DE60222528T2

DE60222528T2 - Impfstoff gegen Pferdearteritisvirus

Info

Publication number: DE60222528T2
Application number: DE60222528T
Authority: DE
Inventors: Matthias Giese; Gholamreza Darai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: DE60222528D1; ATE373675T1; EP1346998A1; EP1346998B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung gehört in das Gebiet der Tiergesundheit und des equinem Aterititisvirus (EAV). Die Erfindung stellt Vakzinezusammensetzungen bereit, die aus den offenen Leserahmen (ORF) 2b, ORF 5 und ORF 7 Nukleinsäure von EAV bestehen, Nukleinsäure enthaltend besagtes ORF2b, ORF5 und ORF7 und Vektoren, die besagte ORFs umfassen, wobei die Nukleinsäuren in einem einzelnen Vektor-Rückgrat oder in einer Vielzahl von Vektor-Rückgraten enthalten sind, wobei jedes davon regulatorische Sequenzen umfasst. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung besagter ORFs und Vektoren in der Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und Behandlung von EAV Infektionen.
Hintergrund der Erfindung
Equine Arteritis ist eine ansteckende Krankheit von Pferden und wird über den respiratorischen oder reproduktiven Trakt verbreitet, und durch equinen Arteritisvirus (EAV) verursacht, die ein Mitglied der Arteriviridae Familie ist, die den Lactat-Dehydrogenase erhöhenden Virus (LDV), Schweine reproduktiven und respiratorischen Syndrom Virus (PRRSV), und Affen hämorrhagisches Fiebervirus (SHFV) einschließt.
EAV ist gut untersucht und seine biologischen und biophysikalischen Eigenschaften zusammen mit den Daten über virale Pathogenese und Zell-Virus-Interaktionen wurden in über 200 wissenschaftlichen Berichten dokumentiert (Anlage 1). Die Genomorganization und transkriptionelle Strategie von Arteriviren werden in 1 gezeigt. Die EAV Virionen sind 60–65 nm im Durchmesser und besitzen ein 49S RNA Genom, das einzelsträngige, nicht segmentierte, gecappte und polyadenylierte Message-Sense RNA ist (12687 Nukleotide; den Boon, et al. 1991; GenBank Zugriffsnummer: X53459). Das EAV Genom ist infektiös und enthält mindestens acht offene Leserahmen (ORF) 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6, und 7 (SEQ ID Nr. 10). Die zwei größten viralen ORFs (ORF 1a und ORF 1b) kodieren für die virale Replicase (den Boon, et al. 1991) und befinden sich an dem 5'-Ende des viralen Genoms zwischen den Nukleotidpositionen 1 und 9807. Die ORFs 2 bis 7 überlappen und befinden sich an dem 3'-Ende des EAV Genoms. Diese ORFs kodieren für vier bekannte strukturelle virale Protein und zwei Proteine unbekannter Funktion (Genprodukte von ORFs 3 und 4). Das EAV Virion besteht aus einem phosphorylierten Nukleokapsidprotein (N, 14 kDa, Genprodukt von ORF 7), einem N-glykolysierten Hauptmembranprotein (G_L, 30–44 kDa, Genprodukt von ORF 5), einem N-glykolysierten Nebenmembranprotein (G_S, 25 kDa, Genprodukt von (ORF 2b), und einem nicht glykolysierten Membranprotein (M, 17 kDa, Genprodukt von ORF 6). Tobiash et al. beschreibt, dass das große Hüll-Glykoprotein und das Nukleokapsidprotein von EAV eine Immunantwort in Balb/c Mäusen durch DNA Vakzinierung induzieren (Virus Genes, vol. 22, Nr. 2, März 2001, S. 1787–199). Chow Y.H. et al. diskutieren die Verbesserung von Hepatitis B Virus DNA Vakzinen durch Plasmide, die Hepatitis B Oberflächenantigen und Interleukin-2 koexpremieren (Journal of Virology, vol. 71, Nr. 1, Januar 1997, S. 169–178) und Krieg A.M. et al. diskutieren die Rolle von CpG Dinukleotiden in DNA Vakzinen (Trends in Microbiology, vol. 6, Nr. 1, Januar 1998, S. 23–27). Ein neues Strukturprotein von Arteriviren wird durch Snijder E. et al. (Journal of Virology, August 1999, vol. 73, Nr. 8, S. 6335–6345) identifiziert.
Die EAV Infektion verbleibt in der Pferdepopulation, da chronische Trägertiere EAV in ihren Samen ausschütten und es venereal an Stuten währen der Paarungszeit übertragen. PRRSV wird durch reproduktives Versagen, z.B. späte Aborte in Säuen und als Ursache für respiratorische Erkrankungen und Sterblichkeit bei jungen Schweinen gekennzeichnet.
Die Analyse der genetischen Stabilität von EAV während horizontaler und vertikaler Übertragung bei einem Ausbruch von equiner viraler Arteritis offenbarte, dass der Trägerhengst die Quelle der genetischen Diversität von EAV ist (Balasuriya et al., 1999). Es ist bekannt, dass der infizierte Trägerhengst das kritische natürliche Reservoir von EAV ist. Der Ausbruch von einer EAV Infektion kann durch die horizontale Aerosolübertragung von spezifischen viralen Varianten initiiert werden, die im Samen des Trägerhengstes vorkommen. Jedoch zeigten Patton und Kollegen, dass nicht nur der Trägerhengst das kritische natürliche Reservoir von EAV ist, sondern genetische Diversität des Virus auch im Verlauf der persistenten Infektion der Trägerhengste erzeugt wird. (Patton et al., 1999).
Konsequenterweise verursachen PRRSV und EAV ökonomisch wichtigen Infektionskrankheiten auf Schweine- und Pferdefarmen weltweit. Die Entwicklung eines wirksamen Vakzins ist von besonderer Bedeutung, da es sich auf die Prävention der Erkrankungen konzentriert. In der Technik gab es einen lang andauernden Bedarf für ein effektives EAV Vakzin, das in der Lage ist, EAV assoziierten Krankheiten vorzubeugen oder diese zu heilen. Daher war das technischen Problem, das dieser Erfindung zu Grunde liegt, ein solches Vakzin bereitzustellen, das in der Lage ist, EAV assoziierten Krankheiten vorzubeugen oder diese zu heilen.
Figuren
1: Schematisches Diagramm der Genomorganisation und transkriptionellen Strategie der Familie Arteriviridae.
2: Schematisches Diagramm der Strategie, die für die molekulare Klonierung der neutralisierende Domäne von equinem Arteritisvirus (EAV) verwendet wurde.
3: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die in zwei unabhängigen Experimenten (A und B) mit der DNA des rekominanten Plasmids pCR3.1-EAV-O5-BX-C14 inokuliert wurden, das ORF 5 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfasst und exprimiert.
4: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA des rekombinanten Plasmide pCR3.1-EAV-O5-BX-C14 und pCR3.1-EAV-O7-BX-C3 inokuliert wurden, die ORF 5 und 7 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfassen und exprimieren.
5: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA der rekombinanten Plasmide pDP-EAV-O5-BsS-C2 und pDP-EAV-o7-BsS-C1 inokuliert wurden, die ORF 5 und 7 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfassen und exprimieren.
6: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA der rekombinanten Plasmide pCR3.1-EAV-o5-BX-C14 und pCR3.1-EAV-06-BE-C4 inokuliert wurden, die ORF 5 und 6 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfassen und exprimieren.
7: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA des rekombinanten Plasmids pCR3.1-EAV-o4-BX-C3 inokuliert wurden, das ORF 4 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfasst und exprimiert. Die individuellen Tiere sind mit Nummer 1 bis 10 bezeichnet.
8: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA des rekombinanten Plasmids pCR3.1-EAV-o4-BE-C3 inokuliert wurden, das ORF 4 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfasst und exprimiert. Die individuellen Tiere sind mit Nummer 1 bis 10 bezeichnet.
9: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA des rekombinanten Plasmids pCR31-EAV-o5-deL-121 inokuliert wurden, das die N-terminale hydrophile Ectodomäne von GL Hüll-Glykoprotein (Aminosäurerest 1–121 von ORF) von equinem Arteritisvirus (EAV) umfasst und exprimiert.
10: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA der rekombinanten Plasmide pCR3.1-EAV-O2-BX-C5, pCR3.1-EAV-O5-BX-C14 und pCR3.1-EAV-O6-BE-C4 inokuliert wurden, die ORF 2b (kleines Hüllprotein), 5 (großes Hüll-Glycoprotein) und 6 (Membranprotein) von equinem Arteritisvirus (EAV) umfassen und exprimieren.
11: Die Ergebnisse der Neutralisationstests, die durch die Analyse der Seren der individuellen Balb/c Mäuse erhalten wurden, die mit der DNA der rekombinanten Plasmide pCR3.1-EAV-O2-BX-C5 und pCR3.1-EAV-O4-BX-C3 inokuliert wurden, die ORF 2b und 4 von equinem Arteritisvirus (EAV) umfassen und exprimieren.
12: Ein Beispiel der Ergebnisse, die durch Enzym gebundenen Immunosorptionsassay (ELISA) zur Detektion von EAV spezifischen Antikörpern erhalten wurden.
13: Etablierung eines Lymphoproliferationsassay zur Detektion der zellulären Immunantwort
14: (14–14b) Bestimmung der maximalen zellulären ⁵¹Cr-Aufnahme
15: (15a–15e) Berechnete spezifische Lyse nach der zweiten und dritten Booster Immunisierung
Offenbarung der Erfindung
Definitionen der in der Beschreibung verwendeten Begriffe
Vor den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung muss angemerkt werden, dass, wie hier, und in den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Einzahlform „ein" und „der/die/das" die Mehrzahl mit umschließt, falls der Kontext nicht klar etwas anderes vorschreibt. Somit schließt, zum Beispiel, der Bezug auf „eine Nukleinsäure" eine Vielzahl solcher Nukleinsäuremoleküle, der Bezug auf einen „Vektor" ist ein Bezug auf einen oder mehr Vektoren und Äquivalente davon, die den Fachleuten bekannt sind, und so weiter. Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen hier verwendeten Begriffe die gleichen Bedeutungen, wie sie durch die Fachleute auf diesem Gebiet der Technik gemeinhin verstanden werden, zu dem diese Erfindung gehört.
Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die denjenigen ähnlich oder äquivalent sind, die hier beschrieben werden, in der Ausübung oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren, Geräte und Materialien beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen werden durch Bezugnahme aufgenommen, zum Zwecke des Beschreibens und Offenbarens der Zelllinien, Vektoren und Methodologien, wie sie in den Veröffentlichungen berichtet werden, welche in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden könnten. Nichts hier soll so verstanden werden, dass die Erfindung nicht berechtigt ist solch einer Offenbarung durch frühere Erfindung voranzugehen.
Der Begriff "EAV", wie hier verwendet, bezieht sich auf alle Viren, die zu der Spezies equiner Arteritisvirus innerhalb der Familie Arteriviridae gehören.
Ein "Fragment" gemäß der Erfindung ist eine Untereinheit eines DNA Moleküls (z.B. Teil eines offenen Leserahmens (ORF)) eines längeren DNA Moleküls (z.B. eine gesamter ORF) EAV gemäß der Erfindung, d.h. jeder Teil, dadurch gekennzeichnet, dass er durch eine kürzere Nukleinsäuren als die offenbarte kodiert wird, die immer noch in RNA transkribiert werden kann. „Fragment" bezieht sich auf Teile von Proteinen, d.h. kleinere Proteine, die durch die DNA Fragmente kodiert werden. Die Expression soll abhängig von dem Kontext, in dem sie verwendet wird, verstanden werden.
Eine "funktionelle Variante" des DNA Moleküls gemäß der Erfindung oder des Proteins, das dadurch kodiert wird, ist eine DNA Molekül oder Protein, das eine biologische Aktivität besitzt (entweder funktional oder strukturell), die im Wesentlichen dem DNA Molekül oder Protein gemäß der Erfindung ähnlich ist. Der Begriff „funktionale Variante" umfasst auch „ein Fragment", „eine funktionale Variante", „Variante basierend auf degeneriertem Nukleinsäurecode" oder „chemisches Derivat". Solch eine „funktionale Variante", z.B. kann eine oder mehrere Nukleinsäureaustäusche, Deletionen oder Insertionen tragen. Solche Austausche, Deletionen oder Insertionen können zu 10% der gesamten Sequenz beitragen. Die funktionalen Varianten behält wenigstens zum Teil ihre biologische Aktivität, z.B. funktionieren als ein infektiöser Klon oder ein Vakzinstamm, oder üben eine verbesserte biologische Aktivität aus.
Eine "Variante basierend auf der degenerativen Natur des genetischen Codes" ist eine Variante resultierend von der Tatsache, das eine bestimmte Aminosäure durch zahlreiche verschiedenen Nukleotidtripletts kodiert werden kann. Die Variante behält wenigstens zum Teil ihre biologische Aktivität, oder übt eine verbesserte biologische Aktivität aus.
Gemäß der Erfindung meint "Mutation" die Ersetzung eines Nukleotids durch ein anderes (z.B. C für ein T), eine sogenannte „Substitution" oder jede andere Mutation wie „Deletion" oder „Insertion". „Deletion" bedeutet die Entfernung eines oder mehrerer Nukleotide oder Aminosäuren.
Ein „Fusionsmolekül" kann das DNA Molekül oder Protein gemäß der Erfindung sein, das mit einem, z.B. Reporter wie einer radioaktiven Markierung, einem chemischen Molekül, wie einer fluoreszierenden Markierung oder jedem in der Technik bekanntem Molekül fusioniert ist. Wie hier verwendet, ist ein „chemisches Derivat" gemäß der Erfindung ein DNA Molekül oder Protein gemäß der Erfindung, das chemisch modifiziert ist oder zusätzliche chemische Einheiten enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Einheiten können die Solubilität, Absorption, biologische Halbwertszeit, etc., des Moleküls verbessern.
Ein Molekül ist „im Wesentlichen ähnlich" zu einem anderen Molekül, wenn beide Moleküle im Wesentlichen ähnliche Nukleotidsequenzen oder biologische Aktivität besitzen. Somit werden zwei Moleküle, vorausgesetzt, dass sie eine ähnliche Aktivität besitzen, als Varianten betrachtet, wie der Begriff hier verwendet wird, wenn die Nukleotidsequenz nicht identisch ist, und zwei Moleküle, die eine ähnliche Nukleotidsequenz besitzen, werden als Varianten betrachtet, wie der Begriff hier verwendet wird, selbst wenn ihre biologische Aktivität nicht identisch ist.
Die Begriffe "Vakzin" und "Vakzinzusammensetzung" werden austauschbar verwendet.
Der Begriff "Vakzin", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine immunologisch aktiven Komponente umfasst, die eine Immunantwort in einem Tier induziert und möglicherweise aber nicht notwendigerweise eine oder mehr zusätzliche Komponenten umfasst, die die immunologische Aktivität der aktiven Komponente verstärkt. Ein Vakzin kann zusätzlich weitere Komponenten umfassen die für pharmazeutische Zusammensetzungen typisch sind. Die immunologisch aktiven Komponenten eines Vakzins kann komplette Viruspartikel in entweder ihrer originalen Form oder als attenuierte Partikel in einem sogenannten mofiziertem Lebendvakzin (MLV) oder Partikeln, die durch geeignete Verfahren in eine sogenanntem Todvakzin (KV) inaktiviert wurden, umfassen. In einer anderen Form umfasst die immunologisch aktive Komponente eines Vakzins geeignete Elemente der Organismen (Untereinheitvakzine), wobei diese Elemente entweder durch Zerstören des gesamten Partikels oder Anzuchtkulturen, die solche Partikeln enthalten, erzeugt werden, und optional nachfolgende Reinigungsschritte, die die gewünschte(n) Struktur(en) ergeben, oder durch synthetische Prozesse, die eine geeignete Manipulation durch Verwendung eines geeigneten Systems, zum Beispiel, Bakterien, Insekten, Säugern oder anderen Spezies plus optionaler nachfolgender Isolierungs- und Aufreinigungsverfahren, oder durch Induktion des synthetischen Prozesses in dem Tier, das ein Vakzin benötigt, durch direkte Aufnahme des genetischen Materials mit geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen (Polynukleotidvakzinierung) einschließen. Ein Vakzin kann eines oder gleichzeitig mehr als eines der oben beschriebenen Elemente umfassen.
Der Begriff „Vakzin", wie hierin verstanden, ist ein Vakzin für die veterinäre Verwendung, umfassend antigene Substanzen und wird verabreicht zum Zwecke des Induzierens einer spezifischen und aktiven Immunität gegen eine Krankheit, die durch EAV ausgelöst wird. Das EAV Vakzin gemäß der Erfindung vermittelt aktive Immunität, die passiv über maternale Antikörper gegen die Immunogene, die es enthält, und manchmal gegen antigenisch verwandte Organismen enthält, transferiert werden kann.
Zusätzliche Komponenten, um die Immunantwort zu verstärken, sind Bestandteile, die gewöhnlich als Adjuvantien bezeichnet werden, wie, z.B. Aluminiumhydroxid, Mineral- oder andere Öle oder Hilfsmoleküle, die zu dem Vakzin hinzugefügt werden oder durch den Körper nach der jeweiligen Induktion durch solche Komponenten, wie, aber nicht beschränkt auf, Interferone, Interleukine oder Wachstumsfaktoren erzeugt werden.
Eine „Vakzinzusammensetzung" besteht im Wesentlichen aus einem oder mehr Inhaltsstoffe, die in der Lage sind, physiologische, z.B., immunologische Funktionen des Organismus, an denen sie verabreicht werden, oder von Organismen, die in oder auf dem Organismus leben, zu modifizieren. Der Begriff schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Antibiotika oder Antiparasitika, wie auch andere Bestandteile, die gewöhnlich verwendet werden, um bestimmte andere Ziele zu erreichen, wie, aber nicht beschränkt auf, das Verabeiten von Merkmalen, Sterilität, Stabilität, Durchführbarkeit die Zusammensetzung über entereale oder parentereale Routen zu verabreichen, wie oral, intranasal, intravenös, intramuskulär, subkutan, intradermal oder andere geeignete Routen, Toleranz nach Verabreichung, Eigenschaften der kontrollierten Freisetzung.
Offenbarung der Erfindung
Die Lösung zu dem obigen technischem Problem wird durch die Beschreibung und die in den Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen erreicht.
Der lang anhaltende Bedarf in der Technik für ein Vakzin, das in der Lage ist einer EAV assoziierten Krankheit vorzubeugen oder sie zu heilen wurde durch die gegenwärtigen Erfindung befriedigt, die ein solches Nukleinsäure basiertes prophylaktische oder therapeutisches Vakzin für EAV assoziierte Krankheiten bereitgestellt hat. Dieses Vakzin wird in größerem Detail unten beschrieben. Überraschenderweise ist das auf Nukleinsäure basierende Vakzin gemäß der Erfindung zum erstem Mal in der Technik in der Lage in Pferden, nicht nur eine humorale (Antikörper basierte) Antwort zu erzeugen (gezeigt in einer exemplarischen Weise, z.B. in Beispiel 1), sondern auch eine zellulläre Immunantwort. Nur diese zelluläre Immunantwort, wie in Beispielen 2 bis 5 exemplarisch dargestellt, ist gegen horizontale und vertikale EAV Übertragung in Pferden protektiv. Noch überraschender ist, entgegen dem, was der Fachmann erwarten würde (Barry und Johnston, 1997) das Vakzin gemäß der Erfindung protektiv gegen eine Infektion nicht nur in jungen Pferden, sondern auch in Pferden aller Altersstufen (wie durch die Daten exemplarisch veranschaulicht, siehe Tabelle 8 und 10). Somit sind die Vakzine gemäß der Erfindung, wie sie unten beschrieben sind, in der Lage eine zelluläre Immunantwort in Pferden zu induzieren und sie sind gegen horizontale und vertikale EAV Übertragung in Pferden aller Alterstufen protektiv.
In einer ersten wichtigen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Vakzinzusammensetzung, die gegen equine Arterivirus (EAV) Infektionen in Pferden protektiv ist und eine zelluläre Immunantwort induziert bestehend aus offenen Leserahmen Nukleinsäuren (ORF) 2b, ORF 5 und ORF 7 von EAV, wobei die Nukleinsäuren in einem einzelnen Vektor-Rückgrat oder in einer Vielzahl von Vektor-Rückgraten enthalten sind, wobei jedes davon regulatorische Sequenzen umfasst. Die Erfindung bezieht sich auch auf Vakzinzusammensetzungen, wobei (ORF) 2b, ORF 5 und ORF 7 Fragmente funktionale Varianten oder Mutationen besitzen, wie oben definiert.
Um solche Nukleinsäuren herzustellen, kann der Fachmann den Beispiele der vorliegenden Erfindung folgen und auch Standart molekularbiologische Verfahren anwenden, die, z.B. in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2te A., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York und Bertram, S. und Gassen, H.G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, (1991) gefunden werden.
Überraschenderweise, entgegen der Meinung in der Technik, ist ein Vakzin umfasssend Nukleinsäure mit besagten drei ORFs besonders effektiv und viel besser als ein Vakzin, in dem die gesamte cDNA von EAV verwendet wird. ORF 2 b kodiert für ein kleines Glycoprotein. ORF 5 kodiert für ein großes Hüllglycoprotein. ORF 7 kodiert für das Nucleokapsidprotein. Die Erfindung bezieht sich auch auf Vakzinzusammensetzungen umfassend mutierte oder trunkierte ORFs, wie ORF 5 in einer deletierten Form (SEQ ID Nr. 9).
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vakzinzusammensetung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin die Vakzinzusammensetzung ferner einen ORF umfasst ausgewählt aus der Gruppe ORF 1a, ORF 1b, ORF 3, ORF 4, ORF 6. ORF 1a und ORF 1b kodieren für die virale Replicase. ORF 3 und ORF 4 kodieren für Proteinen von bisher unbekannter Funktion. ORF 6 kodiert für eine unglykolisiertes Membranprotein. Vorzugsweise ist das oder die ORFs in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6 offenbart.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Vakzinzusammensetzungen umfassend mutierte oder trunkierte ORFs wie die partielle ORF1 Sequenz in SEQ ID Nr. 8.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin die Nukleinsäure cDNA ist.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, wobei die Vakzinzusammensetzung aus einem oder mehreren Nukleinsäurevektoren besteht, jeder die ORFs umfassend. Eine Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf einen solchen Vektor, umfassend mehr als einen ORF.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, wobei der/die Vektor/Vektoren (ein) Expressionsvektor(en) ist/sind.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, wobei der/die Expressionvektor(en) weiter eine eukaryotische cis-wirkende Transkriptions-/Translationssequenz umfasst/umfassen, die funktional mit dem/den ORF(s) verknüpft ist.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus der Gruppe aus pCR3.1, pcDNA3.1/His A, pcDNA3.1/His B, pcDNA3.1/His C und pDisplay (pD). Solche Vektoren sind kommerziell verfügbar (Invitrogen).
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, ferner eine Nukleinsäure, die für ein equines Interleukin 2 (IL-2) kodiert, oder einen Vektor oder Expressionsvektor umfassend, der die Nukleinsäure, die für IL-2 kodiert, umfasst.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff umfassend.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, ferner eines oder mehrere Adjuvanzien umfassend, ausgewählt aus der Gruppe aus Muramyl-dipeptid (MDP), Montanide 720, Poly Inosin:Cytosin (Poly I:C) oder Plasmid DNA umfassend unmethyliertes Cytosin, Guanin-dinukleotid Sequenzmotive (CpG).
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Vakzin gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, wobei jedes der Adjuvanzien eines von denen ist, die beschrieben sind in Kapitel 7 (S. 141–227) von "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" (Hrg. Powell, M. F. und Newman, M. J.) Pharmaceutical Biotechnology, Band 6, Plenum Press (New York). Beispiele dieses Kompendiums schließen Muramyl Dipeptid (MDP) und Montanid 720 ein, wie oben offenbart. Moleküle wie Poly Inosin:Cytosin (Poly I:C) oder "immunstimmulatorische Nukleinsäurenmoleküle", wie Plasmid-DNA enthaltend CpG Motive können auch als Adjuvanzien in Kombination mit Antigenen verabreicht werden, die in Mikropartikeln verkapselt sind. Bin „immunstimmulatorisches Nukleinsäurenmolekül" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine unmetylierte Cytosin, Guanindinukleotidesequenz besitzt (d.h. „CpG DNA " oder DNA enthaltend eine Cytosin gefolgt von Guanosin und verbunden durch eine Phosphatbindung) und (z.B. besitzt eine mitogene Effekt auf, induziert oder erhöht die Cytokinexpression durch) eine Vertebratenlymphocyte stimuliert. Bin immunstimulatorisches Nukleinsäuremolekül kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Im Allgemeinen, sind doppelstängige Moleküle in vivo stabiler, während einzelsträngige Moleküle erhöhte Immunaktivität besitzen. Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Befund, das bestimmte „immunstimmulatorische Nukleinsäurenmoleküle" enthaltend unmetylierte Cytosin-Guanin (CpG) Dinukleotide Lymphozyten in einem Subjekt aktivieren und die Immunantwort eines Subjekts von einer Th2 zu einer Th1 verschieben (z.B. durch Induzieren der moncytischen Zellen und anderer Zellen, um Th1 Cytokine zu produzieren, einschließend IL-12, IFN-Gamma und GM-CSF).
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, bestehend aus Expressionsvektoren umfassend ORF 2b, ORF 5 bzw. ORF 7 von EAV und optional Träger, Auszüge oder Adjuvanzien und einen Expressionsvektor umfassend die Nukleinsäure kodierend für IL-2. Die Nukleinsäure ist bevorzugt equines IL-2. Vorzugsweise wird die kodierende IL-2 Nukleinsäure auf einem Vektor koexprimiert, wie oben offenbart, kodierend einen oder mehrere EAV ORFs.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, in der ORF 2b SEQ ID Nr. 2, ORF 5 SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 9 ist und ORF 7 SEQ ID Nr. 7 ist.
Geeignet für die gezielte Verabreichung der Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung sind kolloidale Dispersionssysteme oder Liposomen. Eine Beispiel eines gezielten Verabreichungssystems für die EAV ORF Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung ist das kolloidale Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme schließen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrospheren, Kugeln, und Lipid basierte Systeme ein, einschließend Öl in Wasser Emulsionen, Micellen, gemischte Micellen und Liposomen oder Liposomformulierungen. Das bevorzugte kolloidale System dieser Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als Verabreichungsvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Diese Formulierungen können Netto kationische, anionische oder neutrale Landungseigenschaften besitzen sind nützliche Eigenschaften bei in vitro, in vivo und ex vivo Verabreichungsverfahren. Es wurde gezeigt, das große unilamellare Vesikel (LUV), die in Hinsicht auf Größe von 0.2–4.0 μm reichen, einen substantiellen Prozentsatz eines wässrigen Puffers enthaltend, große Makromoleküle einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können in dem wässrigen Inneren eingekapselt werden und an Zellen in einer biologisch aktiven Form verabreicht werden (Fraley R und Papahadjopoulos D (1981). New generation liposomes – The engineering of an efficient vehicle for intracellular delivery of nucleic acids. Trends Biochem Sci 6, 77–80). Zusätzlich zu Säugerzellen wurden Liposomen für die Verabreichung von Polynukleotiden in Pflanzen, Hefe und bakteriellen Zellen verwendet. Damit die Liposomen ein effizientes Gentransfervehikel der EAV ORFs gemäß der Erfindung sind, sollten folgende Eigenschaften vorliegen: (1) Einkapseln der interessierenden Gene mit hoher Effizienz, während ihre biologische Aktivität nicht eingeschränkt wird; (2) bevorzugtes und substantielles Binden an eine Targetzelle in Vergleich zu Nicht-Targetzellen; (3) Verabreichen von wässrigen Inhalten des Vesikels an das Targetzell-Zytoplasma mit hoher Effizienz; und (4) akkurate und effektive Expression von genetischer Information (Mannino RJ, und Gould-Fogerite S (1988). Liposome mediated gene transfer. BioTechniques 6, 682–690.).
Die Zusammensetzung des Liposoms ist gewöhnlich eine Kombination von Phospholipiden, insbesondere Hochphase-Übergangstemperatur-Phospholipiden, gewöhnlich in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterol. Andere Phospholipide oder andere Lipide können auch verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften der Liposomen hängen von pH, Ionenstärke und dem Vorligen von divalenten Kationen ab.
Die Vakzinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann den rekombinanten Vektor als eine „nackten Expressionsvektor" enthalten. Dies bedeutet, dass das Konstrukt nicht mit einem Verabreichungsvehikel (z.B. Liposomen, kolloidalen Partikeln und ähnlichem) assoziiert ist. Einer der wichtigsten Vorteile von nacktem DNA Vektor ist das Fehlen einer durch den Vektor selbst stimulierten Immunantwort.
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin die Nukleinsäure oder der Nukleinsäurevektor oder Expressionsvektor in Liposomen eingekapselt ist.
Zahlreiche Typen von liposomalen Präparationen können für die Verkapselung verwendet werden, große mulitlamillare Vesikel, kleine unilamillare Vesikel, neutrale, anionische Liposomen oder einfache kationische Amphiphile einschließend. Am meisten bevorzugt sind kationische Liposomen. Diese synthetisches Genverabreichungssysteme werden durch viele Begriffe beschrieben. Die kationische Lipid vermittelte Transfektion wurde auch Liposom vermittelte Transfektion, kationische Liposom vermittelte Transfektion, Lipofektion, Cytofektion, Amphifektion und Lipid vermittelte Transfektion genannt. In ähnlicher Weise werden die Komplexe, die produziert werden, wenn kantionische Lipide mit DNA gemischt werden, als Cytosomen, Amphisomen, Liposomen, Nucleolipid-Partikel, kationische Lipid-DNA Komplexe, Lipid-DNA Komplexe, DNA-Lipid Komplexe etc. bezeichnet. Kürzlich wurden eine gemeinsame Nomenklatur vorgeschlagen: Lipoplex ersetzt alle Begriffe für kationische Lipid-Nukleinsäure-Komplexe (DNA, RNA oder synthetisches Oligonukleotide einschließend) und Lipofektion meint die durch Lipoplexe vermittelte Nukleinsäureverabreichung. Jedes der Genverabreichungssysteme kann gemäß der Erfindung verwendet werden.
Die postiv geladenen kationischen Lipidmoleküle erleichtern ihre Assoziierung mit negativ geladener Nukleinsäure wie auch mit Membran-Phospholipiden (negativ geladen), was die Basis für die nicht spezifische Interaktion des Komplexes ist.
Die spezifische Bindung an die Zelle wird durch die Verwendung von spezifischen Liganden für zelluläre Rezeptoren vermittelt. Kationische Liposomen können DNA entweder direkt über die Plasmamembran oder über das Endosomen-Kompartment verabreichen. Unabhängig von seinem exakten Eintrittspunkt, akkumuliert viel DNA in den Endosomen und geht durch die interne hydrolytische Verdauung mit den Endosomen verloren. Um die Plasmid DNA zu schützen, können zahlreiche Strategien gemäß der Erfindung verwendet werden. Dieses schließt die Verwendung von acidotropen schwachen Aminen wie Choroquin ein, die vermutlich DNA Abbau durch Hemmung der endosomalen Ansäuerung verhindern. Aber auch virale Fusionspeptide oder ganze Viren können eingeschlossen werden, um Endosomen zu disruptieren oder Fusion von Liposomen mit Endosoomen zu fördern und die Freisetzung der DNA in das Cytoplasma zu ermöglichen. Solcher Schutz der Plasmid DNA ist auch eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
Die DNA Konzentration, das Verhältnis von Lipid-Reagenz zu DNA, die Transfektionszeit und die Wirkung des Serums sind die kritischtesten Faktoren in jeder Transfektion.
Liposomen müssen stabil sein. Im Fall des Leckens würden sie Antigen und Adjuvanzien vorzeitig verlieren.
Bevorzugt ist eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, umfassend 0.05 μg–10 μg, vorzugweise 0.1 μg–1 μg, am meisten bevorzugt 0.5 μg. Weiterhin bevorzugte Dosierungsbereiche sind: unter Bereich 0.1–1.0 μg, am meisten bevorzugt 0.5 μg, mittlerer Bereich 1.1–10 μg, am meisten bevorzugt 15 μg, oberer Bereich 11 μg–20 μg, am meisten bevorzugt 15 μg. Der Fachmann kennt die Kriterien für die ideale Dosierung, die von dem Verabreichungsweg abhängt, d.h. mit der „gene gun" wird das Vakzin direkt in Langerhans Zellen injiziert, somit geht sehr wenig Antigen verloren, während i.m. Injektion viel höhere Dosierungen benötigt.
Am meisten bevorzugt ist eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, umfassend 0.5 μg individuellen Nukleinsäurevektor oder vorzugsweise Expressionvektor pro Vakzinierung und vorzugweise für 10 Schüsse pro Tier, d.h. 5 μg individuellen Nukleinsäurevektor (oder vorzugsweise Expressionsvektor) pro Vakzinierung, z.B. wenn sieben Nukleinsäurevektoren (oder vorzugsweise Expressionsvektoren) verwendet werden, 35 μg pro Vakzinierung und Tier (siehe Beispiel 2).
Auch bevorzugt ist eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, umfassend: unterer Bereich 10–100 μg, am meisten bevorzugt 50 μg, mittlerer Bereich 101–500 μg, am meisten bevorzugt 200 μg, oberer Bereich 501 μg–2000 μg, am meisten bevorzugt 1000 μg. Wiederum kennt der Fachmann die Kriterien für die ideale Dosierung, die von dem Verabreichungsweg abhängt, d.h. mit der „gene gun" wird das Vakzin direkt in Langerhans Zellen injiziert, somit geht sehr wenig Antigen verloren, während i.m. Injektion viel höhrere Dosierungen benötigt.
Auch bevorzugt ist eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, umfassend 50 μg vom individuellen Nukleinsäurevektor oder vorzugsweise Expressionsvektor und vorzugsweise für 4 Injektion pro Tier, d.h 200 μg vom individuellen Nukleinsäurevektor (oder vorzugsweise Expressionvektor) pro Vakzinierung, z.B. wenn sieben Nukleinsäurevektoren (oder vorzugsweise Expressionsvektoren) verwendet werden e, 1,4 mg pro Vakzinierung und Tier (siehe Beispiel 2).
In noch einer anderen wichtigen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf einen Nukleinsäurevektor bestehend aus Nukleinsäuren ORF 2b ORF 5, und ORF7 von EAV, und einem Vektorrückgrat und regulatorischen Sequenzen. Vorzugsweise sind die ORFs wie in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 7 offenbart.
Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Nukleinsäurevektor gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin die Nukleinsäure DNA ist.
Ein stärker bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Nukleinsäurevektor gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin der Nukleinsäurevektor ein Expressionsvektor ist.
Ein anderer stärker bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Nukleinsäurevektor gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin der Expressionsvektor eine eurkaryotische cis-wirkende Transkritions/Translationssequenz besitzt, die funktional mit dem ORF(s) verbunden ist. Um Expression zu erreichen, wurde eine breite Vielzahl von Vektoren entwickelt und sind kommerziell verfügber, die induzierbare Expression (z.B., LacSwitch Expressionsvektoren, Stratagene, La Jolla, CA) oder verwandte Expression (z.B., pcDNA3 Vektoren, Invitrogen, Chatsworth, CA) von EAV ORF Nukleotidseuqenz unter der Regulierung eines künstlichen Promoterelements ermöglichen. Solche Promotorelemente werden oft von CMV von SV40 viralen Genen abgeleitet, obwohl andere starke Promoterelemente, die in eurkaryotischen Zellen aktiv sind, auch eingesetzt werden können, um Transkription von EAV ORF Nukleotidsequenzen zu induzieren. Typischerweise enthalten diese Vektoren auch eine künstliche Polyadenylierungssequenz und ein 3'UTR, das auch von exogenen viralen Gensequenz oder von anderen eurkaryotischen Genen abgeleitet werden kann. Weiterhin sind in einigen Konstrukten, künstliche nicht kodierende spleißbare Introns und Exons in dem Vektor eingeschlossen, um die Expression der interessierenden Nukleotidsequenz zu verstärken (in diesem Fall, EAV ORF Sequenzen). Diese Expressionssysteme sind allgemein von kommerziellen Quellen verfügbar und werden durch Vektoren wie pCDNA3 und pZeoSV repräsentiert (Invitrogen, San Diego, CA). Unzählige kommerziell verfügbare wie auch individuell angefertigte Expressionsvektoren sind von kommerziellen Quellen verfügbar, um die Expression von jedem gewünschen EAV ORF Transkript in mehr oder weniger jedem gewünschten Zelltyp zu ermöglichen, entweder konstitutiv oder nach Exposition gegenüber einem bestimmten exogenen Stimulus (z.B. Entzug von Tetracyclin oder Exposition gegenüber IPTG).
Ein am meisten bevorzugter Aspekt der Erfindung ist eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin der Nuklseinsäurevektor ausgewählt ist aus der Gruppe pCR3.1, pcDNA3.1/His A, pcDNA3.1/His B, pcDNA3.1/His C und pDisplay (pD).
Ein anderer am meisten bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Nukleinsäure gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, worin der Expressionsvektor aus einer Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 9 und/oder SEQ ID Nr. 7, und einem Vektorrückgrat und regulatorischen Sequenzen besteht.
„Gene gun" ist eine ballistische System, das DNA beschichtete Mikropartikel direkt in die Haut treiben kann. Plasmid DNA wird auf Goldpartikel mit ungefähr 0,45 μm fixiert. Die Gesamtmenge von DNA pro Lage ist eine Funktion des DNA/Gold Verhältnis, d.h. 5 μg DNA/mg Gold. Wenn ungefähr 0,4 mg Goldpartikel in die Epidermis/Dermis, angetrieben durch Helium (Heliumentladungsdruck 400–450 psi), geschossen werden, werden ungefähr 2 μg DNA in die Haut inokuliert. Damit ist der fundamentale Unterschied von „Gene gun" gegenüb i.m. Injektion die Menge der DNA, die benötigt wird, um ein äquivalentes Niveau der Genexpression zu erreichen. Dieser offenbare Unterschied ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass i.m. oder i.d. Injektionen durch die Nadel die DNA auch in extrazellulären Räume platzieren, Exposition der DNA gegenüber Nukleasen in der intestitielen Flüssigkeit oder dass der hydrostatische Druck, der von der Injektion von meheren μl Saline in einen Muskel resultiert, die DNA aus Protein produzierenden Zellen heraustreibt, so dass nur eine geringe Menge der injizierten DNA als Protein exprimiert werden wird.
Interessanterweise ist die „gun" im Allgemeinen auf die geringe Menge des Plasmids begrenzt, die in einer Inokulierung verabreicht werden kann. Diese Grenze ist ungefähr bei 2.5 μg Plasmid pro Schuss. Überschreiten dieser Menge verursacht, dass die Partikel zusammen klumpen, was „Makropartikel" verursacht, die erhöhten Schaden an dem Zielgewebe verursachen. Im Gegensatz dazu können Milligram von Plasmid DNA durch i.m. Injektionen mit Nadeln verabeicht werden und der Erfolg der i.m. Injektion kann leicht durch das Anschwellen des injizierten Muskelbündels beobachtet werden. Qualitative Unterschiede bei der Immunisierung durch die „Gene gun" und i.m. Injektion können umgangen werden durch Erhöhen der Menge von DNA. Eine DNA Inokulierung durch „Gene gun" benötigt fast haarlose Haut. Somit müssen die meisten Tiere, die vakziniert werden sollen, rasiert werden.
Solche Probleme sollten durch neue Generationen von „Gene guns" überwunden werden, die auch gemäß der Erfindung eingesetzt werden können. Ein neues Gerät, das PowderJect^® System, angetrieben durch Heliumgas, ist das erste, das in der Lage ist, sowohl metallische als auch nicht metallische Partikel in Gewebe zu verabreichen. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung des PowderJect^® Systems.
Somit ist eine andere wichtige Ausführungsform der Erfindung die Verwendung von einem oder mehreren Nukeinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen, wobei der/die eine oder meherere Nukleinsäurevektor(en) und Zusammensetzung(en)

(i) auf Trägerpartikel zu schichten sind;
(ii) die beschichteten Trägerpartikel in Epidermalzellen der Pferdes in vivo zu beschleunigen sind, um eine protektive oder therapeutische Immunantwort in dem Pferd auf Exposition gegenüber EAV hin oder nach Exposition gegenüber EAV zu induzieren, wobei die Reduktion von EAV assoziierten Symptomen oder die Reduktion von horizontaler oder vertikaler Übertragung beobachtet werden kann.

Vorzugsweise sind die Trägerpartikel in der oben offenbarten Verwendung aus Gold.
Jedes der oben offenbarten Geräte wie „Gene gun" oder das PowderJect^® System kann verwendet werden. Die Injektion kann, wie oben offenbart, ausgeführt werden. Am meisten bevorzugt kann das Verfahren wiederholt ausgeführt werden. Ein geeignetes Vakzinierungsschema kann vorzugsweise an Tag 0 (Grundvakzinierung), 2 Wochen danach, 4 Wochen nach der Grundvakzinierung und 7 Wochen nach der Grundvakzinierung sein. Dies ist exemplarisch in Beispiel 2 dargestellt.
Ebenfalls bevorzugte Vakzinierungsschemata sind:

1) nur eine Grundimmunisierung ohne Booster; oder
2) Grundimmunisierung, erster Booster nach 8–12 Wochen; oder
3) Grundimmunisierung, erster Booster nacht 8–12 Wochen; zweiter Booster nach 12 Monaten.

Das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, oder eine mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung können auf jedem bekanntem Weg durch jeden bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden: vorzugsweise oral, nasal, lingual, intravenös (i.v.), intradermal (i.d.), intraepidermal (durch in die Haut Einreiben), intranasal, vaginal, subkutan (s.c.), intramuskulär (i.m.).
Gemäß der Erfindung können zahlreiche Administrationsvehikel des Vakzins, DNA Moleküls(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung oder eine mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung verwendet werden: nur Plasmid „nackt" DNA Inokulierung durch Nadel – Liposomen – Goldkügelchen – biologisch abbaubare Nanopartikel – Virus-artige Partikel (VLP) – Aerosol.
Bevorzugte Arten der Adminstration für das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, einen oder eine mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung sind: Injektion durch Nadel, „Gene gun", in Liposomen eingekapselt oder Einreiben in die Haut. Bevorzugte Dosierungen sind 0,5 μg des individuellen Nukleinsäurevektors oder bevorzugten Expressionsvektors und 10 Schüsse pro Tier, d.h. 5 μg individueller Nukleinsäurevektor (oder bevorzugter Expressionsvektor) pro Vakzinierung, z.B. wenn sieben Nukleinsäurevektoren (oder bevorzugte Expressionsvektoren) verwendet werden, 35 μg pro Vakzinierung und Tier (siehe Beispiel 2).
Bevorzugt sind 1 bis 10, bevorzuger 5 oder 7 oder 10 Schüsse pro Tier, am meisten bevorzugt sind 10 Schüsse pro Tier.
Ein bevorzugtes Verfahren der Vakzinierung ist die direkte Injektion von Plasmid DNA in Skelettmuskel. Lang andauerende Immunantwort werden in vielen Fällen ohne Boost erhalten.
Für den i.m. Weg wird DNA vorzugsweise durch eine Nadel injeziert, während für den i.e. Weg, eine „Gene gun" vorzugsweise verwendet wird (siehe oben).
Eine noch andere wichtige Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines oder mehrerer Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen, wobei die eine oder mehrere Nukleinsäurevektoren und Zusammensetzungen

(i) in muskuläre Zellen des Pferdes in vivo zu injizieren sind, um eine protektive oder therapeutische Immunantwort in dem Pferd auf Exposition gegenüber EAV hin oder nach Exposition gegenüber EAV zu induzieren, wobei die Reduktion von EAV assoziierten Symptomen oder die Reduktion von horizontaler oder vertikaler Übertragung beobachtet werden kann.

Am meisten bevorzugt kann die Verwendung wiederholt ausgeführt werden. Ein geeignetes Vakzinierungsschema kann vorzugsweise an Tag 0 (Grundvakzinierung), 2 Wochen danach, 4 Wochen nach der Grundvakzinierung und 7 Wochen nach der Grundvakzinierung sein. Dies ist exemplarisch in Beispiel 2 dargestellt.
Bevorzugte Dosierungen sind 50 μg des individuellen Nukleinsäurevektors oder bevorzugten Expressionsvektors und 4 Inokulationen pro Tier, d.h. 200 μg individueller Nukleinsäurevektor (oder bevorzugter Expressionsvektor) pro Vakzinierung, z.B. wenn sieben Nukleinsäurevektore (oder bevorzugte Expressionsvektoren) verwendet werden, 1,4 mg pro Vakzinierung und Tier (siehe Beispiel 2).
Auch bevorzugt ist eine Vakzinzusammensetzung gemäß der Erfindung, wie oben offenbart, umfasst: unterer Bereich 10–100 μg, am meisten bevorzugt 50 μg, mittlerer Bereich 101–500 μg, am meisten bevorzugt 200 μg, oberer Bereich 501 μg–2000 μg, am meisten bevorzugt 1000 μg. Wiederum kennt der Fachmann die Kriterien für die ideale Dosierung, die von dem Verabreichungsweg abhängt, d.h. mit der „gene gun" wird das Vakzin direkt in Langerhans Zellen injiziert, somit geht sehr wenig Antigen verloren, während i.m. Injektion viel höhrere Dosierungen benötigt.
Wiederum bevorzugte Vakzinierungsschemata sind:

Das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, oder eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung können auf jedem bekanntem Weg durch jeden bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden: vorzugsweise oral, intravenös (i.v.), intradermal (i.d.), intraepidermal (durch in die Haut Einreiben), intranasal, vaginal, subkutan (s.c.), intramuskulär (i.m.).
Bevorzugte Arten der Adminstration für das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, einen oder eine mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung sind: Injektion durch Nadel, „Gene gun", in Liposomen eingekapselt oder Einreiben in die Haut. Bevorzugt sind 1 bis 10, bevorzuger 3 oder 4 oder 5 Inokulierungen pro Tier, am meisten bevorzugt sind 4 Inokulierungen pro Tier.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf die Verwendung von einem oder mehreren Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen. Bevorzugt ist die Verwendung von einem oder mehreren Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines für intraepidermale, intradermale oder intramuskuläre Verabreichung für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen.
Stärker bevorzugt ist die Verwendung DNA Molekül(en) oder Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines für intraepidermale oder intradermale Verabreichung für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen, wobei das Vakzin an Tag 0 (Grundvakzinierung), 2 Wochen danach, 4 Wochen nach der Grundvakzinierung und 7 Wochen nach der Grundvakzinierung verabreicht wird. Dies ist exemplarisch in Beispiel 2 dargestellt.
Mehr bevorzugt ist die Verwendung von DNA Molekül(en) oder Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung, das geeignet für die für die Herstellung eines Vakzines für intraepidermale oder intradermale Verabreichung für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen ist, wobei das Vakzin 0,5 μg des individuellen Nukleinsäurevektors oder bevorzugten Expressionsvektors und vorzugsweise 10 Schüsse pro Tier, d.h. 5 μg individueller Nukleinsäurevektor (oder bevorzugter Expressionsvektor) pro Vakzinierung, z.B. wenn sieben Nukleinsäurevektoren (oder bevorzugte Expressionsvektoren) verwendet werden, 35 μg pro Vakzinierung und Tier (siehe Beispiel 2) umfasst.
Bevorzugt ist die Verwendung von DNA Molekül(en) oder Nukleinsäurevektor(en) gemäß der Erfindung umfassend unterer Bereich 0,05–10 μg, bevorzugt 0,1 μg–1 μg, am meisten bevorzugt 0,5 μg. Ferner bevorzugte Dosierungsbereiche sind unterer Bereich 0,1–1,0 μg, am meisten bevorzugt 0,5 μg, mittlerer Bereich 1,1–10 μg, am meisten bevorzugt 15 μg, oberer Bereich 11 μg–20 μg, am meisten bevorzugt 15 μg. Der Fachmann kennt die Kriterien für die ideale Dosierung, die von dem gewählten Verabreichungsweg abhängt, d.h. mit der „gene gun" wird das Vakzin direkt in Langerhans Zellen injiziert, somit geht sehr wenig Antigen verloren, während i.m. Injektion viel höhrere Dosierungen benötigt.
Wiederum bevorzugte Vakzinierungsschemata sind:

Das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, oder eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung können durch jeden bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden: vorzugsweise oral, nasal, lingual, intravenös (i.v.), intradermal (i.d.), intraepidermal (durch in die Haut Einreiben), intranasal, vaginal, subkutan (s.c.), intramuskulär (i.m.).
Bevorzugte Arten der Adminstration für das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, einen oder eine mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung sind: Injektion durch Nadel, „Gene gun", in Liposomen eingekapselt oder Einreiben in die Haut.
Bevorzugt sind 1 bis 10, bevorzuger 3 oder 4 oder 5 Inokulierungen pro Tier, am meisten bevorzugt sind 4 Inokulierungen pro Tier.
Bevorzugt sind 1 bis 10, bevorzuger 3 oder 4 oder 5 Verabreichungen pro Tier, am meisten bevorzugt sind 4 Verabreichungen pro Tier.
Bevorzugter ist die Verwendung von einem DNA Molekül(en) oder mehreren Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines geeignet für intraepidermale oder intradermale Verabreichung für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen, wobei das Vakzin an Tag 0 (Grundvakzinierung), 2 Wochen danach, 4 Wochen nach der Grundvakzinierung und 7 Wochen nach der Grundvakzinierung verabreicht wird. Dies ist exemplarisch in Beispiel 2 dargestellt.
Bevorzugt ist die Verwendung von einem DNA Molekül(en) oder mehreren Nukleinsäurevektor(en) oder Expressionsvektoren gemäß der Erfindung umfassend 0,05–10 μg, bevorzugt 0,1 μg–1 μg, am meisten bevorzugt 0,5 μg. Ferner bevorzugte Dosierungsbereiche sind unterer Bereich 0,1–1,0 μg, am meisten bevorzugt 0,5 μg, mittlerer Bereich 1,1–10 μg, am meisten bevorzugt 15 μg, oberer Bereich 11 μg–20 μg, am meisten bevorzugt 15 μg. Der Fachmann kennt die Kriterien für die ideale Dosierung, die von dem gewählten Verabreichungsweg abhängt.
Wiederum bevorzugte Vakzinierungsschemata sind:

Das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, oder eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung können durch jeden bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden: vorzugsweise oral, intravenös (i.v.), intradermal (i.d.), intraepidermal (durch in die Haut Einreiben), intranasal, vaginal, subkutan (s.c.), intramuskulär (i.m.). Bevorzugte Verabreichungsweisen für das Vakzins, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung oder eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung können sein: Injektion durch Nadel, „Gene gun", in Liposomen eingekapselt oder Einreiben in die Haut.
Bevorzugt sind 1 bis 10, bevorzuger 3 oder 4 oder 5 Verabreichungen pro Tier, am meisten bevorzugt sind 4 Verabreichungen pro Tier.
Auch ist noch bevorzugter die Verwendung von DNA Molekül(e) oder Nukleinsäurevektor(en) oder Expressionsvektor gemäß der oben offenbarten Erfindung für die Herstellung eines Vakzines geeignet für intramuskuläre Verabreichung für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen, wobei das Vakzin 50 μg des individuellen Nukleinsäurevektors oder bevorzugten Expressionsvektors und vorzugsweise 4 Schüsse pro Tier, d.h. 200 μg individueller Nukleinsäurevektor (oder bevorzugter Expressionsvektor) pro Vakzinierung, z.B. wenn sieben Nukleinsäurevektoren (oder bevorzugte Expressionsvektoren) verwendet werden, 1,4 mg pro Vakzinierung und Tier (siehe Beispiel 2).
Auch bevorzugt ist die Verwendung von DNA Molekül(en) oder Nukleinsäurevektor(en) oder Expressionsvektor gemäß der oben offenbarten Erfindung umfassend: unterer Bereich 10–100 μg, am meisten bevorzugt 50 μg, mittlerer Bereich 101–500 μg, am meisten bevorzugt 200 μg, oberer Bereich 501 μg–2000 μg, am meisten bevorzugt 1000 μg. Wiederum kennt der Fachmann die Kriterien für die ideale Dosierung, die von dem gewählten Verabreichungsweg abhängt, d.h. mit der „gene gun" wird das Vakzin direkt in Langerhans Zellen injiziert, somit geht sehr wenig Antigen verloren, während i.m. Injektion viel höhrere Dosierungen benötigt.
Wiederum bevorzugte Vakzinierungsschemata sind:

Das Vakzin, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung, oder eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung können durch jeden bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden: vorzugsweise oral, intravenös (i.v.), intradermal, intraepidermal (durch in die Haut Einreiben), intranasal, vaginal, subkutan (s.c.), intramuskulär (i.m.). Bevorzugte Verabreichungsweisen für das Vakzins, DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung oder eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung sind: Injektion durch Nadel, „Gene gun", in Liposomen eingekapselt oder Einreiben in die Haut. Bevorzugt sind 1 bis 10, bevorzugter 3 oder 4 oder 5 Verabreichungen pro Tier, am meisten bevorzugt sind 4 Verabreichungen pro Tier.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit aus Bestandteilen umfassend eine Vakzinzusammensetzung gemäß der oben offenbarten Erfindung oder ein oder mehrere EAV ORF DNA Molekül(e) gemäß der oben offenbarten Erfindung oder einen oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) gemäß der oben offenbarten Erfindung. Der Kit ist zum sofortigen Gebrauch für die Vakzinierung von Pferden. Der Kit kann weiter enthalten, ist aber nicht beschränkt auf, Teströhrchen, andere geeignete Container, Washreagenzien und Reaktionspuffer (die in Hinsicht auf pH und Magnesiumkonzentrationen variieren können), steriles Wasser, Liposomenpräparationen, Transfektionsreagenz wie DOTAP Liposomal (Roche) oder Lipofectin, BME (Eagle's Basismedium), Etanol, Gold, Spermidin, CaCl₂, Trägerproteine und anderen weitere dem Fachmann bekannte Verbindungen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen; aber das gleiche sollte nicht als den Umfang der hier offenbarten Erfindung einschränkend verstanden werden.
Beispiel 1 Neutralisationstests (Beispiel fällt nicht unter den Umfang der Erfindung)
MATERIALIEN UND METHODEN
Viren und Zellen
Das in dieser Studie verwendete equine Arteritisvirus (EAV) wurde freundlicherweise von Professor H. Ludwig, Berlin bereitgestellt und auf Kanichen Nieren Zellen (RK13, ATCC Nummer CCL-37) vermehrt. Die Zellkulturen wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in „Basal Medium Eagle" (BME) supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 IE/Penicillin G; 100 IE/ml Streptomycin gehalten. Medium und Serum wurden von GibcoBRL (Eggenstein, Deutschland) erworben.
Produktion von EAV spezifischen Antisera
Antiserum gegen EAV wurde in Neuseeland weißen Kaninchen induziert. Das Tier wurden subkutan mit 0,5 ml gereinigtem EAV inokuliert. Die Inokulierung wurde vier Mal wiederholt. Das expermentelle Protokol ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Sensitität der Kaninchen Antiseren wurde durch Western Blot Analyse bestimmt. Es wurde gefunden, dass das gegen EAV erzeugte Kaninchen Antiserum in der Lage ist, virales Protein spezifisch bei der Verdünnung von ungefähr 1:2000 und höher zu erkennen.
Präparation von viraler RNA
Virion RNA und Gesamt- infizierte Zell RNA wurden aus EAV infizierten RK13 Zellkulturen bei 12, 24, 36 und 48 h p.i. mit einem Guanidinium Iso-thiocyanat/Caesiumchlorid Verfahren basierend auf dem durch Glisin et al. (1974) beschriebenen Verfahren präpariert. Infizierte Zellen oder Virionen von geklärten infizierten Zellkulturüberständen wurden in einer 4.0 M Guanidiumthiocyanat (GTC) Lösung gelöst. Zelluläre DNA in der infizierten Zellpräparation wurde geschert, indem die Lösung wiederholt durch eine 23 Gauge Nadel passiert wurde. CsCl und Sarcosyl (30% wässrige Lösung) wurde zu der GTC Lösung für Endkonzentrationen von 0,15 g/ml bzw. 3,0%hinzugefügt. In Einheiten von 8 ml wurde die Präparation auf ein 3 ml 5.7 M CsCl Kissen transferiert und bei 29,000 upm in einem Beckman SW41 Rotor für 24 h bei 20°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA Pellet wurde in RNase freiem H₂O auf eine Endkonzentration von ungefähr 10 μg/ml verdünnt. Die RNA Präparationen wurden bei –20°C in 80% Ethanol enthaltend 100 mM Natrium-acetat aufbewahrt. Als eine Alternative wurde Gesamt-RNA von EAV infizierten Zellen mit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert.
Erststrang cDNA Synthese
Für jede Erststrang cDNA Synthesereaktion wurden ungefähr 0,5 μg gereinigte RNA pelletiert und in 10 μl RNase freiem H₂O enthaltend 20 U RNase Inhibitor (Takara Shuzo -Co., Ltd., Shiga, Japan) gelöst. Die Reaktion wurde in 20 μl Volumina mit Enzymen und Reagenzien des RNA LA PCR Kits Ver.1.1 (Takara Shuzo Co., Ltd., Shiga, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Die Reaktion schloss 5 mM MgCl₂, 1 mM jedes dNTPs, 10 pmol eines spezifischen reversen Oligonucleotidprimers, und 5 U AMV reverse Transcriptase XL ein. Die Reaktion wurde in einem automatisiertem Temperaturzyklierungsreakor inkubiert (Genius, Techne, Cambridge, UK) für 2 min bei 60°C gefolgt von 15 min bei 50°C. Dann wurde die Temperatur allmählich auf 42°C mit einer Gewchwindigkeit von 1°C/min gesenkt. In einem finalen Schritt wurde die Reaktion für 2 min bei 80°C inkubiert und schnell auf 4°C abgekühlt. RNase freies H₂O wurde zu den Reaktionsprodukten hinzugefügt, um ein Endvolumen von 100 μl zu erhalten. Die Erststrang cDNA Stammlösungen wurden bei –20°C aufbewahrt.
Oligonukleotide und Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Spezifische Oligonukleotide wurden mit einem Oligo 1000M DNA Synthesegerät (Beckman Instruments GmbH, München, Deutschland) synthetisiert. Die Eigenschaften der individuellen Oligonukleotidprimer werden in Tabelle 2 zusammengefasst. Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde in 100 μl Volumina mit TaKaRa LA Taq DNA Polymerase (bereitgestellt mit Reaktionspuffer, Takara Shuzo Co., Ltd., Shiga, Japan) durchgeführt. Jede Reaktion enthielt 1.5–2.5 mM MgCl₂, 12.5 nmol jedes dNTPs (Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Deutschland), 50 pmol jedes Oligonukleotidprimers, und 1 μl einer Erststrang cDNA Stammlösung (siehe oben). Ein verbessertes PCR Protokoll wurde basierend auf einer Kombination von gewöhnlichen verwendeten Heißstart und „Touch down" Prozeduren entwickelt. Kurz gesagt, wurden vor dem Zufügen der dNTP Mischung und der Polymerase die Proben für 5 Min auf 94°C vorgeheizt und schnell auf 4°C abgekühlt. Dann wurden dNTPs und DNA Polymerase bei 4°C hinzugfügt und die Reaktionsröhrichen wurden direkt auf eine vorgeheizten Temperaturzyklierungsreaktor (Genius, Techne, Cambridge, UK) bei 94°C transferiert. PCR Reaktionen wurden für 35 Zyklen unter Zyklierungsbedingungen von 94°C für 30 sec, 70–56°C für 1 min (startend bei 70°C und sich vermindernt um 0.4°C pro Zyklus), und 72°C bei 1–5 min abhängig von der Größe des erwarteten PCR Produktes inkubiert. In einem finalen Schritt wurde die Reaktionsmischung für 7 min bei 72°C inkubiert. Reaktionsprodukte wurden durch Polyacrylamid Scheibengelelektrophorese und Ethidiumbromid Färbung analysiert.
Molekulares Klonieren viraler cDNA und Präparation von Plasmid DNA
PCR Produkte, die EAV spezifischen cDNA Sequenzen repräsentierend, wurden Restriktionsendonuklease Behandlung unterworfen und Restriktionsfragmente wurden mit niedriger- Schmelzpunkt-Agarose Gelelektrophorese gereinigt. Spezifische DNA Banden wurden aus dem Gel durch eine Heiß-Phenolverfahren gefolgt von Gelfiltration extrahiert. Restringierte und gereinigte EAV cDNA wurde in einen der folgenden Expressionsvektoren inseriert: pCR3.1, pcDNA3.1, pcDNA3.1/His, pDisplay (Invitrogen). Vektorplasmide wurden mit Restriktionsendonukleasen präpariert und wie oben beschrieben aufgereinigt. Zusätzlich wurden restringierte Vektor DNA mit "calf intestine phosphatase" (CIP) dephosphoryliert. Ligation von spezifischen EAV cDNA Fragmenten mit Expressionsvektor DNA wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Rösen-Wolff et al., 1991). Die resultierenden rekombinanten Plasmidkonstrukte sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Spezifität der Reaktion wurde durch Nukleotidsequenzanalyse des Inserts und der flankierenden Vektorregionen bestätigt.
Nukleotidsequenzanalyse
PCR Produkte wurden mit 1 Vol Phenol:Chloroform (5:1) und mit 3 vol 95% Ethanol enthaltend 100 mM Natriumacetat gefällt. Die DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in bidestilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 20 ng/μl gelöst. Plasmid DNA wurde mit dem Qiagen tip100 Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Gereinigte DNA wurde mit H₂O auf eine Endkonzentration von 1 μg/μl eingestellt. Gereinigte DNA wurde automatisch mit einem 373A "Verlängert" DNA Sequenzierungsgerät mit der BigDye Terminator-Taq Zyklussequenzierungstechnik (Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland) sequenziert. Jede Sequenzierungsreaktion wurde in einem Volumen von 20 μl enthaltend 100 ng eines PCR Produktes oder 0.5 μg von Plasmid DNA, 50 pmol des Sequenzierungsprimers, und 5 μl der BigDye Terminator Reaktionsmischung durchgeführt. Die Zyklussequenzierungsreaktion wurde für 28 Zyklen in einem automatischen Temperaturzyklierungsreaktor (GeneE, Techne, Cambridge, UK) unter Zyklierungsbedingungen von 96°C für 30 sec und 60°C für 4 min pro Zyklus inkubiert. Die Proben wurden für die Elektrophorese wie durch den Hersteller beschrieben präpariert. Die Elektrophorese der Proben wurden auf einem 36 Nocken 48 cm WTR („well to read", gut zu lese) Polyacrylamidgel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen, erhalten von individuellen Sequenzierungsreaktionen wurden mit der Sequence Navigator Software zusammengefügt (Version 2.1, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland). Nukleotid- und Aminosäuresequenze wurden mit gegenwärtigen GenBank, EMBL, und SwissProt Datenbanksequenzeinträgen mittels des BLAST Dienstes des National Center for Biotechnology Information verglichen (National Library of Medicine, Bethesda, MD, USA). Physico chemische Eigenschaften der Protein wurden bestimmt und konservierte Sequenzmotive wurden mit den PHYSCHEM und PROSITS Programmen enthalten in der PC/Gene Software (Ausgabe 6.85, A. Bairoch, University von Genf, Schweiz) identifiziert. Das ClustalX Programm (Version 1.64b) (Thompson et at., 1997) wurde verwendet um multiple Sequenzalignments zu erzeugen.
Präperation von viraler RNA und Northernblotanalyse
Zelluläre Gesamt RNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion mit dem Guanidinium/Caesiumchlorid Verfahren, wie zuvor beschrieben, isoliert (Rösen-Wolff et al., 1988, 1989; Rösen-Wolff und Darai, 1991). Die Northernblotanalyse dieser RNAs wurde mit Formaldehyd Agarosegelelektrophorese (1%) durchgeführt, wie am anderen Ort beschrieben (Rösen-Wolff et al., 1988, 1989; Rösen-Wolff und Darai, 1991).
DNA Vakzinierung von Tieren
Das immunogene Potential der EAV Translationseinheiten wurden in vivo mit BALB/C Mäusen untersucht, an die DNA der konstruierten Expressionvektoren, enthaltend und exprimerend die cDNA der individuellen ORFs von EAV, verabreicht wurde. Die BALB/c Mäsue wurden mit ungefähr 100 μg/DNA verdünnt in 100 μl PBS injiziert. Die DNA wurde subkutan und in den Tibialis cranialis Muskel (Musculus gastrocnemius) und mit einer 27 Gauge Nadel injiziert. Die Mäuse wurden 3 bis 5 Mal mit den gleichen Mengen von DNA und unter den gleichen Bedingungen in ungefähr 2 Wochen Intervallen geboostet. Kontrollmäuse erhielten über einen identischen Weg bei identischer Häufigkeit die gleiche Menge an parentalen Expressionsvektoren.
Neutralisationtests
Neutralisationstests wurden ausgeführt, indem EAV spezifische Maus- oder Kaninchensera mit PBS (1:2 bis 1:1024) in einer Falcon Mikrotiterplatte verdünnt wurden. Serumverdünnungen (50 μl) wurden mit 100 TCID₅₀ von EAV (50 μl) gemischt. Die Serum-Virus Mischung wurde in einer 5% CO₂-Luftatmosphäre bei 37°C für 2 h inkubiert. Danach wurden 5 × 10³ RK13 Zellen in Suspension zu jeder Probe der Serum-Virus Mischung hinzugegeben. Nach 12 h wurden die infizierten Kulturen mit BME enthaltend 10% FCS und 0.5% Carboxymethylzellulose überschichtet. Dann wurden die Kulturen für 3–4 Tage bei 37°C in einer 5% CO₂ Luftatmosphäre inkubiert. Titer der infektiösen Enheiten wurden nach Färbung mit 1% Kristallviolett bestimmt.
Immunoblotanalyse
Konfluente Monolager von Zellen wurden durch Abschaben der Zellen von der Kulturschale, den Petrischalen und/oder Flaschen, nachdem sie drei Mal mit PBS gewaschen wurden (pH 7.2) geerntet. Das finale Zellpellet wurde in distilliertem Wasser resuspendiert. Die Proteinkonzentration wurden mit dem Standartverfahren gemessen (Bradford, 1976). Proben wurden in einem gleichen Volumen von Lysispuffer (0.01 M Tris HCl, 10% Glycerol, 2% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 0.1% (w/v) Bromophenolblau, pH 8) gelöst, für fünf Minuten bei 95°C erhitzt, und SDS-PAGE gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970) unterzogen. Proteine, die von infizierten und transfizierten Zellen stammten, wie auch rekombinantes N Protein wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosefilter elektrogeblottet mit Halbtrocken-Elektroblottkammern (Renner, Dannstadt, Deutschland). Die Transfereffizienz wurde mit Ponceau Färbung (Sigma, München, Deutschland) überprüft. Filter wurden für 1 h geblockt und mit einer 1:1000 und 1:2000 Verdünnung der oben erwähnten Kaninchantisera inkubiert. Mit Alkalischer Phosphatase konjugierte Antikörper (Anti-Kaniniche oder Maus Ig-AP, Boehringer Mannheim, Deutschland) wurden verwendet, um Interaktion des Kaninchen- oder Maus-Antiserums mit EAV Protein zu detektieren.
Immunfluoreszenzassay
Der indirekte Immunofluoreszenzassay wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Welzel et al., 1998). Kurz gesagt wurden RK13 Zelllinien auf Gewebekammerobjekträger gesäht (Nunc Inc., Naperville, USA). Die Monolager Zellkultur wurde mit EAV bei der MOI von 2 PFU/Zellen infiziert und 48 h nach Infektion wurden die Zellen mit Aceton-Methanol fixiert und die Objekträger wurden bei –20°C aufbewahrt. Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugiertes Anti-Kaninchen oder Maus IgG F(ab')2 fragment Immunoglobulin (Boehringer, Mannheim, FRG) wurde als zweiter Antikörper verwendet. Zusätzlich wurde Rhodamin B-isothiocyanat (Merck, Darmstadt, Deutschland) verwendet bei einer Endkonzentration von 10 ng/μl zum Gegenfärben der Zellen, zusammen mit dem Zweiten Antikörper.
Enzyme gebundener Immunosorptionsassay (ELISA)
Polysorp F8 Microtiterplatten (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) wurden mit 50 μl EAV Protein ((EAV) + Wirt (RK13)) bei einer Konzentration von 2 μg × ml^–1 in PBS (+ 0.05% N₃Na) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet gefolgt von drei Waschzyklen mit H₂O und dann mit 300 μl Blockingpuffer (0.017 M Na₂B₄O₇ × 10 H₂O, 0.12 M Na Cl, 0.05% Tween 20, 1 mM EDTA, 5% BSA, 0.05% NaN₃) für 3 h bei 28°C gefolgt von drei Waschzyklen mit H₂O. Für den Assay wurden die folgenden Reagentien nacheinander verwendet: Kaninchen Anti EAV Serum bei einer reziproken Verdünnung von bis zu 16000 oder Maus Anti EAV Serum bei einer reziproken Verdünnung von bis zu 800. Die Verdünnungen wurden in Probenpuffer POD vorgenommen (DADE Behring, Marburg, Deutschland). Nach drei Waschzyklen mit 300 μl/Nocke wurde jeweils Meerretich-Peroxidase markiert mit Kaninchen Anti IgG zweitem Antikörper oder Meerretich-Peroxidase markiert mit Maus Anti IgG zweitem Antikörper (Boehringer, Mannheim, Deutschland) bei einer vorbestimmten optimalen Verdünnung von 1:3000 jeweils hinzugefügt. Die Verdünnungen wurden in Blockierungspuffer hergestellt. Inkubationsschritte wurden für 1 h bei 28°C durchgeführt, jeweils gefolgt von drei Waschzyklen mit 300 μl/Nocke Waschpuffer (DADE Behring, Marburg, Deutschland). Die Farbe wurden entwickelt durch Zugabe von 200 μl/Nocke frisch bereitetem Puffer/Substrat TMB und Chromogen TMB (10:1) (DADE Behring, Marburg, Deutschland). Der Assay wurde nach 30 Min durch Zugabe von 50 μl/Nocke Stoplösung POD gestoppt und gemäß Standartverfahren bei 450 nm auf einem automatischem ELISA Lesegerät gelesen (MR5000, DYNATECH, Denkendorf, Deutschland).
Lymphocytenaktivierungsassay
Ein Lymphozytenaktivierungsassay für die eventuelle Verwendung der zellulären Antwort der immunisierten Mäuse wurde etabliert.
BALB/c Maus, weibliche, Anti-Maus CD3ε (500A2, PharMingen, Kat. Nr. 01511D), anti-Maus CD69 (H1.2F3, PharMingen, Kat. Nr. 01505B), Geys Puffer (140 mM NH₄Cl, 2.7 mM KCl, 6.5 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 0.7 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂), FACS Puffer (PBS, 2% FCS, 0.01% NaN3), Polystyrol Rundbodenröhrchen (Falcon, Becton Dickinson, Kat. Nr. 2052), und sechs Nockenplatten (TPP, Kat. Nr. 9206) wurden verwendet. Die Messung der Proben wurde mit FACScan (Becton Dickinson) und fünf messbaren Parametern durchgeführt: drei Hochleistungs sekundäre Potomultiplikatoren mit Bandpassfilter: 530 nm für Fluoreszein-isothiocyanat (FITC), 585 nm für Phycoerythrin (PE) und 650 nm (rote Fluoreszenz), Vor- und Seitenstreuung.
Eine Maus wurde getötet, die MHz entfernt und die Milz wurde in ein steriles Röhrchen mit 1 × BME Medium transferiert. Die Milz wurden durch einen sterilen Homogenisierer für die intakte Milzzellentrennung passiert. Der Homogenisierer wurde mit 1 × BME Medium gewaschen. Die Lösung wurde für 3 Min mit 1500 upm zentrifigiert. Das Pellet in 1,5 ml Geys Puffer gelöst. Danach wird die Lösung für 3 Min mit 1500 upm zentrifugiert. Das Pellet wurde in 9 ml BME Medium mit 10% FCS gelöst. Eine 6 Nockenplatte wurde mit 1 ml 1 × BME Medium mit 10% FCS gefüllt, in 3 Nocken der Platte wurden zusätzlichen 1 μg/ml anti-Maus CD3ε hinzugefügt. 1,5 ml Zelllösung wurde zu jeder Nocke hinzugefügt. Die 6 Nocken Platte wurde bei 37°C, 5% CO₂ für drei Tage inkubiert. Lösung mit aktivierten und nicht aktivierten Zellen wurden in vier Polystyrol Rundbodenröhrchen aufgeteilt. Die Röhrchen wurden mit FACS Puffer gefüllt und für 3 Min bei 1500 upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in zwei von vier Röhrchen mit 100 μl anti-Maus CD3ε (1:100 verdünnt in FACS Puffer) resuspendiert und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Für Doppelfluoreszenz wurden die Zellen für 3 Min bei 1500 upm zentrifugiert, das Pellet wurde in 100 μl anti-Maus CD69 (1:100 verdünnt in FACS Puffer) resupendiert und für 30 Minuten bei 4°C wieder inkubiert. Die Zellen wurden für 3 Min zentrifugiert, bei 1500 upm, das Pellet wurden in 2 ml FACS Puffer resuspendiert, wieder für 3 Min bei 1500 upm zentrifugiert und jeweils in 500 μl FACS Puffer resuspendiert, gevortext und im FACSscan gemessen.
Computer-unterstützte Sequenzanalyse
Nukleotidsequenzen wurden mit der ABI Sequenz navigator software version 1.2 zusammengefügt. Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wurden mit dem PC/GENE Programm Ausgabe 6.85 (Intelligenetics Inc. Mountain View, California, U.S.A.) und dem OMIGA Programm Ausgabe 11.3 (Oxford Molecular Group Ltd., Oxford, UK) analysiert.
ERGEBNISSE
Etablierung eines Zellkultursystems zur Virusvermehrung, Isolierung von Viruspartikeln und Extraktion von viraler RNA
Dier in dieser Studie verwendete equine Arteritisvirus (EAV) wurde auf Kaninchennierenzellen (RK-13) gezogen und vermehrt. Virionen von EAV wurden präpariert, gereinigt und die virale RNA wurde extrahiert.
Erzeugung von spezifischen Kaninchen Antisera gegen das gesamte Virus
Um spezifisch virale Genprodukte durch serologische Assays zu detektieren, wurde ein polyklonales Hymperimmun Kaninchen-Antiserum gegen komplete EAV Virion-Komponenten in Neuseeland weißen Kaninchen erzeugt. Das Protokoll des Immunisierungsexperiments wird in Tabelle 1 gegeben. Der Titer des Antiserums lag bei > 1:2000, wie durch Western Blot Analyse bestimmt wurde.
Erzeugung von Kaninchen Antisera gegen synthetische Polypeptide
Die biophysikalische Analyse des Nucleocapsidproteins (ORF 7) von EAV zeigt an, dass eine starke antigene Domäne innerhalb der ersten 38 Aminosäuren des ORF 7 Genprodukts lokalisiert war. Um das immunogene Potential des N-Terminus des viralen Nucleocapsidproteins zu untersuchen, wurde ein synthetisches Polypeptid korrespondierend zu den Aminosäureresten 1–38 synthetisiert und mit einem „keyhole limpet hemocyanine" (KLH) verbunden und verwendet, polyklonales monospecifisches Antiserum in Kaninchen zu erzeugen. Es wurde gefunden, dass das Antiserum spezifsche EAV Genprodukte im Western Blotassay bei einer Verdünnung von 1:200 detektiert.
Amplifikation von vitalen Genen durch RT-PCR und molekulares Klonieren von vitalen Genen in Expressionsvektoren
Das EAV Genom besteht aus ungefähr 12.287 Nukleotiden mit einem kurzen 3' Poly(A) Schwanz. Für molekulares Klonieren des vitalen Genoms wurden spezifische Oligonukleotide synthetisiert (Tabelle 2) und gereinigte virale RNA wurde in 3'-RACE Experimenten verwendet, um eine cDNA Bank aus der genomischen RNA zu erzeugen, cDNA von vitalen mRNA Transkripten einschließend. Die amplifizierten cDNA Fragmente schließen die vitalen offenen Leserahmen (ORFs) 2b bis 7 ein, die das kleine Glycoprotein, nicht strukturelle Proteine, großes Glycoprotein, Membranprotein, bzw. Nucleokapsidprotein kodieren (Tabelle 3). Die vitalen Gene wurden molekular in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert (pCR3.1, pDisplay, und pcDNA3.1/His A, B, C; Invitrogen). Die Identität der cDNA der individuellen viralen ORFs wurde durch Nukleotidsequenzanalyse bestätigt. Die Eigenschaften der konstruierten Säugerexpressionsvektoren, die EAV spezifische cDNA der individuellen viralen Translationseinheiten umfassen und exprimieren sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Als ein zusätzliches Ziel für die Entwicklung von effizienten EAV DNA Vakzinen in Zukunft wird es erwogen, Expressionsvektoren, die überlappenden oder Volllängen virale cDNA umfassen und exprimieren, zu konstruieren. Eine Expressionsbibliothek von klonierter hoch Molekulargewichtsviraler cDNA wurden konstruiert, die das gesamt vital Genom überspannt. Mit optimierten lang Bereichs RT-PCR Protokollen wurde eine Anzahl von überlappenden viralen cDNA Fragmenten erzeugt, die von 2,000 bis über 8,500 bp reichen. Die Identitäten der RT-PCR Produkte wurden durch Nukleotidsequenz Analyse bestätigt. Diese Bibliothek ist essentiell, um Volllängen cDNA Klone zu etablieren, die die Gesamtheit der vitalen Antigene, falls notwendig, simultan in vivo und in vitro exprimieren. Die Eigenschaften der individuellen RT-PCR Produkte sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit verschiedenen Vektorkonstrukten und Evaluierung der korrespondierenden Immunantwort
DNA Vakzinierung von Mäusen mit einem Vektorkonstrukt, das virale ORFs 5 und 7 exprimiert
Balb/c Mäuse wurden als ein Modellsystem für die Evaluierung der Immunantwort gegen individuelle Genprodukte von EAV, die durch Verabreichung von rekombinanter Plasmid DNA verwendet. Die Fähigkeit der Expressionsvektoren, die EAV ORF5 und ORF7 umfassen und exprimieren, die das virale Nucleokapsidprotein und das virale Haupt-Glycoprotein kodieren, in dem Maussystem eine Immunantwort zu induzieren, wurde untersucht. Die Tiere wurden subkutan und intramuskulär für fünf Mal mit 100 μg der jeweiligen DNA in 14 Tage Intervallen inokuliert.
Analyse der individuellen Maussera offenbarte, dass die verabreichten DNAs der Vektoren, die beide virale Genprodukte expremieren, in der Lage sind, eine signifikante Immunantwort in Mäusen zu induzieren, wie durch Neutralisationstest (NT) getestet wurde. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 5 zusammengefasst und in 3 für ORF 5 gezeigt. Eine signifikante Immunantwort wurde detektiert, wenn die Tiere mit den rekombinanten Plasmiden pCR3.1-EAV-07-BX-C3 und pCR3.1-EAV-OS-C14 immunisiert wurden, die die ORFs 7 und 6 umfassen, die für das virale Nucleokapsidprotein bzw. das große Hüllglycoprotein (GL) kodieren. Wie in Tabelle 5 gezeigt wurde gefunden, dass die rekombinanten Plasmide pCR3.1-EAV-O7-BX-C3 in der Lage sind, Antikörper gegen EAV in Mäusen zu erzeugen (80% Immunantwort), wie durch Neutralisationstest detektiert wurde. Ähnliche Ergebnisse (50–70% Immunantwort) wurden in zwei unabhängigen Experimenten erhalten, wenn die Tiere mit den rekombinanten Plasmiden pCR3.1-EAV-O5-BX-C14 inokuliert wurden (Tabelle 5 und 3A und B).
In dem nächsten Schritt dieser Untersuchung wurde den Tieren die DNA der rekombinante Plasmide pCR3.1-EAV-O7-BX-C3 und pCR3.1-EAV-O5-C14 simultan unter den gleichen oben beschriebenen Bedingungen verabreicht. Die Ergebnisse dieser Studie, die in Übereinstimmung mit den korrespondierenden Ergebnissen sind, die aus der Analyse der Genprodukte der EAV ORFs 7 und 5 erhalten wurden (Tabelle 5 und 3), sind in Tabelle 5 zusammengefasst und 4 gezeigt. Dieser Daten zeigen an, dass die native DNA von rekombinanten pCR3.1-EAV-07-BX-C3 (enthaltend ORF 7) und pCR3.1-EAV-O5-C14 (enthaltend ORF 5) in der Lage ist, die korrespondierenden Genprodukte in vivo zu exprimieren (virales Nucleocapsidprotein und großes Hüllglycoprotein (GL)).
Die Ergebnisse dieser Studien unterstreichen eindeutig, dass die Genprodukte der EAV ORFs 7 und 5 geeignete Kandidaten für die Entwicklung eines DNA Vakzins sind, das vor einer EAV Infektion schützt.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit einem Vektorkonstrukt, das virale ORFs 5, 7, und IL-2 exprimiert.
Um zu bestimmen, ob oder ob nicht IL-2 in der Lage ist, das immunogene Potential des Genprodukts der EAV ORFs 5 und 7 durch DNA Vakzinierung zu verstärken, wurden die folgende Experimente durchgeführt. Ein Expressionsvektor (pWS2ms) enthaltend die murine IL-2-Expressionskassette (freudlicherweise durch Dr. W. Schmidt, Intercell, Wien bereitgestellt) wurde mit zwei neu konstruierten rekombinanten Plasmiden pDP-EAV-O7-BgS-C2 und pDP-EAV-05-C, die EAV ORFs 7 und 5 umfassen und exprimieren, ko-inokuliert, die das virale Nucleocapsidprotein bzw. Hüllglycoprotein (GL) kodieren. Die Konstruktion dieser Expressionsvektoren basierte auf dem pDisplay System, das pCR3.1 ähnlich ist. Dieses System erlaubt zusätzlich die Zelloberflächenexpression von inserierten Epitopen durch Fusion an ein N-terminales Signalpeptid und eine C-terminale Transmembrandomäne. Balb/c Mäuse wurden subkutan und intramuskulär vier Mal mit 100 μg jedes Vektorkonstrukts in 14 Tage Intervallen inokuliert. Unter den verwendeten Bedingungen war eine verstärkte EAV spezifische Immunantwort in Mäusen detektierbar, wie in Tabelle 5 gezeigt.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit einem Vektorkonstrukt, das virale ORFs 5 und 6 exprimiert
Das EAV besteht aus einem unglycolysierten Membranprotein (M, 17 kDa, Genprodukt von ORF 6). Es war von besonderem Interesse, zu beweisen, ob oder ob nicht dieses virale Genprodukt eventuell das immunogene Potential der Genprodukte von EAV ORF 5 in vivo beinflussen und/oder verstärken kann. Ein rekombinantes Plasmid pCR3.1-EAV-06-BE-C3 wurde konstruiert, in dem die Translationeinheit des EAV ORF 6 in die korrespondierende Stelle des Expressionsvektors pCR3.1 inseriert wurde. Balb/c Mäuse wurden mit den rekombinanten Plasmiden pCR3.1-EAV-06-BE-C3 und pCR3.1-EAV-O5-C14 unter den oben beschriebenen Bedingungen inokuliert. Die von den Balb/c Mäusen (Prä- und Post-DNA-Vakzinierung) erhaltenen Seren wurden mit Neutralisationstests analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 bereitgestellt und in 6 gezeigt. Ein signifikant verstärktes Potential des Genprodukts des EAV-ORF 6 auf die funktionalen Aktivitäten des viralen großen Hüllglycoprotein (Genprodukt von EAV ORF 5) wurde in vivo nicht beobachtet.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit einem Vektorkonstrukt, das ORFs 3 und 4 exprimiert
Obwohl die funktionale Aktivität der Genprodukte der zwei EAV ORFs 3 und 4 nicht bekannt ist, wurde die eventuelle Aktivität dieser viralen Protein in vivo untersucht. Zwei rekombinante Plasmide pCR3.1-EAV-03-BX-C1 und pCR3.1-EAV-O4-BX-C3 wurden konstruiert (Tabelle 3), in denen die cDNA der EAV ORFs 3 und 4 in die korrespondierende Stelle des Expressionsvektors pCR3.1 inseriert wurde. Die von den Balb/c Mäusen (Prä- und Post-DNA-Vakzinierung), die mit diesen rekombinanten Plasmiden inokuliert wurde, erhaltenen Seren wurden mit Neutralisationstests analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 bereitgestellt und in 7 und 8 für die Genprodukte von EAV ORFs 3 und 4 gezeigt. Keine neutralisierenden Antikörper wurden in den immunisierten Balb/c Mäusen unter den verwendeten Bedingungen detektiert.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit einem Vektorkonstrukt, das die EAV N-terminale hydrophile Ectodomäne des großen Hüllglycoproteins (G_L) exprimiert
Balasuriya und Mitabeiter (1995) fanden, dass die Neutralisationsdeterminanten von EAV auf dem Genprodukt von ORF 5 (großes Hüllglycoprotein) innerhalb der N-terminalen Ectodomäne (Aminosäurepositionen 1–121; Balasuriya et al., 1997) lokalisiert sind. Entsprechend wurde ein neuer Expressionsvektor basierend auf dem pcDNA3.1/His System konstruiert. Dieser Vektor ist pCR3.1 ähnlich, erlaubt aber die spezifische Detektion und Aufreinigung der exprimierten Fusionsproteine mit N-terminalen Aminosäuresequenztags. Die Strategie dieses Experimentes ist in 2 gezeigt. Ein rekombinantes Plasmid wurde konstruiert und pC31-HIS-EAV-O5-del-121 genannt. Das Insert dieses Expressionsvektors besitzt die kodierende Region von EAV ORF 5, die den Aminosäuren 1–121 des viralen großem Hüllglycoproteins entspricht, die in die korrespondierenden Stellen des Ausgangsvektors pcDNA3.1-HIS-C (Tabelle 5 und 2) inseriert wurde. Balb/c Mäuse wurden mit rekombinantem Plasmid pC31-HIS-EAV-05-del-121 unter den oben beschriebenen Bedingungen inokuliert. Die von den Balb/c Mäusen (Prä- und Post-DNA- Vakzinierung) erhaltenen Seren wurden mit Neutralisationstests analysiert. Wie in Tabelle 5 und 9 gezeigt, wurde gefunden, dass die Mehrzahl der DNA vakzinierten Tiere (90%) einen signifikant neutralisierenden Antikörper gegen EAV entwickelten.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit Vektorkonstrukten, die vitale Membran- und Glycoproteine in Kombination mit IL-2 Genexpression exprimieren
Wie oben beschrieben, ist es gezeigt worden, dass das vitale N-glycosilierte Haupt-Membranprotein (G_L), das N-glycolisierte Neben-Membranprotein (G_S, 25 kDa) und unglycolisiete Membranprotein (M, 17 kDa) in der Lage sind, eine signifikante Immunantwort in vivo zu entwickeln, wie durch DNA Vakzinierung von Balb/c Mäusen detektiert wurde. Weiterhin ist die Verstärkerfunktion der IL-2 Genpexpression während DNA-Vakzinierung bekannt. Jedoch ist eine intermolekulare Interaktion dieser Proteine während Genexpression in vivo, z.B. Durch DNA Vakzinierung bislang nicht bekannt. Daher war es von besonderer Wichtigkeit zu beweisen, ob oder ob nicht diese Proteine in der Lage sind, eine adäquate Immunantwort durch simultane Expression in vivo zu induzieren. Vier rekombinante Plasmide pCR3.1-EAV-06-BE-C4, pCR3.1-EAV-O2-BX-C5, pC3.1-EAV-O5-BX-C14 und pWS2ms wurden verwendet. Diese Vektorkonstrukte sind in der Lage, virales Membranprotein, Glycoproteine Gs, GL bzw. Mäuse Interleukin 2 zu exprimieren. Balb/c Mäuse wurden mit einer DNA Mischung inokuliert, die die vier rekombinanten Plasmide unter den oben beschriebenen Standartbedingungen enthält. Die von den Balb/c Mäusen (Prä- und Post-DNA-Vakzinierung) erhaltenen Seren wurden mit Neutralisationstests analysiert und die korrespondierenden Daten sind in Tabelle 5 zusammengefasst und in 10 gezeigt. Unter den in diesem Experiment verwendeten Bedingungen entwickelten 90% der DNA vakzinierten Mäuse eine signifikante Immunantwort gegen EAV.
DNA Vakzinierung von Mäusen mit Vektorkonstrukten, die vitales kleines Glycoprotein und das Geprodukt von ORF 4 exprimieren
Die Fähigkeit des EAV kleinen Glycoproteins (Genprodukt von ORF2b) und Genprodukts von ORF4 ein Immunantwort in vivo zu entwickeln, wurde durch DNA Vakzinierung von Balb/c Mäusen untersucht. Zwei rekomninante Plasmide pCR3.1-EAV-O2-BX-C5 und pCR3.1-EAV-O4-BX-C3 wurden verwendet. Diese Vektrokonstrukte sind in der Lage, vitales kleines Glycoprotein G_S bzw. das Genprodukt von EAV ORF 4 zu exprimieren. Balb/c Mäuse wurden mit einer DNA Mischung, die die zwei rekombinanten Plasmide unter den oben beschriebenen Standartbedingungen enthält, inokuliert. Die von den Balb/c Mäusen (Prä- und Post-DNA-Vakzinierung) erhaltenen Seren wurden mit Neutralisationstests analysiert. Wie in 11 und Tabelle 5 gezeigt, wurde gefunden, dass ungefähr 50% der DNA vakzinierten Tiere NT-Titer gegen EAV entwickelten.
Logistik für die DNA Vakzinierung von Pferden
Zusätzlich zu dem Ziel unserer Studien war es notwendig ein neues Screeningsystem zur Dektion von humoraler und zellulärer Immunantwort in vakzinierten Pferden zu entwickeln. Ein Enzym gebundener Immunosorptionsassay (ELISA) und ein Lymphocytenaktivierungsassay wurden, wie oben im Abschnitt Material und Method beschrieben, etabliert. Weiterhin war es notwendig, einen leicht nutzbaren Kit zur Vakzinierung von Pferden mit den konstruierten Expressionsvektoren herzustellen, die die viralen Genprodukte von ORFs 2b bis 7 umfassen und exprimieren.
Entwicklung eines neuen Enzym gebundenen Immunosorptionsassays
Polysorp F8 Microtiterplatten wurden mit Protein von EAV infizierten RK13 Zellen bei einer Konzentration von 2 μg × ml^–1 beschichtet. In diesem System können Antikörper gegen EAV (Kaninchen-, Maus- und Pferdeserum, usw.) detektiert werden. Meerretich-Peroxidase markierte Kaninchen Anti-IgG oder Meerretich-Peroxidase markierte Maus Anti-IgG dienten als zweite Antikörper. Die Farbe wurde durch Zugabe von Puffer/Substrat TMB und Chromogen TMB entwickelt und die Adsorption gemäß Standartverfahren bei 450 nm auf einem automatischem ELISA Lesegerät bestimmt (für Details siehe Abschnitt Material und Methoden). Bin Beispiel der Ergebnisse dieser Analyse ist in 12 gezeigt. Die für den ELISA hergestellten Antigene können für die Durchführung von ungefähr 20,000 ELISA Assays verwendet werden.
Entwicklung eines Lymphocytenaktivierungsassays
Ein Lymphozytenaktivierungsassay für die eventuelle Verwendung der zellulären Antwort der immunisierten Mäuse wurde etabliert. BALB/c Maus, weibliche, Anti-Maus CD3ε (500A2, PharMingen, Kat. Nr. 01511D), anti-Maus CD69 (H1.2F3, PharMingen, Kat. Nr. 01505B), Geys Puffer (140 mM NH₄Cl, 2.7 mM KCl, 6.5 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 0.7 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂), FACS Puffer (PBS, 2% FCS, 0.01% NaN3), Polystyrol Rundbodenröhrchen (Falcon, Becton Dickinson, Kat. Nr. 2052), und sechs Nockenplatten (TPP, Kat. Nr. 9206) wurden verwendet. Die Messung der Proben wurde mit FACScan (Becton Dickinson) und mit fünf messbaren Parametern durchgeführt: drei Hochleistungs sekundäre Potomultiplikatoren mit Bandpassfilter: 530 nm für Fluoreszein-isothiocyanat (FITC), 585 nm für Phycoerythrin (PE) und 650 nm (rote Fluoreszenz), Vor- und Seitenstreuung.

Eine Maus wurde getötet, die MHz entfernt und die Milz wurde in ein steriles Röhrchen mit 1 × BME Medium transferiert. Danach die Lösung wurde für 3 Min mit 1500 upm zentrifigiert. Das Pellet in 1,5 ml Geys Puffer gelöst. Danach wird die Lösung für 3 Min mit 1500 upm zentrifugiert. Das Pellet wurde in 9 ml BME Medium mit 10% FCS gelöst. Eine 6 Nockenplatte wurdem 1 ml 1 × BME Medium mit 10% FCS gefüllt, in 3 Nocken der Platte wurden zusätzlichen 1 μg/ml anti-Maus CD3ε hinzugefügt. 1,5 ml Zelllösung wurde zu jeder Nocke hinzugefügt. Die 6 Nocken Platte wurde bei 37°C, 5% CO₂ für drei Tage inkubiert. Lösung mit aktivierten und nicht aktivierten Zellen wurde in vier Polystyrol Rundbodenröhrchen jeweils aufgeteilt. Die Röhrchen wurden mit FACS Puffer gefüllt und für 3 Min bei 1500 upm zentrifugiert. Der Überstand wurden verworfen und das Pellet wurde in zwei von vier Röhrchen mit 100 μl anti-Maus CD3ε (1:100 verdünnt in FACS Puffer) resuspendiert und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Für Doppelfluoreszenz wurden die Zellen für 3 Min bei 1500 upm zentrifugiert, das Pellet wurde in 100 μl anti-Maus CD69 (1:100 verdünnt in FACS Puffer) resupendiert und für 30 Minuten bei 4°C wieder inkubiert. Die Zellen wurden für 3 Min, bei 1500 upm zentrifugiert, das Pellet wurde in 2 ml FACS Puffer resuspendiert, wieder für 3 Min bei 1500 upm zentrifugiert und jeweils in 500 μl FACS Puffer resuspendiert, gevortext und im FACSscan gemessen. Tabelle 1: Ein Beispiel eines experimentellen Protokolls, das für die Produktion von polyklonalen Antikörpern gegen equines Arteritisvirus in Neuseeland weißen Kanininchen verwendet wird

Datum	Behandlung
09.06.1998	Präimmun-Serum
	10 × 620 μl
10.06.1998	1^te Inokulierung*
	0.5 ml/s.c.
24.06.1998	2^te Inokulierung*
	0.5 ml/s.c.
08.07.1998	3^te Inokulierung*
	0.5 ml/s.c.
22.07.1998	4^te Inokulierung*
	0.5 ml/s.c.
	Erste Blutung (10 ml)
	Titer durch Immunoblotanalyse = 1:200
30.07.1998	5^te Inokulierung*
	0.5 ml/s.c.
11.08.1998	Erste Blutung (30 × 1.5 ml)
	Titer durch Immunoblotanalyse = > 1:2000

Virus: Equines Arteritis Virus: Virion in 0.5 ml PBS, gereinigt durch Saccharose Gradientenzentrifugation
Tier: Neuseeland weißes Kaninchen (ca 2 kg/Weibchen)

* ORF1: ORF 1a: 208–5391, ORF 1b: 5388–9734 Nukleotide
** ORF2-7: 9807–12628 Nukleotide

Experiment (Nr. der Tiere)	Expressionsvektor (ORF/Gen-Produkt)	Mittelwert des NT-AB^a Titers Minimum/ Maximum		% of Immunantwort^b
		PIS	PVS
MV-00-01(10)	pCR3.1	<1:10	<1:10	0
07/27/1998 bis
10/19/1998
MV-07-01(10)	pCR3.1-EAV-07-BX-C3 (ORF	<1:10/1:10	1:20/1:640	80
07/27/1998 bis	7/Nukleocapsidprotein =NP)
10/19/1998
MV-05-01(10)	pCR3.1-EAV-05-BX-C14 (ORF	<1:10	1:10/1:160	70
08/29/1998 bis	5/großes Hüll-Glycoprotein = G_L)
11/11/1998
MV-05-02(10)	pCR3.1b-EAV-05-BX-C14 (ORF	<1:10	1:10/1:160	50
12/07/1998 bis	5/G_L)
03/20/1999
MV-57-01(10)	pCR3.1-EAV-O5-BX-C14 (ORF	<1:10	1:10/1:80	30/70^c
09/11/1998 bis	7/NP) pCR3.1-EAV-07-BX-C3 (ORF
11/23/1999	5/GL)
MV-57IL2-1	pDP-EAV-05-BgS-C1 (ORF 7/NP)	<1:10/1:10	1:10/1:80	40/80^c
(10) 10/26/1998	pDP-EAV-07-BgS-C2 (ORF 5/G_L)
bis 01/25/1999	pWS2ms (IL2)
MV-56-01(10)	pCR3.1-EAV-05-BX-C14 (ORF 7/NP)	<1:10	1:10/1:80	20/70^c
12/07/1998 bis	PCR3.1-EAV-06-BE-C4 (ORF
02/08/1999	6/Membranprotein)
MV-03-01(10)	pCR3.1-EAV-03-BX-C1 (ORF 3/?)	<1:10	<1:10/1:10	0
12/21/1998 bis
03/22/1999
MV-04-01(10)	pCR3.1-EAV-04-BX-C3 (ORF4/?)	<1:10	<1:10/1:20	0
12/22/1998 bis
03/22/1999
MV-05d-01(10)	pC3.1-HIS-EAV-05-del-121	<1:10	1:20/1:160	90/100^c
12/29/1998 bis	(Aminoterminus von großem Hüll-
03/22/1999	Glycprotein; die ersten 121
	Aminosäuren)
MV 256IL2-1	pCR3.1-EAV-O2-BX-C5 (ORF	<1:10/1:10	1:10/1:80	70/90^c
02/12/1999 bis	2b/kleines Glycoprotein) pCR3.1-
04/07/1999	EAV-O5-BX-C14 (ORF 5/G_L)
	pCR3.1-EAV-O6-BE-C4 (ORF
	6/Membranprotein) pWS2ms (IL2
	Gen)
Mv-99/5(10)	pCR3.1-EAV-O2-BX-C5 (ORF	<1:10/1:10	<1:10/1:80	40/50^c
o5/14/1999 bis	2b/kleines Glycoprotein) pCR3.1-
07/09/1999	EAV-O4-BX-C3 (ORF4/?)

a Neutralisierende Antikörper
^b Neutralisierender Titer 1:20 ausgeschlossen
^c Neutralisierender Titer 1:20 eingeschlossen
PIS: Präimmun Serum; PVS: Postvakzinierungsserum
^? Protein unbekannter Funktion

Beispiel 2 DNA Vakzinierung von Pferden
Präparation eines DNA Vakzinkits zur Applikation in Pferden
Ein leicht zu benutzender Kit für die Vakzinierung von Pferden, der die individuellen konstruierten rekombinanten Plasmide (10 mg DNA) beinhaltet, die die viralen Genprodukte von ORFs 2b bis 7 exprimierten, wurden präpariert. Die Eigenschaften des DNA Vakzinierungskits sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Um die Möglichkeit der Expression von EAV cDNA von ORFs 2b und 5 bis 7 in dem autologen Tiersystem Pferd zu beweisen, war es notwendig, die Pferdeseren vor dem Immunisierungsversuch zu screenen. Die Auswahl der geeigneten Tiere basierte auf den aus der Analyse der Pferdeseren erhaltenen Ergebnisse. Diese Studien erlaubten es, das Vorliegen einer vorherigen natürlich vorkommenden EAV Injektion in den Pferden zu detekieren. Fünf Seren wurden von Prof. Dr. H.
Müller (Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig) erhalten. Die Pferdeseren wurden durch Neutralisationsassasy und ELISA, wie oben beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse dieser Exprimente für die aus Leipzig erhaltenen Seren sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass drei Pferde aus Tierhöfen von Leipzig keine spezifischen Antikörper gegen eine EAV Infektion entwickelten. Konsequenterweise scheint es rational zu sein, dass die Tiere von dem letzteren Hof für die Evaluierung eines EAV DNA Vakzin in seinem natürlichen Wirt in Betracht gezogen werden können.
Präparation von autologen Hautfibroblasten
Zwei Hautbiopsien wurden von jeder der fünf an der Studie beteiligten Pferde genommen. (Daggy, Frieda, Friedrich, Jessy, Nelke). Hautproben wurden in (5–8) Scheibchen geschnitten und in Zellkulturflaschen angebracht. Nach einer 30 min Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden die Hautproben in „Dulbecco's modified eagles medium" (DMEM) enthaltend 1% fötales Käberserum (FCS), Antibiotika und Antimycotica kultiviert. Fibroblasten, die aus den Hauptproben auswuchsen, wurden zwei Mal passagiert und auf 2 × 10⁷ Zellen vermehrt. Von jedem Pferd wurden Zellen in flüssigem Sticktstoff (N₂) in Aliquots enthaltend mindestens 2 × 10⁶ Zellen gefroren. Zahlreiche Aliquts wurden aufgetaut und in DMEM enthaltend 10% FCS und Antibiotika kultiviert, um die Kompetenz dieser Zellen für weiteres Wachstum zu verifizieren. Zellen wurden mehr als 20 Mal passagiert. Für Trans fektionsexperimente erwiesen sich Zellen der Passage 15 und darüber als nicht geeignet.
Aufreinigung von Plasmid DNA
Plasmide wurden von Boehringer Ingelheim erhalten (pCR3.1-EAV-02-BX-C3, pCR3.1-EAV-05-BX-C14 und pCR3.1-EAV-07-BX-C3 genannt). Nach Selektion von Amipicillin resistenten E.coli K12 Kolonien, wurden Baktierienkulturen enthaltend die verschiedenen Plasmide im großen Maßstab angezogen. Von jedem Plasmid wurden 500 μl DNA bei einer Konzentration von 1.5 μg/μl isoliert und bei –20°C für die Transfektionsexperimente aufbewahrt.
Transfektionsexperimente
Transfektionsexperimente wurden anfangs in 12 und 24 Nockenplatten durchgeführt. Titrationsexperimente in den 24 Nockenplattenformat mit Zellzahlen zwischen 15 × 10⁴ und 3 × 10⁵ pro Nocke zeigten, dass 1.25 × 10⁵ in jede Nocke gesähte Zellen innerhalb von 24 Stunden fast konfluent (85%) waren.
a) Lipofektion als Transfektionsreagenzien
Titrationsexperimente, die in einem 24 Nockenplatte Format mit 5–20 μl/Nocke Lipofectin durchgeführt wurden, zeigten, dass Mengen > 15 μl für die Zellen toxisch waren. Titrationsexperimente mit verschiedenen Mengen (5–80 μg/Nocke) DNA mit 12.5 μl Lipofectin zeigten, dass Konzentrationen von 80 μg DNA die höchsten Transfektionseffizienzen zeigten. Jedoch überstieg in diesen Transfektionsexperimenten die Effizienz nicht 10%.
b) LipofectAMINE als Transfektionsreagenz
Um die Transfektionseffizienz zu erhöhen wurden Transfektionsexperimente mit zusätzlichen Transfektionsreagenzien durchgeführt (LipofectAMINE, LipofectAMINE plus, DMRIE). Verglichen mit den Ergebnissen der Transfektionsexperimente mit Lipofectin resultierte DMRIE nicht in einer höheren Anzahl von transfizierten Zellen. LipofectAMINE erwiese sich als toxischer für die Zellen, aber die Transfektionseffizienzen waren höher. Die Empfehlung des Herstellers, zusätzlich zu LipofectAMINE das „Plus" Reagenz zu verwenden, erhöhte nicht die Transfektionrate. Daher scheint LipofectAMINE das Reagenz der Wahl zu sein, um die kultivierten primären Pferdehautfibroblasten zu transfizieren.
In den ersten Experimenten mit 7.5 μl LipofectAMINE und 5 μg DNA wurden ungefähr 15% der Targetzellen transfiziert. Gegenwärtig werden Transfektionsexperimente durchgeführt, um weiter die Transfektionseffizienz zu erhöhen. Insofern ist die Transfektionsrate ungefähr 20%.
Isolierung von peripheren Blutlymphocyten
Drei Wochen und ein Tag vor der ersten Immunisierung wurden 50 ml heparinisiertes Blut von jedem Pferde durch Punktierung der Jugularvene gesammelt. Das Blut wurde bei 400 × g für 5 min zentrifugiert und das Plasma entfernt. Blutzellen (10 ml) wurden mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) auf ein Volumen von 25 ml resuspendiert, auf einen Ficoll Hypaque Grandienten (15 ml) geschichtet und bei 400 x-g für 30 min zentrifugiert. Die PBMC wuden von der Interphase gesammelt, zwei mal in PBS gewaschen, gezählt und in Aliquots in N₂ in 10% DMSO und 90% FCS eingefroren. Um die Viabilität der PBMC zu testen, wurden Zellen aufgetaut, in Isocove's „modified Eagles medium" (IMEM) enthaltend 10% FCS und Antibiotika kultiviert. PBMC wurden für zwei Tage mit 2.5 μg/ml Pokeweed Mitogen stimuliert und danach in der Gegenwart von 200 U humanem rekombinantem IL-2 kultiviert. PBMCs zeigten eine gute Proliferation, wurden bis auf 2 × 10⁶ Zellen/ml gezogen und wieder als Aliquots in N₂ eingefroren.
Detektion von EAV spezifischen Antikörpern
Serum wurde 4 Monate, drei Wochen und einen Tag vor der ersten Immunisierung gesammelt. Serum des ersten Zeitpunktes wurde an dem Institut für medizinische Virologie (Prof. Darai) in Heidelberg auf das Vorhandensein von EAV spezifischen Antikörpern untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
Immunisierung der Pferde
Alle fünf Pferde wurden durch intramuskuläre (i.m.) Injektion und intradermale Applikation der EAV Plasmid DNA kodierend für (Teile von) ORF 2b ORF 5, und ORF 7 mit einer „gene gun" immunisiert. Die i.m. Inokulationen wurden an die Musculi semimembranosus/semitendinosus/gluteus verabreicht. Die „Gene gun" Applikation der DNA wurde auf beiden Seiten des Nackens durchgeführt. Die entsprechenden Teile der Haut (40cm²) wurden vorher rasiert, um eine gut DNA Applikation mit der „Gene gun" zu ermöglichen. Ein detailliertes Protokoll der DNA Immunisierung (einschließlich der Sedierung der Pferde, Menge an DNA, Adjuvantien, Puffern) wird in Beispiel 4 bereitgestellt. Die Pferde wurden 24 und 48 h nach Immunisierung auf lokale und systemische Reaktionen untersucht. Keines der Tiere entwickelte Fieber und die lokalen Reaktionen (Dicke der Haut, Entwicklung und Beteiligung von Papeln) werden in Tabellen 12 und 13 zusammengefasst.
Sammlung von Blut- und Serumproben
Periphere Blutlymphocyten, Serum und Plasma der Pferde wurden, wie in Tabelle 12 umrissen, genommen. Bislang wurden Blut- und Serumproben drei Mal nach der dritten Boosterimmunisierung genommen, um die Kinetiken der Antikörpertiter und Aktivitäten von zytotoxischen T-Lymphocyten zu messen.
Bestimmung der maximalen zellulären ⁵¹Cr-Aufnahme
Titrationsexperimente wurden mit (i) konstanten Mengen von ⁵¹Cr bei verschiedenen Zellkonzentrationen und Inkubationszeiten und (ii) konstanten Inkubationszeiten bei verschiedenen Zellkonzentrationen und Mengen von ⁵¹Cr durchgeführt.
Targetzellen (5 × 10³, 2 × 10⁴, und 5 × 10⁴) wurden mit 100 μCi für jeweils 90 min., 150 min. und 240 min markiert. Die zelluläre ⁵¹Cr-Aufnahme wie auch in dem Kulturüberstand vorliegendes ⁵¹Cr wurden bestimmt. In den Überständen der markierten Kulturen wurde ein linearer Anstieg des ⁵¹Cr gemessen (14a). Die Menge von zellulärem ⁵¹Cr erhöhte sich auch mit längeren Inkubationszeiten und höheren Zellzahlen.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn diese Experimente mit konstanten Inkubationszeiten bei verschieden Zellkonzentrationen und Mengen von ⁵¹Cr durchgeführt wurden (14a). Die Subtraktion des in den Zellen vorhandenen ⁵¹Cr und des ⁵¹Cr, das in der Überstand freigesetzt wurde, wird in 14 b gezeigt. Für die Messung der cytotoxischen T-Lymphocytenaktivitäten in dem Blut der immunisierten Pferde wurde entschieden, 5 × 10⁴ Targetzellen mit 200 μCi für 240 min zu markieren.
Messung der zytotoxischen T-Lymphocytenaktivitäten nach der zweiten und ditten Boosterimmunisierung
Die Präparation der Targetzellen einschließlich der Transfektion und der ⁵¹Cr Markierung wurde wie im Detail in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Isolierung der peripheren Blutlymphocyten, die Zellkultur in vitro wie auch die Restimulierung der Effektorzellen wurde auch so durchgeführt, wie in Beispiel 3 umrissen.
Wie oben beschrieben, markierten wir 5 × 10⁴ Zellen mit 200 μCi für 240 min. Um spontane Freisetzung von ⁵¹Cr zu vermeiden, wurden die Targetzellen auf Eis für 45 min nach dem ersten Waschschritt gehalten. Die Effektorzellen wurden zu den Kulturen unter Verwendung eines Effektor/Targetzell Verhältnis von 3:1, 25:1 und 50:1 zugegeben. Nach Inkubation für 8 h bei 37°C und 5% CO₂ wurden die Kulturschalen bei 1000 upm für 3 min zentrifugiert und jeder Überstand wurde auf das Vorliegen von ⁵¹Cr in einer Szintilliationsmessung gemessen. Negativkontrollen Kulturüberstände bestanden aus markierten Zellen ohne Zugabe von Effektorzellen (spontane ⁵¹Cr Freisetzung der Zellen). Positivkontrollen Kulturüberstände bestanden aus Kulturen von markierten Zellen nach Zelllyse mit 10% Triton X-100 (maximale ⁵¹Cr Aufnahme durch die Zellen). Die Ergebnisse der ⁵¹Cr Freisetzung der individuellen Kulturen einschließlich der Effektorzellen vor der Immunisierung, zwei Wochen nach der zweiten und zwei Wochen nach der dritten Boosterimmunisierung (siehe Tabelle 11) sind als Tabelle 18 hier eingeschlossen. 15a)–15e) zeigen die berechnete spezifischen Lyse ≥ 0 gemäß Hammond SA, Issel CJ und Montelaro RC (1998): General method for the detection and in vitro expansion of equine cytolytic T lymphocytes. J Immunol Method 213: 73–85.
Die Datenblätter enthaltend die ⁵¹Cr Freisetzung der individuellen Kulturen (Tabelle 18) zeigen die relativ kleine Standartabweichungen zwischen den vier individuell gehandhabten Kulturen jeder Probe. Verglichen mit den früheren zytotoxischen T-Zellassays, die mit Zellen nach der ersten Immunsierung und der ersten Boosterimmunisierung durchgeführt wurden (siehe Beispiel 3), sind die Unterschiede zwischen den Negativkontrollen Kulturüberstanden (spontane ⁵¹Cr Freisetzung der Zellen) und den Positivkontrollen Kulturüberstanden (maximale ⁵¹Cr Aufnahme durch die Zellen) in dem gegenwärtigen Assay größer. Im Allgemeinen maß e höhere Prozentigkeiten der berechneten spezifischen Lyse (15). In den Kulturen enthaltende Effektorzellen erhalten vor der Immunisierung, maßen wir jedoch relativ hohe Prozentwerte von spezifischer Lyse, Es würde erwartet werden, dass es höhere Mengen von an die Überstände freigesetztes ⁵¹Cr enthält, wenn höheren Mengen an Effektorzellen zu den Targets hinzu gegeben werden. Die in den Überständen der Kulturen mit Effektor-/Targetzell Verhältnissen von 3:1, 25:1 und 50:1 gemessenen Werte, zeigten jedoch keine Konsistenz in Hinsicht auf spezifische Lyse. Möglicherweise ist die Menge an Antigen exprimierenden Targetzellen (ungefähr 20%) nicht hoch genug, um die Messung der spezifischen Lyse zu ermöglichen. Um die Zahl der Antigen positiven Zellen zu vergrößern, verwendeten wird in den gegenwärtigen Experimenten 5 × 10⁴ Targetzellen. Andere mögliche Gründe für die Inkonsistenz der spezifischen Lyse sind nicht effiziente Restimulierungen der Effektorzellen in vitro oder andere unbekannte methodische Details.
Zusammenfassung der gemessenen zytotoxischen T-Lymphocytenaktivitäten
Wegen der Inkonsistenz der gemessenen spezifischen Lyse ist es schwierig Schlüsse bezüglich des Antigens(e) zu ziehen, das am besten für die Induktion von zytotoxischen T-Lymphocyten geeignet ist. In einem Versuch einen Überblick über die gemessene spezifische Lyse zu geben, berechneten wir für jedes ORF die Durchschnittswert (X) der spezifischen Lyse bei allen verschiedenen Effektor-/Targetzell Verhältnissen (3:1, 25:1, 50:1) und zogen den Durchschnittswert (Y) der Negativkontrollen ab (Ergebnisse der Zellen vor der Immunisierung), die ähnlich berechnet werden.
Die Ergebnisse zeigen den absoluten Anstieg der Zelllyse in Prozent zu den angegebenen Zeitpunkten für jedes ORF verglichen mit den Werten, die vor der Immunisierung erhalten wurden. Zwei verschiedene Maßstäbe wurden verwendet, um den Anstieg der spezifischen Lyse auszudrücken. In Beispiel 5, Tabelle 19, wird der zwischen 0 und 5% gemessenen Lyse ein a + (Plus) gegeben. In Beispiel 5, Tabelle 20, wird der zwischen 0 und 5% gemessenen Lyse ein a – (Minus) gegeben. Pferd Daggy war serologisch positiv vor der Immunisierung. Dies erklärt die gemessene spezifische Lyse schon zwei Wochen nach der ersten Immunisierung. Pferd „Frieda" hat eine schwache Antikörperantwort vor der ersten Immunisierung. Zytotoxische T-Lymphocyten, gerichtet gegen das Expressionsprodukt von ORF2b und 7, wurde auch in dem Blut dieses Tieres zwei Wochen nach der ersten Immunisierung gemessen. Die serologisch negativen Tiere „Nelke" und „Friedrich" entwickelten keine zytotoxischen T-Lymphocyten nach der ersten Immunisierung.

Nur in Pferd „Jessy", serologisch auch negativ vor der Immunisierung, wurden zytotoxische T-Lymphocyten gerichtet gegen das Expressionprodukt von ORF 7 gemessen. Bedauerlicherweise war die spezifische Lyse nicht konsistent an den folgenden Zeitpunkten. Nach der dritten Boosterimmunisierung wurde spezifische Lyse (> 10%) bei allen Tieren gemessen. Die Aktivität der zytotoxischen T-Lymphocyten war in Pferden „Frieda" und „Jessy" gegen das Expressionsprodukt von ORF 5 gerichtet, in Pferden „Daggy" und „Friedrich" gegen das Expressionsprodukt von ORF 7 gerichtet, und in Pferd „Nelke" gegen das Expressionsprodukt von ORF 7 gerichtet. Tabelle 6: Inhalt eines Kits, der für die DNA Vakzinierung von Pferden unter Verwendung von Expressionsvektoren hergestellt wurde, die individuelle Gene von equinem Arteritisvirus umfassen und exprimieren.

Expressionsvektoren	Konzentration der Plasmid- DNA μg/μl	Gesamt-DNA mg
pCR3.1-EAV-02-BX-C5	1	10
Genprodukt: kleines Glycoprotein
pCR3.1-EAV-03-BX-C1	1	10
Genprodukt: unbekannt
pCR3.1-EAV-04-BX-C3	1	10
Genprodukt: unbekannt,
pCR3.1-EAV-O5-BX-C14	1	10
Genprodukt: großes Hüllglycoprotein
pCR3.1-EAV-06-BE-C4	1	10
Genprodukt: Membranprotein
pCR3.1-EAV-07-BX-C3	1	10
Genprodukt: Nucleocapsidprotein
pDP-EAV-05-BgS-C1	1	10
Genprodukt: großes Hüllglycoprotein
pDP-EAV-07-BgS-C2	1	10
Genprodukt: Nucleocapsidprotein,
pC3.1-HIS-EAV-O5del-121-C12Gene	1	10
Produkt: Die N-terminale (121aa) hydrophile
Ectodomäne vom großen Hüllglycoprotein
GD-HD-07-12-1999

Tabelle: 7: Test von EAV spezifischen Antikörpern im Präimmun-Serum Die Ergebnisse von Neutralisationstest (NT) und ELISA Test, in denen die Präimmun-Sera von 5 Pferden aus Leipzig auf das Vorliegen einer humoralen Immunantwort gescreent wurden, die sich während einer natürlichen Infektion mit Wildtyp equinem Arteritisvirus (EAV) entwicklt wurde

Pferd	Titer des Serums NT^a	Titer des Serums ELISA	Anmerkungen
Daggi	1:40	1:100	positiv
Frieda	1:20	1:50	an der Grenze
Friedrich	1:10	<1:50
Jessy	1:10	<1:50
Nelke	1:10	<1:50
Positiv	1:160^b		positiv
Kontroll-Serum	1:80^c	1:200^c	positiv

^a Multiplizität der Infektion (MOI): 100 PFU von EAV/1000 RK-13 3 Zellen/Nocke
^b Gegen EAV erzeugtes Kaninchenantiserum
^c Pferdeserum wurde von Prof. Dr. Ludwig, Berlin, bezogen

Pferd	Prä-Vakzin	1.Post-	2.Post-	3.Post-	4. Post-	5. Post-	6. Post-
	Serum	Vakzin	Vakzin	Vakzin	Vakzin	Vakzin	Vakzin
	22.5.2000	Serum	Serum	Serum	Serum	Serum	Serum
	NT-Titer:	5.6.2000	28.7.2000	22.9.2000	19.1.2001	16.3.2001	11.5.2001
		NT-Titer:	NT-Titer:	NT-Titer:	NT-Titer:	NT-Titer:	NT-Titer:
Daggy	1:64	1:256	1:256	1:264	1:128	1:96	1:16
Frieda	<1:2	1:256	1:256	1:264	1:64	1:32	1:16
Friedrich	<1:2	1:64	1:128	1:512	1:48	1:32	1:8
Jessy	<1:2	1:256	1:128	1:128	1:16	1:16	1:8
Nelke	1:8	1:256	1:256	1:128	1:16	1:16	1:16

Pferd	1. Basisimmunisierung:	1. Booster	2. Booster	3. Booster
	23.Mai 2000	6.Juni 2000	21.Juni 2000	14.Juli 2000
Daggy	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m
Frieda	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m
Friedrich	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400	35 μg GG + 1400	35 μg GG + 1400

Immunisierungsschema mit den cDNA EAV ORFs 2b, 5 und 7 und mit cDNA, die für equines IL 2 kodiert. Kombinierte Anwendung von cDNA (in μg) via Gene Gun (GG) und intramuskulärer Injektion (i.m.)

Pferd	1. Basisimmunisierung:	1. Booster	2. Booster	3. Booster
	23. Mai 2000	6. Juni 2000 μg i.m	21. Juni 2000 μg i.m	14. Juli 2000 μg i.m
Jessy	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m
Nelke	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m	35 μg GG + 1400 μg i.m

Tabelle 10: Alter der Pferde

Pferde	Alter (Jahre)	Anti-EAV Antikörper*
Daggi	22	++
Frieda	16	?
Jessy	16	–
Friedrich	10	–
Nelke	6	–

* vor der Immunisierung (10/99)

	DNA	Sammlung der	Isolierung von
	Applikation	Plasmaproben	PBMC*
Prä	n.d.	02.03.00	02.03.00
immunisierung
Prä	n.d.	23.03.00	23.03.00
immunisierung
Prä	n.d.	22.05.00	22.05.00
immunisierung
Immunisation	23.05.00	05.06.00	05.06.00
1. Booster	06.06.00	20.06.00	20.06.00
2. Booster	21.06.00	13.07.00	13.07.00
3. Booster	14.07.00	28.07.00	28.07.00
	n.d.	25.08.00	25.08.00
	n.d.	22.09.00	22.09.00

* periphere mononukleäre Blutzellen
n.d.: nicht vorgenommen

	Daggy			Frieda			Nelke	Friedrich	Jessy
Anzahl der	le: 6			le: 4			le: 2	le: 5	le: 6
Papeln	ri: 6			ri: 6			ri: 1	ri: 5	ri: 6
Beschreibung d	er le: stark			le: stark			le: moderat	le: nicht zu	le: mild bis
Papeln	geschwollen,			geschwollen,			geschwollen,	mild	moderat
	Epidermis löst			Epidermis löst			Str.c. normal	geschwollen,	geschwollen,
	sich ab			sich stark ab				Str.c. normal	Str.c. schuppig
	ri: stark			ri: moderat			ri: siehe links	ri: moderat	ri: mild
	geschwollen, 1			geschwollen,				geschwollen,	geschwollen,
	Papel ohne			Str.c. schwach				Str.c. normal	Str.c. schuppig
	Epidermis			abgelöst
Hautdicke	le:	ri:	le:	ri:	le:	ri:	le:	ri:	le:	ri:
i) normal	0.25 cm	0.30 cm	0.30 cm	0.30 cm	0.20 cm	0.20 cm	0.30 cm	0.35 cm	0.40 cm	0.40 cm
ii) Papeln	0.60 cm	0.60 cm	0.60 cm	0.60 cm	0.45 cm	0.40 cm	0.40 cm	0.40 cm	0.60 cm	0.60 cm
Durchmesser	le: 1.1–1.2cm			le: 0.8–1.0cm			le: 0.6-0.8cm	le: 1.0–1.1cm	le: 0.5–0.6 cm
	ri: 1.0 cm			ri: 0.7–0.8cm			ri: 0.7 cm	ri: 0.9–1.2 cm	ri: 0.5 cm 1
									Papel: 1.0 cm
Eigenschaften				Auf beiden			Sehr dünne	1 Papel: Str.c.	1 Papel mit
				Seiten:			Haut, le: 2	mild geschwollen,	Ablösung,
				Mückenbisse			weiße Kreise	verstopft und	starken Ödema
				mit				Falten der Haut	und Pruritus
				allergischen
				Ödemen

Le: linke Seite des Nackens; ri: rechte Seite des Nackens; Str.c.: Stratum corneum;
* Immunisierungsdatum: 23/05/2000; Protokollierungstag der Hautreaktion: 24/05/2000

	Daggy			Frieda			Nelke	Friedrich	Jessy
Anzahl der	le: 6			le: 4			le: 2	le: 5	le: 6
Papeln
	ri: 6			ri: 6			ri: 1	ri: 5	ri: 6
Beschreibung	le: stark			le: stark			le: moderat	le: nicht zu	le: mild bis
der Papeln	geschwollen,			geschwollen,			geschwollen,	mild	moderat
	Epidermis löst sich			Epidermis			Str.c. normal	geschwollen,	geschwollen,
	ab			löst sich stark				Str.c. normal	Str.c.
				ab					schuppig
	ri: stark			ri: moderat			ri: siehe links	ri: moderat	ri: mild
	geschwollen, 1			geschwollen,				geschwollen,	geschwollen,
	Papel ohne			Str.c.				Str.c. normal	Str.c.
	Epidermis			schwach					schuppig
				abgelöst
Skin thickness	le:	ri:	le:	ri:	le:	ri:	le:	ri:	le:	ri:
i) normal	0.25 cm	0.30 cm	0.30 cm	0.30 cm	0.20 cm	0.20 cm	0.30 cm	0.35 cm	0.40 cm	0.40 cm
ii) Papeln	0.70 cm	0.60 cm	0.50–0.60cm	0.45 cm	0.45 cm	0.40 cm	0.40 cm	0.40 cm	0.60 cm	0.60 cm
Durchmesser	le: 1.1–1.2 cm			le: 0.8–1.0 cm			le: 0.6–0.8 cm	le: 1.0–-1.1 cm	le: 0.5
	ri: 1.0 cm			ri: 0.7–0.8 cm			ri: 0.7 cm	ri: 0.9–1.2 cm	ri: 0.9–1.2 cm
Eigenschaften				Auf beiden			Sehr dünne	1 Papel: Str.c.	1 Papel mit
				Seiten:			Haut, le: 2 weiße	mild	Ablösung,
				Mückenbisse			Kreise	geschwollen,	starken Ödema
				mit allergischen				verstopft und	und Pruritus
				Ödemen				Falten der Haut

Beispiel 3 Zytotoxischer T-Lymphocyt (CTL) Assay
1. Immunisierung von Pferden
1.1. DNA Applikation und beobachtete Hautreaktionen

Die Pferde (Daggy, Frieda, Friedrich, Jessy, Nelke) wurden gemäß dem Immuniserungsschema (Tabelle 14) durch intramuskuläre (i.m.) Injektion und intradermale Applikation der EAV ORF 2b ORF 5, und ORF 7 Expressionsplasmide immunisiert. Die i.m. Inokulationen wurden an die Musculi semimembranosus/semitendinosus/gluteus verabreicht. Die „Gene gun" Applikationen der DNA wurden auf beiden Seiten des Nackens durchgeführt. Die entsprechenden Teile der Haut (40 cm²) wurden vorher rasiert, um eine optimale DNA Applikation mit der „Gene gun" zu ermöglichen. Die Pferde wurden 24 h nach den DNA Applikationen auf systemische und lokale Reaktionen untersucht. Keines der Tiere entwickelte Fieber oder lokale Reaktionen wie Verdickung der Haut, Entwicklung und Beteiligung von Papeln. Protokolle sind in Tabellen 12 und 13 enthalten (siehe oben). Photographien der involvierten Hautbereiche wurden 24 h nach DNA Applikation aufgenommen. Tabelle 14. Probensammlung und Immunisierungsschema

	DNA Applikation	Sammlung der Plasmaproben	Isolierung von PBMC*
Prä-Immunisierung	n.d.	02.03.00	02.03.00
Prä-Immunisierung	n.d.	23.03.00	23.03.00
Prä-Immunisierung	n.d.	22.05.00	22.05.00
Immunisation	23.05.00	05.06.00	05.06.00
1. Booster	06.06.00	20.06.00	20.06.00
2. Booster	21.06.00	13.07.00	13.07.00
3. Booster	14.07.00	28.07.00	28.07.00

* Periphere mononukleäre Blutzellen
n.d.: nicht vorgenommen

1.2 Detektion von EAV-spezfischen Antikörpern
Serum und Plasmaproben der immunisierten Tiere wurden zwei/drei Wochen nach den DNA Applikationen genommen, wie in Tabelle 14 dargestellt.
2. Präparation von Targetzellen
2.1. Transfektionsexperimenten in T25 Zellkulturflaschen
Hautfibroblasten (1.43 × 10⁶ Zellen) wurden bei 37°C und 5% CO₂ in T25 (25 cm) Zellkulturflaschen mit „Dulbecco's modified Eagles medium" (DMEM) enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) und Antibiotika inkubiert. Zellen wurden mit 100 μg DNA eines „Green Fluorescent Protein" (GFP) Expressionsplasmides in 1,3 ml Optimem^® (Gibco) durch die Zugabe von 87,5 μl LipofectAMINE^® (Gibco) transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und bei einer Konzentration von 5 × 10³ bis 5 × 10⁴ Zellen pro Nocke in 96 Nocken Platten ausgesäht. Ungefähr 20% der Zellen waren anch 24 h Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ transfiziert, wie durch Immunofluoreszenz bestimmt wurde.
2.2. Titrationsexperimente mit polyklonalem EAV spezifischen Kaninchenserum (11.08.98)
Verozellen (10⁴) wurden in jede Nocke einer 96 Nocken Platte gesät und über Nacht wachsen gelasen (üN) in DMEM Kulturmedium enthaltend 10% FCS und Antibiotika bei 37° und 5% CO₂.
Die Monolager wurden danach mit einer 1:100 oder 1:1000 verdünnter auf Verozellen vermehrten EAV Stammlösung (Institut für Virologie, Universität Leipzig) infiziert. Die ersten EAV spezifschen zytopathischen Wirkungen (CPE) wurden 36 h nach Infektion beobachtet und die Kulturen wurden sofort für 30 min mit Ethanol bei 4°C fixiert. Die 96 Nocken Platte wurde mit Ethanol bei –70°C aufbewahrt.
Für immunhistochemische Detektion von viralen Antigenen in infizierten Zellen wurden die Kulturen für 5 min mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (RT) gespült.
Um endogene Peroxidasen zu blocken wurden die Kulturen für 5 min mit 7.5% H₂O₂ in Methanol inkubiert. Zellen wurden mit PBS gespült und für 1 h mit Serumverdünnungen inkubiert (polyklonales EAV spezifisches Kaninschenserum vom 11.8.98, Präimmun [Kaninchen #98/8] vom 10.06.98, die von 1:100 und 1:200 bis zu 1:16000 in 0.05% Tween 20-PBS reichten). Kulturen wurden zweimal mit 0.05% Tween 20-PBS und einmal mit destilliertem Wasser gespült und für 1 h mit bioinyliertem Antikaninchen Antikörper bei 37°C inkubiert, der 1:750 verdünnt war. Zellen wurden wie zuvor mit Tween 20-PBS und destilliertem Wasser gespült und für 30 min bei 37°C mit Streptavidin-Peroxidase (1:500 in Tween 20-PBS) inkubiert. Die Kulturen wurden wieder gespült und das Substrat AEC (14,25 ml Na-Acetat Puffer 0.75 μl ABC, 75 μl H₂O₂ 1:10 verdünnt in destilliertem Waser) wurde hinzu gegeben. Selbst bei der höchsten Antikörperverdünnung (1:1600) waren klar positive Reaktionen sichtbar.
2.3. Transfektion von Hautfibroblasten mit EAV spezifischen Expressionsplasmiden
Transfektionsexperimente wurden in ähnlicher Weise durchgeführt wie in dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll mit dem 24 Nocken Platte Format. Immunohistochemischen Analyse mit dem polyklonalen EAV spezifischen Kaninnchenantisierum (11.08.98), verdünnt in 1:800 in 0.05% Tween 20-PBS, zeigte, das ungefähr 20% der Zellen mit den EAV ORF-2b, EAV ORF-5 und EAV ORF-7 Expressionsplasmiden transfiziert waren.
2.4. Kultivieren der Targetzellen vor dem CTL Assay
Hautfibroblasten der Pferde wurden in „Iscove's modified Eagles medium" (IMEM) enthaltend 10% FCS und Antibiotika kultiviert. Die Kulturen wurden auf drei T25 Zellkulturflaschen ausgedehnt und, wenn sie zu 80–90% konfluent waren, mit jeweils 100 μg der EAV ORF-2b, EAV ORF-5 und EAV ORF-7 Expressionplasmide transfiziert. Nach 24 h wurden die Kulturen mit Trypsin behandelt, die Zellen wurden gezählt und in Suspension mit ⁵¹Cr markiert.
3. Präparation von Effektorzellen
3.1. Inaktivierung von EAV mit ¹³⁷Cs γ-Strahlen
Um Antigen für die Restimulierung von EAV spezifischen Effektorzellen zu erhalten, wurden Verozellen mit EAV bei einer Infektionsmultiplizität (moi) von 1 infiziert. Nach 36 h wurden die Zellkulturen zwei Mal gefroren/aufgetaut und die Kulturen wurden für 5 min bei 1750 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Zentrifugation üN bei 19.000 upm pelletiert. Das Pellet wurden in 3 ml PBS resuspendiert und die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein Assay^® (Pierce) gemessen. Aliquots der Proben enthaltend 2 mg/ml wurden bei –70°C aufbewahrt. Proben wurden auf Trockeneis ¹³⁷Cs γ-Strahlen im Bereich von 15 Gy bis zu 1 k Gy exponiert. Virustitration mit Verozellen zeigte, dass der infektiöse Titer nur um < log1 vermindert war, sogar nach Exposition gegenüber 1 k Gy.
3.2. Inaktivierung von EAV mit ultraviolettem Licht
Da EAV nicht durch ¹³⁷Cs γ-Strahlen inaktiviert werden konnte, wurden die Proben gegenüber ultravioletter Strahlung (254 nm) bei einem Abstand von 5 cm für 5 min bis 80 min exponiert. Virustitration auf Verozellen zeigte, dass kein infektiöses Virus nach einer 5 min Exposition detektiert werden konnte. Um EAV in den Proben vollständig zu inaktivieren, die für die Restimulierung der Effektorzellen verwendet werden, wurden diese Proben für 30 min exponiert und Aliquots enthaltend 2 mg Protein pro ml wurden bei –70°C aufbewahrt.
3.3. Kultivierung von Effektorzellen vor dem CTL Assay
PBMC wurden in IMEM enthaltend 10% FCS und Antibiotika kultiviert. Nach Stimulierung für zwei Tage mit 2.5 μg/ml Pookweed Mitogen wurden die Zellen für zwei Tage in der Gegenwart von 200 U humanem IL-2 kultiviert (Amersham-Pharmacia). EAV spezifische zytotoxische T-Zellen wurden für vier Tage mit 30 μg/ml inaktiviertem EAV in der Gegenwart von 100 U IL-2 restimuliert. Danach wurden die Kulturen für vier Tage in der Gegenwart von 200 U IL-2 vermehrt. Zellen wurden gezählt und in dem CTL Assay verwendet.
4. Messung von EAV spezifischen T-Zellen
4.1. ⁵¹Cr-Markierung von Targetzellen
Nach Trypsinbehandlung wurden die transfizierten Zellen in 1,5 ml resuspendiert und für 2 h mit 100 μCi ⁵¹Cr/10⁷ Zellen markiert. Zellen wurden drei Mal mit Kulturmedium gewaschen und 7.7 × 10³ Zellen wurden in jede Nocke einer 96 U-Bodenzellkulturschale in einem Volumen von 150 μl gesät. Kulturen wurden für 4 h bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert, um die Zellen an die Schale anheften zu lassen.
4.2. Zugabe von Effektorzellen
PBMC wurden gezählt und zu den Kulturen in 100 μl Volumen gegen und bei Effektor-/Targetzell Verhältnissen von 3:1, 25:1, und 50:1 hinzu. Zellen wurden für 8 h in einem Gesamtvolumen von 250 μl bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
4.3. Messung der ⁵¹Cr Freisetzung in Kulturen mit verschiedenen Effektor-/Targetzell Verhältnissen
Kulturschalen wurden bei 1000 upm für 3 min zentrifugiert und jeder Überstand wurde auf das Vorhandensein von ⁵¹Cr in einem Szintillaionszähler für 60 sek gemessen. Negativkontroll Kulturüberstände bestanden aus markierten Zellen ohne die Zugabe von Effektorzellen Effektorzellen (spontane ⁵¹Cr Freisetzung der Zellen). Positivkontrollen Kulturüberstände bestanden aus Kulturen von markierten Zellen nach Zelllyse mit 10% Triton X-100 (maximale ⁵¹Cr Aufnahme). Die Ergebnisse der ⁵¹Cr Freisetzung der individuellen Kulturen einschließlich der Effektorzellen vor der Immunisierung, zwei Wochen nach der zweiten und zwei Wochen nach der dritten Boosterimmunisierung (siehe Tabelle 14) sind als Tabelle 18 hier eingeschlossen. 9a)- 9e) zeigen die berechnete spezifische Lyse ≥ 0 gemäß Hammond SA, Issel CJ und Montelaro RC (1998): General method for the detection and in vitro expansion of equine cytolytic T lymphocytes. J Immunol Method 213: 73–85.
Die Datenblätter der ⁵¹Cr Freisetzung der individuellen Kulturen zeigen einen relativ kleinen Unterschied zwischen den Negativkontrollen Kulturüberstanden (spontane ⁵¹Cr Freisetzung der Zellen) und den Positivkontrollen Kulturüberständen (maximale ⁵¹Cr Aufnahme durch die Zellen).
Die spezifische Lyse ist daher schwierig zu messen, selbst wenn die Standartabweichungen zwischen den vier individuell gehandhabten Kulturen jeder Probe klein sind (Tabelle 18).
Beispiel 4 DNA-Vakzinierung von Pferden

1. Schema für die DNA für die Vakzinierung von Pferden

23.Mai, 2000	1^ste Immunisierung	Tag 0
6. Juni, 2000	2^te Immunisierung	Tag 14
21. Juni, 2000	3^te Immunisierung	Tag 29
14. Juli,2000	4^te Immunisierung	Tag 51

2. Strategie und Präparation von DNA für die Vakzinierung
2.1. Applikation von DNA mit dem „Helios Gene Gun System" (BIO-RAD):
2.1.1. Anzahl der Schüsse pro Tier und Vakzinierung: 10
2.1.2. Gesamt-DNA pro Schuss: 3.5 μg
2.1.3. Anzahl der verwendeten Expressionsvektoren: 7 (die Eigenschaften und Quelle der vür die Vakzinierung verwendeten DNA sind in Tabelle 15 zusammengefasst)
1. pCR3.1-EAV-02-BX-C5
2. pCR3.1-EAV-O5-BX-C14
3. pDP-EAV-O5-BgS-C1
4. pCR3.1-HIS-EAV-O5del-121-C12
5. pCR3.1-EAV-07-BX-C3
6. pDP-EAV-07-BgS-C2
7. pCR3.1-Horse-IL2
2.1.4. DNA vom individuellen Expressionsvektor pro Schuss: 0.5 μg = 500 ng
2.1.5. Gesamt-DNA vom individuellen Expressionsvektor pro Tier und Vakzinierung: 5 μg
2.1.6. Gesamt-DNA pro Vakzinierung pro Tier: 7 × 5 = 35 μg
2.1.7. Anzahl der Tiere: 5
2.1.8. Gesamt-DNA vom individuellen Expressionsvektor pro Vakzinierung: 5 × 35 = 175 μg
2.1.9. Anzahl der Vakzinierungen: 4
2.1.10. Gesamt-DNA vom verabreichten individuellen Expressionsvektor: 175 × 4 = 700 μg
2.2. Applikation von DNA über den intramukulären Weg.
2.2.1. Anzahl der Inokulationen pro Tier und Vakzinierung: 4
2.2.2. DNA vom individuellen Expressionsvektor pro Inokulation: 50 μg
2.2.3. Gesamt-DNA vom individuellen Expressionsvektor pro Tier und Vakzinierung: 50 × 4 = 200 μg
2.2.4. Anzahl der verwendeten Expressionsvektoren: 7 (siehe Tabelle 15)
2.2.5. Gesamt-DNA pro Vakzinierung pro Tier: 7 × 200 = 1.4 mg
2.2.6. Anzahl der Tiere: 5
2.2.7. Gesamt-DNA vom verabreichten Expressionsvektor: 5 × 1.4 = 7.0 mg
2.2.8. Anzahl der Vakzinierungen: 4
2.2.9. Gesamt-DNA vom verabreichten individuellen Expressionsvektor: 200 × 5 × 4 = 4 mg
2.2.10. Transfektionsreagenz: DOTAP Liposomal (Roche; Kat.# 1811177) 50 μg/ml BME (3 ml/Tier) Puffer I enthaltend DNA (Röhrchen mit gelber Kappe) Lipofectin (Life Technology; Kat.# 18292-011) 50 μg/ml BME (3 ml/Tier) Puffer II (Röhrchen mit weißer Kappe) Zugabe zur DNA vor der Applikation

Expressionsvektoren	Pro Vakzinierung verwendete DNA in μg/Pferd
	Gene GUN	Klassisch i.m.
PCR3.1-EAV-O2-BX-C5 (1 μg/μl)* 1.Klon/5. Passage	5	200
16.06.1999
Genprodukt: kleines Glycoprotein
pCR3.1-EAV-O3-BX-C1 (1 μg/μl)* 1.Klon/6. Passage
17.06.1999
Genprodukt: unbekannt
pCR3.1-EAV-O4-BX-C3 (1 μg/μl)* 1.Klon/6. Passage
18.06.1999
Genprodukt: unbekannt
pCR3.1-EAV-O5-BX-C14 (1 μg/μl) 1.Klon/5. Passage	5	200
05.06.1999
pDP-EAV-O5-BgS-C1 (1 μg/μl) 1.Klon/5. Passage	5	200
07.06.1999
pCR3.1-HIS-EAV-O5del-121-C12 (1 μg/μl) 1.Klon/6.	5	200
Passage 04.06.1999
Genprodukt: großes Hüll-Glycoprotein
pCR3.1-EAV-O6-BE-C4 (1 μg/μl) 1.Klon/5. Passage
15.06.1999
Genprodukt: Membranprotein
pCR3.1-EAV-O7-BX-C3 (1 μg/μl) 1.Klon/6. Passage	5.	200
09.06.1999
pDP-EAV-O7-BgS-C2 (1 μg/μl) 1.Klon/5. Passage	5	200
10.06.1999
Genprodukt: Nukleocapsidprotein
pCR3.1-Horse-IL2 (1 μg/2 μl) 2.Klon/2. Passage	5	200
06.02.2000
Genprodukt: Pferde-Interleukin-2

3. Präparation der DNA für die Vakzinierung von Pferden mit dem „Helios Gene Gun System" (BIO-RAD) und dem Optimierungskit (Katalog 165–2424)
3.1. Berechnung:
s3.1.1. MLQ = 1 (1 mgAu/Schuss)
3.1.2. DRL = 3.5 (3.5 μg DNA/mg Au, Partikel = 1.6 μm)
3.1.3. Länge der Partrone = 13 mm
3.1.4. Nalgene Röhre = 750 mm
3.1.5. Faktor für Au = 750/13 = 58 mg Au
3.1.6. 58 x-3,5-μg DNA = 203 μg DNA ~ 210 μg DNA
3.2 Prozedur:
3.2.1. In einem 1.5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, wiege 60 mg Au aus.
3.2.2. Zu dem gewogenen Au gebe 210 μl 0.05 M Spermidin hinzu.
3.2.3. Vortex # 3.2.2. für wenige Sekunden, dann für 3–5 Sekunden sonfizieren.
3.2.4. Zu der Au und Spermidin Mischung, gebe 210 μg Gesamt-DNA von sieben Expressionsvektoren hinzu = 30 μg von den individuellen Expressionsvektoren).
3.2.5. Mische DNA, Spermidin und Au durch Vortexen 5 Sekunden.
3.2.6. Gebe 210 μl CaCl₂ tropfenweise zu # 3.2.5., während es bei moderalter Geschwindigkeit gevortext wird
3.2.7. Für 10 min bei Raumtemperatur fällen.
3.2.8. Das meiste des Au wird nun in einem Pellet sein, aber einiges kann auf den Wänden der Röhre sein. Der Überstand sollte relativ klar sein. Zentrifigier die Mikrocarrierlösung in einer Mikrofuge für 15 Sekunen um das Au zu pelletieren.
3.2.9. Entferne und verwerfe den Überstand.
3.2.10. Resuspendiere das Pellet in dem verbleibenden Überstand durch kurzes Vortexen. Wasche das Pellet drei Mal mit 1 ml 100% Ethanol jedes Mal.
3.2.11. Zentrifugier für 5 Sekunden in einer Mikrofuge zwischen jedem Waschschritt. Verwerfe die Überstände.
3.2.12. Nach dem letzten Ethanolwaschschritt, resuspendiere das in Pellet in 200 μl der Ethanollösung enthaltend 0.05 mg/ml PVP in Ethanol.
3.2.13. Füge # 3.2.12 zu 2800 μl 0.05 mg/ml PVP in Ethanol hinzu.
3.2.14. Präparation der Patronen: 20. Mai, 2000: 300 Patronen wurden gemäß dem obigen Protokoll und dem „Helios Gene Gun" System Handbuch präpariert. Jede Patrone = einzelner Schuss enthält 3.5 μg DNA korrespondierend zu 0.5 μg = 500 ng DNA von individuellen Expressionsvektoren
4. Präimmunsera Die Prämimunsear von 5 Pferden (Daggi, Frieda, Friedrich, Jessy und Nelke), die im Oktober 1999 erhalten wurden, und durch NT und ELISA Test analysiert wurden, die in unserem Labor zum Screenen von Antikörpern gegen equines Arteritisvirus (EAV) entwicklt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 zusammengefasst.

Nr.	Pferd	Serumtiter NT°	Serumtiter ELISA	Bemerkungen
1	Daggi	1:40	1:100	positiv
2	Frieda	1:20	1:50	grenzwärtig
3	Friedrich	1:10	<1:50
4	Jessy	1:10	<1:50
5	Nelke	1:10	<1:50
	Positiv	1:160^b	1:200	positiv
	Kontrolle	1:80^c		positiv
	Serum

^a Multiplizität der Infektion (MOI): 100 PFU von EAV/1000 RK-13 Zellen/Nocke
^b gegen EAV erzeugtes Kaninchenantiserum
^cPferdeserum wurde von Prof. Dr. Ludwig, Berlin erhalten

Vakzinierungsprotokoll
Dienstag, 23. Mai, 2000

1. Pferderassen: Jessy: Shetland Pony, Rest: sogenannte „Warmblüter"
2. Alter der Pferde
2.1. Daggi: 22 Jahre alt
3.2. Frieda: 16 ahre alt
3.3. Friedrich: 10 ahre alt
3.4. Jessy: 16 Jahre alt
3.5. Nelke: 6 Jahre alt
3. Vakzinierung:

3.1. Jessy	Start	12.15	Ende	12.22	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)
3.2. Nelke	Start	12.30*	Ende	12.38	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)
3.3. Daggi	Start	12.45 §&	Ende	12.55	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)
3.4. Frieda	Start	12.47 §&	Ende	12.57	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)
3.5. Friedrich	Start	13.10 §	Ende	13.15	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)

* Sedativum: Domosedan (Pfizer) = Methyl-4-hydrooxybenzoad 1 ml i.v. (10 mg)
§ Rometar (Serum-Werk Bernburg) = Xylazin i.v. Methyl-4-hydrooxybenzoad
& Daggi und Frieda wurden zusammen vakziniert

4. Sera: 2tes Präimmunserum wurde am Montag, 22. Mai 2000 genommen (3 ml pro Tier)
5. 24. Mai, 2000: Alle vakzinierten Tiere entwickelten Hautreaktionen „DTH-Reaktion" am Ziel des Schusses.

Dienstag, 6. Juni, 2000

6. Sera: 1stes Serum nach Vakzinierung wurde am Montag 5. Juni 2000 genommen (3 ml pro Tier)
7. Vakzinierung:

3.1. Frieda	Start	12.25*	Ende	12.30	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)
3.2. Daggi	Start	12.27*	Ende	12.33	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)
3.3. Jessy	Start	12.37*	Ende	12.43	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)
3.4. Nelke	Start	12.44*	Ende	12.47	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)
3.5. Friedrich	Start	12.49*	Ende	12.54	(10 × Schuss: 5 pro Nackenseite)

* Sedativum: Rometar = Xylazin i.v. Methyl-4 hydrooxybenzoad 2% (Serum-Werk Bernburg) Vakzinierungsprotokoll Dienstag 21 Juni 2000

8. Sera: 2tes Serum nach Vakzinierung wurde am Montag 20. Juni 2000 genommen (1.5 ml pro Tier)
9. Vakzinierung:

3.1. Frieda	Start	12.10*	Ende	12.16	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)
3.2. Daggi	Start	12.17*	Ende	12.20	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)
3.3. Jessy	Start	12.25*	Ende	12.28	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)
3.4. Nelke	Start	12.29*	Ende	12.32	(11 × Schuss: 5 & 6 pro Nackenseite)
3.5. Friedrich	Start	12.36*	Ende	12.39	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite)

* Sedativum: Rometar = Xylazin i.v. Methyl-4 hydrooxybenzoad 2% (Serum-Werk Bernburg)

Vakzinierungsprotokoll
Freitag 14. Juli 2000

10. Sera: 3tes Serum nach Vakzinierung wurde am 13. Juli 2000 genommen, 1.5 ml pro Tier
11. Vakzinierung:

3.1. Daggi	Start	12.00*	Ende	12.07	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite, 530 psi)
3.2. Frieda	Start	12.08*	Ende	12.11	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite, 530 psi)
3.3. Jessy	Start	12.21*	Ende	12.24	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite, 430 psi)
3.4. Nelke	Start	12.25*	Ende	12.27	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite, 500 psi)
3.5. Friedrich	Start	12.35*	Ende	12.42	(12 × Schuss: 6 pro Nackenseite, 400 psi)

*Sedativum: Domosedan (Pfizer) = Methyl-4-hydrooxybenzoad 1 ml i.v. (10 mg)
§ Rometar (Serum-Werk Bernburg) = Xylazin i.v. Methyl-4-hydrooxybenzoad

12. Sera: 4tes Serum nach Vakzinierung wurde am 28. Juli 2000 genommen, 1.5 ml pro Tier
13. Bestimmung des neutralierenden Antikörpers Bestimmung der neutralierenden Antikörper der individuellen Pferdesera wurde durchgeführt (30 Serumproben, die mit Kodenummern 1-30 markiert waren, siehe Tabelle 3). Die Ergebnisse der Neutralisationstests sind in Tabelle 17 zusammengefasst.

Pferd	NT-Titer von individuellen Pferden genommen zu verschiedenen Zeipunkten vor und nach DNA-Vakzinierung ^a
	Präimmun-	Präimmun-	Serum nach	Serum nach	Serum nach	Serum nach
	serum 1	serum 2	Vakzinierung	Vakzinierung	Vakzinierung	Vakzinierung 4
			1	2	3
	20.10.1999	22.05.2000	05.06.2000	20.06.2000	13.07.2000	28.07.2000
1. Daggi	1:16 (#01)	1:64 (#06)	1:256 (#11)	1:256 (#16)	1:256 (#21)	1:256 (#26)
			1:256^e		1:256^e
2. Frieda	≤1:2(#02)	≤1:2 (#07)	1:256 (#12)	1:256 (#17)	1:128 (#22)	1:256 (#27)
			1:256^e	1:256^e		1:256^e
3.	≤1:2 (#03)	≤1:2 (#08)	1:64 (#13)	1:128 (#18)	1:128 (#23)	1:128 (#28)
Friedrich
4. Jessy	≤1:2 (#04)	≤1:2 (#09)	1:256 (#14)	1:256 (#19)	1:256 (#24)	1:128 (#29)
			1:256^e	1:256^e	1:256^e
5. Nelke	1:2 (#05)	1:8 (#10)	1:256 (#15)	1:128 (#20)	1:256 (#25)	≤1:2 (#30)
			1:512 (#15)		1:512^e	1:256^d

^a DNA-Vakzinierung von Pferden wurde wie folgt durchgeführt: May 23, 2000: 1^te Immunisierung (Tag 0), Juni 6, 2000: 2^te Immunisierung (Tag 14), Juni 21, 2000: 3^te Immunisierung (Tag 29), und Juli 14, 2000: 4^te Immunisierung (Tag 51)
^b Die Zahl in Klammern zeigt die Codenummer der individuelle Seren an, die durch die Neutralisierungstests verwendet wurden, die durch Dr. Herzog, Tierärztliches Labor am Institut für klinische Analyse, 71611 Ludwigsburg, Deutschland durchgeführt wurden
^cDieser Titer muss noch einmal überprüft werden.
^d Der Titer 1:2 war ein Schreibfehler. Der korrekte Titer erwies sich als 1:256, (Dr. Herzog Labor, 08/20/2000)
^e Die Ergebnisse der zweiten Analyse, die von diesen Seren erhalten wurden, waren ein Titer von 1:256, (Dr. Herzog Labor, 09/06/2000)

Biologisches Material

14. Sera: 5tes Serum nach Vakzinierung wurde am 25. August 2000 genommen (2 × 1,5 ml pro Tier)
15. Sera: 6tes Serum nach Vakzinierung wurde am 22. September 2000 genommen (2 × 1,5 ml pro Tier)
16. Sera: 7tes Serum nach Vakzinierung wurde am 23. Oktober 2000 genommen (2 × 1,5 ml pro Tier).

⁵¹

Pferd	orf	Immunisierung	1.Booster	2.Booster	3.Booster
Frieda	2b	++	++	–	+
	5	+	++	–	+++
	7	++	+	+	–
Daggy	2b	+++	–	–	++++
	5	+++	++	–	–
	7	+++	–	–	–
Nelke	2b	+	–	–	–
	5	+	+	–	–
	7	–	–	–	+++
Friedrich	2b	–	–	+	+++
	5	+	+	+	–
	7	+	+	–	–
Jessy	2b	+	+	–	–
	5	–	–	++++	+++
	7	++	+++	–	–

Pferd	orf	Immunisierung	1.Booster	2.Booster	3.Booster
Frieda	2b	+	+	–	–
	5	–	+	–	++
	7	+	–	–	–
Daggy	2b	++	–	–	+++
	5	++	+	–	–
	7	++	–	–	–
Nelke	2b	–	–	–	–
	5	–	–	–	–
	7	–	–	–	++
Friedrich	2b	–	–	–	++
	5	–	–	–	–
	7	–	–	–	–
Jessy	2b	–	–	–	–
	5	–	–	+++	++
	7	+	++	–	–

Fundstellen

Balasuriya, U. B. R., Hedges, J. F., Nadler, S. A., McCollum, W.H., Timoney, P. J. and MacLachlan, N. J. (1999) Genetic stability of equine arteritis virus during horizontal and vertical transmission in an outbreak of equine viral arteritis. J. Gen. Virol. 80, 1949–1958.
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Balasuriya, U.B., Patton, J.F., Rossitto, P.V., Timoney, P.J., McCollum, W.H., and MacLachlan, N. J. (1997). Neutralization determinants of laboratory strains and field isolates of equine arteritis virus: identification of four neutralization sites in the amino-terminal ectodomain of the G(L) envelope glycoprotein. Virology 232, 114–128.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vakzine-Zusammensetzung, die gegenüber Equinem Arterivirus (EAV) Infektionen in Pferden protektiv ist, und eine zelluläre Immunantwort induziert, bestehend aus Nukleinsäuren, die für die offenen Leserahmen (ORF) 2b, ORF 5 und ORF 7 von EAV kodieren, wobei die Nukleinsäuren in einem einzelnen Vektor-Rückgrat oder in einer Vielzahl von Vektor-Rückgraten enthalten sind, wobei jedes davon regulatorische Sequenzen umfasst, wobei ORF2B die Nukleotidsequenz ist, die in SEQ ID Nr. 2 dargelegt ist, oder eine funktionale Variante davon, wobei die Varianten Nukleinsäureaustausche, Deletionen oder Insertionen tragen, die bis zu 10% der Nukleinsäuren der Nukleinsäuresequenz ausmachen, die in SEQ ID Nr. 2 dargelegt ist.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Vakzine-Zusammensetzung ferner eine einzelne Nukleinsäure umfasst, die für einen EAV ORF kodiert, ausgewählt aus der Gruppe aus ORF 1a, ORF 1b, ORF 3, ORF 4, ORF 6.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Nukleinsäure cDNA ist.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der/die Vektor/Vektoren (ein) Expressionsvektor(en) ist/sind.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei der/die Expressionvektor(en) weiter eine eukaryotische cis-wirkende Transkriptions-/Translationssequenz umfasst/umfassen, die funktional mit dem/den ORF(s) verknüpft ist.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei der/die Expressionsvektor(en) ausgewählt sind aus der Gruppe aus pCR3.1, pcDNA3.1/His A, pcDNA3.1/His B, pcDNA3.1/His C und pDisplay (pD).
Vakzine-Zusammensetzung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 6, ferner eine Nukleinsäure, die für ein equines Interleukin 2 (IL-2) kodiert, oder einen Vektor oder Expressionsvektor umfassend, der die Nukleinsäure, die für IL-2 kodiert, umfasst.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 6, ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff umfassend.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 8, ferner eines oder mehrere Adjuvanzien umfassend, ausgewählt aus der Gruppe aus Muramyl-dipeptid (MDP), Montanide 720, Poly Inosin:Cytosin (Poly I:C) oder Plasmid DNA umfassend unmethyliertes Cytosin, Guanindinukleotid Sequenzmotive (CpG).
Vakzine-Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1–9, wobei ORF 2b SEQ ID Nr. 2, ORF 5 SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 9 ist und ORF 7 SEQ ID Nr. 7 ist.
Vakzine-Zusammensetzung gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Nukleinsäurevektor oder Expressionsvektor in kationische Liposomen eingekapselt ist.
Nukleinsäurevektor bestehend aus: (i) Sequenzen, kodierend für ORF 2b, ORF 5 und ORF 7 von Equinem Arterivirus (EAV), und (ii) einem Vektor-Rückgrat und regulatorischen Sequenzen, wobei ORF 2b die Nukleotidsequenz ist, die in SEQ ID Nr. 2 dargelegt ist, oder eine funktionale Variante davon, wobei die Varianten Nukleinsäureaustausche, Deletionen oder Insertionen tragen, die bis zu 10% der Nukleinsäuren der Nukleinsäuresequenz ausmachen, die in SEQ ID Nr. 2 dargelegt ist.
Nukleinsäurevektor gemäß Anspruch 12, wobei die Nukleinsäure DNA ist.
Nukleinsäurevektor gemäß Ansprüchen 12 oder 13, wobei der Nukleinsäurevektor ein Expressionsvektor ist.
Nukleinsäurevektor gemäß Anspruch 14, wobei der Expressionsvektor weiter eine eukaryotische cis-wirkende Transkriptions-/Translationssequenz umfasst, die funktional mit dem/den ORF(s) verknüpft ist.
Nukleinsäurevektor gemäß jedem der Ansprüche 14 bis 15, wobei der/die Expressionsvektor(en) ausgwählt ist/sind aus der Gruppe aus pCR3.1, pcDNA3.1/His A, pcDNA3.1/His B, pcDNA3.1/His C und pDisplay (pD).
Nukleinsäurevektor gemäß jedem der Ansprüche 12 bis 16, wobei der Nukleinsäurevektor weiter Nukleinsäure SEQ ID Nr. 9 umfasst.
Verwendung von einem oder mehreren Nukeinsäurevektor(en) gemäß jedem der Ansprüche 12 bis 17 oder den Zusammensetzungen gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung eines Vakzines für die Prophylaxe und Behandlung von EAV Infektionen.
Die Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei der eine oder mehrere Nukleinsäurevektor(en) und Zusammensetzung(en) (i) auf Trägerpartikel zu schichten sind; (ii) die beschichteten Trägerpartikel in Epidermalzellen der Pferdes in vivo zu beschleunigen sind, um eine protektive oder therapeutische Immunantwort in dem Pferd auf Exposition gegenüber EAV hin oder nach Exposition gegenüber EAV zu induzieren, wobei die Reduktion von EAV assoziierten Symptomen oder die Reduktion von horizontaler oder vertikaler Übertragung beobachtet werden kann.
Die Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei die Trägerpartikel aus Gold sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die eine oder mehrere Nukleinsäurevektoren und Zusammensetzungen in muskuläre Zellen des Pferdes in vivo zu injizieren sind; und um eine protektive oder therapeutische Immunantwort in dem Pferd auf Exposition gegenüber EAV hin oder nach Exposition gegenüber EAV zu induzieren, wobei die Reduktion von EAV assoziierten Symptomen oder die Reduktion von horizontaler oder vertikaler Übertragung beobachtet werden kann.