FR2697534A1 - Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu. - Google Patents
Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu. Download PDFInfo
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Abstract
Un virus recombinant herpès de la dinde (HVT) contenant des séquences codantes de protéines structurales du virus de la maladie de Gumboro, caractérisé en ce qu'il contient, dans un site de son génome, au moins une séquence codant pour une protéine choisie dans le groupe formé par les protéines VP2 et VP3 dans des conditions permettant l'expression desdites séquences et la production de ladite protéine, la séquence codant pour la protéine VP4 étant absente ou incapable d'être exprimée. Vaccin comprenant ce virus.
Description
VIRUS HERPES DE LA DINDE RECOMBINANT POUR LA REALISATION DE
VACCIN DE LA MALADIE DE GUMBORO, SON PROCEDE DE PREPARATION
ET VACCIN OBTENU.
VACCIN DE LA MALADIE DE GUMBORO, SON PROCEDE DE PREPARATION
ET VACCIN OBTENU.
La présente invention concerne l'utilisation d'un virus recombinant herpès de la dinde (HVT) pour la réalisation d'un vaccin protégeant les poulets contre la maladie de Gumboro ainsi que son procédé de préparation et le vaccin obtenu.
Le virus de la maladie de Gumboro infectant les tissus lymphoïdes de la bourse de Fabricius, cause chez le poulet une sévère immunodépression. En dehors de la maladie clinique entraînant perte de poids et mortalité, le virus est à ltori.gine d'une diminution de la résistance des animaux vis-à-vis d'autres pathogènes aviaires. La maladie est aujourd'hui contrôlée avec des vaccins vivants atténués ou inactivés. A cause de la présence d'une immunité passive transmise par la poule, les poussins sont actuellement vaccinés avec un vaccin atténué durant les premières semaines suivant l'éclosion. De tels vaccins atténués peuvent présenter une virulence résiduelle et provoquer des lésions au niveau de la bourse de Fabricius.
Le virus HVT est un candidat de choix pour le développement d'un tel vecteur vaccinal dans le domaine aviaire puisqu'il présente le double avantage de pouvoir étre utilisé pour ses propriétés vaccinales propres contre la maladie de Marek et comme vaccin de la maladie de
Gumboro.. De plus le virus HVT entrain une virémie permanente chez le poussin et peut étre utilisé en embryovaccination.
Gumboro.. De plus le virus HVT entrain une virémie permanente chez le poussin et peut étre utilisé en embryovaccination.
La technique pour construire un virus HVT recombinant a été décrite, en particulier dans les brevets antérieurs (PCT HO 90/02803, EP 0447303 Al, EP 0477056 Al).
Le virus de la maladie de Gumboro appartient à la famille des Birnaviridae. Le génome viral est constitué d'un
ARN double brin bisegmenté. Le segment le plus petit
(segment B) code pour une protéine de 90 kDa correspondant probablement à une réplicase. Le segment le plus grana (segment A) code pour une polyprotéine de 115 kDa secondairement clivée en trois protéines VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa). VPt serait une protéase intervenant dans la maturation de la polyprotéine 115 kDa.
ARN double brin bisegmenté. Le segment le plus petit
(segment B) code pour une protéine de 90 kDa correspondant probablement à une réplicase. Le segment le plus grana (segment A) code pour une polyprotéine de 115 kDa secondairement clivée en trois protéines VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa). VPt serait une protéase intervenant dans la maturation de la polyprotéine 115 kDa.
Deux sérotypes ont été décrits ainsi que différents variants appartenant au sérotype-1. L'apparition de ces variants cause d'importants problèmes à l'industrie du poulet.
La protéine structurale VP2 est un immunogène induisant des anticorps neutralisants et une protection contre la maladie de Gumboro chez le poulet. La protéine VP2 produite à l'aide d'un vecteur d'expression dans des cellules de levure, induit des anticorps séroprotecteurs (K.
Fahey et al. Avian Pathology, 1991, 20, 447-460). Produite sous forme de protéine de fusion avec la ss galactosidase à l'aide d'un vecteur fowlpox, la protéine VP2 induit une protection contre la mortalité suivant une épreuve virulente mais pas contre l'atteinte de la bourse de Fabricius (C.
Bayliss et al., Archives of Virology, 1991, 120, 193-205).
Par contre la protéine VP2 exprimée dans E. Coli n'induit aucune réponse protectrice (M. Jagadish et al., Gene, 1990, 95, 179-186).
Le déterminant antigénique inducteur d'anticorps neutralisants, situé dans la région centrale de VP2, est fortement dépendant de la conformation de la protéine. De plus, la séquence en acides aminés correspondant à cette région, présente une variabilité importante entre les différentes souches de sérotype 1.
La protéine VP3 présente une forte réactivité croisée avec les anticorps monoclonaux spécifiques des deux sérotypes et porte un déterminant antigénique spécifique de groupe. La protéine VP3, exprimée dans E. Coli sous forme de protéine de fusion avec la S galactosidase, induit une faible réponse en anticorps neutralisants chez un poulet sur six (A. Azad, Virology, 1986,. 149, 190-198).
La polyprotéine de 115 kDa a été exprimée dans des cellules de levure. Le précurseur ainsi exprimé, donnant naissance après clivage aux protéines VP2, VP3 et VP4, induit chez le poulet des anticorps séroprotecteurs (K.
Fahey et al., Avian pathology, 1991, 20, 447-460). Par contre le précurseur de 115 kDa exprimé à l'aide d'un vecteur HVT, meme après clivage de VP2, VP3 et VP4 n'induit pas de façon significative d'anticorps neutralisants ni de protection (Brevet WO 89/01040 du 27 juillet 1988).
La présente invention a donc pour objectif de fournir des virus herpès de la dinde (HVT) recombinants pour la production de vaccin vivant efficace contre la maladie de
Gumboro.
Gumboro.
L'expérience prouve que la polyprotéine de 115 kDa du virus de la maladie de Gumboro exprimée à l'aide d'un vecteur HVT dans des fibroblastes d'embryon de poulet, bien que clivée pour donner naissance aux protéines structurales
VP2 et VP3, n'induit aucune protection significative chez le poussin.
VP2 et VP3, n'induit aucune protection significative chez le poussin.
Par contre et cela de façon surprenante, si les gènes codant pour VP2 et VP3 sont exprimés simultanément et de manière indépendante à l'aide d'un vecteur HVT, la vaccination des poussins avec ce virus recombinant confère une protection efficace contre la maladie de Gumboro.
L'association des protéines VP2 et VP3 exprimées simultanément chez le poulet par un ou des vecteurs HVT recombinants, en l'absence d'activité protéolytique liée à VP4, permet d'obtenir une meilleure protection vis-à-vis des variants par rapport à celle obtenue avec les protéines VP2 ou VP3 exprimées individuellement.
L'invention a pour objet la description de l'insertion des gènes codant pour VP2 et VP3 dans le génome du virus HVT.
Plus précisément l'invention a pour objet un vaccin vivant recombinant contre la maladie de Gumboro, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule usuel approprié une quantité efficace de virus HVT dont le génome contient des gènes codant pour VP2 et VP3 dans des conditions permettant leur expression in vivo.
Le vaccin peut contenir deux virus HVT dans lesquels sont respectivement insérés les gènes codant pour
VP2 et VP3, ou un virus HVT dans le génome duquel ont été insérés, en un même site d'insertion, ou en deux sites distincts, les gènes codant pour VP2 et VP3.
VP2 et VP3, ou un virus HVT dans le génome duquel ont été insérés, en un même site d'insertion, ou en deux sites distincts, les gènes codant pour VP2 et VP3.
Description des figures
Figure n" 1 : Séquence de la région du segment A du génome du virus IBDV codant pour la polyprotéine VP2,
VP4, VP3
Figure n 2 : Construction du plasmide pHVT 006.
Figure n" 1 : Séquence de la région du segment A du génome du virus IBDV codant pour la polyprotéine VP2,
VP4, VP3
Figure n 2 : Construction du plasmide pHVT 006.
Figure n" 3 : Construction des plasmides pIBDVA0l et pIBDVA02
Figure n" 4 : Construction du plasmide de recombinaison pGH010
Figure n S : Construction du plasmide de recombinaison pEL020
Figure n" 6 : Construction du plasmide de recombinaison pGHO11
MATERIELS ET METHODES
Toutes les techniques utilisées pour le clonage des matériels génomiques viraux et pour les constructions de plasmides recombinants sont les techniques standards décrites par Maniatis et al. 1982, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY.
Figure n" 4 : Construction du plasmide de recombinaison pGH010
Figure n S : Construction du plasmide de recombinaison pEL020
Figure n" 6 : Construction du plasmide de recombinaison pGHO11
MATERIELS ET METHODES
Toutes les techniques utilisées pour le clonage des matériels génomiques viraux et pour les constructions de plasmides recombinants sont les techniques standards décrites par Maniatis et al. 1982, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY.
Virus et culture du virus
Le virus utilisé comme virus parental est la souche FC126 de l'herpèsvirus de la dinde (HVT) isolée en 1968 par le Dr. Witter du Regional Poultry Research
Laboratory (USDA, East Lansing, Michigan, USA), dans un troupeau de dindes de 23 semaines (R.L. Witter et ai. 1970,
Am. J. Vet. Res. 31, 525-538). Les conditions de culture de ce virus sont celles décrites par ailleurs (Demande de brevet français Al 2659349).
Le virus utilisé comme virus parental est la souche FC126 de l'herpèsvirus de la dinde (HVT) isolée en 1968 par le Dr. Witter du Regional Poultry Research
Laboratory (USDA, East Lansing, Michigan, USA), dans un troupeau de dindes de 23 semaines (R.L. Witter et ai. 1970,
Am. J. Vet. Res. 31, 525-538). Les conditions de culture de ce virus sont celles décrites par ailleurs (Demande de brevet français Al 2659349).
Clonage et séquençage du segment A du virus IBDV
Le virus IBDV (souche Farragher) a été purifié à partir de bourses de Fabricius de poulets infectés expérimentalement. L'ARN génomique a été extrait des virions purifiés et les ADNs complémentaires ont été synthétisés à partir des segments d'ARN génomique. L'ADN complémentaire correspondant au segment A (contenant le gène-codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3) a été cloné entre les sites XbaI et KpnI du vecteur pBlueScript KS+ (Stratagène) pour générer le plasmide pIBDVAO0. Le fragment XbaI-KpnI cloné a une taille de.3 060 pb représentant 96 % de la taille totale du segment A (environ 3 200 pb). Ce fragment a été entièrement séquencé (SEQ ID N" 1, Figure 1).
Le virus IBDV (souche Farragher) a été purifié à partir de bourses de Fabricius de poulets infectés expérimentalement. L'ARN génomique a été extrait des virions purifiés et les ADNs complémentaires ont été synthétisés à partir des segments d'ARN génomique. L'ADN complémentaire correspondant au segment A (contenant le gène-codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3) a été cloné entre les sites XbaI et KpnI du vecteur pBlueScript KS+ (Stratagène) pour générer le plasmide pIBDVAO0. Le fragment XbaI-KpnI cloné a une taille de.3 060 pb représentant 96 % de la taille totale du segment A (environ 3 200 pb). Ce fragment a été entièrement séquencé (SEQ ID N" 1, Figure 1).
Exemple 1 : Construction du plasmide donneur pGH010 pour l'insertion et l'expression du "gène" IBDV VP2 dans le locus HVT RR2.
Le plasmide pmpl9RR1Sma (cf Demande de brevet français Al 2659349) a été digéré par BamHI et SmaI pour isoler le fragment BamHI-SmaI 1 100 pb (Séquence flanquante 5' HVT RR2). Ce fragment a été cloné entre les sites BamHI et SmaI du vecteur pBluéScript SK+ (Stratagène) pour produire le plasmide pSK8. Le plasmide pmpl8RR2-Sal (cf
Demande de brevet français Al 2659349) a été digéré par KpnI et SalI pour isoler le fragment SalI-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2). Ce fragment a été cloné entre les sites KpnI et SalI du plasmide. pSK8 pour produire le plasmide pHVT 005 (5 990 pb).Le plasmide pHVT005 comprenant les séquences flanquantes 5' et 3' nécessaires à la recombinaison dans le locus HVT RR2 a été modifié par mutagenèse dirigée avec l'oligonucléotide de synthèse SEQ ID N" 2 (21 mer) : 5'CATGGCGGCGATCGTGAGTTA 3' pour générer le plasmide pHVT 006. Ce plasmide possède un site de restriction PvuI à l'extrémité 3' de la séquence flanquante 5'.
Demande de brevet français Al 2659349) a été digéré par KpnI et SalI pour isoler le fragment SalI-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2). Ce fragment a été cloné entre les sites KpnI et SalI du plasmide. pSK8 pour produire le plasmide pHVT 005 (5 990 pb).Le plasmide pHVT005 comprenant les séquences flanquantes 5' et 3' nécessaires à la recombinaison dans le locus HVT RR2 a été modifié par mutagenèse dirigée avec l'oligonucléotide de synthèse SEQ ID N" 2 (21 mer) : 5'CATGGCGGCGATCGTGAGTTA 3' pour générer le plasmide pHVT 006. Ce plasmide possède un site de restriction PvuI à l'extrémité 3' de la séquence flanquante 5'.
Le plasmide pIBDVA00 a été modifié par mutagenèse dirigée avec l'oliqonucléotide de synthèse SEQ ID N"3 (22 mer) : 5' AAGGAGGTAAGCTTTGCCGGTG 3' pour introduire un codon stop TAA et un site de restriction HindIII à la fin de la séquence codant pour VP2 (positions 1371 à 1378 sur la séquence SEQ ID N" 1). Le plasmide contenant la mutation recherchée a été dénommé pIBDVA01. Sur ce plasmide, le "gène" VP2 est encadré par les sites de restriction PvuI (11 bases en amont de 1'ATG) et Hindîli.
Le plasmide pHVT006 a été digéré par PvuI et SspI pour isoler le fragment SspI-PvuI (séquence flanquant 5' du locus HVT RR2). Ce fragment a été cloné entre les sites PvuI et SspI du vecteur pBR 322 pour générer le plasmide pGH001
(4 680 pb). Le plasmide pHVT006 a été digéré également par HindIII et KpnI pour isoler le fragment HindIII-KpnI 1 950 pb correspondant à la séquence flanquante 3' du locus HVT
RR2. Ce fragment a été cloné entre les sites Hindîli et KpnI du vecteur pUC 19 pour générer le plasmide pGH002 (4 595 pb).
(4 680 pb). Le plasmide pHVT006 a été digéré également par HindIII et KpnI pour isoler le fragment HindIII-KpnI 1 950 pb correspondant à la séquence flanquante 3' du locus HVT
RR2. Ce fragment a été cloné entre les sites Hindîli et KpnI du vecteur pUC 19 pour générer le plasmide pGH002 (4 595 pb).
Le plasmide pIBDVA0î a été digéré par HindIII et
XbaI pour isoler le fragment XbaI-HindIII 1 380 pb ("gène"
IBDV VP2). Ce fragment a été cl.oné entre les sites XbaI et
HindIII du vecteur pUC18 pour générer le plasmide pGH004
(4 050 pb).
XbaI pour isoler le fragment XbaI-HindIII 1 380 pb ("gène"
IBDV VP2). Ce fragment a été cl.oné entre les sites XbaI et
HindIII du vecteur pUC18 pour générer le plasmide pGH004
(4 050 pb).
Le. plasmide pGH002 a été digéré par HindîlI et
XmnI pour isoler le fragment XmnI-HindIII 2 740 pb (fragment
A). Le plasmide pGH004 a été digéré par HindIII et XmnI pour isoler le fragment XmnI-HindIII 3 240 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour générer le plasmide pGH006 (5 980 pb) comprenant la séquence flanquante 3' du locus HVT RR2 en aval du "gène" IBDV VP2.
XmnI pour isoler le fragment XmnI-HindIII 2 740 pb (fragment
A). Le plasmide pGH004 a été digéré par HindIII et XmnI pour isoler le fragment XmnI-HindIII 3 240 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour générer le plasmide pGH006 (5 980 pb) comprenant la séquence flanquante 3' du locus HVT RR2 en aval du "gène" IBDV VP2.
Le plasmide pGH006 a été digéré par PvuI pour
isoler le fragment PvuI-PvuI 3 440 pb ("gène" VP2-HVT RR2 3'). Ce fragment a été cloné dans le site unique PvuI de pGH001 pour générer .le plasmide pGH008 (8 135 pb). . Le plasmide pGH008 contient la construction du "gène" IBDV VP2 flanqué des séquences 5' et 3' nécessaires à la recombinaison homologue au niveau du locus d'insertion HVT
RR2, dans le vecteur pBR322.
isoler le fragment PvuI-PvuI 3 440 pb ("gène" VP2-HVT RR2 3'). Ce fragment a été cloné dans le site unique PvuI de pGH001 pour générer .le plasmide pGH008 (8 135 pb). . Le plasmide pGH008 contient la construction du "gène" IBDV VP2 flanqué des séquences 5' et 3' nécessaires à la recombinaison homologue au niveau du locus d'insertion HVT
RR2, dans le vecteur pBR322.
Le plasmide pGH008 a été digéré par KpnI et SspI pour isoler le fragment SspI - séquence flanquante 5' HVT
RR2 - "gène" VP2 - séquence flanquante 3' HVT RR2 - KpnI. Ce fragment a été cloné entre les sites KpnI et 5maI du vecteur pBlueScript KSf pour produire finalement le plasmide pGH010
(7 000 pb) qui a été utilisé pour les expériences de recombinaison. Dans cette construction, le "gène" IBDV VP2 se trouve sous la dépendance du promoteur de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HVT.
RR2 - "gène" VP2 - séquence flanquante 3' HVT RR2 - KpnI. Ce fragment a été cloné entre les sites KpnI et 5maI du vecteur pBlueScript KSf pour produire finalement le plasmide pGH010
(7 000 pb) qui a été utilisé pour les expériences de recombinaison. Dans cette construction, le "gène" IBDV VP2 se trouve sous la dépendance du promoteur de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HVT.
Exemple 2 : Construction du plasmide donneur pEL020 pour l'insertion et l'expression du "gène" IBDV VP3 dans le locus HVT RR2.
Le plasmide pIBDVAOO a été modifié par mutagenèse dirigée avec l'oligonucléotide de synthèse SEQ ID N 4 (27 mer) 5' CCTTGAGTGAGAATTCTGGTACCCAGC3' pour produire un site de restriction EcoRI juste après le stop du cadre ouvert de lecture codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3 (Position 3051 à 3056 sur la séquence SEQ ID N 1). Le plasmide contenant la mutation recherchée a été dénommé pIBDVA02.
Le plasmide pGHO10 a été digéré par BamHI et PvuI pour isoler le fragment BamHI-PvuI 755 pb (séquence flanquante 5' HVT RR2) (fragment A).
Le plasmide pGH010 a été digéré par HindIII et
KpnI pour isoler le fragment HindIII-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2) (fragment B).
KpnI pour isoler le fragment HindIII-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2) (fragment B).
Le plasmide pIBDVA02 a été digéré par EcoRI et
XhoI pour isoler le fragment XhoI-EcoRI 750 pb ("gène" VP3 moins les 130 premières paires de bases) (fragment C).
XhoI pour isoler le fragment XhoI-EcoRI 750 pb ("gène" VP3 moins les 130 premières paires de bases) (fragment C).
La partie 5' du "gène" VP3 (130 pb) a été obtenue par amplification PCR en utilisant les oligonucléotides de synthèse SEQ ID N" 5 (42 mer) 5' ATTATCACGATCGCCGCCATGTTCCCTCACAATCCACGAGAC 3' et SEQ ID N 6 (22 mer) 5'CTGACAGCGCTCTCGAGTTCAG 3' et le.plasmide pIBDVA00 comme matrice. Le fragment PCR a été digéré par PvuI et XhoI pour obtenir le fragment PvuI-XhoI 140 pb (fragment D) (10 dernières bases de la séquence flanquante 5' HVT RR2 - 130 premières bases du "gène" VP3). Le "gène" VP3 est ainsi initié par une méthionine créée au niveau des positions 2178 à 2180 sur la séquence SEQ ID N" 1. Cette méthionine remplace l'arginine du site de clivage théorique Lys-Arg entre VP4 et VP3. Le fragment B a été cloné entre les sites
KpnI et HindîlI du vecteur pBlueScript SK+ pour produire le plasmide pEL018 (4 900 pb). Les fragments A et D ont été ligaturés dans le vecteur pBlueScript SK préalablement digéré par BamHI et XhoI pour produire le plasmide pEL019 (3 800 pb).
KpnI et HindîlI du vecteur pBlueScript SK+ pour produire le plasmide pEL018 (4 900 pb). Les fragments A et D ont été ligaturés dans le vecteur pBlueScript SK préalablement digéré par BamHI et XhoI pour produire le plasmide pEL019 (3 800 pb).
Le plasmide pEL018 a été digéré par BamHI et EcoRI pour isoler le vecteur linéaire pEL018 BamHI-EcoRI (fragment
E).
E).
Le plasmide pEL019 a été digéré par BamHI et XhoI pour isoler le fragment BamHI séquence fianquante 5' HVT
RR2 - VP3 5'-XhoI 890 bp (fragment F).
RR2 - VP3 5'-XhoI 890 bp (fragment F).
Les fragments C, E et F ont finalement été ligaturés ensemble pour produire le plasmide pEL020 (6 510 pb). Le plasmide pEL020 contient la construction du "gène"
IBDV VP3 inséré dans le locus HVT RR2. Dans cette construction, le "gène" IBDV VP3 se trouve sous la dépendance du promoteur de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HVT. Le plasmide pEL020 a été utilisé pour les expériences de recombinaison.
IBDV VP3 inséré dans le locus HVT RR2. Dans cette construction, le "gène" IBDV VP3 se trouve sous la dépendance du promoteur de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HVT. Le plasmide pEL020 a été utilisé pour les expériences de recombinaison.
Exemple 3 : Construction du plasmide donneur pGH011 pour l'insertion e-t l'expression du gène codan-t pour la polyprotéine VP2 - VP4 - VP3 du virus IBDV dans le locus
HVT RR2.
HVT RR2.
Le plasmide pHVT006 précédemment décrit a été digéré par EcoRI et KpnI pour isoler le fragment EcoRI-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2). Ce fragment a été cloné entre les sites EcoRI et KpnI du vecteur pUC18 pour produire le plasmide pGH003 (o 860 pb).
Le plasmide pIBDVA02 précédemment décrit a été digéré par NotI, réparé par la polymérase Klenow, et digéré par EcoRI pour isoler le fragment "Blunt" - EcoRI 3 050 pb représentant la totalité du gène codant pour la polyprotéine d'IBDV. Ce fragment a été cloné entre les sites EcoRI et 5maI de pUC19 pour produire le plasmide pGH005 (5 730 pb).
Le plasmide pGH003 précédemment décrit a été digéré par EcoRI et SspI pour isoler le fragment SspI-EcoRI 2 570 pb (vecteur pUC18 partiel + séquence flanquante 3' HVT
RR2) (fragment A).
RR2) (fragment A).
Le plasmide pGH005 a également été digéré par
EcoRI et SspI pour isoler le fragment SspI.- EcoRI 5 720 pb (vecteur pUC partiel + gène de la polyprotéine IBDV) (fragment B).
EcoRI et SspI pour isoler le fragment SspI.- EcoRI 5 720 pb (vecteur pUC partiel + gène de la polyprotéine IBDV) (fragment B).
Les fragments A et B ont alors été ligaturés ensemble pour produire le plasmide pGH007 (7 990 pb) comprenant le gène de la polyprotéine IBDV flanqué en 3' de la séquence HVT RR2 3'.
Le plasmide pGH007 a été digéré par PvuI pour isoler le fragment PvuI-PvuI 5 110 pb (gène IBDV polyprotéine + séquence flanquante 3' HVT RR2). Ce fragment a été cloné dans le site unique PvuI du plasmide pGH001 précédemment décrit pour produire le plasmide pGH009 (9 805 pb). Ce plasmide contient la construction du gène de la polyprotéine VP2 - VP4 - VP3 du virus IBDV flanqué des séquences 5' et 3' nécessaires à la recombinaison homologue dans le locus d'insertion HVT RR2. Dans cette construction, le gène de la polyprotéine d'IBDV se trouve sous la dépendance du promoteur du gène codant pour la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HVT.
Le plasmide pGH009 a été digéré par KpnI et SspE pour isoler le fragment SspI - séquence flanquante 5' HVT
RR2 - gène de la polyprotéine IBDV - séquence flanquante 3'
HVT RR2 - KpnI 5725 pb. Ce fragment a finalement été cloné entre les sites KpnI et SmaI du vecteur pBlueScript KS+ pour produire le plasmide pGH0Iî (8 630 pb).
RR2 - gène de la polyprotéine IBDV - séquence flanquante 3'
HVT RR2 - KpnI 5725 pb. Ce fragment a finalement été cloné entre les sites KpnI et SmaI du vecteur pBlueScript KS+ pour produire le plasmide pGH0Iî (8 630 pb).
Exemple 4 : Constructions des "gènes" VP2, VP3, et du gène codant pour la polyprotéine dans d'autres sites d'expression existant sur le génome d'HVT.
Il est possible pour l'homme de l'art de construire d'autres plasmides de recombinaison pour insérer le gène de la polyprotéine ou les "gènes" VP2 et VP3 dans des sites d'expression présents sur le génome d'HVT, et autres que le site d'expression RR2 (petite.sous-unité de la ribonucléotide réductase). Par exemple, on peut insérer ces gènes au niveau du gène thymidine kinase (TK) ou du gène codant pour la sérine/thréonine protéine kinase (PK) (gène
HVT homologue du gène HSV-1 US3) du virus HVT.
HVT homologue du gène HSV-1 US3) du virus HVT.
Dans ces constructions, les gènes IBDV peuvent être placés sous le contrôle du promoteur endogène correspondant au site d'expression choisi (par exemple promoteur du gène HVT TK, ou promoteur du gène HVT PK) ou bien sous le contrôle de promoteurs rapportés (tels que par exemple le promoteur du gène "immediate-early" du virus
CMV).
CMV).
Exemple 5 : Isolement et purification d'un virus recombinant HVT/IBDV VP2 (vHVTl).
Des cellules primaires d'embryons de poulets ont été cotransfectées avec 5 ug de plasmide pGH010 et 1 pg d'ADN génomique HVT FC126 infectieux selon la technique de la lipofectine, puis réparties en plaques 96 puits et cultivées pendant 72 à 96 heures selon les conditions déjà décrites (demande de brevet français Al 2659349). Les cupules présentant une seule plage d'effet cytopathique ont été trypsinées, prélevées et soniquées. La moitié environ du prélèvement de chaque cupule a été déposée et fixée sur un filtre de nitrocellulose. La recherche de la présence des virus HVT recombinants ayant inséré le "gène" IBDV VP2 a été réalisée selon la technique du "dot blot" avec une sonde radioactive spécifique de la séquence nucléotidique du "gène" IBDV VP2.L'autre moitié de l'un des échantillons donnant un signal positif a été soniquée et répartie à nouveau sur une plaque 96 puits pour un nouveau cycle de culture sur cellules primaires d'embryonsd poulets. 3 à 4 cycles successifs de ce processus ont permis d'obtenir un virus recombinant à 100 % de pureté et comprenant le gène
IBDV VP2 inséré dans le site d'expression HVT RR2. Ce virus recombinant pur à 100 % a été dénommé vHVTl.La recombinaison homologue au niveau du site RR2 a été vérifiée par la technique du "Southern blot" avec des sondes spécifiques du gène VP2, du gène HVT RR2 et des sondes spécifiques des régions. situées en amont et en aval des séquences flanquantes HVT RR2 5' et 3' utilisées dans le plasmide pGH010. L'expression du produit du "gène" VP2 a été contrôlée par un test d'immunofluorescence indirecte avec un anticorps monoc-lonal reconnaissant spécifiquement un épitoge conformationnel situé sur la protéine VP2 du virus IBDV. Les cellules infectées par le virus recombinant vHVTl présentent
toutes une fluorescence (interne) alors que les cellules
infectées par le virus parental HVT FC126 ne présentent pas de fluorescence.
IBDV VP2 inséré dans le site d'expression HVT RR2. Ce virus recombinant pur à 100 % a été dénommé vHVTl.La recombinaison homologue au niveau du site RR2 a été vérifiée par la technique du "Southern blot" avec des sondes spécifiques du gène VP2, du gène HVT RR2 et des sondes spécifiques des régions. situées en amont et en aval des séquences flanquantes HVT RR2 5' et 3' utilisées dans le plasmide pGH010. L'expression du produit du "gène" VP2 a été contrôlée par un test d'immunofluorescence indirecte avec un anticorps monoc-lonal reconnaissant spécifiquement un épitoge conformationnel situé sur la protéine VP2 du virus IBDV. Les cellules infectées par le virus recombinant vHVTl présentent
toutes une fluorescence (interne) alors que les cellules
infectées par le virus parental HVT FC126 ne présentent pas de fluorescence.
Exemple 6 : Isolement et purification des virus recombinants HVTiIBDV VP3 et HVT/IBDV polyprotéine
VP2-VP4-VP3.
VP2-VP4-VP3.
Le schéma de sélection des virus recombinants
HVT/IBDV VP3 et HVT/IBDV polyprotéine est le même que celui qui a été suivi pour la purification du virus vHVT1, sauf que des réactifs spécifiques des Virus recombinants recherchés ont été utilisés, à savoir une sonde spécifique de la séquence nucléotidique du "gène" VP3 et un sérum spécifique de VP3 pour le virus HVT/VP3, et les sondes ADN spécifiques de VP2 et de VP3 et les anticorps spécifiques des produits des "gènes" VP2 et VP3 pour le recombinant
HVT/IBDV polyprotéine.
HVT/IBDV VP3 et HVT/IBDV polyprotéine est le même que celui qui a été suivi pour la purification du virus vHVT1, sauf que des réactifs spécifiques des Virus recombinants recherchés ont été utilisés, à savoir une sonde spécifique de la séquence nucléotidique du "gène" VP3 et un sérum spécifique de VP3 pour le virus HVT/VP3, et les sondes ADN spécifiques de VP2 et de VP3 et les anticorps spécifiques des produits des "gènes" VP2 et VP3 pour le recombinant
HVT/IBDV polyprotéine.
Exemple 7 : Obtention d'un virus recombinant HVT double HVT/VP2 + VP3.
Ce recombinant peut être obtenu de .plusieurs manières. On peut soit utiliser le virus vHVTl comme virus parental et cotransfecter l'ADN infectieux de ce virus avec un plasmide donneur contenant l'une des constructions du "qène" IBDV VP3 dans le site d'expression PK décrites dans l'exemple 4, soit utiliser le virus vHVT/VP3 ("gène" VP3 exprimé dans le site HVT RR2) comme virus parental et cotransfecter l'ADN infectieux de ce virus avec un plasmide donneur contenant l'une des constructions du "gène" IBDV VP2 dans le site d'expression PK, constructions qui auront été réalisées selon un mode similaire aux constructions de VP3 dans le site PK et réalisable par toute personne de l'art.
Figure n 1 : Séquence de la région du segment A du génome du virus IBDV (souche Farragher) codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3.
Informations pour SEQ ID n 1 1. Caractéristiques de la séquence
a) Longueur : 3 063 paires de bases
b) Type : nucléotides 2. Nombre de brins : double brin 3. Configuration de la séquence : linéaire 4. Type : ADN complémentaire 5. Séquence hypothétique : non 6. Antisens : non 7. Origine de la molécule
a) Organisme Infectious Bursal Disease Virus
(virus de la maladie de Gumboro)
b) Souche : Farragher 8. Bibliothèque d'ADN complémentaire
Figure n 1 : Séquence de la région du segment A du génome du virus
IBDV (souche Farragher) codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3 Informations pour SEQ ID no a 1. Caractéristiques de la séquence
a) Longueur : 3 063 paires de bases
b) Type : nucléotides 2. Nombre de brins : double brin 3. Configuration de la séquence : linaire 4. Type : ADN complémentaire 5. Séquence hypothétique : non 6. Antisens non non 7. Origine de la molecule
a) Organisme : Infrctious Bursal Disease Virus (virus de la
maladie de Gumboro3
b) Souche : Farragher 8. Bibliothèque d'ADN complémentaire
a) Longueur : 3 063 paires de bases
b) Type : nucléotides 2. Nombre de brins : double brin 3. Configuration de la séquence : linéaire 4. Type : ADN complémentaire 5. Séquence hypothétique : non 6. Antisens : non 7. Origine de la molécule
a) Organisme Infectious Bursal Disease Virus
(virus de la maladie de Gumboro)
b) Souche : Farragher 8. Bibliothèque d'ADN complémentaire
Figure n 1 : Séquence de la région du segment A du génome du virus
IBDV (souche Farragher) codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3 Informations pour SEQ ID no a 1. Caractéristiques de la séquence
a) Longueur : 3 063 paires de bases
b) Type : nucléotides 2. Nombre de brins : double brin 3. Configuration de la séquence : linaire 4. Type : ADN complémentaire 5. Séquence hypothétique : non 6. Antisens non non 7. Origine de la molecule
a) Organisme : Infrctious Bursal Disease Virus (virus de la
maladie de Gumboro3
b) Souche : Farragher 8. Bibliothèque d'ADN complémentaire
Claims (8)
1. Un virus recombinant herpès de la dinde (HVT) contenant des séquences codantes de protéines structurales du virus de la maladie de Gumboro, caractérisé en ce qu il contient, dans un site de son génome, au moins une séquence codant pour une protéine choisie dans le groupe formé par les protéines VP2 et VP3 dans des conditions permettant l'expression desdites séquences et la production de ladite protéine, la séquence codant pour la protéine VP4 étant absente ou incapable d'être exprimée.
2. Un virus selon la-revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte, d'une part la séquence codant pour la protéine VP2 et d'autre part la séquence codant pour la protéine VP3 de façon à permettre leur expression simultanée.
3. Un virus selon la revendication 2, caractérisé en ce que les deux séquences sont insérées dans un même site du génome.
4. Un virus selon la revendication 2, caractérisé en ce que les deux séquences sont insérées dans deux sites distincts du génome.
5. Mélange de virus HVT recombinants selon la revendication 1, l'un desdits virus contenant la séquence codant pour VP2 et l'autre, la séquence codant pour VP3.
6. Vaccin caractérisé en ce qu il comporte au moins l'un des virus selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Vaccin selon -la revendication 6, contenant un tel virus vivant.
8. Un vaccin vivant recombinant contre la maladie de GUMBORO, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule usuel approprié une quantité efficace de virus HVT dont le génome contient des gènes codant pour VP2 et VP3 dans des conditions permettant leur expression in vivo chez le poulet.
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|---|---|---|---|
| FR9213109A FR2697534A1 (fr) | 1992-11-02 | 1992-11-02 | Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu. |
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