WO1994010321A1 - Vecteur herpesviral de la dinde comme vaccin recombinant contre la maldie de gumboro - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the use of a recombinant herpes turkey virus (HVT) for the production of a vaccine protecting chickens against Gumboro disease as well as its preparation process and the vaccine obtained.
- HVT herpes turkey virus
- the Gumboro disease virus infecting the lymphoid tissue of the bursa of Fabricius causes severe immunosuppression in chicken. In addition to the clinical disease causing weight loss and mortality, the virus is responsible for a reduction in the resistance of animals to other avian pathogens.
- the disease is now controlled with live attenuated or inactivated vaccines. Because of the presence of passive immunity transmitted by the hen, the chicks are currently vaccinated with an attenuated vaccine during the first weeks following hatching. Such attenuated vaccines can show residual virulence and cause damage to the bursa of Fabricius.
- the HVT virus is a prime candidate for the development of such a vaccine vector in the avian field since it has the double advantage of being able to be used for its own vaccine properties against Marek's disease and as a vaccine for Gumboro disease. .
- the HVT virus causes permanent viremia in the chick and can be used in embryo-vaccination.
- the Gumboro disease virus belongs to the Birnaviridae family.
- the viral genome consists of a bisected double-stranded RNA.
- the smallest segment (segment B) codes for a 90 kDa protein probably corresponding to a replicase.
- the largest segment (segment A) codes for a 115 kDa polyprotein secondarily cleaved into three proteins VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa).
- VP4 is a protease involved in the maturation of the 115 kDa polyprotein.
- the structural protein VP2 is an immunogen that induces neutralizing antibodies and protects against Gumboro disease in chicken.
- the VP2 protein produced using an expression vector in yeast cells, induces seroprotective antibodies (K. Fahey et al. Avian Pathology, 1991, 20, 447-460).
- the protein VP2 induces protection against mortality following a virulent test but not against reaching the Fabricius bursa (C. Bayliss et al., Archives of Virology, 1991, 120, 193 -205).
- the protein VP2 expressed in E. Coli does not induce any protective response (M. Jagadish et al., Gene, 1990, 95, 179-186).
- the antigenic determinant inducing neutralizing antibodies located in the central region of VP2, is highly dependent on the conformation of the protein.
- the amino acid sequence corresponding to this region shows significant variability between the different strains of serotype 1.
- the VP3 protein has a strong cross-reactivity with the monoclonal antibodies specific for the two serotypes and carries a group specific antigenic determinant.
- the VP3 protein expressed in E. Coli as a fusion protein with ⁇ galactosidase, induces a weak response in neutralizing antibodies in one in six chickens (A. Azad, Virology, 1986, 149, 190-198).
- the 115 kDa polyprotein was expressed in yeast cells.
- the precursor thus expressed giving birth after cleavage to the proteins VP2, VP3 and VP4, induces seroprotective antibodies in chicken (K. Fahey et al., Avian pathology, 1991, 20, 447-460).
- the 115 kDa precursor expressed using an HVT vector even after cleavage of VP2, VP3 and VP4 does not significantly induce neutralizing or protective antibodies (Patent WO 89/01040 of 27 July 1988).
- the present invention therefore aims to provide recombinant herpes turkey viruses (HVT) for production of an effective live vaccine against Gumboro disease.
- HVT herpes turkey viruses
- the subject of the invention is the description of the insertion of the genes coding for VP2 and VP3 into the genome of the HVT virus.
- the subject of the invention is a live recombinant vaccine against Gumboro disease, characterized in that it comprises, in a suitable usual vehicle, an effective amount of HVT virus, the genome of which contains genes coding for VP2 and VP3 in conditions allowing their expression in vivo.
- the vaccine may contain two HVT viruses into which the genes coding for
- VP2 and VP3 or an HVT virus in the genome of which have been inserted, at the same insertion site, or at two separate sites, the genes coding for VP2 and VP3.
- SEQ ID no 1 Sequence of the segment A region of the genome of the IBDV virus coding for the polyprotein VP2, VP4, VP3
- FIG. 1 Construction of the recombination plasmid pGH011
- FIG. 2 Construction of the plasmid pHVT 006
- Figure 3 Construction of the plasmids pIBDVAO 1 and pIBDVA02
- FIG. 5 Construction of the recombination plasmid pEL020
- the virus used as parental virus is the strain FC126 of the turkey herpesvirus (HVT) isolated in
- segment A of the IBDV virus The IBDV virus (Farragher strain) was purified from bursa of Fabricius from experimentally infected chickens. Genomic RNA was extracted from purified virions and complementary DNAs were synthesized from the genomic RNA segments. The complementary DNA corresponding to segment A (containing the gene coding for the polyprotein VP2-VP4-VP3) was cloned between the Xbal and KpnI sites of the vector pBlueScript KS + (Stratagene) to generate the plasmid pIBDVA00. The cloned Xbal-KpnI fragment has a size of 3060 bp representing 96% of the total size of segment A (approximately 3200 bp). This fragment was completely sequenced (SEQ ID No. 1, Figure 1).
- Example 1 Construction of the donor plasmid pGHO10 for the insertion and expression of the IBDV VP2 "gene" in the HVT RR2 locus.
- the plasmid pmp19RRlSma (cf. French Patent Application A1 2659349) was digested with BamHI and SmaI to isolate the BamHI-SmaI fragment 1100 bp (5 'flanking sequence HVT RR2). This fragment was cloned between the BamHI and SmaI sites of the vector pBlueScript SK + (Stratagene) to produce the plasmid pSK8.
- the plasmid pmpl8RR2-Sal (cf. French patent application Al 2659349) was digested with KpnI and Sali to isolate the Sall-KpnI 1950 bp fragment (3 'flanking sequence HVT RR2).
- This fragment was cloned between the KpnI and SalI sites of the plasmid pSK8 to produce the plasmid pHVT 005 (5,990 bp).
- the plasmid pHVT005 comprising the 5 'and 3' flanking sequences necessary for recombination in the HVT RR2 locus was modified by site-directed mutagenesis with the synthetic oligonucleotide SEQ ID No 2 (21 mer): 5 'CATGGCGGCGATCGTGAGTTA 3' to generate the plasmid pHVT 006
- This plasmid has a Pvul restriction site at the 3 'end of the 5' flanking sequence.
- the plasmid pIBDVAOO was modified by site-directed mutagenesis with the synthetic oligonucleotide SEQ ID No. 3 (22 mer): 5 'AAGGAGGTAAGCTTTGCCGGTG 3' to introduce a stop codon TAA and a HindIII restriction site at the end of the coding sequence for VP2 (positions 1371 to 1378 on the sequence SEQ ID No. 1).
- the plasmid containing the mutation sought was called pIBDVA01. On this plasmid, the VP2 "gene” is surrounded by the Pvul (11 bases upstream of the ATG) and HindIII restriction sites.
- the plasmid pHVTOO6 was digested with Pvul and Sspl to isolate the Sspl-Pvul fragment (5 'flanking sequence of the HVT locus RR2). This fragment was cloned between the Pvul and Sspl sites of the vector pBR 322 to generate the plasmid pGH001
- the plasmid pHVT006 was also digested with HindIII and KpnI to isolate the HindIII-KpnI 1950 bp fragment corresponding to the 3 'flanking sequence of the HVT RR2 locus. This fragment was cloned between the HindIII and KpnI sites of the vector pUC 19 to generate the plasmid pGH002 (4595 bp).
- the plasmid pIBDVA01 was digested with HindIII and
- Plasmid pGH002 was digested with HindIII and
- Plasmid pGH004 was digested with HindIII and Xmnl to isolate the XmnI-HindIII 3,240 bp fragment (fragment B). The Fragments A and B were ligated together to generate the plasmid pGH006 (5,980 bp) comprising the 3 'flanking sequence of the HVT RR2 locus downstream of the IBDV VP2 "gene".
- Plasmid pGH006 was digested with Pvul to isolate the PvuI-PvuI 3440 bp fragment ("gene" VP2-HVT RR2
- Plasmid pGH008 contains the construction of the IBDV VP2 "gene" flanked by the 5 'and 3' sequences necessary for homologous recombination at the HVT insertion locus
- Plasmid pGH008 was digested with KpnI and Sspl to isolate the SspI fragment - 5 'flanking sequence HVT RR2 - "gene” VP2 - 3' flanking sequence HVT RR2 - KpnI. This fragment was cloned between the KpnI and SmaI sites of the pBlueScript KS + vector to finally produce the plasmid pGHO10 (7000 bp) which was used for the recombination experiments.
- the IBDV VP2 "gene” is under the control of the promoter of the small subunit of the ribonucleot ide reductase of the HVT virus.
- Example 2 Construction of the donor plasmid PEL020 for the insertion and expression of the IBDV VP3 "gene" in the HVT RR2 locus.
- the plasmid pIBDVAOO was modified by site-directed mutagenesis with the synthetic oligonucleotide SEQ ID N ° 4 (27 mer) 5 'CCTTGAGTGAGAATTCTGGTACCCAGC3' to produce an EcoRI restriction site just after the stop of the open reading frame coding for the polyprotein VP2- VP4-VP3 (Position 3051 to 3056 on the sequence SEQ ID No. 1).
- the plasmid containing the mutation sought was called pIBDVA02.
- the plasmid pGHO10 was digested with BamHI and PvuI to isolate the BamHI-PvuI 755 bp fragment (5 'flanking sequence HVT RR2) (fragment A).
- the plasmid pGHO10 was digested with HindIII and KpnI to isolate the HindIII-KpnI 1 950 bp fragment (3 'flanking sequence HVT RR2) (fragment B).
- the plasmid pIBDVA02 was digested with EcoRI and XhoI to isolate the XhoI-EcoRI 750 bp fragment ("gene" VP3 minus the first 130 base pairs) (fragment C).
- the 5 'part of the VP3 "gene” (130 bp) was obtained by PCR amplification using the synthetic oligonucleotides SEQ ID No 5 (42 mer) 5' ATTATCACGATCGCCGCCATGTTCCCTCACAATCCACGAGAC 3 'and SEQ ID No 6 (22 mer) 5 'CTGACAGCGCTCTCGAGTTCAG 3' and the plasmid pIBDVA00 as matrix.
- the PCR fragment was digested with Pvul and Xhol to obtain the PvuI-XhoI 140 bp fragment (fragment D) (last 10 bases of the 5 'flanking sequence HVT RR2 - first 130 bases of the "gene” VP3).
- the VP3 "gene” is thus initiated by a methionine created at positions 2178 to 2180 on the sequence SEQ ID No. 1. This methionine replaces the arginine of the theoretical Lys-Arg cleavage site between VP4 and VP3.
- Fragment B was cloned between the KpnI and HindIII sites of the vector pBlueScript SK + to produce the plasmid pEL018 (4,900 bp).
- Fragments A and D were ligated into the vector pBlueScript SK + previously digested with BamHI and Xhol to produce the plasmid pEL019 (3800 bp).
- the plasmid pEL018 was digested with BamHI and EcoRI to isolate the linear vector pEL018 BamHI-EcoRI (fragment
- Plasmid pEL019 was digested with BamHI and Xhol to isolate the BamHI fragment - flanking sequence 5 'HVT RR2 - VP3 5 '-XhoI 890 bp (fragment F).
- Plasmid pEL020 contains the construction of the IBDV VP3 "gene" inserted into the HVT RR2 locus. In this construction, the IBDV VP3 "gene” is under the control of the promoter of the small subunit of the ribonucleotide reductase of the HVT virus. Plasmid pEL020 was used for the recombination experiments.
- Example 3 Construction of the donor plasmid pGH011 for the insertion and expression of the gene coding for the polyprotein VP2-VP4-VP3 of the IBDV virus in the HVT RR2 locus.
- the plasmid pHVT006 previously described was digested with EcoRI and KpnI to isolate the EcoRI-KpnI fragment
- the plasmid pIBDVA02 previously described was digested with NotI, repaired by Klenow polymerase, and digested with EcoRI to isolate the "Blunt" - EcoRI 3050 bp fragment representing the entire gene coding for the IBDV polyprotein. This fragment was cloned between the EcoRI and SmaI sites of pUC19 to produce the plasmid pGH005 (5 730 bp).
- the plasmid pGH003 previously described was digested with EcoRI and Sspl to isolate the SspI-EcoRI 2,570 bp fragment (partial pUC18 vector + 3 'flanking sequence HVT RR2) (fragment A).
- Plasmid pGH005 was also digested with EcoRI and Sspl to isolate the Sspl - EcoRI 5 720 bp fragment.
- Fragments A and B were then ligated together to produce the plasmid pGH007 (7,990 bp) comprising the polyprotein IBDV gene flanked 3 ′ of the HVT RR2 3 ′ sequence.
- the plasmid pGH007 was digested with PvuI to isolate the PvuI-PvuI 5 110 bp fragment (IBDV polyprotein gene + 3 'flanking sequence HVT RR2). This fragment was cloned into the unique PvuI site of the plasmid pGH001 previously described to produce the plasmid pGH009 (9,805 bp).
- This plasmid contains the construction of the gene for the polyprotein VP2 - VP4 - VP3 of the IBDV virus flanked by the 5 'and 3' sequences necessary for the recombination of its counterpart in the insertion locus HVT RR2. In this construction, the IBDV polyprotein gene is under the control of the promoter of the gene coding for the small subunit of the r ibonucleot ide reductase of the HVT virus.
- Plasmid pGH009 was digested with KpnI and Sspl to isolate the Sspl fragment - 5 'flanking sequence HVT RR2 - IBDV polyprotein gene - 3' flanking sequence HVT RR2 - KpnI 5725 bp. This fragment was finally cloned between the KpnI and SmaI sites of the pBlueScript KS + vector to produce the plasmid pGH011 (8,630 bp).
- Example 4 Constructions of the VP2, VP3 "genes" and of the gene coding for the polyprotein in other expression sites existing on the HVT genome.
- telomeres genes that can be inserted at the level of the thymidine kinase (TK) gene or of the gene coding for serine / threonine protein kinase (PK) (HVT gene homologous to the HSV-1 US3 gene) of the HVT virus.
- TK thymidine kinase
- PK serine / threonine protein kinase
- the IBDV genes can be placed under the control of the endogenous promoter corresponding to the chosen expression site (for example promoter of the HVT TK gene, or promoter of the HVT PK gene) or else under the control of reported promoters (such as for example the promoter of the "immediate-early" gene of the CMV virus).
- the endogenous promoter corresponding to the chosen expression site for example promoter of the HVT TK gene, or promoter of the HVT PK gene
- reported promoters such as for example the promoter of the "immediate-early" gene of the CMV virus.
- Example 5 Isolation and purification of a recombinant virus HVT / IBDV VP2 (vHVTl).
- the search for the presence of the recombinant HVT viruses having inserted the "gene” IBDV VP2 was carried out according to the technique of "dot blot" with a radioactive probe specific for the nucleotide sequence of the "gene” IBDV VP2.
- the other half of one of the samples giving a positive signal was sonicated and distributed again on a 96-well plate for a new culture cycle on primary cells of chicken embryos. 3 to 4 successive cycles of this process have resulted in a 100% purity recombinant virus comprising the IBDV VP2 gene inserted into the HVT RR2 expression site. This 100% pure recombinant virus was called vHVT 1.
- the homologous recombination at the RR2 site was verified by the "Southern blot" technique with probes specific for the VP2 gene, the HVT gene RR2 and probes specific for the regions. , located upstream and downstream of the flanking sequences HVT RR2 5 'and 3' used in the plasmid pGHO10.
- the expression of the product of the VP2 "gene” was checked by an indirect immunofluorescence test with a monoclonal antibody specifically recognizing a conformational epi tope located on the protein VP2 of the IBDV virus.
- the cells infected with the recombinant virus vHVT1 all show fluorescence (internal) while the cells infected with the parental virus HVT FC126 do not show fluorescence.
- Example 6 Isolation and purification of the recombinant viruses HVT / IBDV VP3 and HVT / IBDV polyprotein VP2-VP4-VP3.
- HVT / IBDV VP3 and HVT / IBDV polyprotein is the same as that followed for the purification of the vHVT 1 virus, except that reagents specific for the recombinant viruses sought were used, namely a probe specific for the nucleotide sequence of " gene "VP3 and a serum specific for VP3 for the HVT / VP3 virus, and the DNA probes specific for VP2 and VP3 and the antibodies specific for the products of the" genes "VP2 and VP3 for the recombinant HVT / IBDV polyprotein.
- Example 7 Obtaining a double HVT recombinant virus HVT / VP2 + VP3.
- This recombinant can be obtained in several ways.
- Type nucleotides 2. Number of strands: double strand
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Abstract
Virus herpés de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu. Un virus recombinant herpès de la dinde (HVT) contenant des séquences codantes de protéines structurales du virus de la maladie de Gumboro, caractérisé en ce qu'il contient, dans un site de son génome, au moins une séquence codant pour une protéine choisie dans le groupe formé par les protéines VP2 et VP3 dans des conditions permettant l'expression desdites séquences et la production de ladite protéine, la séquence codant pour la protéine VP4 étant absente ou incapable d'être exprimée. Vaccin comprenant ce virus.
Description
VECTEUR HERPESVIRAL DE LA DINDE COMME VACCIN RECOMBINANT CONTRE LA MALADIE DE GUMBORO.
La présente invention concerne l'utilisation d'un virus recombinant herpès de la dinde (HVT) pour la réalisation d'un vaccin protégeant les poulets contre la maladie de Gumboro ainsi que son procédé de préparation et le vaccin obtenu.
Le virus de la maladie de Gumboro infectant les tissus lymphoïdes de la bourse de Fabricius, cause chez le poulet une sévère iπununodépression. En dehors de la maladie clinique entraînant perte de poids et mortalité, le virus est à l'origine d'une diminution de la résistance des animaux vis-à-vis d'autres pathogènes aviaires. La maladie est aujourd'hui contrôlée avec des vaccins vivants atténués ou inactivés. A cause de la présence d'une immunité passive transmise par la poule, les poussins sont actuellement vaccinés avec un vaccin atténué durant les premières semaines suivant l'éciosion. De tels vaccins atténués peuvent présenter une virulence résiduelle et provoquer des lésions au niveau de la bourse de Fabricius.
Le virus HVT est un candidat de choix pour le développement d'un tel vecteur vaccinal dans le domaine aviaire puisqu'il présente le double avantage de pouvoir être utilisé pour ses propriétés vaccinales propres contre la maladie de Marek et comme vaccin de la maladie de Gumboro. De plus le virus HVT entraîne une virémie permanente chez le poussin et peut être utilisé en embryovaccinat ion.
La technique pour construire un virus HVT recombinant a été décrite, en particulier dans les brevets antérieurs (PCT WO 90/02803, EP 0447303 Al, EP 0477056 Al).
Le virus de la maladie de Gumboro appartient à la famille des Birnaviridae. Le génome viral est constitué d'un ARN double brin bisegmenté. Le segment le plus petit (segment B) code pour une protéine de 90 kDa correspondant probablement à une réplicase. Le segment le plus grand (segment A) code pour une polyprotéine de 115 kDa secondairement clivée en trois protéines VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa). VP4 serait une protéase intervenant dans la maturation de la polyprotéine 115 kDa.
Deux sérotypes ont été décrits ainsi que différents variants appartenant au sérotype 1. L'apparition de ces variants cause d'importants problèmes à l'industrie, du poulet.
La protéine structurale VP2 est un immunogène induisant des anticorps neutralisants et une protection contre la maladie de Gumboro chez le poulet. La protéine VP2 produite à l'aide d'un vecteur d'expression dans des cellules de levure, induit des anticorps séroprotecteurs (K. Fahey et al. Avian Pathology, 1991, 20, 447-460). Produite sous forme de protéine de fusion avec la β galactosidase à
l'aide d'un vecteur fowlpox, la protéine VP2 induit une protection contre la mortalité suivant une épreuve virulente mais pas contre l'atteinte de la bourse de Fabricius (C. Bayliss et al., Archives of Virology, 1991, 120, 193-205). Par contre la protéine VP2 exprimée dans E. Coli n'induit aucune réponse protectrice (M. Jagadish et al., Gène, 1990, 95, 179-186).
Le déterminant antigénique inducteur d'anticorps neutralisants, situé dans la région centrale de VP2, est fortement dépendant de la conformation de la protéine. De plus, la séquence en acides aminés correspondant à cette région, présente une variabilité importante entre les différentes souches de sérotype 1.
La protéine VP3 présente une forte réactivité croisée avec les anticorps monoclonaux spécifiques des deux sérotypes et porte un déterminant antigénique spécifique de groupe. La protéine VP3, exprimée dans E. Coli sous forme de protéine de fusion avec la β galactosidase, induit une faible réponse en anticorps neutralisants chez un poulet sur six (A. Azad, Virology, 1986, 149, 190-198).
La polyprotéine de 115 kDa a été exprimée dans des cellules de levure. Le précurseur ainsi exprimé, donnant naissance après clivage aux protéines VP2, VP3 et VP4, induit chez le poulet des anticorps séroprotecteurs (K. Fahey et al., Avian pathology, 1991, 20, 447-460). Par contre le précurseur de 115 kDa exprimé à l'aide d'un vecteur HVT, même après clivage de VP2, VP3 et VP4 n'induit pas de façon significative d'anticorps neutralisants ni de protection (Brevet WO 89/01040 du 27 juillet 1988).
La présente invention a donc pour objectif de fournir des virus herpès de la dinde (HVT) recombinants pour
la production de vaccin vivant efficace contre la maladie de Gumboro.
L'expérience prouve que la polyprotéine de 115 kDa du virus de la maladie de Gumboro exprimée à l'aide d'un vecteur HVT dans des fibroblastes d'embryon de poulet, bien que clivée pour donner naissance aux protéines structurales VP2 et VP3, n'induit aucune protection significative chez le poussin.
Par contre et cela de façon surprenante, si les gènes codant pour VP2 et VP3 sont exprimés simultanément et de manière indépendante à l'aide d'un vecteur HVT, la vaccination des poussins avec ce virus recombinant confère une protection efficace contre la maladie de Gumboro. L'association des protéines VP2 et VP3 exprimées simultanément chez le poulet par un ou des vecteurs HVT recombinants, en l'absence d'activité protéol yt ique liée à VP4, permet d'obtenir une meilleure protection vis-à-vis des variants par rapport à celle obtenue avec les protéines VP2 ou VP3 exprimées individuellement.
L'invention a pour objet la description de l'insertion des gènes codant pour VP2 et VP3 dans le génome du virus HVT.
Plus précisément l'invention a pour objet un vaccin vivant recombinant contre la maladie de Gumboro, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule usuel approprié une quantité efficace de virus HVT dont le génome contient des gènes codant pour VP2 et VP3 dans des conditions permettant leur expression in vivo.
Le vaccin peut contenir deux virus HVT dans lesquels sont respectivement insérés les gènes codant pour
VP2 et VP3, ou un virus HVT dans le génome duquel ont été
insérés, en un même site d'insertion, ou en deux sites distincts, les gènes codant pour VP2 et VP3.
Description des figures :
SEQ ID nº 1 : Séquence de la région du segment A du génome du virus IBDV codant pour la polyprotéine VP2, VP4, VP3
Figure nº 1 : Construction du plasmide de recombinaison pGH011
Figure nº 2 : Construction du plasmide pHVT 006 Figure n° 3 : Construction des plasmides pIBDVAO 1 et pIBDVA02
Figure n° 4 : Construction du plasmide de recombinaison pGH010
Figure n° 5 : Construction du plasmide de recombinaison pEL020
MATERIELS ET METHODES
Toutes les techniques utilisées pour le clonage des matériels génomiques viraux et pour les constructions de plasmides recombinants sont les techniques standards décrites par Maniatis et al. 1982, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Virus et culture du virus
Le virus utilisé comme virus parental est la souche FC126 de l'herpèsvirus de la dinde (HVT) isolée en
1968 par le Dr. Witter du Régional Poultry Research
Laboratory (USDA, East Lansing, Michigan, USA), dans un troupeau de dindes de 23 semaines (R.L. Witter et al. 1970,
Am. J. Vet. Res. 31, 525-538). Les conditions de culture de ce virus sont celles décrites par ailleurs (Demande de brevet français Al 2659349).
Clonage et séquençage du segment A du virus IBDV Le virus IBDV (souche Farragher) a été purifié à partir de bourses de Fabricius de poulets infectés expérimentalement. L'ARN génomique a été extrait des virions purifiés et les ADNs complémentaires ont été synthétisés à partir des segments d'ARN génomique. L'ADN complémentaire correspondant au segment A (contenant le gène codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3) a été clone entre les sites Xbal et KpnI du vecteur pBlueScript KS+ (Stratagène) pour générer le plasmide pIBDVA00. Le fragment Xbal-KpnI clone a une taille de 3 060 pb représentant 96 % de la taille totale du segment A (environ 3 200 pb). Ce fragment a été entièrement séquence (SEQ ID N° 1, Figure 1).
Exemple 1 : Construction du plasmide donneur pGHOlO pour l'insertion et l'expression du "gène" IBDV VP2 dans le locus HVT RR2.
Le plasmide pmp19RRlSma (cf Demande de brevet français Al 2659349) a été digéré par BamHI et Smal pour isoler le fragment BamHI-SmaI 1 100 pb (Séquence flanquante 5' HVT RR2). Ce fragment a été clone entre les sites BamHI et Smal du vecteur pBlueScript SK+ (Stratagène) pour produire le plasmide pSK8. Le plasmide pmpl8RR2-Sal (cf Demande de brevet français Al 2659349) a été digéré par KpnI et Sali pour isoler le fragment Sall-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2 ) . Ce fragment a été clone entre les sites KpnI et Sali du plasmide pSK8 pour produire le plasmide pHVT 005 (5 990 pb). Le plasmide pHVT005 comprenant les séquences flanquantes 5' et 3' nécessaires à la recombinaison dans le locus HVT RR2 a été modifié par mutagenèse dirigée avec 1' ol igonucléotide de synthèse SEQ ID Nº 2 (21 mer) : 5' CATGGCGGCGATCGTGAGTTA 3' pour générer le
plasmide pHVT 006 Ce plasmide possède un site de restriction Pvul à l'extrémité 3' de la séquence flanquante 5'.
Le plasmide pIBDVAOO a été modifié par mutagenèse dirigée avec 1 ' ol igonucléotide de synthèse SEQ ID N°3 (22 mer) : 5' AAGGAGGTAAGCTTTGCCGGTG 3' pour introduire un codon stop TAA et un site de restriction HindIII à la fin de la séquence codant pour VP2 (positions 1371 à 1378 sur la séquence SEQ ID N° 1). Le plasmide contenant la mutation recherchée a été dénommé pIBDVA01. Sur ce plasmide, le "gène" VP2 est encadré par les sites de restriction Pvul (11 bases en amont de l'ATG) et HindIII.
Le plasmide pHVTOOô a été digéré par Pvul et Sspl pour isoler le fragment Sspl-Pvul (séquence flanquante 5' du locus HVT RR2 ). Ce fragment a été clone entre les sites Pvul et Sspl du vecteur pBR 322 pour générer le plasmide pGH001
(4 680 pb). Le plasmide pHVT006 a été digéré également par HindIII et KpnI pour isoler le fragment HindIII-KpnI 1 950 pb correspondant à la séquence flanquante 3' du locus HVT RR2. Ce fragment a été clone entre les sites HindIII et KpnI du vecteur pUC 19 pour générer le plasmide pGH002 (4 595 pb).
Le plasmide pIBDVA01 a été digéré par HindIII et
Xbal pour isoler le fragment XbaI-HindIII 1 380 pb ("gène" IBDV VP2). Ce fragment a été clone entre les sites Xbal et HindIII du vecteur pUC18 pour générer le plasmide pGH004
(4 050 pb).
Le plasmide pGH002 a été digéré par HindIII et
XmnI pour isoler le fragment XmnI-HindIII 2 740 pb (fragment A). Le plasmide pGH004 a été digéré par HindIII et Xmnl pour isoler le fragment XmnI-HindIII 3 240 pb (fragment B). Les
fragments A et B ont été ligaturés ensemble pour générer le plasmide pGH006 (5 980 pb) comprenant la séquence flanquante 3' du locus HVT RR2 en aval du "gène" IBDV VP2.
Le plasmide pGH006 a été digéré par Pvul pour isoler le fragment PvuI-PvuI 3 440 pb ("gène" VP2-HVT RR2
3'). Ce fragment a été clone dans le site unique PvuI de pGH001 pour générer le plasmide pGH008 (8 135 pb). Le plasmide pGH008 contient la construction du "gène" IBDV VP2 flanqué des séquences 5' et 3' nécessaires à la recombinaison homologue au niveau du locus d'insertion HVT
RR2 , dans le vecteur pBR322.
Le plasmide pGH008 a été digéré par KpnI et Sspl pour isoler le fragment SspI - séquence flanquante 5' HVT RR2 - "gène" VP2 - séquence flanquante 3' HVT RR2 - KpnI. Ce fragment a été clone entre les sites KpnI et Smal du vecteur pBlueScript KS+ pour produire finalement le plasmide pGHO10 (7 000 pb) qui a été utilisé pour les expériences de recombinaison. Dans cette construction, le "gène" IBDV VP2 se trouve sous la dépendance du promoteur de la petite sous-unité de la ribonucléot ide réductase du virus HVT.
Exemple 2 : Construction du plasmide donneur PEL020 pour l'insertion et l'expression du "gène" IBDV VP3 dans le locus HVT RR2.
Le plasmide pIBDVAOO a été modifié par mutagenèse dirigée avec l'oligonucléotide de synthèse SEQ ID N° 4 (27 mer) 5' CCTTGAGTGAGAATTCTGGTACCCAGC3 ' pour produire un site de restriction EcoRI juste après le stop du cadre ouvert de lecture codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3 (Position 3051 à 3056 sur la séquence SEQ ID N°1). Le plasmide contenant la mutation recherchée a été dénommé pIBDVA02.
Le plasmide pGHO10 a été digéré par BamHI et PvuI
pour isoler le fragment BamHI-PvuI 755 pb (séquence flanquante 5' HVT RR2 ) (fragment A).
Le plasmide pGHO10 a été digéré par HindIII et KpnI pour isoler le fragment HindIII-KpnI 1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2 ) (fragment B).
Le plasmide pIBDVA02 a été digéré par EcoRI et Xhol pour isoler le fragment XhoI-EcoRI 750 pb ("gène" VP3 moins les 130 premières paires de bases) (fragment C).
La partie 5' du "gène" VP3 (130 pb) a été obtenue par amplification PCR en utilisant les ol igonucleot ides de synthèse SEQ ID Nº 5 (42 mer) 5' ATTATCACGATCGCCGCCATGTTCCCTCACAATCCACGAGAC 3' et SEQ ID N° 6 (22 mer) 5 ' CTGACAGCGCTCTCGAGTTCAG 3' et le plasmide pIBDVA00 comme matrice. Le fragment PCR a été digéré par Pvul et Xhol pour obtenir le fragment PvuI-XhoI 140 pb (fragment D) (10 dernières bases de la séquence flanquante 5' HVT RR2 - 130 premières bases du "gène" VP3). Le "gène" VP3 est ainsi initié par une méthionine créée au niveau des positions 2178 à 2180 sur la séquence SEQ ID N° 1. Cette méthionine remplace l'arginine du site de clivage théorique Lys-Arg entre VP4 et VP3. Le fragment B a été clone entre les sites KpnI et HindIII du vecteur pBlueScript SK+ pour produire le plasmide pEL018 (4 900 pb). Les fragments A et D ont été ligaturés dans le vecteur pBlueScript SK+ préalablement digéré par BamHI et Xhol pour produire le plasmide pEL019 (3 800 pb).
Le plasmide pEL018 a été digéré par BamHI et EcoRI pour isoler le vecteur linéaire pEL018 BamHI-EcoRI (fragment
E).
Le plasmide pEL019 a été digéré par BamHI et Xhol pour isoler le fragment BamHI - séquence flanquante 5' HVT
RR2 - VP3 5' -XhoI 890 bp (fragment F).
Les fragments C, E et F ont finalement été ligaturés ensemble pour produire le plasmide pEL020 (6 510 pb). Le plasmide pEL020 contient la construction du "gène" IBDV VP3 inséré dans le locus HVT RR2. Dans cette construction, le "gène" IBDV VP3 se trouve sous la dépendance du promoteur de la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase du virus HVT. Le plasmide pEL020 a été utilisé pour les expériences de recombinaison .
Exemple 3 : Construction du plasmide donneur pGH011 pour l'insertion et l'expression du gène codant pour la polyprotéine VP2 - VP4 - VP3 du virus IBDV dans le locus HVT RR2.
Le plasmide pHVT006 précédemment décrit a été digéré par EcoRI et KpnI pour isoler le fragment EcoRI-KpnI
1 950 pb (séquence flanquante 3' HVT RR2). Ce fragment a été clone entre les sites EcoRI et KpnI du vecteur pUC18 pour produire le plasmide pGH003 (4 860 pb).
Le plasmide pIBDVA02 précédemment décrit a été digéré par Notl, réparé par la polymerase Klenow, et digéré par EcoRI pour isoler le fragment "Blunt" - EcoRI 3 050 pb représentant la totalité du gène codant pour la polyprotéine d'IBDV. Ce fragment a été clone entre les sites EcoRI et Smal de pUC19 pour produire le plasmide pGH005 (5 730 pb).
Le plasmide pGH003 précédemment décrit a été digéré par EcoRI et Sspl pour isoler le fragment SspI-EcoRI 2 570 pb (vecteur pUC18 partiel + séquence flanquante 3' HVT RR2) (fragment A).
Le plasmide pGH005 a également été digéré par EcoRI et Sspl pour isoler le fragment Sspl - EcoRI 5 720 pb
(vecteur pϋC partiel + gène de la polyprotéine IBDV)
( f ragmen t B ) .
Les fragments A et B ont alors été ligaturés ensemble pour produire le plasmide pGH007 (7 990 pb) comprenant le gène de la polyprotéine IBDV flanqué en 3 ' de la séquence HVT RR2 3'.
Le plasmide pGH007 a été digéré par PvuI pour isoler le fragment PvuI-PvuI 5 110 pb (gène IBDV polyprotéine + séquence flanquante 3' HVT RR2 ) . Ce fragment a été clone dans le site unique PvuI du plasmide pGH001 précédemment décrit pour produire le plasmide pGH009 (9 805 pb). Ce plasmide contient la construction du gène de la polyprotéine VP2 - VP4 - VP3 du virus IBDV flanqué des séquences 5' et 3' nécessaires à la recombinai son homologue dans le locus d'insertion HVT RR2. Dans cette construction, le gène de la polyprotéine d'IBDV se trouve sous la dépendance du promoteur du gène codant pour la petite sous-unité de la r ibonucléot ide réductase du virus HVT.
Le plasmide pGH009 a été digéré par KpnI et Sspl pour isoler le fragment Sspl - séquence flanquante 5' HVT RR2 - gène de la polyprotéine IBDV - séquence flanquante 3' HVT RR2 - KpnI 5725 pb. Ce fragment a finalement été clone entre les sites KpnI et Smal du vecteur pBlueScript KS+ pour produire le plasmide pGH011 (8 630 pb).
Exemple 4 : Constructions des "gènes" VP2, VP3, et du gène codant pour la polyprotéine dans d'autres sites d'expression existant sur le génome d'HVT.
Il est possible pour l'homme de l'art de construire d'autres plasmides de recombinaison pour insérer le gène de la polyprotéine ou les "gènes" VP2 et VP3 dans des sites d'expression présents sur le génome d'HVT, et autres que le site d'expression RR2 (petite sous-unité de la
ribonucléot ide réductase). Par exemple, on peut insérer ces gènes au niveau du gène thymidine kinase (TK) ou du gène codant pour la serine/ thréonine protéine kinase (PK) (gène HVT homologue du gène HSV- 1 US3) du virus HVT.
Dans ces constructions, les gènes IBDV peuvent être placés sous le contrôle du promoteur endogène correspondant au site d'expression choisi (par exemple promoteur du gène HVT TK, ou promoteur du gène HVT PK) ou bien sous le contrôle de promoteurs rapportés (tels gue par exemple le promoteur du gène " immediate-early" du virus CMV) .
Exemple 5 : Isolement et purification d'un virus recombinant HVT/IBDV VP2 (vHVTl).
Des cellules primaires d'embryons de poulets ont été cotransfectées avec 5 μg de plasmide pGH010 et 1 μg d'ADN génomique HVT FC126 infectieux selon la technique de la lipofectine, puis réparties en plaques 96 puits et cultivées pendant 72 à 96 heures selon les conditions déjà décrites (demande de brevet français Al 2659349). Les cupules présentant une seule plage d'effet cytopathique ont été trypsinées, prélevées et soniquées. La moitié environ du prélèvement de chaque cupule a été déposée et fixée sur un filtre de nitrocellulose. La recherche de la présence des virus HVT recombinants ayant inséré le "gène" IBDV VP2 a été réalisée selon la technique du "dot blot" avec une sonde radioactive spécifique de la séquence nucléotidique du "gène" IBDV VP2. L'autre moitié de l'un des échantillons donnant un signal positif a été soniquée et répartie à nouveau sur une plaque 96 puits pour un nouveau cycle de culture sur cellules primaires d'embryons de poulets. 3 à 4 cycles successifs de ce processus ont permis d'obtenir un
virus recombinant à 100 % de pureté et comprenant le gène IBDV VP2 inséré dans le site d'expression HVT RR2. Ce virus recombinant pur à 100 % a été dénommé vHVT 1. La recombinaison homologue au niveau du site RR2 a été vérifiée par la technique du "Southern blot" avec des sondes spécifiques du gène VP2, du gène HVT RR2 et des sondes spécifiques des régions, situées en amont et en aval des séquences flanquantes HVT RR2 5' et 3' utilisées dans le plasmide pGHO10. L'expression du produit du "gène" VP2 a été contrôlée par un test d' immunofluorescence indirecte avec un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement un épi tope conformationnel situé sur la protéine VP2 du virus IBDV. Les cellules infectées par le virus recombinant vHVT1 présentent toutes une fluorescence (interne) alors que les cellules infectées par le virus parental HVT FC126 ne présentent pas de fluorescence.
Exemple 6 : Isolement et purification des virus recombinants HVT/IBDV VP3 et HVT/IBDV polyprotéine VP2-VP4-VP3.
Le schéma de sélection des virus recombinants
HVT/IBDV VP3 et HVT/IBDV polyprotéine est le même que celui qui a été suivi pour la purification du virus vHVT 1 , sauf que des réactifs spécifiques des virus recombinants recherchés ont été utilisés, à savoir une sonde spécifique de la séquence nuciéotidique du "gène" VP3 et un sérum spécifique de VP3 pour le virus HVT/VP3, et les sondes ADN spécifiques de VP2 et de VP3 et les anticorps spécifiques des produits des "gènes" VP2 et VP3 pour le recombinant HVT/IBDV polyprotéine.
Exemple 7 : Obtention d'un virus recombinant HVT double HVT/VP2 + VP3.
Ce recombinant peut être obtenu de plusieurs manières. On peut soit utiliser le virus vHVTl comme virus parental et cotransfecter 1 'ADN infectieux de ce virus avec un plasmide donneur contenant l'une des constructions du "gène" IBDV VP3 dans le site d'expression PK décrites dans l'exemple 4, soit utiliser le virus vHVT/VP3 ("gène" VP3 exprimé dans le site HVT RR2 ) comme virus parental et cotransfecter l'ADN infect ieυx rie ce virus avec un plasmide donneur contenant l'une des constructions du "gène" IBDV VP2 dans le site d'expression PK, constructions qui auront été réalisées selon un mode similaire aux constructions de VP3 dans le site PK et réalisable par toute personne de l'art.
Séquence de la région du segment A du génome du virus IBDV (souche Farragher) codant pour la polyprotéine VP2-VP4-VP3
Informations pour SEQ ID n° 1 :
1. Caractéristiques de la séquence
a) Longueur : 3 063 paires de bases
b) Type : nucléotides 2. Nombre de brins : double brin
3. Configuration de la séquence : linéaire
4. Type : ADN complémentaire
5. Séquence hypothétique : non
6. Antisens : non 7. Origine de la molécule
a) Organisme : Infectious Bursal Disease Virus
(Virus de la maladie de Gumboro] b) Souche : Farragher
8. Bibliothèque d'ADN complémentaire
Claims
1. Un virus recombinant herpès de la dinde (HVT) contenant des séquences codantes de protéines structurales du virus de la maladie de Gumboro, caractérisé en ce qu'il contient, dans un site de son génome, au moins une séquence codant pour une protéine choisie dans le groupe formé par les protéines VP2 et VP3 dans des conditions permettant l'expression desdites séquences et la production de ladite protéine, la séquence codant pour la protéine VP4 étant absente ou incapable d'être exprimée.
2. Un virus selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte, d'une part la séquence codant pour la protéine VP2 et d'autre part la séquence codant pour la protéine VP3 de faςon à permettre leur expression simultanée.
3. Un virus selon la revendication 2, caractérisé en ce que les deux séquences sont insérées dans un même site du génome.
4. Un virus selon la revendication 2, caractérisé en ce que les deux séquences sont insérées dans deux sites distincts du génome.
5. Mélange de virus HVT recombinants selon la revendication 1, l'un desdits virus contenant la séquence codant pour VP2 et l'autre, la séquence codant pour VP3.
6. Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte au moins l'un des virus selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Vaccin selon la revendication 6, contenant un tel virus vivant.
8. Un vaccin vivant recombinant contre la maladie de GUMBORO, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule usuel approprié une quantité efficace de virus HVT dont le génome contient des gènes codant pour VP2 et VP3 dans des conditions permettant leur expression in vivo chez le poulet.
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