡＶ特異的ペプチド／ペプチド複合体薬剤の投与量６０μｇにおいて中和抗体を誘起することを確認した。ペプチドは、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したＳｐ２５から成る薬剤として送達し、また総てのワクチン１回分に０．５％のＤｕｐｈａｒポリマーアジュバントを添加した。投与は０、５１及び１１４日目に行なった。Ｓｐ２５及びＲｓａＩは投与の度に強い抗体産生を実現した。
実施例３
結合剤としてＦｐ５．ＲｓａＩまたはＳｐ２５を用いるＥＬＩＳＡ
Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ ３マイクロタイタープレートウェルを、５μｇ／ｍｌの抗原を含有するｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ３０４１）１００μｌに４℃で一晩曝露することによりＦｐ５．ＲｓａＩまたはＳｐ２５抗原で被覆した。
プレートを、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有させたもの（以後ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、その後３７℃で一晩、５％の正常ヤギ血清（Ｓｅｒａｌａｂ）を含有するＰＢＳＴ（以後ＰＢＳＴＧ）１００μｌでブロックした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、使用準備を完了した。
試験血清をＰＢＳＴＧで１：１００に稀釈し、この溶液１００μｌを上述のように準備したウェルに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのヤギ抗ウマＩｇＧビオチン複合体（ＫＰＬカタログＮｏ．１６２１０２）をＰＢＳＴＧで１：１０００に稀釈することによって溶液を調製し、これを各ウェルに添加した後３７℃で９０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体（ＫＰＬカタログＮｏ１４−３０−００）をＰＢＳＴＧで１：１０００に稀釈することによって溶液を調製し、これを各ウェルに添加した後室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８２８７）［ｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４９２２）中に０．５ｍｇ／ｍｌ］を各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌの４Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。１：１００に稀釈したウマ血清は天然のＧＳＴに結合し得るので、ＧＳＴに対する血清に関して得られる吸光度をＧＳＴ−融合タンパク質吸光度から減算しなければならない。各血清サンプルを各抗原に対し、二重ウェルにおいて試験する。いずれのＥＬＩＳＡ試験においても、八つのＥＡＶ ＶＮ陽性血清と八つのＥＡＶ ＶＮ陰性血清とを内部対照として用いた。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１２６８７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１１２０７．．１１５３８
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１１１５６．．１１５３９
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１１３５１．．１１７６１
配列
配列番号：２
配列の長さ：１３７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
配列番号：３
配列の長さ：１１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列番号：４
配列の長さ：１１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列番号：５
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列番号：６
配列の長さ：４４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列番号：７
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
ウイルス性ウマ動脈炎は報告されている患者がウマ及びロバのみである疾患で、４０年ほど前から知られており、きわめて様々な臨床徴候を伴って発症する。ＥＡＶ感染はその最も重篤な形態では流産を惹起し、この事実により前記感染は、特に競走馬育種産業にとって潜在的に重大な商業的脅威となる。初期の獣医学論文ではＥＡＶ感染は、流行性化膿性（ｃｅｌｌｕｌｉｔｕｓ）結膜炎またはウマインフルエンザとして言及されている。疾患の発生は希にしか確認されず、一本鎖ＲＮＡウイルスそれ自体の野生単離株はまれである。
上記ウイルスは呼吸経路及び交尾経路によって伝達され、血清反応陽性種牡馬の３０％がキャリヤであると認められることから、交尾経路が特に懸念材料となるが、これはウイルスを放出する（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）前記のような種牡馬は結果的に繁殖用牝馬を感染させかねないからである。上記ウイルス、及び該ウイルスの種牡馬キャリヤが媒介する感染の可能性の潜在的な経済的重要性に照らして、ＥＡＶの予防処置と確実な診断との両方が必要とされている。
ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和（ＶＮ）方式及び補体結合（ＣＦ）方式に基づく室内検査法が開発されている（Ｃｈｉｒｎｓｉｄｅ，Ｂｒ．ｖｅｔ．Ｊ．１４８，ｐ．１８１，１９９２参照）。周知のＥＬＩＳＡは、インフルエンザなど他の疾患及びヘルペスウイルスに関して以前に予防接種を受けたウマに由来する組織、例えば血清等に適用した場合比較的低感度であり、一方ＶＮ及びＣＦ方式は限られた一時的感度しか有しない。ＶＮ検査は予防接種と自然感染とを区別できない。
予防接種操作では、不活化ワクチン及び弱毒生ワクチンの安全性及び効力が専ら求められてきた。生ワクチンは鼻咽腔からのウイルス放出を惹起する恐れが有り、その結果として同じ建物内で飼われている、予防接種処理を受けていない動物が感染しかねない。公知のホルマリン処理（ｆｏｒｍａｌｉｎｉｓｅｄ）ワクチンは確実な防御を実現しない。
診断検査とワクチンとの両方に改良を加える試みには、様々なＥＡＶタンパク質に対する抗体群についての研究が含まれている。特に２９Ｋエンベロープタンパク質は、マウスにおいて抗原性であり、かつ中和抗体の産生を惹起し得ることが確認されている（Ｂａｌａｓｕｒｉｙａ等，Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４，ｐｐ．２５２５−２５２９，１９９３）。このタンパク質の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は未知であるが、本出願の優先権主張日以後にＤｅｒｅｇｔ等によって報告された研究（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，ｐｐ．２４３９−２４４４）は、ＧLタンパク質に対する幾つかのモノクローナル抗体はヌクレオキャプシドＮタンパク質に対する抗体のようにＥＡＶ中和性であることを示している。だが、ウマでの検査結果は報告されていない。
本発明者は、動物、特にウマに投与した時にＥＡＶに対する有効な中和免疫応答を生起する単離ペプチドを提供し、このペプチドは結合アッセイ方式で結合剤として用いた場合高感度のＥＡＶ抗体検出を実現する。本発明者は、上記のようなペプチドをコードするＤＮＡも提供する。
本発明は第一の態様において、動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）であって、前記エピトープがウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）ＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープの中から選択され、ペプチドはＧLタンパク質ではないことを特徴とするペプチドまたはペプチド複合体を提供する。
好ましい本発明のペプチドまたはペプチド複合体はＥＡＶ ＧLのアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号４）中に存在するエピトープを含み、更に好ましくＥＡＶ ＧLのアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号５）、最も好ましくはアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号７）中に存在するエピトープを含む。好ましい本発明のペプチドまたはペプチド複合体はウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列またはこれと少なくとも９０％相同である配列；好ましくはウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７の配列（配列番号４）と少なくとも９０％相同である配列で、ただしアミノ酸８５〜９７、より好ましくは７５〜９７の配列または当該配列と少なくとも９０％相同である配列に対応するアミノ酸配列を含む。場合によっては用い得る他の望ましい同定エピトープに、アミノ酸３３〜４４及び５３〜６４が有る。
本発明の第二の態様は、動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドまたはペプチド複合体であって、診断薬としての使用のために前記エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープの中から選択されることを特徴とするペプチドまたはペプチド複合体を提供する。このようなペプチドまたはペプチド複合体は特に、ＥＡＶを検出する診断薬として用いられる。この態様には当然ながら、上記のような用途に充てるものとしてウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質そのものも含まれる。配列番号２を含むペプチドまたはペプチド複合体が好ましい。上記のような用途のためにはＧLタンパク質も包含される。しかし、ウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７の配列（配列番号３）または配列番号４の配列と少なくとも９０％相同である一方で配列番号２のアミノ酸７５〜９７（配列番号５）、最も好ましくはアミノ酸８５〜９７（配列番号７）、またはこれらの配列と少なくとも９０％相同である配列を保持する配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチドまたはペプチド複合体が用いられ得る。
本発明は第三の態様において、特に例えば予防または診断目的で中和抗体応答の誘起に用いるＧLを含めた、それ自体前述した単離ペプチドまたはペプチド複合体を含有する組成物を提供する。典型的には、上記のような組成物は本発明のペプチドまたはペプチド複合体を、医薬上許容可能な担体かまたは結合試験の使用に適した担体いずれかと共に含有する。
本発明は第四の態様において、本発明のペプチドまたはペプチド複合体をコードする組み換えＤＮＡ、または該ＤＮＡから誘導されるＲＮＡと、前記ＤＮＡを本発明のペプチドまたはペプチド複合体が発現可能であるように含むプラスミド及び該プラスミドで形質転換された細胞とを提供する。上記ＤＮＡは配列番号３〜７の配列及び下記表１に示した配列を有し、プラスミドなどのベクターの形態で細胞内に導入され得るか、または染色体組み込みにより‘裸の（ｎａｋｅｄ）ワクチン’として用いられ得る。これらの技術はいずれも当業者には十分に理解される。
本発明は第五の態様において、特異的結合剤として本発明のペプチドもしくはペプチド複合体、またはＧLタンパク質を用いることを含む、ウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在を検査する方法を提供する。このような検査は好ましくはＥＬＩＳＡ方式を取るが、いわゆるサンドイッチアッセイにおいては本発明のペプチドまたはペプチド複合体を固定化結合剤として、または標識した二次結合剤として用い得る。
ペプチドまたはペプチド複合体を固定化する結合アッセイでは上記方法は、市販のアッセイプレートを用いることによって都合好く実施でき、その際前記プレートを、公知のように行なう適当なインキュベーションにより本発明のペプチドまたはペプチド複合体で被覆する。アッセイを行なうには、ＥＡＶ抗体に関してスクリーニングするべき試料、例えば血清試料を、典型的には例えばウェル内でプレートとの接触下にインキュベートし、その後試料中に存在するＥＡＶ抗体を、例えばリポーター基に結合した抗ウマＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭへの曝露によって同定する。上記リポーター基は放射ラベル、化学ラベルまたは生物ラベルの形態を取り得る。典型的な生物ラベルは酵素または補因子、例えばビオチンであり、リポーター基の存在に依存してリポーター反応が生起するのに必要なあらゆる反応物への曝露によって検出される。ビオチンの場合、ウェルをストレプトアビジン−ペルオキシダーゼに、次いでｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩に曝露し、４９０ｎｍにおけるプレートの吸光度を測定し得る。
別の一具体例では、別の動物において生成させた抗ウマＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を固定化し、これを用いて特異的なウマ抗体群を結合させ、次にこのようにして得られた固定化ウマ抗体を、標識した本発明のペプチドまたはペプチド複合体を含有する溶液に曝露し得、それによって抗ＥＡＶ抗体の存否を、存在するラベルの量のアッセイによって示す。結合した、及び結合していないペプチドまたはペプチド複合体を用いる競合アッセイなど、他のアッセイ方式も当業者には自明である。そのようなアッセイには、単純な稀釈検査におけるペプチドまたはペプチド複合体と抗体との凝集の単純な観察が含まれる。
本発明は更に別の態様において、本発明のアッセイの実施に用いる検査キットも提供し、このキットは本発明のペプチド、ペプチド複合体または抗体を前記のようなアッセイの実施に必要な任意の薬剤及び物品（ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｅｍｓ）に共に含むことを特徴とする。上記薬剤及び物品には、標識抗体、例えばビオチニル化抗ウマＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩など、他の結合剤または発色剤が含まれ得る。本明細書に用いた‘ペプチド’及び‘ペプチド複合体’という語は、エピトープ配列の免疫活性及び内容に関して本発明の基準を満たすものであれば、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含すると理解される。‘複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）’という語は、生理学的に許容可能な実体（ｅｎｔｉｔｙ）との結合を意味する。
次に本発明のペプチド、ペプチド複合体及び結合アッセイの単なる具体例を、以下の配列表、添付図面及び実施例を参照して説明する。
配列表の説明
配列番号１は、完全ＥＡＶゲノムから最初の１８塩基及びポリＡテールを除いたものに等しいＤＮＡ配列である。
配列番号２は、ＥＡＶ ＧLタンパク質（シグナル配列含む）のアミノ酸１〜１３７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＥＡＶ ＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＥＡＶ ＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＥＡＶ ＧLタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列である。
配列番号６は実施例３のＥＬＩＳＡで用いた、Ｆｐ５．ＲｓａＩにおいてＧＳＴと融合したアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＧLの８５〜９７に位置するエピトープに対応するアミノ酸配列である。
図面の説明
第１図は実施例３に述べるように行なったＦｐ５．ＲｓａＩ融合タンパク質ＥＬＩＳＡによって得られたＡ490値を、同じウマから得た試料に関するＶＮから導いた結果と関連させて示すグラフである。
第２図は実施例３に述べるように行なったＳｐ２５ ＥＬＩＳＡによって得られたＡ490値を、同じウマから得た試料に関するＶＮから導いた結果と関連させて示すグラフである。
実施例１
本発明のペプチド及びペプチド複合体並びにこれらをコードするＤＮＡ及びベクターの製造
ＥＡＶタンパク質ＧS、３、４、ＧL、Ｍ及びＮに対応するＥＡＶ読み取り枠（ＯＲＦ）２〜７（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ等，１９９２による呼称）を含むｃＤＮＡを細菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ及びｐＧＥＸ−２Ｔ（表１）中へクローニングし、構築物を、ＰＡＧＥを用いて融合タンパク質発現に関してスクリーニングし、その際クローニングはプラスミド−挿入部連結体全体のＲＥ消化分析及び配列決定によって確認した。アフィニティー精製したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、ウイルス中和ウマ血清パネルを用いる間接ＥＬＩＳＡにより反応性に関してスクリーニングした。上記ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした６種の融合タンパク質（Ｆｐ２．０〜Ｆｐ７．０）のうち、ＥＡＶ ＧLのアミノ酸２８〜１３７にＧＳＴを付加したものに対応するＦｐ５．０（ＥＡＶペプチドの内容については配列番号２参照）のみが中和血清と強く反応した。次に、９６の中和血清と９６の非中和血清とからなるパネルをＦｐ５．０に対して、間接ＥＬＩＳＡにより試験した。試験したウイルス中和血清は９６中９６がＥＬＩＳＡにおいてＦｐ５．０に対し０．４より大きいＡ490を現わし、その際吸光度はウイルス中和抗体力価に対して線形の相関関係を示した（第１図）。試験した９６の中和ウマ血清のうちの１２は上記ＥＬＩＳＡにおいてＦｐ５．０に対し陽性であった。
ＯＲＦ５を用いて追加のクローニング実験を行ない、それによって融合生成物５．１、５．２及び５．４を得、これらをアフィニティー精製してからＥＬＩＳＡで試験した。上記一連の構築物のうち、Ｆｐ５．２は培養中に過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）したが、この構築物はアフィニティー精製しにくいことが判明したので更に１ラウンドのクローニングを行ない、Ｆｐ５．ＲｓａＩを製造した。
実施例２
免疫試験
Ｆｐ５．０、Ｆｐ５．ＲｓａＩ及びＳｐ２５を用いてウサギを免疫し、これらが中和抗体応答を誘起し得ることを証明した。その後３頭ずつ３グループのウマを免疫し、それによってＳｐ２５及びＦｐ５．ＲｓａＩが、これらで免疫したいずれのグループの場合もＥＡＶ特異的ペプチド／ペプチド複合体薬剤の投与量６０μｇにおいて中和抗体を誘起することを確認した。ペプチドは、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したＳｐ２５から成る薬剤として送達し、また総てのワクチン１回分に０．５％のＤｕｐｈａｒポリマーアジュバントを添加した。投与は０、５１及び１１４日目に行なった。Ｓｐ２５及びＲｓａＩは投与の度に強い抗体産生を実現した。
実施例３
結合剤としてＦｐ５．ＲｓａＩまたはＳｐ２５を用いるＥＬＩＳＡ
Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ ３マイクロタイタープレートウェルを、５μｇ／ｍｌの抗原を含有するｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ３０４１）１００μｌに４℃で一晩曝露することによりＦｐ５．ＲｓａＩまたはＳｐ２５抗原で被覆した。
プレートを、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有させたもの（以後ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、その後３７℃で一晩、５％の正常ヤギ血清（Ｓｅｒａｌａｂ）を含有するＰＢＳＴ（以後ＰＢＳＴＧ）１００μｌでブロックした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、使用準備を完了した。
試験血清をＰＢＳＴＧで１：１００に稀釈し、この溶液１００μｌを上述のように準備したウェルに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのヤギ抗ウマＩｇＧビオチン複合体（ＫＰＬカタログＮｏ．１６２１０２）をＰＢＳＴＧで１：１０００に稀釈することによって溶液を調製し、これを各ウェルに添加した後３７℃で９０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体（ＫＰＬカタログＮｏ１４−３０−００）をＰＢＳＴＧで１：１０００に稀釈することによって溶液を調製し、これを各ウェルに添加した後室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８２８７）［ｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４９２２）中に０．５ｍｇ／ｍｌ］を各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌの４Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。１：１００に稀釈したウマ血清は天然のＧＳＴに結合し得るので、ＧＳＴに対する血清に関して得られる吸光度をＧＳＴ−融合タンパク質吸光度から減算しなければならない。各血清サンプルを各抗原に対し、二重ウェルにおいて試験する。いずれのＥＬＩＳＡ試験においても、八つのＥＡＶ ＶＮ陽性血清と八つのＥＡＶ ＶＮ陰性血清とを内部対照として用いた。
配列番号：１
配列の長さ：１２６８７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１１２０７．．１１５３８
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１１１５６．．１１５３９
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：１１３５１．．１１７６１
配列
配列の長さ：１３７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
配列の長さ：１１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列の長さ：１１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列の長さ：２３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列の長さ：４４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
配列の長さ：１３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源
生物名：ウマ動脈炎ウイルス
配列
Claims (30)
- 動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する抗体を生成させる免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドであって、前記エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）中に存在するエピトープの中から選択され、前記ペプチドはウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質そのものではないことを特徴とするペプチド。
- エピトープが前記ＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号４）中に存在するエピトープであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
- ウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸７５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号５）中に存在するエピトープを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
- ウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号７）中に存在するエピトープを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
- ウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸８５〜９７に対応するアミノ酸配列（配列番号７）を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチド。
- エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号４）を有するペプチドフラグメントの形態であることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
- 配列番号３、４、５、６または７に対応するアミノ酸配列のペプチド。
- 動物においてウマ動脈炎ウイルスを中和する免疫応答を誘起し得るエピトープを１個以上含むペプチドであって、ウマ動脈炎ウイルスを検出する診断薬としての使用のために前記エピトープがウマ動脈炎ウイルスＧLタンパク質のアミノ酸１９〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号３）のペプチド中に存在するエピトープの中から選択されることを特徴とするペプチド。
- エピトープが前記ＧLタンパク質のアミノ酸２８〜１３７に対応するアミノ酸配列（配列番号４）のペプチド中に存在するエピトープであることを特徴とする請求項８に記載のペプチド。
- 別のペプチドまたはタンパク質と結合した請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドから成るペプチド複合体。
- グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと結合した配列番号３、４、５、６または７に対応するアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のペプチド複合体。
- 前記別のペプチドまたはタンパク質が、動物に投与された時に請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドに対する免疫応答を促進し得る別のペプチドまたはタンパク質である、請求項１０に記載のペプチド複合体。
- 前記別のタンパク質がスカシガイヘモシアニン、ウシ血清アルブミン及びニワトリ卵アルブミンの中から選択される請求項１２に記載のペプチド複合体。
- 単離された請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドおよび／または請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体を医薬上許容可能な担体と共に含有するワクチン組成物。
- 請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体をコードする組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ。
- 配列番号１の配列の塩基１１２１０〜１１５３８、１１１１４〜１１２９１、１１２４０〜１１４７５、１１７３９〜１１８７６または１１２９２〜１１４２３に対応する配列を含む組み換えＤＮＡ。
- 請求項１６に記載のＤＮＡに対応する配列を含む組み換えＲＮＡ。
- 請求項１５から１７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むプラスミド。
- 請求項１５に記載のＤＮＡを含む細菌発現ベクタープラスミド。
- 請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体を発現させ得る、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の組み換えＤＮＡ、ＲＮＡまたはプラスミドで形質転換した細胞。
- ＥＡＶ媒介疾患を検出する診断薬として用いられる抗血清または抗体の製造方法であって、請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体または請求項１４に記載の組成物に対して抗血清または抗体を生成させる工程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項２１に記載の方法で得られた抗血清を、固定化された請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体またはＧLタンパク質を結合剤として収容したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに掛けて抗体を得ることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
- 試料中に存在するウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在または量を検査する方法であって、特異的結合剤として請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体を用いることを含む方法。
- ＥＬＩＳＡアッセイまたはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
- ペプチドまたはペプチド複合体をアッセイプレート上に固定化して、検査するべき液体試料中に存在するＥＡＶ抗体を特異的に結合させるのに用いることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
- ペプチドまたはペプチド複合体を標識して、アッセイプレート上に固定化したＥＡＶ抗体の同定に用い、その際前記抗体を固定化したプレートを前記標識したペプチドまたはペプチド複合体に曝露し、その後プレートに結合したラベルの量を測定し、このラベル量を試料における抗体の存在または量と関係付けることを特徴とする請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
- 試料においてウマ動脈炎ウイルスの存在を検査する方法であって、請求項２１または２２に記載の方法で得られた抗体を用いることを含む方法。
- 試料においてウマ動脈炎ウイルスに対する抗体の存在を検出する検査キットであって、請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド複合体を請求項２３から２７のいずれか１項に記載の方法の実施に必要な１種以上の他の物品と共に含むキット。
- ＥＬＩＳＡ検査キットであり、１種以上の他の物品が結合剤または発色剤の中から選択されることを特徴とする請求項２８に記載のキット。
- 他の物品がビオチン標識抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩の中から選択されることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
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