NL1003579C2 - Recombinant DNA-vector. - Google Patents

Recombinant DNA-vector. Download PDF

Info

Publication number
NL1003579C2
NL1003579C2 NL1003579A NL1003579A NL1003579C2 NL 1003579 C2 NL1003579 C2 NL 1003579C2 NL 1003579 A NL1003579 A NL 1003579A NL 1003579 A NL1003579 A NL 1003579A NL 1003579 C2 NL1003579 C2 NL 1003579C2
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
virus
dna
sequence
rna
vector
Prior art date
Application number
NL1003579A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric John Snijder
Wilhelmus Josephus Maria Spaan
Petrus Johannes Bredenbeek
Johan Arie Den Boon
Leonie Christina Van Dinten
Alfred Leonard Maria Wassenaar
Original Assignee
Univ Leiden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Leiden filed Critical Univ Leiden
Priority to NL1003579A priority Critical patent/NL1003579C2/nl
Priority to PCT/NL1997/000408 priority patent/WO1998002549A1/en
Priority to AU33624/97A priority patent/AU729975B2/en
Priority to EP97929604A priority patent/EP0912744A1/en
Priority to CA002259964A priority patent/CA2259964A1/en
Priority to JP10505874A priority patent/JP2000514304A/ja
Application granted granted Critical
Publication of NL1003579C2 publication Critical patent/NL1003579C2/nl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/20011Coronaviridae
    • C12N2770/20022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Recombinant DNA-vector
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een recombinant DNA-vector die een DNA-volgorde (-DNA) complementair met ten minste een deel van het genoom van equine arteritis virus (EA-virus) omvat, welke DNA-vector aansluitend op 5 de 3'-zijde van de DNA-volgorde (-DNA) een niet-EA-viruseigen promotor voor een niet-EA-viruseigen RNA-polymerase bezit en, na transcriptie van de DNA-volgorde (-DNA) door het niet-EA-viruseigen RNA-polymerase, RNA oplevert dat in een virusgastheercel infectieus is, de DNA-volgorde (-DNA) een met het ge-10 noemde deel van het genoom overeenstemmende complementaire DNA-volgorde (+DNA) bezit, welke complementaire DNA-volgorde (+DNA) uit een eerste volgorde en aansluitend aan de 5'-zijde van de eerste volgorde een tweede volgorde bestaat, de eerste volgorde de door SEQ nr. 1 weergegeven volgorde is of een 15 genetisch gemodificeerd, in combinatie met de tweede volgorde infectieus derivaat daarvan, en de tweede volgorde de door SEQ nr. 2 weergegeven volgorde is of een functioneel derivaat daarvan, waarbij de DNA-vector die de complementaire DNA-volgorde (+DNA) bestaande uit SEQ nr. 1 en SEQ nr. 2 omvat in 20 E. coli K12 PC2495 (Phabagen Collection, Universiteit van
Utrecht, Postbus 80.056, 3508 TB Utrecht, Nederland) als vec-torgastheercel kan worden gehandhaafd en, na isolatie en een in vitro transcriptiereactie, met T7 promotor (SEQ nr. 3) als niet-EA-viruseigen promotor en T7 RNA polymerase als niet-EA-25 viruseigen RNA polymerase, RNA oplevert dat in baby hamster kidneycelien BHK-21 (C13) (ATCC CCL10) als virusgastheercel infectieus is en leidt tot de vorming van virusdeeltjes.
Het equine arteritis virus (EA-virus) is een virus dat, voor zover bekend, van nature slechts bij paarden en 30 ezels voorkomt, maar wel in andere zoogdiercellijnen kan groeien. Het EA-virus heeft een RNA streng als genoom. Het RNA is een enkele, positieve streng, wat wil zeggen dat het RNA, zodra het in een virusgastheercel is doorgedrongen, direct geschikt is voor translatie. Dat wil zeggen dat de 35 ribosomen van de virusgastheercel op basis van het RNA eiwitten kunnen maken. Het eerste eiwit waar de RNA streng voor 1003*79.
2 codeert is het EAV-replicase, een RNA-polymerase dat van de positieve RNA streng een negatiefstrengige copie kan maken. Net als de positieve RNA streng bezit deze negatiefstrengige RNA copie aan het 3' uiteinde een nucleotidevolgorde die als 5 zeer specifiek aangrijpingspunt voor het replicase fungeert. Het positieve RNA genoom van het EA-virus is een door capsi-den omringde RNA streng. Van andere virussen is bekend dat de uiteinden van de RNA streng zeer belangrijk zijn bij de vorming van het virusdeeltje.
10 Van het EA-virus is de nucleotidenvolgorde in de stand van de techniek grotendeels bekend (SEQ nr. 1). Deze volgorde is bekend geworden door volgordebepaling bij een groot aantal clonen die met behulp van reverse transcriptase gemaakt DNA bevatten. De verschillende fragmenten van het 15 cDNA vertonen overlap, waardoor het mogelijk was de volledige volgorde te bepalen.
Reverse transcriptase maakt bij het maken van het complementaire DNA relatief veel fouten, waardoor de bepaalde volgorde niet overeen hoeft te stemmen met die van het RNA 20 waarvan werd uitgegaan. Reverse transcriptase heeft de neiging om nog voordat het 5' uiteinde van het positieve EA-virus RNA is bereikt te termineren. Hierdoor ontstaat een cDNA (-DNA) dat aan het 3' uiteinde incompleet is. Het bepalen van deze nucleotidevolgorde is zeer lastig. Zoals hierbo-25 ven aangegeven is het uiteinde van de RNA streng zeer belangrijk.
Ook EAV-replicase maakt bij het dupliceren van positieve en negatieve RNA strengen fouten. Daarbij kunnen niet-infectieuze virusmutanten ontstaan. Als deze worden gebruikt 30 bij het maken van cDNA, waarmee op opzichzelf bekende wijze een vectorgastheercel wordt getransformeerd, wordt een kloon verkregen met een defect cDNA fragment.
Het is in principe mogelijk, doch zeer veel werk, door middel van genetische modificatie een kloon te maken 35 waarbij alle cDNA fragmenten in de juiste volgorde, overeenkomstig de RNA volgorde van het virus, achterelkaar zijn gezet. Dat is tot op heden niet gerealiseerd. Ten eerste ontbreekt informatie over de eventueel ontbrekende nucleoti-den. Ten tweede is er het hierboven beschreven risico dat, 1003579.
3 wanneer RNA wordt gemaakt van de verkregen kloon, het verkregen RNA niet langer infectieus is. Ten derde is er het probleem dat er absoluut geen duidelijkheid bestaat of de kloon in de gekozen vectorgastheercel stabiel is. Zo kunnen eiwit-5 producten van het cDNA voor de vectorgastheercel toxisch zijn. Het genoom van EA-virus codeert bijvoorbeeld voor drie proteasen die het metabolisme van de vectorgastheercel kunnen verstoren. Het stapje voor stapje combineren van cDNA fragmenten biedt niet zonder meer soulaas, aangezien uit de 10 literatuur ook gevallen bekend zijn waarbij bij aanwezigheid van een eerste gen de afwezigheid van een tweede gen toxisch was. In geval van toxiciteit is het risico levensgroot dat een kloon wordt geselecteerd waarin het toxiciteitveroorza-kende gen niet meer actief is en daarmee bestaat ook de kans 15 dat een afgeleid RNA niet langer infectieus is. Samengevat biedt het combineren van cDNA de zekerheid van een grote hoeveelheid werk, terwijl er geen redelijke verwachting op succes is.
Aanvraagster heeft thans gevonden dat een recombi-20 nant DNA-vector die een nucleotidevolgorde met SEQ nr. 2 direct voorafgaande aan en aansluitend op SEQ nr. 1 in E. coli K12 PC2495 (Phabagen Collection, Universiteit van Utrecht, Postbus 80.056, 3508 TB Utrecht, Nederland) bevat stabiel in de vectorgastheer kan worden gehandhaafd en waar-25 van het RNA product in baby hamster kidneycellen BHK-21 (C13) (ATCC CCL10) infectieus is.
Hiermee opent aanvraagster de mogelijkheid van het op eenvoudige en op zichzelf bekende wijze genetisch modificeren van het DNA waardoor recombinant RNA kan worden ge-30 vormd. De eerste volgorde kan worden aangepast om bijvoorbeeld door het inbrengen van een niet-EA-viruseigen gen een nieuw eiwitproduct in een virusgastheercel tot expressie te brengen. Ook kan bijvoorbeeld de virulentie van het virus worden gewijzigd of de gastheerspecificiteit worden veran-35 derd.
De uitvinding heeft derhalve tevens betrekking op een vectorgastheercel die een recombinant DNA-vector volgens conclusie 1 bevat, en in het bijzonder op een dergelijke vectorgastheercel welke JSj. coli K12 PC24 95 is en de recombi- 1 00 3 5 7 9.
4 nant DNA-vector pEAV030 bevat, op 11 juli 1996 gedeponeerd onder nummer 760-96 bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland, alsmede op de recombinant DNA-vector PEAV030.
5 Verder heeft de uitvinding betrekking op de DNA
volgorde volgens SEQ nr. 2 of een derivaat daarvan die, wanneer opgenomen in een DNA-vector die een DNA-volgorde (+DNA) omvat bestaande uit SEQ nr. 1 en aansluitend 5' daarvan SEQ nr. 2 of het derivaat ervan, in een vectorgastheercel 10 kan worden gehandhaafd en, met een niet-EA-viruseigen promotor voor een niet-EA-viruseigen RNA polymerase en het niet-EA-viruseigen RNA polymerase, RNA oplevert dat in een virusgastheercel infectieus is en virusdeeltjes oplevert.
Door het wijzigen van dit voor ten minste de repli-15 catie in de virusgastheercel belangrijke oligonucleotide kan het mogelijk zijn om bijvoorbeeld de incapsidatie van het virus te remmen.
De uitvinding heeft verder betrekking op het gebruik van een oligonucleotide gekozen uit de groep bestaande uit de 20 DNA volgorde met SEQ nr. 2, het complement ervan, en fragmenten daarvan, als primer voor een ketenverlengingsreactie.
Dergelijke primers kunnen onder meer bij de detectie van het virus met de Polymerase Chain Reaction techniek worden toegepast, en in het bijzonder ook voor complete dDNA 25 copie van het virale genoom.
RNA kan worden verkregen door transcriptie van de DNA-volgorde (-DNA) van de recombinant DNA-vector volgens de uitvinding. De transcriptie kan in vivo geschieden, doch wordt volgens een gunstige uitvoeringsvorm in vitro uitge-30 voerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een geschikte niet-EA-viruseigen promotor. RNA is onder meer bruikbaar voor de bereiding van virusdeeltjes en een farmaceutisch preparaat.
Derhalve heeft de uitvinding tevens betrekking op een tweetal gunstige werkwijzen voor het verkrijgen van 35 virusdeeltjes, waarbij volgens een eerste uitvoeringsvorm RNA volgens de uitvinding in virusgastheercellen wordt gebracht, de virusgastheercellen worden gekweekt en virusdeeltjes op opzichzelf bekende wijze worden geïsoleerd.
Volgens de tweede gunstige uitvoeringsvorm wordt een '(10 3 5 7 9.
5 recombinant DNA-vector, volgens de uitvinding in virusgastheercellen gebracht, worden de virusgastheercellen gekweekt en worden virusdeeltjes op opzichzelf bekende wijze geïsoleerd. Bij voorkeur is de recombinant DNA-vector voorzien van 5 een niet-EAV-eigen promotor die door al dan niet van nature in de virusgastheercel voorkomend, niet-EAV-eigen polymerase van de virusgastheercel wordt herkend.
De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op een virusgastheercel getransformeerd met RNA volgens de 10 uitvinding of met virusdeeltjes verkregen met de een van de hierboven beschreven werkwijzen.
Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een tweetal werkwijzen voor de bereiding van een farmaceutisch preparaat.
15 Volgens een eerste werkwijze voor het bereiden van een recombinant RNA-houdend farmaceutisch preparaat, wordt de recombinant DNA-vector volgens de uitvinding in een vector-gastheercel vermeerderd, de DNA-vector wordt getranscribeerd onder oplevering van recombinant RNA, desgewenst het recombi-20 nant RNA in een virusgastheercel wordt gebracht onder oplevering van recombinant RNA-bevattende virussen welke desgewenst worden geïsoleerd, en aldus verkregen recombinant RNA met een farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstof tot een farmaceutisch preparaat wordt verwerkt.
25 Volgens een tweede werkwijze voor het bereiden van een recombinant DNA-vector-houdend farmaceutisch preparaat, wordt de recombinant DNA-vector volgens de uitvinding in een vectorgastheercel vermeerderd en op opzichzelf bekende wijze geïsoleerd, en het aldus verkregen recombinant DNA met een 30 farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstof tot een farmaceutisch preparaat wordt verwerkt. Bij voorkeur is in een dergelijk geval de recombinant DNA-vector voorzien van een niet-EAV-eigen promotor die door al dan niet van nature in de virusgastheercel voorkomend, niet-EAV-eigen polymerase van de 35 virusgastheercel wordt herkend.
De uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van de tekening waarin de enige figuur een schematisch overzicht biedt van een recombinant DNA-vector volgens de uitvinding en de wijze waarop deze is gereconstrueerd.
♦ 00 JS7 9.
6
In de figuur is te zien dat een twaalftal klonen, verkregen onder gebruikmaking van reverse transcriptase, is gebruikt voor het reconstrueren van de althans nagenoeg volledige volgorde van een cDNA copie van het RNA genoom van 5 EA-virus. De klonen en de bovenaan in de figuur weergegeven genen (open-leesramen) zijn in detail beschreven door Den Boon, J.A. et al (J. Virol. (1991), 65: blz. 2910-2920).
Boven de klonen is een restrictiekaart weergegeven met daarbij de restrictie-enzymen die zijn gebruikt voor het verwij-10 deren van overlappende cDNA gedeelten van de klonen. Kloon 108, aan de rechterzijde van de figuur, bevatte een poly-A-staart met slechts 25 van de ca. 140 nucleotiden en deze werd op opzichzelf bekende wijze tot ca. 140 nucleotiden verlengd.
Aan het 5'-uiteinde ontbrak een onbekend aantal 15 nucleotiden door vroegtijdig termineren van het reverse transcriptase. Door directe RNA volgordebepaling konden 16 nucleotiden worden bepaald. Een door Dumas J.B. et al. (Nucl. Acids Res. 19: blz. 5227-5232) beschreven werkwijze leverde nucleotide 17 op. Deze volgorde werd, tezamen met een deel 20 van de 5' volgorde gesynthetiseerd en op opzichzelf bekende wijze aan de kloon toegevoegd.
Hoe groot het gevaar is dat weliswaar een stabiele recombinant DNA-vector wordt verkregen doch dat deze geen infectieus RNA oplevert, blijkt wel uit het feit dat één 25 enkele puntmutatie, C in plaats van T op plaats 7491 van SEQ nr. 1, resulteerde in niet-infectieus RNA.
1 0 0 3 5 7 9.
7 SEQ nr. 1
1 TGCCATATAC GGCTCACCAC CATATACACT GCAAGAATTA CTATTCTTGT GGGCCCCTCT 61 CGGTAAATCC TAGAGGGCTT TCCTCTCGTT ATTGCGAGAT TCGTCGTTAG ATAACGGCAA 5 121 GTTCCCTTTC TTACTATCCT ATTTTCATCT TGTGGCTTGA CGGGTCACTG CCATCGTCGT
181 CGATCTCTAT CAACTACCCT TGCGACTATG GCAACCTTCT CCGCTACTGG ATTTGGAGGG 241 AGTTTTGTTA GGGACTGGTC CCTGGACTTA CCCGACGCTT GTGAGCATGG CGCGGGATTG 301 TGCTGCGAAG TGGACGGCTC CACCTTATGC GCCGAGTGTT TTCGCGGTTG CGAAGGAATG 361 GAGCAATGTC CTGGCTTGTT CATGGGACTG TTAAAACTGG CTTCGCCAGT TCCAGTGGGA 10 421 CATAAGTTCC TGATTGGTTG GTATCGAGCT GCCAAAGTCA CCGGGCGTTA CAATTTCCTT
481 GAGCTGTTGC AACACCCTGC TTTCGCCCAG CTGCGTGTGG TTGATGCTAG GTTAGCCATT 541 GAAGAGGCAA GTGTGTTTAT TTCCACTGAC CACGCGTCTG CTAAGCGTTT CCCTGGCGCT 601 AGATTTGCGC TGACACCGGT GTATGCTAAC GCTTGGGTTG TGAGCCCGGC TGCTAACAGT 661 TTGATAGTGA CCACTGACCA GGAACAAGAT GGGTTCTGCT GGTTAAAACT TTTGCCACCT 15 721 GACCGCCGTG AGGCTGGTTT GCGGTTGTAT TACAACCATT ACCGCGAACA AAGGACCGGG
781 TGGCTGTCTA AAACAGGACT TCGCTTATGG CTTGGAGACC TGGGTTTGGG CATCAATGCG 841 AGCTCTGGAG GGCTGAAATT CCACATTATG AGGGGTTCGC CTCAGCGAGC TTGGCATATC 901 ACAACACGCA GCTGCAAGCT GAAGAGCTAC TACGTTTGTG ACATCTCTGA AGCAGACTGG 961 TCCTGTTTGC CTGCTGGCAA CTACGGCGGC TACAATCCAC CAGGGGACGG AGCTTGCGGT 20 1021 TACAGGTGCT TGGCCTTCAT GAATGGCGCC ACTGTTGTGT CGGCTGGTTG CAGTTCTGAC
1081 TTGTGGTGTG ATGATGAGTT GGCTTATCGA GTCTTTCAAT TGTCACCCAC GTTCACGGTT 1141 ACCATCCCAG GTGGGCGAGT TTGTCCGAAT GCCAAGTACG CAATGATTTG TGACAAGCAG 1201 CACTGGCGCG TCAAACGTGC AAAGGGCGTC GGCCTGTGTC TCGATGAAAG CTGTTTCAGG 1261 GGCATCTGCA ATTGCCAACG CATGAGTGGA CCACCACCTG CACCCGTGTC AGCCGCCGTG 25 1321 TTAGATCACA TACTGGAGGC GGCGACGTTT GGCAACGTTC GCGTGGTTAC ACCTGAAGGG
1381 CAGCCACGCC CCGTACCAGC GCCGCGAGTT CGTCCCAGCG CCAACTCTTC TGGAGATGTC 1441 AAAGATCCGG CGCCCGTTCC GCCAGTACCA AAACCAAGGA CCAAGCTTGC CACACCGAAC 1501 CCAACTCAGG CGCCCATCCC AGCACCGCGC ACGCGACTTC AAGGGGCCTC AACACAGGAG 1561 CCACTGGCGA GTGCAGGAGT TGCTTCTGAC TCGGCACCTA AATGGCGTGT GGCCAAAACT 30 1621 GTGTACAGCT CCGCGGAGCG CTTTCGGACC GAACTGGTAC AACGTGCTCG GTCCGTTGGG
1681 GACGTTCTTG TTCAAGCGCT ACCGCTCAAA ACCCCAGCAG TGCAGCGGTA TACCATGACT 1741 CTGAAGATGA TGCGTTCACG CTTCAGTTGG CACTGCGACG TGTGGTACCC TTTGGCTGTA 1801 ATCGCTTGTT TGCTCCCTAT ATGGCCATCT CTTGCTTTGC TCCTTAGCTT TGCCATTGGG 1861 TTGATACCCA GTGTGGGCAA TAATGTTGTT CTGACAGCGC TTCTGGTTTC ATCAGCTAAT 35 1921 TATGTTGCGT CAATGGACCA TCAATGTGAA GGTGCGGCTT GCTTAGCCTT GCTGGAAGAA
1981 GAACACTATT ATAGAGCGGT CCGTTGGCGC CCGATTACAG GCGCGCTGTC GCTTGTGCTC 2041 AATTTACTGG GGCAGGTAGG CTATGTAGCT CGTTCCACCT TTGATGCAGC TTATGTTCCT 2101 TGCACTGTGT TCGATCTTTG CAGCTTTGCT ATTCTGTACC TCTGCCGCAA TCGTTGCTGG 2161 AGATGCTTCG GACGCTGTGT GCGAGTTGGG CCTGCCACGC ATGTTTTGGG CTCCACCGGG 40 2221 CAACGAGTTT CCAAACTGGC GCTCATTGAT TTGTGTGACC ACTTTTCAAA GCCCACCATC
2281 GATGTTGTGG GCATGGCAAC TGGTTGGAGC GGATGTTACA CAGGAACCGC CGCAATGGAG 2341 CGTCAGTGTG CCTCTACGGT GGACCCTCAC TCGTTCGACC AGAAGAAGGC AGGAGCGACT 2401 GTTTACCTCA CCCCCCCTGT CAACAGCGGG TCAGCGCTGC AGTGCCTCAA TGTCATGTGG 2461 AAGCGACCAA TTGGGTCCAC TGTCCTTGGG GAACAAACAG GAGCTGTTGT GACGGCGGTC 45 2521 AAGAGTATCT CTTTCTCACC TCCCTGCTGC GTCTCTACCA CTTTGCCCAC CCGACCCGGT
2581 GTGACCGTTG TCGACCATGC TCTTTACAAC CGGTTGACTG CTTCAGGGGT CGATCCCGCT 2641 TTATTGCGTG TTGGGCAAGG TGATTTTCTA AAACTTAATC CGGGGTTCCG GCTGATAGGT 2701 GGATGGATTT ATGGGATATG CTATTTTGTG TTGGTGGTTG TGTCAACTTT TACCTGCTTA
10 0 3 5 7 9 .
8
2761 CCTATCAAAT GTGGCATTGG CACCCGCGAC CCTTTCTGCC GCAGAGTGTT TTCTGTACCC 2821 GTCACCAAGA CCCAAGAGCA CTGCCATGCT GGAATGTGTG CTAGCGCTGA AGGCATCTCT 2881 CTGGACTCTC TGGGGTTAAC TCAGTTACAA AGTTACTGGA TCGCAGCCGT CACTAGCGGA 2941 TTAGTGATCT TGTTGGTCTG CCACCGCCTG GCCATCAGCG CCTTGGACTT GTTGACTCTA 5 3001 GCTTCCCCTT TAGTGTTGCT TGTGTTCCCT TGGGCATCTG TGGGGCTTTT ACTTGCTTGC
3061 AGTCTCGCTG GTGCTGCTGT GAAAATACAG TTGTTGGCGA CGCTTTTTGT GAATCTGTTC 3121 TTTCCCCAAG CTACCCTTGT CACTATGGGA TACTGGGCGT GCGTGGCGGC TTTGGCCGTT 3181 TACAGTTTGA TGGGCTTGCG AGTGAAAGTG AATGTGCCCA TGTGTGTGAC ACCTGCCCAT 3241 TTTCTGCTGC TGGCGAGGTC AGCTGGACAG TCAAGAGAGC AGATGCTCCG GGTCAGCGCT 10 3301 GCTGCCCCCA CCAATTCACT GCTTGGAGTG GCTCGTGATT GTTATGTCAC AGGCACAACT
3361 CGGCTGTACA TACCCAAGGA AGGCGGGATG GTGTTTGAAG GGCTATTCAG GTCACCGAAG 3421 GCGCGCGGCA ACGTCGGCTT CGTGGCTGGT AGCAGCTACG GCACAGGGTC AGTGTGGACC 3481 AGGAACAACG AGGTCGTCGT ACTGACAGCG TCACACGTGG TTGGCCGCGC TAACATGGCC 3541 ACTCTGAAGA TCGGTGACGC AATGCTGACT CTGACTTTCA AAAAGAATGG CGACTTCGCC 15 3601 GAGGCAGTGA CGACACAGTC CGAGCTCCCA GGCAATTGGC CACAGTTGCA TTTCGCCCAA
3661 CCAACAACCG GGCCCGCTTC ATGGTGCACT GCCACAGGAG ATGAAGAAGG CTTGCTCAGT 3721 GGCGAGGTTT GTCTGGCGTG GACTACTAGT GGCGACTCTG GATCTGCAGT GGTTCAGGGT 3781 GACGCTGTGG TAGGGGTCCA CACCGGTTCG AACACAAGTG GTGTTGCCTA CGTGACCACC 3841 CCAAGCGGAA AACTCCTTGG CGCCGACACC GTGACTTTGT CATCACTGTC AAAGCATTTC 20 3901 ACAGGCCCTT TGACATCAAT CCCGAAGGAC ATCCCTGACA ACATTATTGC CGATGTTGAT
3961 GCTGTTCCTC GTTCTCTGGC CATGCTGATT GATGGCTTAT CCAATAGAGA GAGCAGCCTT 4021 TCTGGACCTC AGTTGTTGTT AATTGCTTGT TTTATGTGGT CTTATCTTAA CCAACCTGCT 4081 TACTTGCCTT ATGTGCTGGG CTTCTTTGCC GCTAACTTCT TCCTGCCAAA AAGTGTTGGC 4141 CGCCCTGTGG TCACTGGGCT TCTATGGTTG TGCTGCCTCT TCACACCGCT TTCCATGCGC 25 4201 TTGTGCTTGX TCCATCTGGT CTGTGCTACC GTCACGGGAA ACGTGATATC TTTGTGGTTC
4261 TACATCACTG CCGCTGGCAC GTCTTACCTT TCTGAGATGT GGTTCGGAGG CTATCCCACC 4321 ATGTTGTTTG TGCCACGGTT CCTAGTGTAC CAGTTCCCCG GCTGGGCTAT TGGCACAGTA 4381 CTAGCGGTAT GCAGCATCAC CATGCTGGCT GCTGCCCTCG GTCACACCCT GTTACTGGAT 4441 GTGTTCTCCG CCTCAGGTCG CTTTGACAGG ACTTTCATGA TGAAATACTT CCTGGAGGGA 30 4501 GGAGTGAAAG AGAGTGTCAC CGCCTCAGTC ACCCGCGCTT ATGGCAAACC AATTACCCAG
4561 GAGAGTCTCA CTGCAACATT AGCTGCCCTC ACTGATGATG ACTTCCAATT CCTCTCTGAT 4621 GTGCTTGACT GTCGGGCCGT CCGATCGGCA ATGAATCTGC GTGCCGCTCT CACAAGTTTT 4681 CAAGTGGCGC AGTATCGTAA CATCCTTAAT GCATCCTTGC AAGTCGATCG TGACGCTGCT 4741 CGTAGTCGCA GACTAATGGC AAAACTGGCT GATTTTGCGG TTGAACAAGA AGTAACAGCT 35 4801 GGAGACCGTG TTGTGGTTAT CGACGGTCTG GACCGCATGG CTCACTTCAA AGACGATTTG
4861 GTGCTGGTTC CTTTGACCAC CAAAGTAGTA GGCGGTTCTA GGTGCACCAT TTGTGACGTC 4921 GTTAAGGAAG AAGCCAATGA CACCCCAGTT AAGCCAATGC CCAGCAGGAG ACGCCGCAAG 4981 GGCCTGCCTA AAGGTGCTCA GTTGGAGTGG GACCGTCACC AGGAAGAGAA GAGGAACGCC 5041 GGTGATGATG ATTTTGCGGT CTCGAATGAT TATGTCAAGA GAGTGCCAAA GTACTGGGAT 40 5101 CCCAGCGACA CCCGAGGCAC GACAGTGAAA ATCGCCGGCA CTACCTATCA GAAAGTGGTT
5161 GACTATTCAG GCAATGTGCA TTACGTGGAG CATCAGGAAG ATCTGCTAGA CTACGTGCTG 5221 GGCAAGGGGA GCTATGAAGG CCTAGATCAG GACAAAGTGT TGGACCTCAC AAACATGCTT 5281 AAAGTGGACC CCACGGAGCT CTCCTCCAAA GACAAAGCCA AGGCGCGTCA CGTTGCTCAT 5341 CTGCTGTTGG ATCTGGCTAA CCCAGTTGAG GCAGTGAATC AGTTAAACTG AGAGCGCCCC 45 5401 ACATCTTTCC CGGCGATGTG GGGCGTCGGA CCTTTGCTGA CTCTAAAGAC AAGGGTTTCG
5461 TGGCTCTACA CAGTCGCACA ATGTTTTTAG CTGCCCGGGA CTTTTTATTT AACATCAAAT 5521 TTGTGTGCGA CGAAGAGTTC ACAAAGACCC CAAAAGACAC ACTGCTTGGG TACGTACGCG 5581 CCTGCCCTGG TTACTGGTTT ATTTTCCGTC GTACGCACCG GTCGCTGATT GATGCATACT
1003579.
9
5641 GGGACAGTAT GGAGTGCGTT TACGCGCTTC CCACCATATC TGATTTTGAT GTGAGCCCAG 5701 GTGACGTCGC AGTGACGGGC GAGCGATGGG ATTTTGAATC TCCCGGAGGA GGCCGTGCAA 5761 AACGTCTCAC AGCTGATCTG GTGCACGCTT TTCAAGGGTT CCACGGAGCC TCTTATTCCT 5821 ATGATGACAA GGTGGCAGCT GCTGTCAGTG GTGACCCGTA TCGGTCGGAC GGCGTCTTGT 5 5881 ATAACACCCG TTGGGGCAAC ATTCCATATT CTGTCCCAAC CAATGCTTTG GAAGCCACAG
5941 CTTGCTACCG TGCTGGATGT GAGGCCGTTA CCGACGGGAC CAACGTCATC GCAACAATTG 6001 GGCCCTTCCC GGAGCAACAA CCCATACCGG ACATCCCAAA GAGCGTGCTT GACAACTGCG 6061 CTGACATCAG CTGTGACGCT TTCATAGCGC CCGCTGCAGA GACAGCCCTG TGTGGAGATT 6121 TAGAGAAATA CAACCTATCC ACGCAGGGTT TTGTGTTGCC TAGTGTTTTC TCCATGGTGC 10 6181 GGGCGTACTT AAAAGAGGAG ATTGGAGACG CTCCACCACT CTACTTGCCA TCTACTGTAC
6241 CATCTAAAAA TTCACAAGCC GGAATTAACG GCGCTGAGTT TCCTACAAAG TCTTTACAGA 6301 GCTACTGTTT GATTGATGAC ATGGTGTCAC AGTCCATGAA AAGCAATCTA CAAACCGCCA 6361 CCATGGCGAC TTGTAAACGG CAATACTGTT CCAAATACAA GATTAGGAGC ATTCTGGGCA 6421 CCAACAATTA CATTGGCCTA GGTTTGCGTG CCTGCCTTTC GGGGGTTACG GCCGCATTCC 15 6481 AAAAAGCTGG AAAGGATGGG TCACCGATTT ATTTGGGCAA GTCAAAATTC GACCCGATAC
6541 CAGCTCCTGA CAAGTACTGC CTTGAAACAG ACCTGGAGAG TTGTGATCGC TCCACCCCGG 6601 CTTTGGTGCG TTGGTTCGCT ACTAATCTTA TTTTTGAGCT AGCTGGCCAG CCCGAGTTGG 6661 TGCACAGCTA CGTGTTGAAT TGCTGTCACG ATCTAGTTGT GGCGGGTAGT GTAGCATTCA 6721 CCAAACGCGG GGGTTTGTCA TCTGGAGACC CTATCACTTC CATTTCCAAT ACCATCTATT 20 6781 CATTGGTGCT GTACACCCAG CACATGTTGC TATGTGGACT TGAAGGCTAT TTCCCAGAGA
6841 TTGCAGAAAA ATATCTTGAT GGCAGCCTGG AGCTGCGGGA CATGTTCAAG TACGTTCGAG 6901 TGTACATCTA CTCGGACGAT GTGGTTCTAA CCACACCCAA CCAGCATTAC GCGGCCAGCT 6961 TTGACCGCTG GGTCCCCCAC CTGCAGGCGC TGCTAGGTTT CAAGGTTGAC CCAAAGAAAA 7021 CTGTGAACAC CAGCTCCCCT TCCTTTTTGG GCTGCCGGTT CAAGCAAGTG GACGGCAAGT 25 7081 GTTATCTAGC CAGTCTTCAG GACCGCGTTA CACGCTCTCT GTTATACCAC ATTGGTGCAA
7141 AGAATCCCTC AGAGTACTAT GAAGCTGCTG TTTCCATCTT TAAGGACTCC ATTATCTGCT 7201 GTGATGAAGA CTGGTGGACG GACCTCCATC GACGTATCAG TGGCGCTGCG CGTACCGACG 7261 GAGTTGAGTT CCCCACCATT GAAATGTTAA CATCCTTCCG CACCAAGCAG TATGAGAGTG 7321 CCGTGTGCAC AGTTTGTGGG GCCGCCCCCG TGGCCAAGTC TGCTTGTGGA GGGTGGTTCT 30 7381 GTGGCAATTG TGTCCCGTAC CACGCGGGTC ATTGTCACAC AACCTCGCTC TTCGCCAACT
7441 GCGGGCACGA CATCATGTAC CGCTCCACTT ACTGCACAAT GTGTGAGGGT TCCCCAAAAC 7501 AGATGGTACC AAAAGTGCCT CACCCGATCC TGGATCATTT GCTGTGCCAC ATTGATTACG 7561 GCAGTAAAGA GGAACTAACT CTGGTAGTGG CGGATGGTCG AACAACATCA CCGCCCGGGC 7621 GCTACAAAGT GGGTCACAAG GTAGTCGCCG TGGTTGCAGA TGTGGGAGGC AACATTGTGT 35 7681 TTGGGTGCGG TCCTGGATCA CACATCGCAG TACCACTTCA GGATACGCTC AAGGGCGTGG
7741 TGGTGAATAA AGCTCTGAAG AACGCCGCCG CCTCTGAGTA CGTGGAAGGA CCCCCTGGGA 7801 GTGGGAAGAC TTTTCACCTG GTCAAAGATG TGCTAGCCGT GGTCGGTAGC GCGACCTTGG 7861 TTGTGCCCAC CCACGCGTCC ATGCTGGACT GCATCAACAA GCTCAAACAA GCGGGCGCCG 7921 ATCCATACTT TGTGGTGCCC AAGTATACAG TTCTTGACTT TCCCCGGCCT GGCAGTGGAA 40 7981 ACATCACAGT GCGACTGCCA CAGGTCGGAA CCAGTGAGGG AGAAACCTTT GTGGATGAGG
8041 TGGCCTACTT CTCACCAGTG GATCTGGCGC GCATTTTAAC CCAGGGTCGA GTCAAGGGTT 8101 ACGGTGATTT AAATCAGCTC GGGTGCGTCG GACCCGCGAG CGTGCCACGT AACCTTTGGC 8161 TCCGACATTT TGTCAGCCTG GAGCCCTTGC GAGTGTGCCA TCGATTCGGC GCTGCTGTGT 8221 GTGATTTGAT CAAGGGCATT TATCCTTATT ATGAGCCAGC TCCACATACC ACTAAAGTGG 45 8281 TGTTTGTGCC AAATCCAGAC TTTGAGAAAG GTGTAGTCAT CACCGCCTAC CACAAAGATC
8341 GCGGTCTTGG TCACCGCACA ATTGATTCAA TTCAAGGCTG TACATTCCCT GTTGTGACTC 8401 TTCGACTGCC CACACCCCAA TCACTGACGC GCCCGCGCGC AGTTGTGGCG GTTACTAGGG 8461 CGTCTCAGGA ATTATACATC TACGACCCCT TTGATCAGCT TAGCGGGTTG TTGAAGTTCA
1 0 0 3 5 7 9 .
10
8521 CCAAGGAAGC AGAGGCGCAG GACTTGATCC ATGGCCCACC TACAGCATGC CACCTGGGCC 8581 AAGAAATTGA CCTTTGGTCC AATGAGGGCC TCGAATATTA CAAGGAAGTC AACCTGCTGT 8641 ACACACACGT CCCCATCAAG GATGGTGTAA TACACAGTTA CCCTAATTGT GGCCCTGCCT 8701 GTGGCTGGGA AAAGCAATCC AACAAAATTT CGTGCCTCCC GAGAGTGGCA CAAAATTTGG 5 8761 GCTACCACTA TTCCCCAGAC TTACCAGGAT TTTGCCCCAT ACCAAAAGAA CTCGCTGAGC
8821 ATTGGCCCGT AGTGTCGAAT GATAGATACC CGAATTGCTT GCAAATTACC TTACAGCAAG 8881 TATGTGAACT CAGTAAACCG TGCTCAGCGG GCTATATGGT TGGACAATCT GTTTTCGTGC 8941 AGACGCCTGG TGTGACATCT TACTGGCTTA CTGAATGGGT CGACGGCAAA GCGCGTGCTC 9001 TACCAGATTC CTTATTCTCG TCCGGTAGGT TCGAGACTAA CAGCCGCGCT TTCCTCGATG 10 9061 AAGCCGAGGA AAAGTTTGCC GCCGCTCACC CTCATGCCTG TTTGGGAGAA ATTAATAAGT
9121 CCACCGTGGG AGGATCCCAC TTCATCTTTT CCCAATATTT ACCACCATTG CTACCCGCAG 9181 ACGCTGTTGC CCTGGTAGGT GCTTCATTGG CTGGGAAAGC TGCTAAAGCT GCTTGCAGCG 9241 TTGTTGATGT CTATGCTCCA TCATTTGAAC CTTATCTACA CCCTGAGACA CTGAGTCGCG 9301 TGTACAAGAT TATGATCGAT TTCAAGCCGT GTAGGCTTAT GGTGTGGAGA AACGCGACCT 15 9361 TTTATGTCCA AGAGGGTGTT GATGCAGTTA CATCAGCACT AGCAGCTGTG TCCAAACTCA
9421 TCAAAGTGCC GGCCAATGAG CCTGTTTCAT TCCATGTGGC ATCAGGGTAC AGAACCAACG 9481 CGCTGGTAGC GCCCCAGGCT AAAATTTCAA TTGGAGCCTA CGCCGCCGAG TGGGCACTGT 9541 CAACTGAACC GCCACCTGCT GGTTATGCGA TCGTGCGGCG ATATATTGTA AAGAGGCTCC 9601 TCAGCTCAAC AGAAGTGTTC TTGTGCCGCA GGGGTGTTGT GTCTTCCACC TCAGTGCAGA 20 9661 CCATTTGTGC ACTAGAGGGA TGTAAACCTC TGTTCAACTT CTTACAAATT GGTTCAGTCA
9721 TTGGGCCCGT GTGATGGGCT TAGTGTGGTC ACTGATTTCA AATTCTATTC AGACTATTAT 9781 TGCTGATTTT GCTATTTCTG TGATTGATGC AGCGCTTTTC TTTCTCATGC TACTTGCATT 9841 GGCTGTTGTT ACTGTGTTTC TTTTCTGGCT CATTGTTGCC ATCGGCCGCA GCTTGGTGGC 9901 GCGGTGTTCA CGAGGTGCGC GTTACAGACC TGTTTAAGGA TTTGCAGTGC GACAACCTGC 25 9961 GCGCGAAAGA TGCCTTCCCG AGTCTGGGAT ATGCTCTGTC GATTGGCCAG TCGAGGCTAT
10021 CGTATATGCT GCAGGATTGG TTGCTTGCTG CGCACCGCAA GGAAGTTATG CCTTCCAATA 10081 TCATGCCTAT GCCCGGTCTT ACTCCTGATT GCTTTGACCA TCTGGAGTCT TCTAGCTATG 10141 CTCCATTTAT CAATGCCTAT CGGCAGGCAA TTTTGAGTCA ATACCCACAA GAGCTCCAGC 10201 TCGAAGCCAT CAACTGTAAA TTGCTTGCTG TGGTTGCACC GGCATTGTAT CATAATTACC 30 10261 ATCTAGCCAA TTTGACCGGA CCGGCCACAT GGGTCGTGCC TACAGTGGGC CAGTTGCACT
10321 ATTATGCTTC TTCCTCTATT TTTGCTTCAT CTGTGGAAGT GTTGGCAGCA ATAATACTAC 10381 TATTTGCATG CATACCACTA GTGACACGAG TGTACATCTC TTTTACGCGG CTAATGTCAC 10441 CTTCCCGTCG CACTTCCAGC GGCACTTTGC CGCGGCGCAA GATTTTGTAG TGCACACGGG 10501 TTATGAATAT GCCGGGGTCA CTATGTTAGT GCACTTGTTT GCCAACTTGG TTCTGACATT 35 10561 TCCGAGCTTA GTTAATTGTT CCCGCCCTGT GAATGTCTTT GCTAATGCTT CTTGCGTGCA
10621 AGTGGTTTGT AGTCATACCA ACTCAACTAC TGGCTTGGGT CAACTTTCTT TTTCCTTTGT 10681 AGATGAAGAT CTACGGCTGC ATATCAGGCC TACTCTTATT TGTTGGTTTG CCTTGTTGTT 10741 GGTGCACTTT CTACCCATGC CACGCTGCAG AGGCTCGTAA TTTTACTTAC ATTAGTCATG 10801 GATTGGGCCA CGTGCACGGT CATGAGGGGT GTAGGAATTT TATTAATGTC ACTCATTCTG 40 10861 CATTTCTTTA TCTTAATCCC ACCACTCCCA CTGCGCCGGC TATAACTCAT TGTTTACTTC
10921 TGGTTCTGGC AGCCAAAATG GAACACCCAA ACGCTACTAT CTGGCTGCAG CTGCAGCCGT 10981 TTGGGTATCA TGTGGCTGGC GATGTCATTG TCAACTTGGA AGAGGACAAG AGGCATCCTT 11041 ACTTTAAACT TTTGAGAGCG CCGGCTTTAC CGCTTGGTTT TGTGGCTATA GTTTATGTTC 11101 TTTTACGACT GGTACGTTGG GCTCAACGAT GTTATCTATG ATTGTATTGC TATTCTTGCT 45 11161 TTGGGGTGCG CCATCACATG CTTACTTCTC ATACTACACC GCTCAGCGCT TCACAGACTT
11221 CACCTTGTGT ATGCTGACGG ATCGCGGCGT TATTGCCAAT TTGCTGCGAT ATGATGAGCA 11281 CACTGCTTTG TACAATTGTT CCGCCAGTAA AACCTGTTGG TATTGCACAT TCCTGGACGA 11341 ACAGATTATC ACGTTTGGAA CCGATTGTGA TGACACCTAC GCGGTCCCAG TTGCTGAGGT
1 0 0 3 5 7 9 .
11
11401 CCTGGAACAG GCGCATGGAC CGTACAGTGC GCTGTTTGAT GACATGCCCC CTTTTATTTA 11461 CTATGGCCGT GAATTCGGCA TAGTTGTGTT GGATGTGTTT ATGTTCTATC CCGTTTTAGT 11521 TCTGTTTTTC TTATCAGTAC TACCCTATGC TACGCTTATT CTTGAAATGT GTGTATCTAT 11581 TCTGTTTATA ATCTATGGCA TTTACAGCGG GGCCTACTTG GCCATGGGCA TATTTGCGGC 5 11641 CACGCTTGCT ATACATTCAA TTGTGGTCCT CCGCCAATTA CTGTGGTTAT GCCTGGCTTG
11701 GCGATACCGC TGTACGCTTC ACGCGTCCTT TATATCAGCT GAGGGGAAAG TGTACCCCGT 11761 AGACCCCGGA CTCCCGGTTG CCGCCGTGGG CAATCGGTTG TTAGTCCCAG GTAGGCCCAC 11821 TATCGATTAT GCAGTGGCCT ACGGCAGCAA AGTCAACCTT GTGAGGTTGG GGGCAGCTGA 11881 GGTATGGGAG CCATAGATTC ATTTTGTGGT GACGGGATTT TAGGTGAGTA TCTAGATTAC 10 11941 TTTATTCTGT CCGTCCCACT CTTGCTGTTG CTTACTAGGT ATGTAGCATC TGGGTTAGTG
12001 TATGTTTTGA CTGCCTTGTT CTATTCCTTT GTATTAGCAG CTTATATTTG GTTTGTTATA 12061 GTTGGAAGAG CCTTTTCTAC TGCTTATGCT TTTGTGCTTT TGGCTGCTTT TCTGTTATTA 12121 GTAATGAGGA TGATTGTGGG TATGATGCCT CGTCTTCGGT CCATTTTCAA CCATCGCCAA 12181 CTGGTGGTAG CTGATTTTGT GGACACACCT AGTGGACCTG TTCCCATCCC CCGCTCAACT 15 12241 ACTCAGGTAG TGGTTCGCGG CAACGGGTAC ACCGCAGTTG GTAACAAGCT TGTCGATGGC
12301 GTCAAGACGA TCACGTCCGC AGGCCGCCTC TTTTCGAAAC GGACGGCGGC GACAGCCTAC 12361 AAGCTACAAT GACCTACTGC GCATGTTTGG TCAGATGCGG GTCCGCAAAC CGCCCGCGCA 12421 ACCCACTCAG GCTATTATTG CAGAGCCTGG AGACCTTAGG CATGATTTAA ATCAACAGGA 12481 GCGCGCCACC CTTTCGTCGA ACGTACAACG GTTCTTCATG ATTGGGCATG GTTCACTCAC 20 12541 TGCAGATGCC GGAGGACTCA CGTACACCGT CAGTTGGGTT CCTACCAAAC AAATCCAGCG
12601 CAAAGTTGCG CCTCCAGCAG GGCCGTAAGA CGTGGATATT CTCCTGTGTG GCGTCATGTT 12661 GAAGTAGTTA TTAGCCACCC AGGAACCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 12721 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 12781 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 25 1 0 0 3 5 7 9.
12 SEQ nr. 2
1 GCTCGAAGTG TGTATGG
5 SEQ nr. 3
1 TAATACGACT CACTATA
10 1 00 3 57 9·

Claims (12)

1. Recombinant DNA-vector die een DNA-volgorde (-DNA) complementair met ten minste een deel van het genoom van 5 equine arteritis virus (EA-virus) omvat, welke DNA-vector aansluitend op de 3'-zijde van de DNA-volgorde (-DNA) een niet-EA-viruseigen promotor voor een niet-EA-viruseigen RNA-polymerase bezit en, na transcriptie van de DNA-volgorde (-DNA) door het niet-EA-viruseigen RNA-polymerase, RNA oplevert 10 dat in een virusgastheercel infectieus is, de DNA-volgorde (-DNA) een met het genoemde deel van het genoom overeenstemmende complementaire DNA-volgorde (+DNA) bezit, welke complementaire DNA-volgorde (+DNA) uit een eerste volgorde en aansluitend aan de 5'-zijde van de eerste volgorde een tweede volgorde be-15 staat, de eerste volgorde de door SEQ nr. 1 weergegeven volgorde is of een genetisch gemodificeerd, in combinatie met de tweede volgorde infectieus derivaat daarvan, en de tweede volgorde de door SEQ nr. 2 weergegeven volgorde is of een functioneel derivaat daarvan, waarbij de DNA-vector die de 20 complementaire DNA-volgorde (+DNA) bestaande uit SEQ nr. 1 en SEQ nr. 2 omvat in E. coli K12 PC2495 (Phabagen Collection) als vectorgastheercel kan worden gehandhaafd en, na isolatie en een in vitro transcriptie reactie, met T7 promotor (SEQ nr. 3. als niet-EA-viruseigen promotor en T7 RNA polymerase als 25 niet-EA-viruseigen RNA polymerase, RNA oplevert dat in baby hamster kidneycellen BHK-21 (C13) (ATCC CCL10) als virusgastheercel infectieus is en leidt tot de vorming van virusdeeltjes .
2. Vectorgastheercel die een recombinant DNA-vector 30 volgens conclusie 1 bevat.
3. Vectorgastheercel volgens conclusie 2, welke E. coli KI2 PC2495 is en de recombinant DNA-vector pEAV030 bevat, op 11 juli 1996 gedeponeerd onder nummer 760-96 bij het Cen-traalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland.
4. Recombinant DNA-vector pEAV030.
5. DNA volgorde volgens SEQ nr. 2 of een derivaat daarvan die, wanneer opgenomen in een DNA-vector die een DNA- 1003579. volgorde (+DNA) omvat bestaande uit SEQ nr. 1 en aansluitend 5' daarvan SEQ nr. 2 of het derivaat ervan, in een vectorgast-heercel kan worden gehandhaafd en, met een niet-EA-viruseigen promotor voor een niet-EA-viruseigen RNA polymerase en het 5 niet-EA-viruseigen RNA polymerase, RNA oplevert dat in een virusgastheercel infectieus is en virusdeeltjes oplevert.
6. Gebruik van een oligonucleotide gekozen uit de groep bestaande uit de DNA volgorde volgens conclusie 5, het complement ervan, en fragmenten daarvan, als primer voor een 10 ketenverlengingsreactie.
7. RNA verkregen door transcriptie van de DNA-volgorde (-DNA) van de recombinant DNA-vector volgens conclusie l.
8. Werkwijze voor het verkrijgen van virusdeeltjes, waarbij RNA volgens conclusie 7 in virusgastheercellen wordt 15 gebracht, de virusgastheercellen worden gekweekt en virusdeeltjes op opzichzelf bekende wijze worden geïsoleerd.
9. Werkwijze voor het verkrijgen van virusdeeltjes, waarbij een recombinant DNA-vector volgens conclusie 1 in virusgastheercellen wordt gebracht, de virusgastheercellen 20 worden gekweekt en virusdeeltjes op opzichzelf bekende wijze worden geïsoleerd.
10. Virusgastheercel getransformeerd met RNA volgens conclusie 7 of met virusdeeltjes verkregen met de werkwijze volgens conclusie 8 of 9.
11. Werkwijze voor het bereiden van een recombinant RNA-houdend farmaceutisch preparaat, waarbij de recombinant DNA-vector volgens conclusie 1 in een vectorgastheercel wordt vermeerderd, de DNA-vector wordt getranscribeerd onder oplevering van recombinant RNA, desgewenst het recombinant RNA in 30 een virusgastheercel wordt gebracht onder oplevering van recombinant RNA-bevattende virussen welke desgewenst worden geïsoleerd, en aldus verkregen recombinant RNA met een farmaceutisch aanvaardbare drager of hulpstof tot een farmaceutisch preparaat wordt verwerkt.
12. Werkwijze voor het bereiden van een recombinant DNA-veetor-houdend farmaceutisch preparaat, waarbij de recombinant DNA-vector volgens conclusie 1 in een vectorgastheercel wordt vermeerderd en op opzichzelf bekende wijze wordt geïsoleerd, en het aldus verkregen recombinant DNA met een farma- 1003579. 5 ceutisch aanvaardbare drager of hulpstof tot een farmaceutisch preparaat wordt verwerkt. 1 00 3 5 7 9.
NL1003579A 1996-07-12 1996-07-12 Recombinant DNA-vector. NL1003579C2 (nl)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1003579A NL1003579C2 (nl) 1996-07-12 1996-07-12 Recombinant DNA-vector.
PCT/NL1997/000408 WO1998002549A1 (en) 1996-07-12 1997-07-14 Recombinant dna-vector comprising genomic equine arteritis virus sequences
AU33624/97A AU729975B2 (en) 1996-07-12 1997-07-14 Recombinant dna-vector comprising genomic equine arteritis virus sequences
EP97929604A EP0912744A1 (en) 1996-07-12 1997-07-14 Recombinant dna-vector comprising genomic equine arteritis virus sequences
CA002259964A CA2259964A1 (en) 1996-07-12 1997-07-14 Recombinant dna-vector comprising genomic equine arteritis virus sequences
JP10505874A JP2000514304A (ja) 1996-07-12 1997-07-14 Ea―ウィルスゲノム配列を含んだ組換えdnaベクター

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1003579A NL1003579C2 (nl) 1996-07-12 1996-07-12 Recombinant DNA-vector.
NL1003579 1996-07-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL1003579C2 true NL1003579C2 (nl) 1998-01-15

Family

ID=19763197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL1003579A NL1003579C2 (nl) 1996-07-12 1996-07-12 Recombinant DNA-vector.

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0912744A1 (nl)
JP (1) JP2000514304A (nl)
AU (1) AU729975B2 (nl)
CA (1) CA2259964A1 (nl)
NL (1) NL1003579C2 (nl)
WO (1) WO1998002549A1 (nl)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5607498A (en) * 1996-12-13 1998-07-03 Genetics Institute Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
DE60222528T2 (de) * 2002-01-30 2008-06-19 Giese, Matthias, Dr. Impfstoff gegen Pferdearteritisvirus

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995019438A1 (en) * 1994-01-14 1995-07-20 The Minister Of Agriculture, Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Equine arteritis virus peptides, antibodies and their use in a diagnostic test

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995019438A1 (en) * 1994-01-14 1995-07-20 The Minister Of Agriculture, Fisheries And Food In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Equine arteritis virus peptides, antibodies and their use in a diagnostic test

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.A.DF. DE VRIES ET AL.: "All subgenomic mRNAs of equine arteritis virus contain a common leader sequence", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 18, no. 11, 11 June 1990 (1990-06-11), IRL PRESS LIMITED,OXFORD,ENGLAND, pages 3241 - 3247, XP002017233 *
BOON DEN J A ET AL: "EQUINE ARTERITIS VIRUS IS NOT A TOGAVIRUS BUT BELONGS TO THE CORONAVIRUSLIKE SUPERFAMILY", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 65, no. 6, 1 June 1991 (1991-06-01), pages 2910 - 2920, XP000607121 *
CHIRNSIDE E D ET AL: "EXPRESSION CLONING AND ANTIGENIC ANALYSIS OF THE NUCLEOCAPSID PROTEIN OF EQUINE ARTERITIS VIRUS", VIRUS RESEARCH, vol. 39, no. 2/03, 1995, pages 277 - 288, XP000607654 *
CHIRNSIDE E D: "EQUINE ARTERITIS VIRUS: AN OVERVIEW", BRITISH VETERINARY JOURNAL, vol. 148, 1 May 1992 (1992-05-01), pages 181 - 197, XP000607273 *
J.A. DEN BOON ET AL.: "Equine arteritis virus subgenomic mRNA synthesis: Analysis of leader-body junction and replicative-form RNAs", J. VIROLOGY, vol. 70, no. 7, 1 July 1996 (1996-07-01), AM.SOC.MICROBIOL.,WASHINGTON,US, pages 4291 - 4298, XP002027008 *
S. YAMAGUCHI: "Infectious cDNA clone of equine arteritis virus", EMBL SEQUENCE DATA BASE, HEIDELBERG, BRD, XP002027007 *
VRIES DE A A F ET AL: "STRUCTURAL PROTEINS OF EQUINE ARTERITIS VIRUS", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 66, no. 11, November 1992 (1992-11-01), pages 6294 - 6303, XP000607054 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0912744A1 (en) 1999-05-06
CA2259964A1 (en) 1998-01-22
AU729975B2 (en) 2001-02-15
AU3362497A (en) 1998-02-09
JP2000514304A (ja) 2000-10-31
WO1998002549A1 (en) 1998-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. The complete sequence (22 kilobases) of murine coronavirus gene 1 encoding the putative proteases and RNA polymerase
Callahan et al. Molecular cloning and complete sequence determination of RNA genome of human rhinovirus type 14.
Mason et al. Molecular basis of pathogenesis of FMDV
Beck et al. Structure of the FMDV translation initiation site and of the structural proteins
Godeny et al. Complete genomic sequence and phylogenetic analysis of the lactate dehydrogenase-elevating virus (LDV)
Bredenbeek et al. The primary structure and expression of the second open reading frame of the polymerase gene of the coronavirus MHV-A59; a highly conserved polymerase is expressed by an efficient ribosomal frameshifting mechanism
Stanway Structure, function and evolution of picornaviruses
Cornelissen et al. Hemagglutinin-esterase, a novel structural protein of torovirus
Duechler et al. Evolutionary relationships within the human rhinovirus genus: comparison of serotypes 89, 2, and 14.
Paul et al. Studies of a putative amphipathic helix in the N-terminus of poliovirus protein 2C
Snijder et al. Comparison of the genome organization of toro-and coronaviruses: evidence for two nonhomologous RNA recombination events during Berne virus evolution
Saeki et al. Identification of spike protein residues of murine coronavirus responsible for receptor-binding activity by use of soluble receptor-resistant mutants
Lavi et al. Coronaviruses
Dong et al. Determinants of the p28 cleavage site recognized by the first papain-like cysteine proteinase of murine coronavirus
Kräusslich et al. Polyprotein processing in picornavirus replication
Keese et al. Nucleotide sequence of the genome of an Australian isolate of turnip yellow mosaic tymovirus
Denison et al. Identification of polypeptides encoded in open reading frame 1b of the putative polymerase gene of the murine coronavirus mouse hepatitis virus A59
Dahllund et al. The genome of echovirus 11
Morris et al. Characterization of coronavirus JHM variants isolated from Wistar Furth rats with a viral-induced demyelinating disease
EP0302801B1 (fr) Vaccins dont l'épitope caractéristique est incorporé dans une protéine de picornavirus, notamment de poliovirus
CA2090335A1 (en) Non-a, non-b hepatitis virus antigen, diagnostic methods and vaccines
Skern et al. Substrate requirements of a human rhinoviral 2A proteinase
Cao et al. Replication of poliovirus RNA containing two VPg coding sequences leads to a specific deletion event
Liu et al. Proteolytic mapping of the coronavirus infectious bronchitis virus 1b polyprotein: evidence for the presence of four cleavage sites of the 3C-like proteinase and identification of two novel cleavage products
NL1003579C2 (nl) Recombinant DNA-vector.

Legal Events

Date Code Title Description
AD1B A search report has been drawn up
PD2B A search report has been drawn up
VD1 Lapsed due to non-payment of the annual fee

Effective date: 20040201