DE69730839T2 - Hühner polynukleotide impfstoff-formulierung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff, der die Impfung von Vogelarten, insbesondere Hühnchen gegen die Newcastle-Krankheit und gegebenenfalls eine oder mehrere andere Vogel-Pathogene gestattet.
  • In der Vergangenheit sind bereits Impfstoffkombinationen gegen eine gewisse Anzahl Viren, die für Krankheitszustände bei Hähnchen verantwortlich sind, vorgeschlagen worden.
  • Die bis heute entwickelten Kombinationen sind aus inaktivierten Impfstoffen oder Lebendimpfstoffen hergestellt worden. Ihre Bereitstellung wirft Probleme der Verträglichkeit zwischen den Valenzen und der Stabilität auf. Es muß nämlich gleichzeitig die Verträglichkeit zwischen den verschiedenen Impfstoffvalenzen sowohl auf der Ebene der verschiedenen verwendeten Antigene als auch auf der Ebene der Formulierungen selbst sichergestellt werden. Es stellt sich gleichfalls das Problem der Aufbewahrung dieser kombinierten Impfstoffe und ihrer Unschädlichkeit insbesondere in Anwesenheit eines Arzneimittelhilfsstoffs. Diese Impfstoffe sind im allgemeinen ziemlich teuer.
  • Die WO-A-96/21034 ist für einen anderen Impfstofftyp repräsentativ, der einen rekombinanten Virusvektor verwendet, der in vivo das für ein Immunogen des Pathogens, gegen das die Impfung gerichtet ist, kodierende Gen trägt und exprimiert. In diesem Dokument ist der Virusvektor ein Virus der Marek-Krankheit, z. B. HVT, und es wird dort die Inserierung von Genen aus Vogel-Pathogenen, zum Beispiel den Genen F und HN des Virus der Newcastle-Krankheit beschrieben.
  • Die Patentanmeldungen WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797 und WO-A-95 20660 haben von der kürzlich entwickelten Technik der Polynukleotidimpfstoffe Gebrauch gemacht. Man weiß, daß diese Impfstoffe ein Plasmid verwenden, das zum Exprimieren des in das Plasmid inserierten Antigens in den Wirtszellen befähigt ist. Es sind alle Verabreichungswege (intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, transkutan, intradermal, mukosal) vorgeschlagen worden. Verschiedene Impfmittel können ebenfalls verwendet werden, wie etwa DNA, die auf der Oberfläche von Goldteilchen abgeschieden und so gespritzt wird, daß sie die Haut des Tiers durchdringt (Tang et al., Nature 356, 152–154, 1992), wobei die Injektoren durch einen Flüssigkeitsstrahl das gleichzeitige Transfizieren in die Haut, den Muskel, das Fettgewebe und das Brustgewebe gestatten (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365–368, 1992).
  • Die Polynukleotid-Impfstoffe können ebenfalls nackte DNA wie etwa zum Beispiel innerhalb von Liposomen oder kationischen Lipiden formulierte DNA verwenden.
  • Die WO-A-98/12808 betrifft diesen Impfstofftyp und beschreibt ein Impfprotokoll gegen die Newcastle-Krankheit. Die Autoren vergleichen ein zirkuläres Plasmid, das das Gen F exprimiert, und lineare Plasmide, die dasselbe Gen exprimieren. Die Ergebnisse zeigen die Abwesenheit eines Schutzes bei dem zirkulären Plasmid. Die Lehre dieses Beispiels sowie die gesamte Lehre dieses Dokuments ist, daß ein zirkuläres Plasmid, das ein Gen des Virus der Newcastle-Krankheit enthält, keine Lösung darstellt, die an die Impfung von Vogelarten gegen diese Krankheit angepaßt ist. Es wird im Gegenteil empfohlen, linearisierte Plasmide zu verwenden.
  • Entgegen dieser Lehre hat der Anmelder gefunden, daß ein zirkuläres Plasmid, das ein Gen des Virus der Newcastle-Krankheit exprimiert, das Herstellen eines wirksamen Polynukleotid-Impfstoffs gestattet.
  • Die Erfindung dient dazu, einen Impfstoff bereitzustellen, der das Sicherstellen einer Impfung gegen die Newcastle-Krankheit gestattet.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen eines Impfstoffs, bei dem verschiedene andere Valenzen kombiniert sind und der gleichzeitig alle Erfordernisse an die Verträglichkeit und Stabilität der Valenzen untereinander aufweist.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen eines Impfstoffs, der das Kombinieren verschiedener Valenzen in demselben Träger gestattet.
  • Ein weiterer Gegenstand ist das Bereitstellen eines solchen Impfstoffs, der leicht hergestellt werden kann und wenig kostet.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Impfen von Hühnervögeln, das den Erhalt eines Schutzes einschließlich eines multivalenten Schutzes mit einem erhöhten Wirksamkeitsgrad und langer Dauer sowie einer guten Unschädlichkeit und einer Abwesenheit von Rückständen gestattet.
  • Die vorliegende Erfindung hat einen Vogel-Impfstoff zum Gegenstand, der ein zirkuläres Plasmid umfaßt, das das Gen HN des Virus der Newcastle-Krankheit und einen geeigneten Träger enthält.
  • Durch die vorliegende Erfindung kann mindestens ein weiteres Plasmid, das ein Gen einer weiteren Valenz eines Vogel-Pathogens umfaßt, so kombiniert werden, daß es in vivo in die Wirtszellen exprimiert wird, wobei diese Valenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Virus der Marek-Krankheit (MDV), dem Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV), dem Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), dem Virus der infektiösen Anämie (CAV), dem Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), dem Virus der Enzephalomyelitis (AEV oder außerdem dem Virus der Vogelleukose ALV), dem Pneumovirosevirus und dem Virus der Vogelpest ausgewählt ist und die Plasmide für jede Valenz ein oder mehr Gene umfassen, die aus der aus gB und gD für das Virus der Marek-Krankheit, HN und F für das Virus der Newcastle-Krankheit, VP2 für das Virus der Gumboro-Krankheit, S, M und N für das Virus der infektiösen Bronchitis, C + NS1 für das Virus der infektiösen Anämie, gB und gD für das Virus der infektiösen Laryngotracheitis, env und gag/pro für das Virus der Enzephalomyelitis, F und G für das Virus der Pneumovirose und HA, N und NP für das Virus der Vogelpest bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  • Unter Valenz versteht man bei der vorliegenden Erfindung mindestens ein Antigen, das einen Schutz gegen das Virus des in Betracht gezogenen Pathogens sicherstellt. Die Valenz kann als Untervalenz ein oder mehr natürliche oder modifizierte Gene aus einem oder mehr in Betracht gezogenen Pathogenstämmen enthalten.
  • Unter Gen eines pathogenen Mittels versteht man nicht nur das vollständige Gen, sondern auch die verschiedenen Nukleotidsequenzen einschließlich Fragmenten, die die Fähigkeit bewahren, eine Schutzantwort auszulösen. Der Begriff Gen umfaßt die Nukleotidsequenzen, die den in den Beispielen genau beschriebenen äquivalent sind, das heißt die verschiedenen Sequenzen, die aber für dasselbe Protein kodieren. Er umfaßt auch die Nukleotidsequenzen anderer in Betracht gezogener Pathogenstämme, die einen Kreuzschutz oder einen für diesen Stamm oder Stammgruppe spezifischen Schutz sicherstellen. Er umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die zum Erleichtern der Exprimierung in vivo durch das Wirtstier modifiziert wurden, aber für dasselbe Protein kodieren.
  • Vorzugsweise umfaßt der erfindungsgemäße Impfstoff zwei andere Valenzen, die aus Marek, Gumboro und infektiöser Anämie ausgewählt sind. Man kann auch vorzugsweise die Valenz infektiöse Bronchitis hinzufügen.
  • Auf dieser Grundlage von 3, 4 oder 5 Valenzen kann man eine oder mehr Valenzen der Vogelpest, Laryngotracheitis, Pneumovirose und Enzephalomyelitis hinzufügen.
  • Was die Marek-Valenz betrifft, kann man die beiden Gene herstellen, die in verschiedenen Plasmiden oder in ein und demselben Plasmid für gB und gD kodieren. Es ist vor allem bevorzugt, nur das Gen gB zu verwenden.
  • Für die Newcastle-Valenz verwendet man bevorzugt die beiden Gene HN und F, die in verschiedene Plasmide oder in ein und dasselbe Plasmid eingebaut sind.
  • Für die Valenz der infektiösen Bronchitis bevorzugt man das Verwenden des Gens S. Gegebenenfalls, aber in weniger bevorzugter Weise kann man S und M in einem einzigen Plasmid oder in verschiedenen Plasmiden kombinieren.
  • Für die Valenz der infektiösen Anämie bevorzugt man das Kombinieren der beiden Gene C und NS1 in demselben Plasmid.
  • Für die Valenz der infektiösen Laryngotracheitis bevorzugt man das Verwenden allein des Gens gB. Gegebenenfalls, aber in weniger bevorzugter Weise kann man die beiden Gene gB und gD in verschiedenen Plasmiden oder ein und demselben Plasmid kombinieren.
  • Für die Valenz der Pneumovirose bevorzugt man das Verwenden der beiden Gene F und G in einem einzigen Plasmid oder in verschiedenen Plasmiden.
  • Für die Valenz der Vogelpest bevorzugt man das Verwenden des Gens HA. Gegebenenfalls, aber in weniger bevorzugter Weise kann man die Kombinationen HA und NP oder HA und N in verschiedenen Plasmiden oder ein und demselben Plasmid verwenden. Bevorzugt kombiniert man in demselben Impfstoff die Sequenzen HA mit mehr als einem Grippevirusstamm, insbesondere verschiedenen auf diesem Gebiet angetroffenen Stämmen. Dagegen stellt NP einen Kreuzschutz sicher und man kann sich so mit einer Sequenz eines einzigen Virenstammes begnügen.
  • Für die Valenz der Enzephalomyelitis bevorzugt man das Verwenden von env.
  • Der Impfstoff gemäß der Erfindung kann in einem Dosisvolumen zwischen 0,1 und 1 ml und insbesondere zwischen 0,3 und 0,5 ml vorliegen.
  • Die Dosis liegt im allgemeinen zwischen 10 ng und 1 mg, bevorzugt zwischen 100 ng und 500 μg und vorzugsweise zwischen 0,1 μg und 50 μg je Plasmidtyp.
  • Man verwendet bevorzugt nackte Plasmide, die einfach in den Impfträger eingebracht werden, der im allgemeinen physiologisches Wasser oder etwas Analoges ist. Man kann selbstverständlich alle im Stand der Technik beschriebenen und insbesondere in Liposomen formulierten Formen eines Polynukleotid-Impfstoffs verwenden.
  • Jedes Plasmid umfaßt einen Promotor, der zum Sicherstellen der Exprimierung des inserierten Gens unter seiner Abhängigkeit in die Wirtszellen befähigt ist. Es handelt sich im allgemeinen um einen starken eukaryoten Promotor und insbesondere um einen frühen Promotor des Cytomegalovirus CMV-IE humanen oder murinen Ursprungs oder mit gegebenenfalls außerdem einem anderen Ursprung wie etwa der Ratte, Schwein, Meerschweinchen.
  • Allgemeiner kann der Promotor viralen Ursprungs oder zellulären Ursprungs sein. Als anderer Viruspromotor als CMV-IE kann der frühe oder späte Promotor des SV-40-Virus oder der LTR-Promotor des Rous-Sarkoms angeführt werden. Es kann sich auch um einen Promotor des Virus sein, aus dem das Gen stammt, zum Beispiel der dem Gen eigene Promotor.
  • Als Zellpromotor kann der Promotor eines Zytoskelettgens wie etwa zum Beispiel der Desmin-Promotor (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117–122, und ZHENLIN et al., Gene, 1989, 78, 243–254) oder außerdem der Actin-Promotor angeführt werden.
  • Wenn mehrere Gene in demselben Plasmid vorhanden sind, können sie in derselben Transkriptionseinheit oder in zwei verschiedenen Einheiten vorhanden sein.
  • Die Kombination verschiedener erfindungsgemäßer Impfstoffvalenzen kann bevorzugt durch Mischen von Polynukleotid-Plasmiden ausgeführt werde, die das oder die Antigene jeder Valenz exprimieren, aber man kann ebenfalls vorsehen, daß die Antigene mehrerer Valenzen durch dasselbe Plasmid exprimiert werden.
  • Die monovalenten Impfstoffe können auch (i) zur Herstellung eines weiter oben beschriebenen polyvalenten Impfstoffs, (ii) einzeln gegen den entsprechenden Krankheitszustand, (iii) kombiniert mit einem Impfstoff eines anderen Typs (vollständig lebend oder inaktiviert, rekombinant, Untereinheit) gegen einen anderen Krankheitszustand oder (iv) als Wiederholungsimpfstoff wie nachstehend beschrieben verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung hat tatsächlich außerdem die Verwendung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Plasmide zur Herstellung eines Vogel-Impfstoffs zum Gegenstand, der zum Impfen mittels eines klassischen (monovalenten oder multivalenten) Erstimpfstoffs erstgeimpfter Tiere bestimmt ist, eines Typs aus denen des Standes der Technik, der insbesondere aus der aus einem ganzen Lebendimpfstoff, ganzen, inaktivierten Impfstoff, Untereinheiten-Impfstoff und rekombinanten Impfstoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei dieser Erst impfstoff das oder die Antigen(e) aufweist (das heißt enthält oder exprimieren kann), die einen Kreuzschutz sicherstellen.
  • Auf bemerkenswerte Weise weist der Polynukleotid-Impfstoff eine wirkungsvolle Wiederholungswirkung auf, die sich in einer Verstärkung der Immunantwort und dem Einsetzen einer Langzeitimmunität äußert.
  • Auf allgemeine Weise können die Impfstoffe der Erstimpfung aus im Handel bei verschiedenen Herstellern veterinärmedizinischer Impfstoffe verfügbaren Impfstoffen ausgewählt werden.
  • Die Erfindung hat außerdem einen Impfkit zum Gegenstand, der einen erfindungsgemäßen Impfstoff und einen vorstehend beschriebenen Impfstoff für eine Erstimpfung umfaßt. Sie bezieht sich auch auf einen erfindungsgemäßen Impfstoff, der von einem Hinweis begleitet wird, der die Verwendung dieses Impfstoffs als Wiederholung einer vorstehend beschriebenen Erstimpfung anzeigt.
  • Man kann außerdem ein Verfahren zur Vogelimpfung entwickeln, das die Verabreichung eines weiter oben beschriebenen wirksamen Impfstoffs umfaßt. Dieses Impfverfahren umfaßt die Verabreichung einer oder mehrerer Dosen Impfstoff, wobei diese Dosen nacheinander in kurzen Zeitabständen und/oder nacheinander an auseinander liegenden Zeitpunkten verabreicht werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können im Rahmen dieses Impfverfahrens auf die verschiedenen, im Stand der Technik im Rahmen der Polynukleotid-Impfung vorgeschlagenen Verabreichungswege und mittels der bekannten Verabreichungstechniken verabreicht werden.
  • Es wird insbesondere auf den intramuskulären, in ovo, intraokulären, Vernebelungs- und Trinkwasserweg abgezielt.
  • Die Wirksamkeit der Darstellung der Antigene gegenüber dem Immunsystem schwankt mit der Funktion der Gewebe. Insbesondere die Luftröhrenschleimhaut dient als Sperre gegenüber dem Eintritt der Pathogene und ist mit dem Lymphgewebe verbunden, das die lokale Immunität stützt. Außerdem stellt die Verab reichung eines Impfstoffs durch Kontakt mit der Schleimhaut, insbesondere Mund-, Schlund und Bronchienregionschleimhaut ein gewisses Interesse für eine Massenimpfung dar.
  • Folglich sind die Verabreichungswege über die Schleimhaut Teil einer für die Erfindung bevorzugten Verabreichungsweise, wobei insbesondere die Vernebelung oder ein Spray oder das Trinkwasser verwendet werden. Die Impfstoffe gemäß der Erfindung können in diesem Rahmen angewendet werden.
  • Die Erfindung sieht außerdem eine vorstehend beschriebene Erstimpfung und eine Wiederholung mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff vor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verabreicht man einem Tier vorab eine wirksame Dosis eines Impfstoffs des klassischen Typs, insbesondere inaktiviert, lebend, verstärkt oder rekombinant oder außerdem einen Untereinheiten-Wirkstoff derart, daß eine Erstimpfung sichergestellt wird und nach einer Verzögerung von 2 bis 6 Wochen stellt man die Verabreichung des erfindungsgemäßen polyvalenten oder monovalenten Impfstoffs sicher.
  • Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung von Impfstofformulierungen, nämlich die Herstellung von Valenzen und ihren Gemischen, so wie sie aus dieser Beschreibung hervorgehen.
  • Die Erfindung wird nun mit Hilfe von Ausführungsweisen der Erfindung unter Bezug auf die angefügten Zeichnungen genauer beschrieben.
  • Liste der Figuren
  • 1: Plasmid pVR1012
  • 2: Plasmid pAB045
  • 3: Plasmid pAB080
  • 4: Gensequenz NDV HN Stamm Texas GB
  • 5: Plasmid pAB046
  • 6: Gensequenz NDV F Stamm Texas GB
  • 7: Plasmid pAB047
  • 8: Gensequenz IBDV VP2 Stamm Faragher
  • 9: Plasmid pAB048
  • 10: Gensequenz IBV S Stamm Massachusetts 41
  • 11: Plasmid pAB049
  • 12: Gensequenz IBV M Stamm Massachusetts 41
  • 13: Plasmid pAB050
  • 14: Gensequenz IBV N Stamm Massachusetts 41
  • 15: Plasmid pAB051
  • 16: Plasmid pAB054
  • 17: Plasmid pAB055
  • 18: Plasmid pAB076
  • 19: Plasmid pAB089
  • 20: Plasmid pAB086
  • 21: Plasmid pAB081
  • 22: Plasmid pAB082
  • 23: Plasmid pAB077
  • 24: Plasmid pAB078
  • 25: Plasmid pAB088
  • 26: Plasmid pAB079
  • Liste der Sequenzen SEQ ID Nr.
    • SEQ ID Nr. 1: Oligonukleotid AB062
    • SEQ ID Nr. 2: Oligonukleotid AB063
    • SEQ ID Nr. 3: Oligonukleotid AB148
    • SEQ ID Nr. 4: Oligonukleotid AB149
    • SEQ ID Nr. 5: Oligonukleotid AB072
    • SEQ ID Nr. 6: Oligonukleotid AB073
    • SEQ ID Nr. 7: Gensequenz NDV HN Stamm Texas GB
    • SEQ ID Nr. 8: Oligonukleotid AB091
    • SEQ ID Nr. 9: Oligonukleotid AB092
    • SEQ ID Nr. 10: Gensequenz NDV F Stamm Texas GB
    • SEQ ID Nr. 11: Oligonukleotid AB093
    • SEQ ID Nr. 12: Oligonukleotid AB094
    • SEQ ID Nr. 13: Gensequenz IBDV VP2 Stamm Faragher
    • SEQ ID Nr. 14: Oligonukleotid AB095
    • SEQ ID Nr. 15: Oligonukleotid AB096
    • SEQ ID Nr. 16: Gensequenz IBV S Stamm Massachusetts 41
    • SEQ ID Nr. 17: Oligonukleotid AB097
    • SEQ ID Nr. 18: Oligonukleotid AB098
    • SEQ ID Nr. 19: Gensequenz IBV M Stamm Massachusetts 41
    • SEQ ID Nr. 20: Oligonukleotid AB099
    • SEQ ID Nr. 21: Oligonukleotid AB100
    • SEQ ID Nr. 22: Gensequenz IBV N Stamm Massachusetts 41
    • SEQ ID Nr. 23: Oligonukleotid CD064
    • SEQ ID Nr. 24: Oligonukleotid CD065
    • SEQ ID Nr. 25: Oligonukleotid CD066
    • SEQ ID Nr. 26: Oligonukleotid AB105
    • SEQ ID Nr. 27: Oligonukleotid AB140
    • SEQ ID Nr. 28: Oligonukleotid AB141
    • SEQ ID Nr. 29: Oligonukleotid AB164
    • SEQ ID Nr. 30: Oligonukleotid AB165
    • SEQ ID Nr. 31: Oligonukleotid AB160
    • SEQ ID Nr. 32: Oligonukleotid AB161
    • SEQ ID Nr. 33: Oligonukleotid AB150
    • SEQ ID Nr. 34: Oligonukleotid AB151
    • SEQ ID Nr. 35: Oligonukleotid AB152
    • SEQ ID Nr. 36: Oligonukleotid AB153
    • SEQ ID Nr. 37: Oligonukleotid AB142
    • SEQ ID Nr. 38: Oligonukleotid AB143
    • SEQ ID Nr. 39: Oligonukleotid AB144
    • SEQ ID Nr. 40: Oligonukleotid AB145
    • SEQ ID Nr. 41: Oligonukleotid AB156
    • SEQ ID Nr. 42: Oligonukleotid AB158
    • SEQ ID Nr. 43: Oligonukleotid AB146
    • SEQ ID Nr. 44: Oligonukleotid AB147
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Viruskultur
  • Die Viren wurden in einem geeigneten Zellsystem bis zum Erhalt einer zytopathischen Wirkung kultiviert. Die für jeden Virus zu verwendenden Zellsysteme sind dem Fachmann wohlbekannt. Kurz gesagt werden die für das verwendete Virus empfindlichen Zellen, die in minimal-essentiellem Eagle-Medium („MEM"-Medium) oder on einem anderen geeigneten Medium kultiviert werden, mit dem untersuchten Virusstamm unter Anwenden einer Infektionsmultiplizität von 1 eingesät. Die infizierten Zellen werden dann bei 37°C über einen zum Auftreten einer vollständigen zytopathischen Wirkung notwendigen Zeitraum inkubiert.
  • Beispiel 2: Extraktion genomischer Virus-DNA
  • Nach der Kultur werden der Überstand und die lysierten Zellen geerntet und die gesamte Virussuspension wird 10 Minuten bei 1000 g und +4°C zentrifugiert, um die Zellbruchstücke zu entfernen. Die Virusteilchen werden darauf durch 1 Stunde Ultrazentrifugieren mit 400000 g bei +4°C geerntet. Das Pellet wird in dem Mindestvolumen Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) aufgenommen. Diese konzentrierte Virussuspension wird 2 Stunden bei 37°C mit Proteinase K (100 μg/ml am Ende) in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,5% am Ende) behandelt. Die Virus-DNA wird anschließend mit einem Gemisch aus Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit 2 Volumina absolutem Ethanol gefällt. Nach einer Nacht bei –20°C wird die DNA 15 Minuten bei 10000 g und +4°C zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird getrocknet und dann im Mindestvolumen ultrapurem sterilem Wasser wieder aufgenommen. Er kann darauf mit Restriktionsenzymen verdaut werden.
  • Beispiel 3: Isolieren der genomischen Virus-DNA
  • Die Virus-DNA wurden gemäß den dem Fachmann wohlbekannten Techniken gereinigt. Die genomische Virus-DNA jedes Virus wurde anschließend unter Anwenden der von P. Chomczynski und N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162, 156–159) beschriebenen Extraktionstechnik „Guanidiniumthiocyanat/Phenol-Chloroform" isoliert.
  • Beispiel 4: molekularbiologische Techniken
  • Alle Plasmidkonstruktionen wurden unter Anwenden der von J. Sambrock et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschriebenen Standardtechniken der Molekularbiologie durchgeführt. Alle für die vorliegende Erfindung verwendeten Restriktionsfragmente wurden unter Verwenden des „Geneclean"-Kits (BIO101 Corp., La Jolla, CA) isoliert.
  • Beispiel 5: RT-PCR-Technik
  • Spezifische Oligonukleotide (die an ihren 5'-Enden Restriktionsstellen zum Erleichtern des Klonierens der verstärkten Fragmente beinhalten) wurden auf eine solche Weise synthetisiert, daß sie die kodierenden Regionen der zu verstärkenden Gene (siehe die spezifischen Beispiele) vollständig abdecken. Die Reaktion der inversen Transkription (RT) und die Kettenverstärkung durch Polymerase (PCR) wurden gemäß den Standardtechniken (Sambrook J. et al., 1989) ausgeführt. Jede RT-PCR-Reaktion wurde mit einem Paar spezifischer Amplimerer und unter Hernehmen der extrahierten genomischen Virus-RNA als Matrize ausgeführt. Die komplementäre verstärkte DNA wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert, bevor sie mit den Restriktionsenzymen verdaut wurde.
  • Beispiel 6: Plasmid pVR1012
  • Das Plasmid pVR1012 (1) wurde von Vical Inc., San Diego, CA, USA, erhalten. Seine Konstruktion wurde bei J. Hartikka et al. (Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205–1217) beschrieben.
  • Beispiel 7: Konstruktion des Plasmids pAB045 (MDV-Gen gB)
  • Eine PCR-Reaktion wurde mit Genom-DNA des Virus der Marek-Krankheit (MDV) (Stamm RB1B) (L. Ross et al., J. Gen. Virol., 1989, 70, 1789–1804), die gemäß der Technik des Beispiels 2 hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00120001
    um das für das Glykoprotein gB des MDV-Virus kodierende Gen in Form eines PstI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 2613 BP durch PstI und BglII verdaut, um ein PstI-BglII-Fragment mit 2602 BP zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit PstI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB045 (7455 BP) (2) zu ergeben.
  • Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pAB080 (MDV-Gen gD)
  • Eine PCR-Reaktion wurde mit der Genom-DNA des Virus der Marek-Krankheit (MDV) (Stamm RB1B) (L. Ross, et al., J. Gen. Virol., 1919, 72, 949–954), die gemäß der Technik des Beispiels 2 hergestellt wurde, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00130001
    um das für das Glykoprotein gD des MDV-Virus kodierende Gen in Form eines PstI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 1215 BP durch PstI und BglII unter Isolieren eines PstI-BglII-Fragments mit 1199 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit PstI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB080 (6051 BP) (3) zu ergeben.
  • Beispiel 9: Konstruktion des Plasmids pAB046 (NDV-Gen HN)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV) (Stamm Texas GB) und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00130002
    um das für das Glykoprotein HN des NDV-Virus, Stamm Texas GB (4 und SEQ ID Nr. 7) kodierende Gen in Form eines NotI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1741 BP durch NotI und BamHI unter Isolieren eines NotI-BamHI-Fragments mit 1723 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit NotI und BamHI verdaut worden war, um das Plasmid pAB046 (6616 BP) (5) zu ergeben.
  • Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids pAB047 (NDV-Gen F)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Newcastle-Krankheit (NDV) (Stamm Texas GB), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00140001
    um das für das Glykoprotein F des NDV-Virus, Stamm Texas GB (6 und SEQ ID Nr. 10) kodierende Gen in Form eines NotI-XbaI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1648 BP durch NotI und XbaI unter Isolieren eines NotI-XbaI-Fragments mit 1669 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit NotI und XbaI verdaut worden war, um das Plasmid pAB047 (6578 BP) (7) zu ergeben.
  • Beispiel 11: Konstruktion des Plasmids pAB048 (IBDV-Gen VP2)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV) (Stamm Faragher), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00140002
    um das für das Protein VP2 des IBDV-Virus, Stamm Faragher (8 und SEQ ID Nr. 13) kodierende Gen in Form eines EcoRV-NotI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1384 BP durch EcoRV und NotI unter Isolieren eines EcoRV-NotI-Fragments mit 1367 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit EcoRV und NotI verdaut worden war, um das Plasmid pAB048 (6278 BP) (9) zu ergeben.
  • Beispiel 12: Konstruktion des Plasmids pAB049 (IBV-Gen S1)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der infektiösen Bronchitis (IBV) (Stamm Massachusetts 41), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00150001
    um das für die Untereinheit S1 des Glykoproteins S des IBV-Virus, Stamm Massachusetts (10 und SEQ ID Nr. 16), kodierende Gen in Form eines SalI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1635 BP durch SalI und BglII unter Isolieren eines SalI-BglII-Fragments mit 1622 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit SalI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB049 (6485 BP) (11) zu ergeben.
  • Beispiel 13: Konstruktion des Plasmids pAB050 (IBV-Gen M)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der infektiösen Hühnerbronchitis (IBV) (Stamm Massachusetts 41), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00150002
    um das für das Glykoprotein M des IBV-Virus, Stamm Massachusetts (12 und SEQ ID Nr. 19), kodierende Gen in Form eines NotI-NotI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 710 BP durch NotI unter Isolieren eines NotI-NotI-Fragments mit 686 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit NotI verdaut worden war, um das Plasmid pAB050 (5602 BP) zu ergeben, das das IBV-Gen M in der richtigen Orientierung bezüglich des Promotors enthielt (13).
  • Beispiel 14: Konstruktion des Plasmids pAB051 (IBV-Gen N)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der infektiösen Hühnerbronchitis (IBV) (Stamm Massachusetts 41), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00160001
    um das für das Protein N des IBV-Virus, Stamm Massachusetts (14 und SEQ ID Nr. 22), kodierende Gen in Form eines PstI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1250 BP durch PstI und BamHI unter Isolieren eines PstI-BamHI-Fragments mit 1233 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI verdaut worden war, um das Plasmid pAB051 (6092 BP) (15) zu ergeben.
  • Beispiel 15: Konstruktion des Plasmids pAB054 (CAV-Gen VP1)
  • Eine PCR-Reaktion wurde mit der Genom-DNA des Virus der Hühneranämie (CAV) (Stamm Cuxhaven-1) (B. Meehan et al., Arch. Virol., 1992, 124, 301–319), die gemäß der Technik des Beispiels 2 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00160002
    um das für das Capsidprotein VP1 des CAV kodierende Gen in Form eines NotI-NotI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 1377 BP durch NotI unter Isolieren eines NotI-NotI-Fragments mit 1359 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit NotI verdaut worden war, um das Plasmid pAB054 (6274 BP) zu ergeben, das das CAV-Gen VP1 in der richtigen Orientierung bezüglich des Promotors enthielt (16).
  • Beispiel 17: Konstruktion des Plasmids pAB055 (CAV-Gen VP2)
  • Eine PCR-Reaktion wurde mit der Genom-DNA des Virus der Hühneranämie (CAV) (Stamm Cuxhaven-1) (B. Meehan et al., Arch. Virol., 1992, 124, 301– 319), die gemäß der Technik des Beispiels 2 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00170001
    um das für das Protein VP2 des CAV-Virus kodierende Gen in Form eines NotI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 674 BP durch NotI und BamHI unter Isolieren eines NotI-BamHI-Fragments mit 659 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit NotI und BamHI verdaut worden war, um das Plasmid pAB055 (5551 BP) (17) zu ergeben.
  • Beispiel 18: Konstruktion des Plasmids pAB076 (ILTV-Gen gB)
  • Eine PCR-Reaktion wurde mit der Genom-DNA des Virus der infektiösen Hühner-Laryngotracheitis (ILTV) (Stamm SA-2) (K. Kongsuwan et al., Virology, 1991, 184, 404–410), die gemäß der Technik des Beispiels 2 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00170002
    um das für das Glykoprotein gB des ILTV-Virus kodierende Gen in Form eines NotI-NotI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 2649 BP durch NotI unter Isolieren eines NotI-NotI-Fragments mit 2631 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit NotI verdaut worden war, um das Plasmid pAB076 (7546 BP), das das ILTV-Gen gB in der richtigen Orientierung bezüglich des Promotors enthielt (18), zu ergeben.
  • Beispiel 20: Konstruktion des Plasmids pAB089 (ILTV-Gen gD)
  • Eine PCR-Reaktion wurde mit der Genom-DNA des Virus der infektiösen Hühner-Laryngotracheitis (ILTV) (Stamm SA-2) (M. Johnson et al., 1994, Zugangsnummer bei Genbank = L31965), die gemäß der Technik des Beispiels 2 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00180001
    um das für das Glykoprotein gD des ILTV-Virus kodierende Gen in Form eines SalI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das PCR-Produkt mit 1134 BP durch SalI und BglII unter Isolieren eines SalI-BglII-Fragments mit 1122 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit SalI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB089 (5984 BP) (19) zu ergeben.
  • Beispiel 21: Konstruktion des Plasmids pAB086 (AEV-Gen env)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Vogelenzephalomyelitis (AEV) (Typ C) (E. Bieth et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 367), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00180002
    um die für das Glykoprotein Env des AEV-Virus kodierende Sequenz in Form eines EcoRV-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1836 BP durch EcoRV und BamHI unter Isolieren eines EcoRV-BamHI-Fragments mit 1825 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit EcoRV und BamHII verdaut worden war, um das Plasmid pAB086 (6712 BP) (20) zu ergeben.
  • Beispiel 22: Konstruktion des Plasmids pAB081 (AEV-Gen gag/pro)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Vogelenzephalomyelitis (AEV) (Typ C) (E. Bieth et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 367), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00190001
    um die für die Proteine Gag und Pro des AEV-Virus kodierende Sequenz in Form eines SalI-XbaI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 2125 BP durch SalI und XbaI unter Isolieren eines SalI-XbaI-Fragments mit 2111 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit SalI und XbaI verdaut worden war, um das Plasmid pAB081 (6996 BP) (21) zu ergeben.
  • Beispiel 23: Konstruktion des Plasmids pAB082 (Pneumovirus-Gen G)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Putenrhinotracheitis (TRV) (Stamm 2119) (K. Juhasz et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 2873–2880), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00190002
    um das für das Glykoprotein G des TRV-Virus kodierende Gen in Form eines PstI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1265 BP durch PstI und BglII unter Isolieren eines PstI-BglII-Fragments mit 1249 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit PstI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB082 (6101 BP) (22) zu ergeben.
  • Beispiel 24: Konstruktion des Plasmids pAB077 (Vogelpest-Gen HA Stamm H2N2)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Vogelpest (AIV) (Stamm H2N2 Postdam) (J. Schäfer et al., Virology, 1993, 194, 781–788), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00200001
    um das für das Glykoprotein HA des Virus der Vogelpest (Stamm H2N2) kodierende Gen in Form eines PstI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1709 BP durch PstI und BglII unter Isolieren eines PstI-BglII-Fragments mit 1693 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit PstI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB077 (6545 BP) (23) zu ergeben.
  • Beispiel 25: Konstruktion des Plasmids pAB078 (Vogelpest-Gen HA Stamm H7N7)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Vogelpest (AIV) (Stamm H7N7 Leipzig) (C. Rohm et al., Virology, 1995, 209, 664–670), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00200002
    um das für das Glykoprotein HA des Virus der Vogelpest (Stamm H7N7) kodierende Gen in Form eines PstI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1707 BP durch PstI und BamHI unter Isolieren eines PstI-BamHI-Fragments mit 1691 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit PstI und BamHI verdaut worden war, um das Plasmid pAB078 (6549 BP) (24) zu ergeben.
  • Beispiel 26: Konstruktion des Plasmids pAB088 (Vogelpest-Gen NP Stamm H1N1)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Vogelgrippe (AIV) (Stamm H1N1 Bavaria) (M. Gammelin et al., Virology, 1989, 170, 71–80), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00210001
    um das für das Nukleoprotein NP des Virus der Vogelgrippe kodierende Gen in Form eines SalI-BamHI-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1515 BP durch SalI und BamHI unter Isolieren eines SalI-BamHI-Fragments mit 1503 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit SalI und BamHI verdaut worden war, um das Plasmid pAB088 (6371 BP) (25) zu ergeben.
  • Beispiel 27: Konstruktion des Plasmids pAB079 (Vogelpest-Gen N Stamm H7N1)
  • Eine RT-PCR-Reaktion gemäß der Technik des Beispiels 5 wurde mit der Genom-RNA des Virus der Vogelpest (AIV) (Stamm H7N1 Rostock) (J. McCauley, 1990, Zugangs-Nr. bei Genbank = X52226), die gemäß der Technik des Beispiels 3 hergestellt worden war, und mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
    Figure 00210002
    um das für das Glykoprotein N des Virus der Vogelpest (Stamm H7N1) kodierende Gen in Form eines SalI-BglII-Fragments zu isolieren. Nach der Reinigung wurde das RT-PCR-Produkt mit 1361 BP durch SalI und BglII unter Isolieren eines SalI-BglII-Fragments mit 1350 BP verdaut. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pVR1012 (Beispiel 6) ligiert, der zuvor mit SalI und BglII verdaut worden war, um das Plasmid pAB079 (6212 BP) (26) zu ergeben.
  • Beispiel 28: Herstellung und Reinigung der Plasmide
  • Zur Herstellung von Plasmiden, die zur Impfung von Tieren bestimmt sind, kann jede Technik verwendet werden, die das Erhalten einer Suspension gereinigter Plasmide in hauptsächlich superhelikaler Form gestattet. Diese Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt. Es kann insbesondere die Technik der alkalischen Lyse, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden Ultrazentrifugationen mit einem Cesiumchloridgradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid wie bei J. Sambrock et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) beschrieben angeführt werden. Es kann auch auf die PCT-Patentanmeldungen WO95/21250 und PCT-WO96/02658 verwiesen werden, die Verfahren zum Herstellen zum Impfen brauchbarer Plasmide im industriellen Maßstab beschreiben. Zum Zweck der Herstellung der Impfstoffe (siehe Beispiel 17) werden die gereinigten Plasmide wieder so suspendiert, daß Lösungen hoher Konzentration (> 2 mg/ml) erhalten werden, die die Lagerung vertragen. Dazu werden die Plasmide entweder in ultrareinem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0) erneut suspendiert.
  • Beispiel 29: Herstellung von Kombinationsimpfstoffen
  • Die verschiedenen, zur Herstellung eines Kombinationsimpfstoffs notwendigen Plasmide werden aus ihren konzentrierten Lösungen (Beispiel 16) gemischt. Die Mischungen werden auf eine solche Weise ausgeführt, daß die Endkonzentration jedes Plasmids der wirksamen Dosis jedes Plasmids entspricht. Die zum Einstellen der Endkonzentration des Impfstoffs verwendbaren Lösungen können entweder eine 0,9%ige NaCl-Lösung oder PBS-Puffer sein.
  • Zur Herstellung von Impfstoffen können auch besondere Formulierungen wie etwa Liposomen und kationische Lipide eingesetzt werden.
  • Beispiel 30: Impfung von Hähnchen
  • Die Hähnchen wurden mit Dosen von 10, 50 oder 100 μg je Plasmid geimpft. Die Injektionen können über eine Nadel auf intramuskulärem Weg durchgeführt werden. Die Injektionsstellen sind das Brustbein (bei Hähnchen von mehr als 2 Wochen) und der Oberschenkel (bei 1 Tag alten oder älteren Hähnchen). In diesem Fall werden die Impfstoffdosen in einem Volumen von 0,1 bis 0,3 ml verabfolgt.
  • Bei dem erwachsenen Hähnchen (Alter mehr als 20 Wochen) werden die Injektionen gleichfalls auf intramuskulärem Weg unter Verwenden eines Injektionsgeräts mit einem Flüssigkeitsstrahl (ohne Nadel) durchgeführt, das speziell auf die Impfung von Hähnchen zugeschnitten ist (zum Beispiel das Gerät AVIJET). In diesem Fall ist das injizierte Volumen 0,3 ml. Die Injektion kann beim Brustbein oder in Höhe des Oberschenkels ausgeführt werden. Ebenso können die Injektio nen beim erwachsenen Hähnchen mit der Nadel auf intramuskulärem Weg in das Brustbein oder den Oberschenkel mit einem Volumen von 0,3 ml ausgeführt werden. Die Injektion des Plasmid-Impfstoffs kann auch in ovo erfolgen. In diesem Fall können besondere Formulierungen wie die in Beispiel 29 angeführten verwendet werden. Das in das 18 Stunden bebrütete Ei injizierte Volumen liegt zwischen 50 μl und 200 μl.

Claims (13)

  1. Vogelimpfstoff umfassend ein zirkuläres Plasmid, das das Gen HN des Virus der Newcastle-Krankheit enthält, und einen geeigneten Träger.
  2. Impfstoff gemäß Anspruch 1, bei dem das Plasmid die beiden Gene F und HN des Virus der Newcastle-Krankheit umfaßt.
  3. Impfstoff gemäß Anspruch 1, der ein weiteres zirkuläres Plasmid umfaßt, das das Gen F des Virus der Newcastle-Krankheit enthält.
  4. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Plasmid einen Promotor umfaßt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus dem CMV-IE-Promotor, dem frühen SV40-Promotor, dem späten SV40-Promotor, dem LTR-Promotor des Virus des Rous-Sarkoms und dem Promotor eines Zytoskelettgens.
  5. Impfstoff gemäß Anspruch 4, bei dem der Promotor ein CMV-IE-Promotor ist.
  6. Impfstoff gemäß Anspruch 4, bei dem der Promotor eines Zytoskelettgens der Desmin-Promotor oder der Actin-Promotor ist.
  7. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet daß er außerdem ein Plasmid umfaßt, das ein Gen eines weiteren Vogel-Pathogens enthält und exprimiert.
  8. Impfstoff gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er zwei aus der Gruppe ausgewählte Plasmide umfaßt, die aus einem das Gen gB oder gD des Virus der Marek-Krankheit enthaltenden Plasmid, einem das Gen VP2 des Virus der Gumboro-Krankheit enthaltenden Plasmid und einem die Gene C + NS1 des Virus der infektiösen Anämie enthaltenden Plasmid besteht.
  9. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er 10 ng bis 1 mg, bevorzugt 100 ng bis 500 μg, noch bevorzugter 0,1 μg bis 50 μg jedes Plasmids umfaßt.
  10. Verwendung eines oder mehrerer in einem der Ansprüche 1 bis 9 beschriebenen Plasmide zur Herstellung eines Vogelimpfstoffs, der zum Impfen erstgeimpfter Tiere gegen die Newcastle-Krankheit, die Marek-Krankheit, die Gumboro-Krankheit und/oder infektiöse Anämie mittels eines erstens Impfstoffs bestimmt ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Lebendvollimpfstoff, inaktivierten Vollimpfstoff, Spaltimpfstoff und rekombinanten Impfstoff, wobei der erste Impfstoff das oder die Antigen(e) aufweist, das (die) durch das oder die Plasmid(e) oder Antigen(e) kodiert wird (werden), die einen Kreuzschutz sicherstellen.
  11. Impfkit umfassend einen Polynukleotidimpfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen Vogelimpfstoff, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Lebendvollimpfstoff, inaktivierten Vollimpfstoff, Spaltimpfstoff und rekombinanten Impfstoff besteht, wobei der erste Impfstoff das Antigen aufweist, das durch das Polynukleotidimpfstoff oder ein Antigen kodiert wird, das einen Kreuzschutz sicherstellt, zu dessen Verabfolgung als Erstimpfung und zur Wiederholung mit der Impfstofformulierung.
  12. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, der von einem Hinweis begleitet wird, der anzeigt, daß dieser Polynukleotidimpfstoff als Wiederholung eines ersten Vogelimpfstoffs verwendbar ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Lebendvollimpfstoff, inaktivierten Vollimpfstoff, Spaltimpfstoff und rekombinanten Impfstoff besteht, wobei der erste Impfstoff das Antigen aufweist, das durch das Polynukleotidimpfstoff oder ein Antigen kodiert wird, das einen Kreuzschutz sicherstellt.
  13. Verwendung eines in einem der Ansprüche 1 bis 6 beschriebenen Plasmids zur Herstellung eines Impfstoffs, der zum Impfen von Vogelarten gegen das Virus der Newcastle-Krankheit zusammen mit einem gegen eine andere Vogelkrankheit gerichteten Lebendvollimpfstoff oder inaktivierten Vollimpfstoff, rekombinanten Impfstoff oder Spaltimpfstoff bestimmt ist.
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