JPH06233682A - 組換えマレック病ウィルス - Google Patents
組換えマレック病ウィルスInfo
- Publication number
- JPH06233682A JPH06233682A JP3190332A JP19033291A JPH06233682A JP H06233682 A JPH06233682 A JP H06233682A JP 3190332 A JP3190332 A JP 3190332A JP 19033291 A JP19033291 A JP 19033291A JP H06233682 A JPH06233682 A JP H06233682A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mdv
- dna
- bamhi
- region
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
家禽中で外来遺伝子を発現できるウィルスベクターとし
てのマレック病ウィルスＩ型の使用。ウィルスのＤＮＡ
ゲノム上の非必須挿入領域；この領域を含むプラスミ
ド；プラスミドを含有する宿主細胞；及び組換えウィル
スを含むワクチン。
てのマレック病ウィルスＩ型の使用。ウィルスのＤＮＡ
ゲノム上の非必須挿入領域；この領域を含むプラスミ
ド；プラスミドを含有する宿主細胞；及び組換えウィル
スを含むワクチン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特にニワトリ（chicke
n ）で、外来遺伝子を発現できるウィルスベクターに係
る。特に、本発明は、挿入領域由来のＤＮＡ配列に隣接
した外来遺伝子からなる異種核酸配列を挿入しうるマレ
ック（Marek ）病ウィルス（「ＭＤＶ」）血清型１のＤ
ＮＡゲノムの挿入領域；前記核酸配列を含むプラスミ
ド；組換えＭＤＶを含むワクチン；及び抗−組換えＭＤ
Ｖ抗体を含有する抗血清の発見に関する。
n ）で、外来遺伝子を発現できるウィルスベクターに係
る。特に、本発明は、挿入領域由来のＤＮＡ配列に隣接
した外来遺伝子からなる異種核酸配列を挿入しうるマレ
ック（Marek ）病ウィルス（「ＭＤＶ」）血清型１のＤ
ＮＡゲノムの挿入領域；前記核酸配列を含むプラスミ
ド；組換えＭＤＶを含むワクチン；及び抗−組換えＭＤ
Ｖ抗体を含有する抗血清の発見に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】マレッ
ク病はヘルペスウィルスであるマレック病ウィルスが引
き起こすニワトリの悪性のリンパ腫疾患である。ウィル
スはニワトリに感染し、感染後数週間以内に種々の組織
でＴ−細胞リンパ腫を起こし、その後最終的には感染し
たニワトリは死亡するかまたは不治となる。この疾患
は、米国や世界中の多くの場所で商業用ブロイラーやブ
ロイラーの畜産家全てにワクチンを接種することにより
２０年間にわたり家禽業界で抑制されてきた点で、ヘル
ペスウィルスによる疾患の中で独特である。
ク病はヘルペスウィルスであるマレック病ウィルスが引
き起こすニワトリの悪性のリンパ腫疾患である。ウィル
スはニワトリに感染し、感染後数週間以内に種々の組織
でＴ−細胞リンパ腫を起こし、その後最終的には感染し
たニワトリは死亡するかまたは不治となる。この疾患
は、米国や世界中の多くの場所で商業用ブロイラーやブ
ロイラーの畜産家全てにワクチンを接種することにより
２０年間にわたり家禽業界で抑制されてきた点で、ヘル
ペスウィルスによる疾患の中で独特である。
【０００３】ＭＤＶはエンベロープを有するＤＮＡウィ
ルスであり、Herpesviridae 科に分類される。これはさ
らに次の３つの血清型に分類される： Ｉ型：ニワトリに対して病原性であり、発癌性であるＭ
ＤＶの毒性のある株及びその株由来の弱毒化した非病原
性株； ＩＩ型：ＭＤＶの天然の非病原性株； ＩＩＩ型：ニワトリに対して非病原性の七面鳥ヘルペス
ウィルス（「ＨＶＴ」）株。
ルスであり、Herpesviridae 科に分類される。これはさ
らに次の３つの血清型に分類される： Ｉ型：ニワトリに対して病原性であり、発癌性であるＭ
ＤＶの毒性のある株及びその株由来の弱毒化した非病原
性株； ＩＩ型：ＭＤＶの天然の非病原性株； ＩＩＩ型：ニワトリに対して非病原性の七面鳥ヘルペス
ウィルス（「ＨＶＴ」）株。
【０００４】２０世紀を通し、ＭＤＶ感染の病因学及び
ＭＤＶの古典的なウィルス学の研究が行われてきた。こ
の１０年間に、ＭＤＶの分子分析が進展してきた。重要
な進展の中には、ウィルスＤＮＡ分子のクローニング
（Fukuchi ら、J. Virol. 51:102-109, 1984）；ＭＤＶ
に対するモノクローナル抗体の生成；ウィルスポリペプ
チドの同定；転写地図の作成（Schat ら、Int. J. Canc
er 44:101-109, 1989 ）、及びＭＤＶゲノム上の遺伝子
の同定（Buckmasterら、J. Gen. Virol. 69:2033-2042,
1988 ）が含まれる。今のところ、ＨＶＴのホスホノア
セテート耐性変異体が１つ報告されているが、ウィルス
の遺伝分析は実際には行われていない。
ＭＤＶの古典的なウィルス学の研究が行われてきた。こ
の１０年間に、ＭＤＶの分子分析が進展してきた。重要
な進展の中には、ウィルスＤＮＡ分子のクローニング
（Fukuchi ら、J. Virol. 51:102-109, 1984）；ＭＤＶ
に対するモノクローナル抗体の生成；ウィルスポリペプ
チドの同定；転写地図の作成（Schat ら、Int. J. Canc
er 44:101-109, 1989 ）、及びＭＤＶゲノム上の遺伝子
の同定（Buckmasterら、J. Gen. Virol. 69:2033-2042,
1988 ）が含まれる。今のところ、ＨＶＴのホスホノア
セテート耐性変異体が１つ報告されているが、ウィルス
の遺伝分析は実際には行われていない。
【０００５】マレック病は経済的に非常に重要であり、
有効なマレック病ワクチンは家禽業界の生計に重要なも
のである。現在、多くの地域でニワトリにＭＤＶワクチ
ン種の複合ワクチンを接種しているが、最も広範に使用
されているワクチンはＨＶＴである。既存のマレック病
ワクチンは将来適切なものではない可能性があり、この
分野の研究者にとって組換えマレック病ワクチンの開発
は引続き重要な課題である。既存のマレック病ワクチン
はヘルペスウィルスの生ワクチンとして家禽業界で既に
２０年間使用されてきているため、これらは現在、家禽
に適した強力なヘルペスウィルスベクターとして研究さ
れている。
有効なマレック病ワクチンは家禽業界の生計に重要なも
のである。現在、多くの地域でニワトリにＭＤＶワクチ
ン種の複合ワクチンを接種しているが、最も広範に使用
されているワクチンはＨＶＴである。既存のマレック病
ワクチンは将来適切なものではない可能性があり、この
分野の研究者にとって組換えマレック病ワクチンの開発
は引続き重要な課題である。既存のマレック病ワクチン
はヘルペスウィルスの生ワクチンとして家禽業界で既に
２０年間使用されてきているため、これらは現在、家禽
に適した強力なヘルペスウィルスベクターとして研究さ
れている。
【０００６】例えば、ワクシニア、パピローマウィル
ス、バキュロウィルス、パルボウィルス及びタバコモザ
イクウィルスを使用するウィルスベクターが報告されて
いる。これらは全て外来遺伝子のクローニングベクター
または発現ベクターとして報告されている。ＭＤＶも、
欧州特許出願第０３３４５３０号にT. Ishikawa らが記
載しているように、外来遺伝子の発現ベクターとして報
告されている。この出願はＨＶＴのＡ抗原部位コード遺
伝子（ｇｐ ５７−６５遺伝子）へのニューキャッスル
病ウィルス（「ＮＤＶ」）のヘムアグルチニン及びノイ
ラミニダーゼをコードする遺伝子のような外来遺伝子の
挿入を記載している。組換えＨＶＴを使用してＮＤＶ及
びＭＤＶの両方に対するワクチンを製造する。
ス、バキュロウィルス、パルボウィルス及びタバコモザ
イクウィルスを使用するウィルスベクターが報告されて
いる。これらは全て外来遺伝子のクローニングベクター
または発現ベクターとして報告されている。ＭＤＶも、
欧州特許出願第０３３４５３０号にT. Ishikawa らが記
載しているように、外来遺伝子の発現ベクターとして報
告されている。この出願はＨＶＴのＡ抗原部位コード遺
伝子（ｇｐ ５７−６５遺伝子）へのニューキャッスル
病ウィルス（「ＮＤＶ」）のヘムアグルチニン及びノイ
ラミニダーゼをコードする遺伝子のような外来遺伝子の
挿入を記載している。組換えＨＶＴを使用してＮＤＶ及
びＭＤＶの両方に対するワクチンを製造する。
【０００７】ＷＯ８８／０７０８８で、S. Martin らは
ＨＶＴの非必須領域に外来遺伝子を挿入し、最終的には
外来遺伝子産物とＨＶＴの両方と免疫原性反応を起こす
ウィルスベクターにトリを感染させる方法を記載してい
る。特に、ＨＶＴはウィルスベクターとして教示されて
いる唯一のトリヘルペスウィルスであり、チミジンキナ
ーゼ及び１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン耐性を
コードするのに使用する非必須領域である。
ＨＶＴの非必須領域に外来遺伝子を挿入し、最終的には
外来遺伝子産物とＨＶＴの両方と免疫原性反応を起こす
ウィルスベクターにトリを感染させる方法を記載してい
る。特に、ＨＶＴはウィルスベクターとして教示されて
いる唯一のトリヘルペスウィルスであり、チミジンキナ
ーゼ及び１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン耐性を
コードするのに使用する非必須領域である。
【０００８】ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０１４０で、Cochra
n らは弱毒化したヘルペスウィルスベクターへの外来Ｄ
ＮＡの挿入を記載している。かれらは偽狂犬病ウィルス
由来のｇｐＸ糖蛋白質部分に融合した抗原性アミノ酸配
列からなる組換え融合蛋白質を記載している。３つのポ
リペプチド、すなわち、ＶＰ２、ＶＰ４及びＶＰ３をコ
ードする感染性ファブリキウス嚢病ウィルス（「ＩＢＤ
Ｖ」）ＲＮＡ大断片のｃＤＮＡコピー並びに大腸菌β−
ガラクトシダーゼ遺伝子をＨＶＴゲノムの非反復長領域
内の非必須部位に挿入した。この組換えウィルスをＩＢ
ＤＶに対するワクチンとして使用した。ＭＤＶ Ａ抗原
遺伝子（ｇｐ ５７−６５）をＭＤＶに対する改良ワク
チンを製造するためにＨＶＴの同じ部位に挿入した。
n らは弱毒化したヘルペスウィルスベクターへの外来Ｄ
ＮＡの挿入を記載している。かれらは偽狂犬病ウィルス
由来のｇｐＸ糖蛋白質部分に融合した抗原性アミノ酸配
列からなる組換え融合蛋白質を記載している。３つのポ
リペプチド、すなわち、ＶＰ２、ＶＰ４及びＶＰ３をコ
ードする感染性ファブリキウス嚢病ウィルス（「ＩＢＤ
Ｖ」）ＲＮＡ大断片のｃＤＮＡコピー並びに大腸菌β−
ガラクトシダーゼ遺伝子をＨＶＴゲノムの非反復長領域
内の非必須部位に挿入した。この組換えウィルスをＩＢ
ＤＶに対するワクチンとして使用した。ＭＤＶ Ａ抗原
遺伝子（ｇｐ ５７−６５）をＭＤＶに対する改良ワク
チンを製造するためにＨＶＴの同じ部位に挿入した。
【０００９】単純包疹ウィルス及び偽狂犬病ウィルスを
含むいくつかのヘルペスウィルスの遺伝子分析が行われ
ているが、ＭＤＶ血清型１（「ＭＤＶ−１」）のＤＮＡ
ゲノムの遺伝子構造はよく判っていない。
含むいくつかのヘルペスウィルスの遺伝子分析が行われ
ているが、ＭＤＶ血清型１（「ＭＤＶ−１」）のＤＮＡ
ゲノムの遺伝子構造はよく判っていない。
【００１０】種々の家禽疾患に対する現在のワクチンは
弱毒化した生病原体を使用して製造することが多いが、
不適切に弱毒化した病原性微生物を動物に接種する危険
性がある。
弱毒化した生病原体を使用して製造することが多いが、
不適切に弱毒化した病原性微生物を動物に接種する危険
性がある。
【００１１】不活化ワクチンは一般に追加免疫を必要と
する低いレベルの免疫しか誘発しない。さらに、ウィル
スの中和誘導抗原性決定因子は不活化処理により変化
し、ワクチンの保護能を低下させることがある。
する低いレベルの免疫しか誘発しない。さらに、ウィル
スの中和誘導抗原性決定因子は不活化処理により変化
し、ワクチンの保護能を低下させることがある。
【００１２】１種以上の弱毒化した、生病原体を１つの
ワクチンに組み合わせると、もう１つの問題が生じるこ
とがある。抗原性成分の相互作用により１つ以上の構成
抗原の免疫原性が低下することがある。
ワクチンに組み合わせると、もう１つの問題が生じるこ
とがある。抗原性成分の相互作用により１つ以上の構成
抗原の免疫原性が低下することがある。
【００１３】ＭＤＶのＤＮＡゲノムがもう１つのトリ疾
患原因体由来抗原をコードする外来遺伝子を含有してい
るＭＤＶベクターを使用してマレック病及び少なくとも
１つの他のトリの疾患に対する強力なワクチンを製造す
るためには、ＭＤＶゲノムの非必須領域を発見し、挿入
領域として使用する必要がある。外来遺伝子が挿入領域
に挿入されると、対応の遺伝産物が発現されるにちがい
ない。ＭＤＶベクターをニワトリに投与すると、好まし
くは複合ワクチンより強い強度で、ＭＤＶ及び他の遺伝
産物例えば蛋白質の両方への免疫応答を誘発しよう。
患原因体由来抗原をコードする外来遺伝子を含有してい
るＭＤＶベクターを使用してマレック病及び少なくとも
１つの他のトリの疾患に対する強力なワクチンを製造す
るためには、ＭＤＶゲノムの非必須領域を発見し、挿入
領域として使用する必要がある。外来遺伝子が挿入領域
に挿入されると、対応の遺伝産物が発現されるにちがい
ない。ＭＤＶベクターをニワトリに投与すると、好まし
くは複合ワクチンより強い強度で、ＭＤＶ及び他の遺伝
産物例えば蛋白質の両方への免疫応答を誘発しよう。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明はこれまで未知
の、ＭＤＶ−１のＤＮＡゲノムの非必須挿入領域を開示
する。この領域はゲノムの非反復短領域のBamHI-A の末
端4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片の読み取り枠を含む。Ba
mHI-A はＭＤＶ−１ゲノムをBamHI で完全に消化して得
た２９個のBamHI 断片中最大のものであり、BamHI-A は
ゲノムの非反復短領域にマッピングされる。この領域は
第１図に示す制限地図で定義される。この領域は本質的
に第２図に示すようにヌクレオチド位置２３８−１０５
０のＤＮＡ配列からなる。本発明にはこの挿入領域を含
むプラスミドも含まれる。
の、ＭＤＶ−１のＤＮＡゲノムの非必須挿入領域を開示
する。この領域はゲノムの非反復短領域のBamHI-A の末
端4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片の読み取り枠を含む。Ba
mHI-A はＭＤＶ−１ゲノムをBamHI で完全に消化して得
た２９個のBamHI 断片中最大のものであり、BamHI-A は
ゲノムの非反復短領域にマッピングされる。この領域は
第１図に示す制限地図で定義される。この領域は本質的
に第２図に示すようにヌクレオチド位置２３８−１０５
０のＤＮＡ配列からなる。本発明にはこの挿入領域を含
むプラスミドも含まれる。
【００１５】本発明には外来遺伝子、好ましくはもう１
種の家禽疾患原因体の免疫原をコードする外来遺伝子を
含有する組換えＭＤＶ−１も含まれる。この組換えウィ
ルスをワクチンに使用して、ＭＤＶと、ＭＤＶ−１ゲノ
ムにその外来遺伝子を挿入した疾患原因体の両方に対す
る免疫応答を誘発することにより健康な動物を保護する
ことができる。
種の家禽疾患原因体の免疫原をコードする外来遺伝子を
含有する組換えＭＤＶ−１も含まれる。この組換えウィ
ルスをワクチンに使用して、ＭＤＶと、ＭＤＶ−１ゲノ
ムにその外来遺伝子を挿入した疾患原因体の両方に対す
る免疫応答を誘発することにより健康な動物を保護する
ことができる。
【００１６】特異な病原体に既に感染している動物をそ
の病原体に対する抗血清で治療できることはよく知られ
ている。本発明では、特異な病原体由来の抗原性ポリペ
プチドをコードする異種遺伝子を含む組換えＭＤＶ−１
により抗体を得る。本発明の組換えＭＤＶ−１に対する
抗血清は、適当な免疫応答を誘発するために有効量の前
記組換えＭＤＶ−１で動物例えば家禽を免疫感作するこ
とにより調製できる。その後、動物から採血し、標準法
で抗血清を調製することができる。
の病原体に対する抗血清で治療できることはよく知られ
ている。本発明では、特異な病原体由来の抗原性ポリペ
プチドをコードする異種遺伝子を含む組換えＭＤＶ−１
により抗体を得る。本発明の組換えＭＤＶ−１に対する
抗血清は、適当な免疫応答を誘発するために有効量の前
記組換えＭＤＶ−１で動物例えば家禽を免疫感作するこ
とにより調製できる。その後、動物から採血し、標準法
で抗血清を調製することができる。
【００１７】有用な組換えＭＤＶ−１の前提条件は、Ｍ
ＤＶ−１ゲノムの非必須位置または領域、すなわちウィ
ルスの必須機能例えば感染または複製に必要な機能を破
壊することなく導入に使用できる位置または領域に異種
核酸配列を導入されていることである。このような領域
は挿入領域と呼ばれている。異種ＤＮＡの導入について
は本発明の挿入領域はこれまで記述されたことがない。
さらに、本明細書に記載の、異種ＤＮＡ配列の導入に使
用するＭＤＶ−１のゲノム領域の制限酵素地図について
の情報はなかった。
ＤＶ−１ゲノムの非必須位置または領域、すなわちウィ
ルスの必須機能例えば感染または複製に必要な機能を破
壊することなく導入に使用できる位置または領域に異種
核酸配列を導入されていることである。このような領域
は挿入領域と呼ばれている。異種ＤＮＡの導入について
は本発明の挿入領域はこれまで記述されたことがない。
さらに、本明細書に記載の、異種ＤＮＡ配列の導入に使
用するＭＤＶ−１のゲノム領域の制限酵素地図について
の情報はなかった。
【００１８】第２図のヌクレオチド位置２３８−１０５
０のＤＮＡ配列として定義される、本発明の組換えＭＤ
Ｖを調製するための異種ＤＮＡ配列導入に使用する好ま
しい挿入領域はゲノムの非反復短領域にある。挿入領域
は第１図の読み取り枠（openreading frame ）を含有す
るゲノム領域の制限酵素地図に示されるようにBamHI-A
の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内にある。具体的には、
挿入領域は、第１図の読み取り枠を含有するゲノム領域
の制限酵素地図に示されるようにBamHI-A の4.3 kb Eco
RI-BamHIサブ断片内にBaglII部位を含有する。
０のＤＮＡ配列として定義される、本発明の組換えＭＤ
Ｖを調製するための異種ＤＮＡ配列導入に使用する好ま
しい挿入領域はゲノムの非反復短領域にある。挿入領域
は第１図の読み取り枠（openreading frame ）を含有す
るゲノム領域の制限酵素地図に示されるようにBamHI-A
の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内にある。具体的には、
挿入領域は、第１図の読み取り枠を含有するゲノム領域
の制限酵素地図に示されるようにBamHI-A の4.3 kb Eco
RI-BamHIサブ断片内にBaglII部位を含有する。
【００１９】上記に概説した非必須挿入領域に対応する
ＤＮＡ配列はＭＤＶ−１ゲノムへの遺伝子の挿入に使用
できる。
ＤＮＡ配列はＭＤＶ−１ゲノムへの遺伝子の挿入に使用
できる。
【００２０】ＭＤＶ−１ゲノムのＤＮＡ配列については
株の間で天然の変異が存在しうるものと理解されよう。
これらの変異は１つ以上の制限部位の位置に影響する可
能性のある１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿
入、逆位または付加を招き、第１図に示すような地図に
関係した制限酵素地図ができる。
株の間で天然の変異が存在しうるものと理解されよう。
これらの変異は１つ以上の制限部位の位置に影響する可
能性のある１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿
入、逆位または付加を招き、第１図に示すような地図に
関係した制限酵素地図ができる。
【００２１】さらに、遺伝子工学の手法を使用して上記
の変異をもたらし、第１図に示す地図に関係する制限酵
素地図を有するＤＮＡ配列を得ることもできる。このよ
うな関連した制限酵素地図のいずれかを特徴とするＭＤ
Ｖ−１ゲノム領域内にある挿入領域に導入された異種遺
伝子を含む組換えＭＤＶ−１も本発明に含まれるものと
する。さらに、本発明で同定される挿入領域は本質的な
機能は示さないので、前記領域を部分的または完全に削
除した後、異種遺伝子を前記領域に挿入することができ
る。本発明の挿入領域またはこの挿入領域の一部に対応
するＭＤＶ−１ゲノムの領域に導入された異種遺伝子を
含む、及び本明細書で特徴付けた組換えＭＤＶ−１も本
発明に含まれる。
の変異をもたらし、第１図に示す地図に関係する制限酵
素地図を有するＤＮＡ配列を得ることもできる。このよ
うな関連した制限酵素地図のいずれかを特徴とするＭＤ
Ｖ−１ゲノム領域内にある挿入領域に導入された異種遺
伝子を含む組換えＭＤＶ−１も本発明に含まれるものと
する。さらに、本発明で同定される挿入領域は本質的な
機能は示さないので、前記領域を部分的または完全に削
除した後、異種遺伝子を前記領域に挿入することができ
る。本発明の挿入領域またはこの挿入領域の一部に対応
するＭＤＶ−１ゲノムの領域に導入された異種遺伝子を
含む、及び本明細書で特徴付けた組換えＭＤＶ−１も本
発明に含まれる。
【００２２】要約すると、本質的に上記に定義した挿入
領域は、異種核酸配列の導入に使用できるＭＤＶゲノム
内の領域の位置の特徴となる。
領域は、異種核酸配列の導入に使用できるＭＤＶゲノム
内の領域の位置の特徴となる。
【００２３】挿入領域のＤＮＡ配列は第２図に示すが、
ヌクレオチド位置２３８−１０５０のＤＮＡ配列を含
む。本発明の挿入領域の特徴付けでは、ＭＤＶ−１ウィ
ルスの間には１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿
入、逆位等を引き起こす天然の変異があることに注意す
ることが重要である。これらの変異は遺伝子工学でも得
られる。ＭＤＶ−１ゲノムのこのような関連しているが
同一ではない領域に導入した異種遺伝子を含む組換えＭ
ＤＶ−１も本発明に含まれる。例えば、第２図に示すＭ
ＤＶ−１ゲノムの核酸配列に欠失を有するＭＤＶ−１株
に異種遺伝子を導入することができる。第２図に示すＤ
ＮＡ配列で本明細書に定義のＭＤＶ−１挿入領域は異種
核酸配列の導入に使用できるＭＤＶ−１ゲノム内の領域
の位置の特徴となる。
ヌクレオチド位置２３８−１０５０のＤＮＡ配列を含
む。本発明の挿入領域の特徴付けでは、ＭＤＶ−１ウィ
ルスの間には１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿
入、逆位等を引き起こす天然の変異があることに注意す
ることが重要である。これらの変異は遺伝子工学でも得
られる。ＭＤＶ−１ゲノムのこのような関連しているが
同一ではない領域に導入した異種遺伝子を含む組換えＭ
ＤＶ−１も本発明に含まれる。例えば、第２図に示すＭ
ＤＶ−１ゲノムの核酸配列に欠失を有するＭＤＶ−１株
に異種遺伝子を導入することができる。第２図に示すＤ
ＮＡ配列で本明細書に定義のＭＤＶ−１挿入領域は異種
核酸配列の導入に使用できるＭＤＶ−１ゲノム内の領域
の位置の特徴となる。
【００２４】本発明のＭＤＶ−１ゲノムに導入する異種
核酸配列は任意の源例えばウィルス、原核細胞、真核細
胞または合成物質由来であってよい。前記核酸配列は病
原体、好ましくはトリの病原体由来であり、ＭＤＶ−１
ゲノムに挿入した後に疾患に対する免疫性誘発に使用で
きる。感染性気管支炎ウィルス（「ＩＢＶ」）、ＭＤ
Ｖ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ニワトリ貧血病原体（ＣＡ
Ａ）、レオウィルス、トリレトロウィルス、家禽アデノ
ウィルス、七面鳥鼻気管炎ウィルス、感染性咽頭気管炎
ウィルス、エイメリア種、サルモネラ種、大腸菌及びマ
イコプラズマガリセプチクム（Mycoplasma galliseptic
um）がＭＤＶ−１ゲノムの挿入領域への導入されよう。
さらに、医薬品または診断用途特に免疫調節剤例えばリ
ンホカイン、インターフェロンまたはサイトカインのポ
リペプチドをコードする核酸配列を前記挿入領域に挿入
することができる。
核酸配列は任意の源例えばウィルス、原核細胞、真核細
胞または合成物質由来であってよい。前記核酸配列は病
原体、好ましくはトリの病原体由来であり、ＭＤＶ−１
ゲノムに挿入した後に疾患に対する免疫性誘発に使用で
きる。感染性気管支炎ウィルス（「ＩＢＶ」）、ＭＤ
Ｖ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ニワトリ貧血病原体（ＣＡ
Ａ）、レオウィルス、トリレトロウィルス、家禽アデノ
ウィルス、七面鳥鼻気管炎ウィルス、感染性咽頭気管炎
ウィルス、エイメリア種、サルモネラ種、大腸菌及びマ
イコプラズマガリセプチクム（Mycoplasma galliseptic
um）がＭＤＶ−１ゲノムの挿入領域への導入されよう。
さらに、医薬品または診断用途特に免疫調節剤例えばリ
ンホカイン、インターフェロンまたはサイトカインのポ
リペプチドをコードする核酸配列を前記挿入領域に挿入
することができる。
【００２５】このような異種核酸配列の発現には配列を
適切で機能性のプロモータに結合することが必要であ
る。このようなプロモータはＭＤＶ−１に感染した細胞
で遺伝子発現させることのできる原核、真核、ウィルス
または合成プロモータのいずれであってもよい。
適切で機能性のプロモータに結合することが必要であ
る。このようなプロモータはＭＤＶ−１に感染した細胞
で遺伝子発現させることのできる原核、真核、ウィルス
または合成プロモータのいずれであってもよい。
【００２６】組換えＭＤＶ−１は次のステップからなる
方法で調製できる：適切なベヒクルにクローニングした
ＭＤＶ−１ゲノムのBamHI-A 制限断片の4.3 kb BamHI-E
coRIサブ断片を含有する第一ベクターを得；第一ベクタ
ーのＭＤＶ−１ＤＮＡ断片に少なくとも１つの外来遺伝
子配列を挿入して第二ベクターを形成し；第二ベクター
からのＤＮＡとＭＤＶ−１からのＤＮＡで細胞をコトラ
ンスフェクト（co-transfect）し；外来遺伝子で中断さ
れたＭＤＶ−１ＤＮＡを含有する第二ベクターのＤＮＡ
断片と第二ベクターのＭＤＶ−１ＤＮＡ断片と相同また
は類似のヌクレオチド配列を有する弱毒化したＭＤＶ−
１のゲノムＤＮＡの間で相同的組換えが起こるのに十分
な時間コトランスフェクトした細胞をインキュベート
し；トラスフェクトした細胞から弱毒化したＭＤＶ−１
及びその中に挿入した外来遺伝子を含む組換えウィルス
を単離する。
方法で調製できる：適切なベヒクルにクローニングした
ＭＤＶ−１ゲノムのBamHI-A 制限断片の4.3 kb BamHI-E
coRIサブ断片を含有する第一ベクターを得；第一ベクタ
ーのＭＤＶ−１ＤＮＡ断片に少なくとも１つの外来遺伝
子配列を挿入して第二ベクターを形成し；第二ベクター
からのＤＮＡとＭＤＶ−１からのＤＮＡで細胞をコトラ
ンスフェクト（co-transfect）し；外来遺伝子で中断さ
れたＭＤＶ−１ＤＮＡを含有する第二ベクターのＤＮＡ
断片と第二ベクターのＭＤＶ−１ＤＮＡ断片と相同また
は類似のヌクレオチド配列を有する弱毒化したＭＤＶ−
１のゲノムＤＮＡの間で相同的組換えが起こるのに十分
な時間コトランスフェクトした細胞をインキュベート
し；トラスフェクトした細胞から弱毒化したＭＤＶ−１
及びその中に挿入した外来遺伝子を含む組換えウィルス
を単離する。
【００２７】第１ステップでは、ＭＤＶ−１ゲノムのBa
mHI-A 制限断片の4.3 kb BamHI-EcoRIサブ断片を適切な
ベクターに連結して第一ベクターを形成する。ベクター
は好適なプラスミド、コスミドまたはバクテリオファー
ジのいずれの由来であってよく、プラスミドが好まし
い。最も好ましいプラスミドはｐＭＤ１００プラスミド
である。BamHI-A 制限断片の4.3 kb BamHI-EcoRIサブ断
片は、慣用法でＭＤＶ−１の23 kb BamHI-A 断片を含有
するクローンをBamHI 及びEcoRI で消化することにより
単離する。
mHI-A 制限断片の4.3 kb BamHI-EcoRIサブ断片を適切な
ベクターに連結して第一ベクターを形成する。ベクター
は好適なプラスミド、コスミドまたはバクテリオファー
ジのいずれの由来であってよく、プラスミドが好まし
い。最も好ましいプラスミドはｐＭＤ１００プラスミド
である。BamHI-A 制限断片の4.3 kb BamHI-EcoRIサブ断
片は、慣用法でＭＤＶ−１の23 kb BamHI-A 断片を含有
するクローンをBamHI 及びEcoRI で消化することにより
単離する。
【００２８】必要に応じ、ＭＤＶ−１の23 kb BamHI-A
断片を含有するクローンをＭＤＶ−１のゲノムライブラ
リーから単離することができる。ウィルスのゲノムライ
ブラリーは、慣用法で宿主細胞培養例えばトリの細胞培
養中でＭＤＶ−１を培養し、慣用法でＭＤＶ−１に感染
した宿主細胞培養からウィルスＤＮＡを単離することに
より調製できる。例えば、ＭＤＶ−１をニワトリの胚繊
維芽細胞に接種し、培養してウィルスに感染した細胞を
得る。ウィルス感染した細胞を採取し、バッファで洗
い、遠心し、１ｍｌ当り１−５×１０8 細胞の密度でト
リス塩酸及びＥＤＴＡ中に再懸濁する。ドデシル硫酸ナ
トリウム（「ＳＤＳ」）を最終濃度０．５％まで加え、
プロテイナーゼＫを最終濃度 200μｇ／ｍｌまで加え
る。インキュベーション後、さらにプロテイナーゼＫを
加え、１時間インキュベーションを続ける。溶液をフェ
ノール−クロロホルム（１：１）混合物で２回抽出し、
慣用法で核酸をエタノール沈澱させる。感染細胞からの
全ＤＮＡを遠心で回収し、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）及び１ｍＭＥＤＴＡ（「ＴＥ」）に溶解させ
る。酵素供給者の推奨した条件に従って、ＤＮＡをSau3
A のような制限酵素と共にインキュベートする。反応生
成物をアガロースゲルで分離し、１６から２０ｋｂの大
きさの画分を単離する。慣用法で、適当な制限酵素で消
化した好適ベクターＤＮＡとこれらのＤＮＡ断片１００
ナノグラムを連結する。好適ベクターは例えばBamHI-Ec
oRI で消化したλEMBL3 ＤＮＡであろう。連結後、反応
混合物を市販の抽出物を使用してin vitroでパッケージ
する。組換えバクテリオファージを約１００ＰＦＵ／プ
レートの密度でLE392 またはK802のような適当なE. col
i 宿主株にプレートする。慣用法に従ってニトロセルロ
ースフィルターを使用して２枚組で皿のレプリカを調製
する。第一セットのフィルターは慣用法を使用して非感
染細胞由来の放射性標識ＤＮＡとハイブリッド形成さ
せ、第二セットのフィルターはＭＤＶ−１感染細胞由来
の放射性標識ＤＮＡとハイブリッド形成させる。洗浄
し、Ｘ線フィルムに露光した後、２枚組のフィルターの
イメージを正確な配向に重ね、ＭＤＶ−１感染細胞から
得たプローブで特異的にシグナルを与えるいくつかのプ
ラークを単離し、それら由来のバクテリオファージを増
幅させる。これらのバクテリオファージクローンを挿入
物の制限マッピングで詳細に分析し、制限酵素認識パタ
ーンを有するクローンを見いだすと、これはＭＤＶ−１
ゲノムのBamHI-A 断片を含有していることを示す。
断片を含有するクローンをＭＤＶ−１のゲノムライブラ
リーから単離することができる。ウィルスのゲノムライ
ブラリーは、慣用法で宿主細胞培養例えばトリの細胞培
養中でＭＤＶ−１を培養し、慣用法でＭＤＶ−１に感染
した宿主細胞培養からウィルスＤＮＡを単離することに
より調製できる。例えば、ＭＤＶ−１をニワトリの胚繊
維芽細胞に接種し、培養してウィルスに感染した細胞を
得る。ウィルス感染した細胞を採取し、バッファで洗
い、遠心し、１ｍｌ当り１−５×１０8 細胞の密度でト
リス塩酸及びＥＤＴＡ中に再懸濁する。ドデシル硫酸ナ
トリウム（「ＳＤＳ」）を最終濃度０．５％まで加え、
プロテイナーゼＫを最終濃度 200μｇ／ｍｌまで加え
る。インキュベーション後、さらにプロテイナーゼＫを
加え、１時間インキュベーションを続ける。溶液をフェ
ノール−クロロホルム（１：１）混合物で２回抽出し、
慣用法で核酸をエタノール沈澱させる。感染細胞からの
全ＤＮＡを遠心で回収し、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）及び１ｍＭＥＤＴＡ（「ＴＥ」）に溶解させ
る。酵素供給者の推奨した条件に従って、ＤＮＡをSau3
A のような制限酵素と共にインキュベートする。反応生
成物をアガロースゲルで分離し、１６から２０ｋｂの大
きさの画分を単離する。慣用法で、適当な制限酵素で消
化した好適ベクターＤＮＡとこれらのＤＮＡ断片１００
ナノグラムを連結する。好適ベクターは例えばBamHI-Ec
oRI で消化したλEMBL3 ＤＮＡであろう。連結後、反応
混合物を市販の抽出物を使用してin vitroでパッケージ
する。組換えバクテリオファージを約１００ＰＦＵ／プ
レートの密度でLE392 またはK802のような適当なE. col
i 宿主株にプレートする。慣用法に従ってニトロセルロ
ースフィルターを使用して２枚組で皿のレプリカを調製
する。第一セットのフィルターは慣用法を使用して非感
染細胞由来の放射性標識ＤＮＡとハイブリッド形成さ
せ、第二セットのフィルターはＭＤＶ−１感染細胞由来
の放射性標識ＤＮＡとハイブリッド形成させる。洗浄
し、Ｘ線フィルムに露光した後、２枚組のフィルターの
イメージを正確な配向に重ね、ＭＤＶ−１感染細胞から
得たプローブで特異的にシグナルを与えるいくつかのプ
ラークを単離し、それら由来のバクテリオファージを増
幅させる。これらのバクテリオファージクローンを挿入
物の制限マッピングで詳細に分析し、制限酵素認識パタ
ーンを有するクローンを見いだすと、これはＭＤＶ−１
ゲノムのBamHI-A 断片を含有していることを示す。
【００２９】上記に概説するように、慣用法によりBamH
I 及びEcoRI 制限酵素でBamHI-A を含有するゲノムクロ
ーンを消化してＭＤＶ−１ゲノムのBamHI-A 制限断片の
4.3kb BamHI-EcoRIサブ断片を単離する。消化断片を低
融点アガロースゲル電気泳動で分離し、4.3 kb EcoRI-B
amHIサブ断片を単離し、例えばフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱を含む標準法で精製する。精製した4.3 kb E
coRI-BamHIサブ断片をＤＮＡリガーゼを使用する慣用法
に従って好適ベクターに連結して第一ベクターを生成す
る。好適ベクターはプラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ
１９であり、これはLife Technologies, Inc., P.O. Bo
x 6009, Gaithersburg, MD 20877から入手できる。連結
産物を好適な宿主細胞にトランスフォームする。トラン
スフォーマントからのＤＮＡを慣用法で精製、分析し、
正しい第一ベクターが得られたことを確認する。第一ベ
クターは4.3 kb BamHI-EcoRIサブ断片内にBglII 制限酵
素認識部位を含有している。好適な第一ベクターは第３
図に示すプラスミドｐＭＤ１００である。
I 及びEcoRI 制限酵素でBamHI-A を含有するゲノムクロ
ーンを消化してＭＤＶ−１ゲノムのBamHI-A 制限断片の
4.3kb BamHI-EcoRIサブ断片を単離する。消化断片を低
融点アガロースゲル電気泳動で分離し、4.3 kb EcoRI-B
amHIサブ断片を単離し、例えばフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱を含む標準法で精製する。精製した4.3 kb E
coRI-BamHIサブ断片をＤＮＡリガーゼを使用する慣用法
に従って好適ベクターに連結して第一ベクターを生成す
る。好適ベクターはプラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ
１９であり、これはLife Technologies, Inc., P.O. Bo
x 6009, Gaithersburg, MD 20877から入手できる。連結
産物を好適な宿主細胞にトランスフォームする。トラン
スフォーマントからのＤＮＡを慣用法で精製、分析し、
正しい第一ベクターが得られたことを確認する。第一ベ
クターは4.3 kb BamHI-EcoRIサブ断片内にBglII 制限酵
素認識部位を含有している。好適な第一ベクターは第３
図に示すプラスミドｐＭＤ１００である。
【００３０】次のステップでは、少なくとも１つの外来
遺伝子配列を第一ベクターのＭＤＶ−１ＤＮＡ断片に挿
入して第二ベクターを形成する。
遺伝子配列を第一ベクターのＭＤＶ−１ＤＮＡ断片に挿
入して第二ベクターを形成する。
【００３１】第一ベクターのBglII 部位への挿入には任
意の外来遺伝子を使用できる。第一ベクターへの挿入に
使用する外来遺伝子はＭＤＶ−１とは異種の生物から調
製してもよい。外来ゲノムがＲＮＡからなるときには、
市販の逆転写酵素を使用する慣用法によりゲノムに相補
的なＤＮＡを調製する必要がある。第一ベクターに外来
遺伝子を適切に挿入するためには、外来遺伝子の制限地
図を作成し、外来遺伝子のヌクレオチド配列を決定する
ことが好ましい。制限地図の作成及びヌクレオチド配列
の決定は慣用法で実施できる。
意の外来遺伝子を使用できる。第一ベクターへの挿入に
使用する外来遺伝子はＭＤＶ−１とは異種の生物から調
製してもよい。外来ゲノムがＲＮＡからなるときには、
市販の逆転写酵素を使用する慣用法によりゲノムに相補
的なＤＮＡを調製する必要がある。第一ベクターに外来
遺伝子を適切に挿入するためには、外来遺伝子の制限地
図を作成し、外来遺伝子のヌクレオチド配列を決定する
ことが好ましい。制限地図の作成及びヌクレオチド配列
の決定は慣用法で実施できる。
【００３２】外来遺伝子の発現には、適当な機能性プロ
モータを外来遺伝子に連結する必要がある。プロモータ
は組換えＭＤＶ−１に感染した細胞に遺伝子転写を行わ
せることのできる原核、真核またはウィルスプロモータ
でありうる。例としては、レトロウィルスＬＴＲ由来の
プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、またはＭＤＶもしく
はＨＶＴゲノムに存在するプロモータがある。
モータを外来遺伝子に連結する必要がある。プロモータ
は組換えＭＤＶ−１に感染した細胞に遺伝子転写を行わ
せることのできる原核、真核またはウィルスプロモータ
でありうる。例としては、レトロウィルスＬＴＲ由来の
プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、またはＭＤＶもしく
はＨＶＴゲノムに存在するプロモータがある。
【００３３】第一ベクターへの外来遺伝子の挿入は慣用
法で実施できる。第一ベクターをＭＤＶ−１ゲノムのBa
mHI-A 制限断片の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内にある
BglIIで切断する。ＤＮＡリガーゼ及び慣用法を使用し
て外来遺伝子をBglII 部位に連結し、第二ベクターを形
成する。連結産物を適切な宿主細胞にトランスフォーム
する。トランスフォーマントを慣用法で精製、分析し、
正しい第二ベクターが得られたことを確認する。第二ベ
クターからのプラスミドＤＮＡは慣用法で調製し、塩化
セシウム平衡遠心により２回バンド化する。
法で実施できる。第一ベクターをＭＤＶ−１ゲノムのBa
mHI-A 制限断片の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内にある
BglIIで切断する。ＤＮＡリガーゼ及び慣用法を使用し
て外来遺伝子をBglII 部位に連結し、第二ベクターを形
成する。連結産物を適切な宿主細胞にトランスフォーム
する。トランスフォーマントを慣用法で精製、分析し、
正しい第二ベクターが得られたことを確認する。第二ベ
クターからのプラスミドＤＮＡは慣用法で調製し、塩化
セシウム平衡遠心により２回バンド化する。
【００３４】第３ステップでは、上記概説したようにし
て得た第二ベクター由来のＤＮＡ及びＭＤＶ−１株由来
のＤＮＡで細胞をコトランスフェクトさせる。第二ベク
ター由来ＤＮＡでＭＤＶ−１感染細胞をトランスフェク
トさせることもできる。
て得た第二ベクター由来のＤＮＡ及びＭＤＶ−１株由来
のＤＮＡで細胞をコトランスフェクトさせる。第二ベク
ター由来ＤＮＡでＭＤＶ−１感染細胞をトランスフェク
トさせることもできる。
【００３５】慣用法に従って、二次ニワトリ胚繊維芽細
胞培養を適当な弱毒化ＭＤＶ−１に感染させ、強力な細
胞病理作用が明かとなるまで培養物をインキュベートす
ることによりＭＤＶ−１からのＤＮＡを得る。０．２ｍ
ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、０．５％ＳＤＳ、１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）及び
１ｍＭＥＤＴＡを含有する消化溶液中でＭＤＶ−１感染
細胞を４時間インキュベートすることにより全細胞ＤＮ
Ａを精製する。溶液をフェノールで１回、クロロホルム
−イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出する。
ＤＮＡは２容の無水エタノールを加えて沈澱させ、遠心
で回収し、ＴＥに溶解し、２６０ｎｍの吸光度により定
量する。この方法で調製したＤＮＡを本明細書中では
「ＭＤＶＤＮＡ」と呼ぶ。ＭＤＶ ＤＮＡは任意の好適
なＭＤＶ−１に感染した培養物から調製できる。
胞培養を適当な弱毒化ＭＤＶ−１に感染させ、強力な細
胞病理作用が明かとなるまで培養物をインキュベートす
ることによりＭＤＶ−１からのＤＮＡを得る。０．２ｍ
ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、０．５％ＳＤＳ、１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）及び
１ｍＭＥＤＴＡを含有する消化溶液中でＭＤＶ−１感染
細胞を４時間インキュベートすることにより全細胞ＤＮ
Ａを精製する。溶液をフェノールで１回、クロロホルム
−イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出する。
ＤＮＡは２容の無水エタノールを加えて沈澱させ、遠心
で回収し、ＴＥに溶解し、２６０ｎｍの吸光度により定
量する。この方法で調製したＤＮＡを本明細書中では
「ＭＤＶＤＮＡ」と呼ぶ。ＭＤＶ ＤＮＡは任意の好適
なＭＤＶ−１に感染した培養物から調製できる。
【００３６】第二ベクターからのＤＮＡとＭＤＶ ＤＮ
Ａによるコトランスフェクションは、燐酸カルシウムに
よるトランスフェクションの慣用法（F.L. Graham ら、
Virology 52:456-467, 1977 ；及びN.D. Stow ら、J. G
en. Virol. 33:447-458, 1976 ）を以下のように変えて
実施する。一次（初代）ニワトリ胚繊維芽細胞は特定の
病原体を含まない卵から得た１０日齢のニワトリの胚か
ら得る。１日後に、二次ニワトリ胚繊維芽細胞を一次培
養物から調製する。二次ニワトリ胚繊維芽細胞を調製す
る一方、燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱を作り、微細な沈
澱が見えるまで管を放置し、次に内容物を新しくプレー
トした細胞の２枚の皿に均等に分ける。インキュベーシ
ョン後、培養物を血清を含まない維持培地中ですすぎ、
１ｘＨＢＳＰ（0.75mM Na2 HPO4 ・7H2 O, 5mM KCl,
140mM NaCl, 6mM グルコース, 25mM HEPES, pH7 ）中の
１５％グリセロールで３分間処理し、すすぎ、完全維持
培地を加える。
Ａによるコトランスフェクションは、燐酸カルシウムに
よるトランスフェクションの慣用法（F.L. Graham ら、
Virology 52:456-467, 1977 ；及びN.D. Stow ら、J. G
en. Virol. 33:447-458, 1976 ）を以下のように変えて
実施する。一次（初代）ニワトリ胚繊維芽細胞は特定の
病原体を含まない卵から得た１０日齢のニワトリの胚か
ら得る。１日後に、二次ニワトリ胚繊維芽細胞を一次培
養物から調製する。二次ニワトリ胚繊維芽細胞を調製す
る一方、燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱を作り、微細な沈
澱が見えるまで管を放置し、次に内容物を新しくプレー
トした細胞の２枚の皿に均等に分ける。インキュベーシ
ョン後、培養物を血清を含まない維持培地中ですすぎ、
１ｘＨＢＳＰ（0.75mM Na2 HPO4 ・7H2 O, 5mM KCl,
140mM NaCl, 6mM グルコース, 25mM HEPES, pH7 ）中の
１５％グリセロールで３分間処理し、すすぎ、完全維持
培地を加える。
【００３７】第４ステップでは、外来遺伝子と共にＭＤ
Ｖ−１ゲノムのＤＮＡ断片を含有する第二ベクターのＤ
ＮＡ断片と、第二ベクター内のＭＤＶ−１ＤＮＡ断片と
相同または類似のヌクレオチド配列を有する弱毒化した
ＭＤＶ−１のＤＮＡの部分との間で相同的組換えが起こ
るに十分な時間、コトランスフェクトした細胞をインキ
ュベートする。
Ｖ−１ゲノムのＤＮＡ断片を含有する第二ベクターのＤ
ＮＡ断片と、第二ベクター内のＭＤＶ−１ＤＮＡ断片と
相同または類似のヌクレオチド配列を有する弱毒化した
ＭＤＶ−１のＤＮＡの部分との間で相同的組換えが起こ
るに十分な時間、コトランスフェクトした細胞をインキ
ュベートする。
【００３８】最後に、弱毒化したＭＤＶ−１及び挿入し
た外来遺伝子を含有する組換えウィルスを培養したトラ
ンスフェクトした細胞から単離し、他の外来遺伝子を含
有する組換え体は適当なプローブとのハイブリッド形
成、特異的抗体との反応性及び関連酵素活性の消失また
は獲得を含む多くの方法で同定できる。
た外来遺伝子を含有する組換えウィルスを培養したトラ
ンスフェクトした細胞から単離し、他の外来遺伝子を含
有する組換え体は適当なプローブとのハイブリッド形
成、特異的抗体との反応性及び関連酵素活性の消失また
は獲得を含む多くの方法で同定できる。
【００３９】例えば、ハイブリッド形成により組換えウ
ィルスを同定するためには、培養物からの維持培地を捨
て、アガロースを含有する新しい維持培地を細胞上に重
ねる。プラーク形成が始まるまで培養物を１−３日イン
キュベートする。各プラークの一部をアガロースゲルの
一部と共に集め、市販のメンブレンフィルター上に移
す。慣用法に従って、フィルターを変性、中和させ、各
プラークからのＤＮＡをフィルター上に不動化する。外
来遺伝子からなる放射性標識プローブを使用する慣用法
に従って、得られたフィルターをプラークハイブリッド
形成法にかける。プローブとハイブリッド形成するプラ
ークを陽性とみなす。正のハイブリッド形成シグナルに
対応する組換えプラークを組織培養皿上のアガロース上
層から単離し、ＭＤＶ−１について慣用の手順に従って
増殖させる。
ィルスを同定するためには、培養物からの維持培地を捨
て、アガロースを含有する新しい維持培地を細胞上に重
ねる。プラーク形成が始まるまで培養物を１−３日イン
キュベートする。各プラークの一部をアガロースゲルの
一部と共に集め、市販のメンブレンフィルター上に移
す。慣用法に従って、フィルターを変性、中和させ、各
プラークからのＤＮＡをフィルター上に不動化する。外
来遺伝子からなる放射性標識プローブを使用する慣用法
に従って、得られたフィルターをプラークハイブリッド
形成法にかける。プローブとハイブリッド形成するプラ
ークを陽性とみなす。正のハイブリッド形成シグナルに
対応する組換えプラークを組織培養皿上のアガロース上
層から単離し、ＭＤＶ−１について慣用の手順に従って
増殖させる。
【００４０】他の方法を使用してトランスフェクタント
（transfectant）中の外来遺伝子の存在を検出すること
ができる。例えば、外来遺伝子産物に特異的な抗体を使
用して組換えＭＤＶ−１プラークを含有する組織培養皿
を染色することができる。外来遺伝子産物産生組換えＭ
ＤＶ−１を含有するプラークは抗体により特異的に認識
されよう。
（transfectant）中の外来遺伝子の存在を検出すること
ができる。例えば、外来遺伝子産物に特異的な抗体を使
用して組換えＭＤＶ−１プラークを含有する組織培養皿
を染色することができる。外来遺伝子産物産生組換えＭ
ＤＶ−１を含有するプラークは抗体により特異的に認識
されよう。
【００４１】上記に概説したように組換えＭＤＶ−１を
培養細胞中で増殖させる。全ＤＮＡを組換えＭＤＶ−１
感染細胞から単離し、慣用法を使用してサザンブロット
分析にかけて標的部位すなわちBamHI-A の4.3kb EcoRI-
BamHI サブ断片に外来遺伝子が挿入されたことを確認す
る。
培養細胞中で増殖させる。全ＤＮＡを組換えＭＤＶ−１
感染細胞から単離し、慣用法を使用してサザンブロット
分析にかけて標的部位すなわちBamHI-A の4.3kb EcoRI-
BamHI サブ断片に外来遺伝子が挿入されたことを確認す
る。
【００４２】トリの病原体の１種以上の異種ポリペプチ
ドを発現する生きた組換えＭＤＶ−１を使用してこれら
の病原体に感受性のある動物、特にニワトリ及び七面鳥
に予防接種することができる。本明細書に記載のように
組換えＭＤＶ−１から調製したベクター生ワクチンでの
予防接種の後に、接種された宿主内で、in vivo で異種
ポリペプチド及びＭＤＶ−１ポリペプチドを発現する組
換えＭＤＶ−１を複製させるのが好ましい。保護免疫応
答が生じると、接種された動物はそれらの病原体による
その後の感染から保護されよう。
ドを発現する生きた組換えＭＤＶ−１を使用してこれら
の病原体に感受性のある動物、特にニワトリ及び七面鳥
に予防接種することができる。本明細書に記載のように
組換えＭＤＶ−１から調製したベクター生ワクチンでの
予防接種の後に、接種された宿主内で、in vivo で異種
ポリペプチド及びＭＤＶ−１ポリペプチドを発現する組
換えＭＤＶ−１を複製させるのが好ましい。保護免疫応
答が生じると、接種された動物はそれらの病原体による
その後の感染から保護されよう。
【００４３】１種以上の異種ポリペプチドを含有及び発
現する本発明の組換えＭＤＶ−１は１価または多価ワク
チンとして作用しうる。このようなＭＤＶ−１は不活化
ワクチンの製造にも使用できる。これらワクチンはワク
チン製造業の当業者によく知られた方法で製造される。
現する本発明の組換えＭＤＶ−１は１価または多価ワク
チンとして作用しうる。このようなＭＤＶ−１は不活化
ワクチンの製造にも使用できる。これらワクチンはワク
チン製造業の当業者によく知られた方法で製造される。
【００４４】実施例を挙げてさらに本発明を説明する
が、本発明を限定するものではない。
が、本発明を限定するものではない。
【００４５】
【実施例】実施例１−材 料 ＭＤＶ−１のＧＡ株は M. Nonoyama(Showa Research In
stitute for Biomedicine, St. Petersburg, Florida）
から得た。この株を使用してＭＤＶ−１のBamHI プラス
ミドライブラリーを作成した（Fukuchi ら、１９８
４）。継代レベルが約７５になるまで二次ニワトリ胚繊
維芽細胞（「ＣＥＦ」）内で株を継代した。
stitute for Biomedicine, St. Petersburg, Florida）
から得た。この株を使用してＭＤＶ−１のBamHI プラス
ミドライブラリーを作成した（Fukuchi ら、１９８
４）。継代レベルが約７５になるまで二次ニワトリ胚繊
維芽細胞（「ＣＥＦ」）内で株を継代した。
【００４６】実施例２−プラスミドの構築 標準法を使用してクローニング手順を実施した。製造業
者の指示に従って制限酵素消化を実施した。プラスミド
ｐＭＤ１００は第３図に示すようにプラスミドベクター
ｐＵＣ１９にクローニングしたBamHI-A の末端4.3kb Ec
oRI-BamHI サブ断片を含有する。4.3 kb EcoRI-BamHIサ
ブ断片は完全にゲノムの非反復短領域内にある。lacZカ
セットは Intervet International, Boxmeer, オランダ
から得た。カセットは真核アッセイベクターｐＣＨ１１
０（Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ ）からlacZ遺伝
子を除去し、次のように改変して構築した。すなわち、
ＳＶ４０複製起源に近くの７２塩基対Sph1断片を次の構
造： 5′-GGATCCGTCGACCATG- 3′ 3′-GTACCCTAGGCAGCTG- 5′ の二本鎖合成オリゴヌクレオチドで置き換えた。ｐＣＨ
１１０の２つのSph1制限部位間へのリンカーの挿入によ
りどちらの部位にもSph1の認識配列は回復せず、ＳＶ４
０初期プロモータの上流にBamHI とSaII部位の両方が作
成された。次にこの構築物をBamHI で消化すると4.0 kb
発現カセットが生成された。第４図に示すように、lacZ
遺伝子は長さ４０５６ｂｐであり、ＳＶ４０初期プロモ
ータの制御下にある。
者の指示に従って制限酵素消化を実施した。プラスミド
ｐＭＤ１００は第３図に示すようにプラスミドベクター
ｐＵＣ１９にクローニングしたBamHI-A の末端4.3kb Ec
oRI-BamHI サブ断片を含有する。4.3 kb EcoRI-BamHIサ
ブ断片は完全にゲノムの非反復短領域内にある。lacZカ
セットは Intervet International, Boxmeer, オランダ
から得た。カセットは真核アッセイベクターｐＣＨ１１
０（Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ ）からlacZ遺伝
子を除去し、次のように改変して構築した。すなわち、
ＳＶ４０複製起源に近くの７２塩基対Sph1断片を次の構
造： 5′-GGATCCGTCGACCATG- 3′ 3′-GTACCCTAGGCAGCTG- 5′ の二本鎖合成オリゴヌクレオチドで置き換えた。ｐＣＨ
１１０の２つのSph1制限部位間へのリンカーの挿入によ
りどちらの部位にもSph1の認識配列は回復せず、ＳＶ４
０初期プロモータの上流にBamHI とSaII部位の両方が作
成された。次にこの構築物をBamHI で消化すると4.0 kb
発現カセットが生成された。第４図に示すように、lacZ
遺伝子は長さ４０５６ｂｐであり、ＳＶ４０初期プロモ
ータの制御下にある。
【００４７】ｐＭＤ１００にlacZカセットを挿入するた
めに、１μｇのｐＭＤ１００をBglII （Bethesda Resea
rch Laboratories[BRL], Gaithersburg, MD ）で消化し
た。子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Man
nhaim, Indianapolis, IN ）約１単位を加え、３０分間
インキュベーションを続けた。反応条件を２０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１００μｇ／ｍｌプ
ロテイナーゼＫ（ＢＲＬ）に調整し、さらに１時間イン
キュベーションを続けた。反応液をフェノールで１回抽
出し、酢酸ナトリウムを最終濃度０．１Ｍまで加え、２
容の無水エタノールを加えた。ＤＮＡをマイクロフュー
ジで、最高速度で１５分間遠心して集めた。ＤＮＡペレ
ットを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ（ＴＥ）の２０μｌに溶解した。
めに、１μｇのｐＭＤ１００をBglII （Bethesda Resea
rch Laboratories[BRL], Gaithersburg, MD ）で消化し
た。子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Man
nhaim, Indianapolis, IN ）約１単位を加え、３０分間
インキュベーションを続けた。反応条件を２０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１００μｇ／ｍｌプ
ロテイナーゼＫ（ＢＲＬ）に調整し、さらに１時間イン
キュベーションを続けた。反応液をフェノールで１回抽
出し、酢酸ナトリウムを最終濃度０．１Ｍまで加え、２
容の無水エタノールを加えた。ＤＮＡをマイクロフュー
ジで、最高速度で１５分間遠心して集めた。ＤＮＡペレ
ットを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ（ＴＥ）の２０μｌに溶解した。
【００４８】改変したlacZ遺伝子を次の連結反応でｐＭ
Ｄ１００のBglII 部位に挿入した。６６ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．６）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び１ｍＭ ＡＴ
Ｐからなる連結バッファ全量１０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（ＢＲＬ）の２単位と共に、BglII で消化した
ｐＭＤ１００の５０ｎｇ及び lacZ カセットの１０ｎｇ
を４℃で１晩インキュベートした。連結反応物をＴＥ中
でμｌ当りベクター１ｎｇまで希釈し、希釈した反応液
の２μｌを使用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転
換した。プラスミドＤＮＡを各コロニーから精製し、la
cZ配列の存在について分析した。第５図に示すようにla
cZ含有ｐＭＤ１００をｐＭＴ１Ａと表した。第５図の第
二プラスミドｐＭＴ１Ｂを構築したが、lacZカセットの
配向についてｐＭＴ１Ａとは異なっている。プラスミド
ＤＮＡは標準手順で調製し、塩化セシウム平衡遠心で２
回バンド化した。
Ｄ１００のBglII 部位に挿入した。６６ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．６）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び１ｍＭ ＡＴ
Ｐからなる連結バッファ全量１０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（ＢＲＬ）の２単位と共に、BglII で消化した
ｐＭＤ１００の５０ｎｇ及び lacZ カセットの１０ｎｇ
を４℃で１晩インキュベートした。連結反応物をＴＥ中
でμｌ当りベクター１ｎｇまで希釈し、希釈した反応液
の２μｌを使用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転
換した。プラスミドＤＮＡを各コロニーから精製し、la
cZ配列の存在について分析した。第５図に示すようにla
cZ含有ｐＭＤ１００をｐＭＴ１Ａと表した。第５図の第
二プラスミドｐＭＴ１Ｂを構築したが、lacZカセットの
配向についてｐＭＴ１Ａとは異なっている。プラスミド
ＤＮＡは標準手順で調製し、塩化セシウム平衡遠心で２
回バンド化した。
【００４９】実施例３−ＭＤＶ ＤＮＡの調製 上記のようにＭＤＶ感染したＣＥＦからの全ＤＮＡを調
製した。簡単には、７５ｃｍ2 のフラスコ内で増殖した
二次ＣＥＦ（フラスコ当り１．６×１０7 細胞をプレー
ト）を細胞性ウィルス（１０5 ＰＦＵ／フラスコ）に感
染させ、６日間インキュベートした。０．２ｍｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫ（ＢＲＬ）、０．５％ＳＤＳ、１００
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）及び１ｍ
ＭＥＤＴＡを含有する消化溶液中で４時間、細胞をイン
キュベートしてＤＮＡを精製した。溶液をフェノールで
１回、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：
１）で２回抽出した。２容の無水エタノールを加えてＤ
ＮＡを沈澱させ、遠心で回収し、ＴＥに溶解し、２６０
ｎｍの吸光度により定量した。この方法で調製したＤＮ
ＡをＭＤＶ ＤＮＡと呼ぶことにする。
製した。簡単には、７５ｃｍ2 のフラスコ内で増殖した
二次ＣＥＦ（フラスコ当り１．６×１０7 細胞をプレー
ト）を細胞性ウィルス（１０5 ＰＦＵ／フラスコ）に感
染させ、６日間インキュベートした。０．２ｍｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫ（ＢＲＬ）、０．５％ＳＤＳ、１００
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）及び１ｍ
ＭＥＤＴＡを含有する消化溶液中で４時間、細胞をイン
キュベートしてＤＮＡを精製した。溶液をフェノールで
１回、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：
１）で２回抽出した。２容の無水エタノールを加えてＤ
ＮＡを沈澱させ、遠心で回収し、ＴＥに溶解し、２６０
ｎｍの吸光度により定量した。この方法で調製したＤＮ
ＡをＭＤＶ ＤＮＡと呼ぶことにする。
【００５０】実施例４−トランスフェクション 各ＭＤＶ ＤＮＡ調製物についてＭＤＶ ＤＮＡによる
プラーク形成の用量反応を測定し、最大のプラーク収量
が得られるＭＤＶ ＤＮＡの量をコトランスフェクショ
ン（co-transfection ）に使用した。トランスフェクシ
ョンの前に、ＭＤＶ ＤＮＡの４〜８μｇ及びプラスミ
ドＤＮＡの０．５μｇをエタノール沈澱させ、遠心で回
収し、５０μｌのＴＥに溶解した。
プラーク形成の用量反応を測定し、最大のプラーク収量
が得られるＭＤＶ ＤＮＡの量をコトランスフェクショ
ン（co-transfection ）に使用した。トランスフェクシ
ョンの前に、ＭＤＶ ＤＮＡの４〜８μｇ及びプラスミ
ドＤＮＡの０．５μｇをエタノール沈澱させ、遠心で回
収し、５０μｌのＴＥに溶解した。
【００５１】一次ニワトリ胚繊維芽細胞を特定病原体を
含まない卵から得た１０日齢のニワトリ胚から調製し
た。細胞を８×１０5 細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、１．
６×１０7 細胞／７５ｃｍ2 フラスコ（２０ｍｌ／フラ
スコ）の密度でプレートした。１日後、一次（初代）培
養物を血清を含まない維持培地で１回洗い、０．０５％
トリプシンで処理してフラスコから除去した。約０．５
ｍｌの子牛血清を加えてトリプシンを不活化し、細胞を
２５００ｒｐｍで１０分間遠心し、始めの１．５倍の容
量に再懸濁し、約８×１０5 細胞／ｍｌの濃度で一次培
養物としてプレートし、チーズクロスで２回濾過した。
燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物を加える直前に、細胞を
４×１０6 細胞／皿（５ｍｌ／皿）の密度で６０ｍｍの
グリッドのある組織培養皿にプレートした。
含まない卵から得た１０日齢のニワトリ胚から調製し
た。細胞を８×１０5 細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、１．
６×１０7 細胞／７５ｃｍ2 フラスコ（２０ｍｌ／フラ
スコ）の密度でプレートした。１日後、一次（初代）培
養物を血清を含まない維持培地で１回洗い、０．０５％
トリプシンで処理してフラスコから除去した。約０．５
ｍｌの子牛血清を加えてトリプシンを不活化し、細胞を
２５００ｒｐｍで１０分間遠心し、始めの１．５倍の容
量に再懸濁し、約８×１０5 細胞／ｍｌの濃度で一次培
養物としてプレートし、チーズクロスで２回濾過した。
燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物を加える直前に、細胞を
４×１０6 細胞／皿（５ｍｌ／皿）の密度で６０ｍｍの
グリッドのある組織培養皿にプレートした。
【００５２】二次ニワトリ胚繊維芽細胞を調製する一
方、１５ｍｌのポリスチレン管に次の試薬を順次加えて
燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物を作成した：水３８８μ
ｌ、ＴＥ中のＤＮＡ５０μｌ、及び２Ｍ塩化カルシウム
６２μｌ。正確に５００μｌの２×ＨＢＳＰ（２×ＨＢ
ＳＰ＝１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ グルコ
ース、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）をゆっくりと加
え、溶液にピペットの先から５−６個の泡をそっと吹き
込んで試験管の内容物を混合した。試験管は微細な沈澱
が見えるまで室温で３０分間放置し、緩和に混合し、新
しくプレートした細胞の２つの皿に均等に分けた。３７
℃で４時間インキュベートした後、培養物を血清を含ま
ない維持培地で注意深くすすぎ、１ｘＨＢＳＰ中の１５
％グリセロール（１．５ｍｌ／皿）で３分間処理し、す
すぎ、完全維持培地を加えた。
方、１５ｍｌのポリスチレン管に次の試薬を順次加えて
燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物を作成した：水３８８μ
ｌ、ＴＥ中のＤＮＡ５０μｌ、及び２Ｍ塩化カルシウム
６２μｌ。正確に５００μｌの２×ＨＢＳＰ（２×ＨＢ
ＳＰ＝１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ グルコ
ース、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）をゆっくりと加
え、溶液にピペットの先から５−６個の泡をそっと吹き
込んで試験管の内容物を混合した。試験管は微細な沈澱
が見えるまで室温で３０分間放置し、緩和に混合し、新
しくプレートした細胞の２つの皿に均等に分けた。３７
℃で４時間インキュベートした後、培養物を血清を含ま
ない維持培地で注意深くすすぎ、１ｘＨＢＳＰ中の１５
％グリセロール（１．５ｍｌ／皿）で３分間処理し、す
すぎ、完全維持培地を加えた。
【００５３】６日後にプラークを計測した。第１表に示
すように、使用したＭＤＶ ＤＮＡ調製物によってコト
ランスフェクション実験のプラーク形成頻度は変化し
た。
すように、使用したＭＤＶ ＤＮＡ調製物によってコト
ランスフェクション実験のプラーク形成頻度は変化し
た。
【００５４】
【表１】
【００５５】ａ 材料及び方法に概説したようにＧＡ感
染ＣＥＦからの全ＤＮＡを調製した。
染ＣＥＦからの全ＤＮＡを調製した。
【００５６】ｂ ＭＤＶ ＤＮＡと５００ｎｇのプラス
ミドＤＮＡを共沈した。
ミドＤＮＡを共沈した。
【００５７】ｃ 各燐酸カルシウム沈澱物は２枚の６０
ｍｍグリッド付皿に均等に分けた。数値は沈澱当りに存
在するプラークの合計である。
ｍｍグリッド付皿に均等に分けた。数値は沈澱当りに存
在するプラークの合計である。
【００５８】ｄ １００％β−ガラクトシダーゼ陽性の
プラーク精製単離体の数。
プラーク精製単離体の数。
【００５９】大腸菌のlacZ遺伝子を含有する組換え体は
次のように同定した。トランスフェクションの７日後、
組織培養培地を２ｍｌに減らし、皿に２０μｌの Bluog
al（ＢＲＬ）溶液（ジメチルスルホキシド中に新たに調
製、２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、Bluogal 最終濃度を０．
２ｍｇ／ｍｌとした。組織培養インキュベータで皿を１
−２時間インキュベートした。青色のプラークが現れた
ら取り、０．０５％トリプシンに懸濁させて細胞をバラ
バラにした。５分後、子牛血清を１−２滴加えてトリプ
シンを不活化し、単離したプラークを新たにプレートし
た二次ＣＥＦでタイター（titer ）した。７日後に、皿
を染色し、青色のプラークを取り、再度プレートした。
次のように同定した。トランスフェクションの７日後、
組織培養培地を２ｍｌに減らし、皿に２０μｌの Bluog
al（ＢＲＬ）溶液（ジメチルスルホキシド中に新たに調
製、２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、Bluogal 最終濃度を０．
２ｍｇ／ｍｌとした。組織培養インキュベータで皿を１
−２時間インキュベートした。青色のプラークが現れた
ら取り、０．０５％トリプシンに懸濁させて細胞をバラ
バラにした。５分後、子牛血清を１−２滴加えてトリプ
シンを不活化し、単離したプラークを新たにプレートし
た二次ＣＥＦでタイター（titer ）した。７日後に、皿
を染色し、青色のプラークを取り、再度プレートした。
【００６０】染色後、上記表１に示すように、計測した
プラークの０．３〜１．０％がガラクトシダーゼ活性に
ついて陽性であった。各陽性プラークについて約４回採
取・染色を繰り返し、安定なプラーク精製単離体を得
た。安定な、プラーク単離体は最初に採取した青色のプ
ラークの１８％について得られ、従って、安定な組換え
単離物はトランスフェクション皿に存在する最初のプラ
ークの約０．１％から得られた。安定な組換え体を単離
すると、細胞培養でウィルスを継代してもウィルスＤＮ
Ａを二次ＣＥＦに再トランスフェクトしても、それから
得たプラークは１００％β−ガラクトシダーゼ陽性のま
まであった。全体で４つの、lacZを発現する組換えウィ
ルスが単離された。これらの単離物はＧＡｌａｃ１、Ｇ
Ａｌａｃ２、ＧＡｌａｃ３及びＧＡｌａｃ４と表した。
単離物のうち３つ（ＧＡｌａｃ１、ＧＡｌａｃ２及びＧ
Ａｌａｃ３）はｐＭＴ１Ｂを使用して、１つ（ＧＡｌａ
ｃ４）はｐＭＴ１Ａを使用して作成した。
プラークの０．３〜１．０％がガラクトシダーゼ活性に
ついて陽性であった。各陽性プラークについて約４回採
取・染色を繰り返し、安定なプラーク精製単離体を得
た。安定な、プラーク単離体は最初に採取した青色のプ
ラークの１８％について得られ、従って、安定な組換え
単離物はトランスフェクション皿に存在する最初のプラ
ークの約０．１％から得られた。安定な組換え体を単離
すると、細胞培養でウィルスを継代してもウィルスＤＮ
Ａを二次ＣＥＦに再トランスフェクトしても、それから
得たプラークは１００％β−ガラクトシダーゼ陽性のま
まであった。全体で４つの、lacZを発現する組換えウィ
ルスが単離された。これらの単離物はＧＡｌａｃ１、Ｇ
Ａｌａｃ２、ＧＡｌａｃ３及びＧＡｌａｃ４と表した。
単離物のうち３つ（ＧＡｌａｃ１、ＧＡｌａｃ２及びＧ
Ａｌａｃ３）はｐＭＴ１Ｂを使用して、１つ（ＧＡｌａ
ｃ４）はｐＭＴ１Ａを使用して作成した。
【００６１】実施例６−ＧＡｌａｃ組換えＤＮＡの分
析 ７５ｃｍ2 のフラスコ内で増殖している二次ＣＥＦを精
製したＧＡｌａｃ組換え体に感染させ、約１０，０００
プラーク／フラスコを得た。組換えウィルスに感染した
培養物からの全ＤＮＡを上記のように精製した。標準法
を使用してサザーンブロットを作成し、第６図に示すよ
うにｐＭＤ１００からの4.3 kb挿入物、lacZ遺伝子の
５’末端を含有するｐＣＨ１１０の2.5 kb PvuII断片ま
たはｐＢＲ３２２でプローブした。ランダムプライムＤ
ＮＡ合成キット（Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN ）を使用して、プローブを32Ｐ−デオキシヌクレオ
チドで放射性標識した。５０％ホルムアミド、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ＳＤＳ、１００μ
ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、０．１％Ficoll 400（Si
gma Chemical Company, St. Louis, MO USA ）含有５xD
enhardt 溶液、０．１％ポリビニルピロリドン、及び６
ｘＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含有している［ｐＨ
７］）中、４２℃で１６時間ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッ
ド形成を実施した。ハイブリッド形成したニトロセルロ
ースフィルターを０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳか
らなる洗浄溶液中、６５℃で、３０分ずつ４回洗った。
析 ７５ｃｍ2 のフラスコ内で増殖している二次ＣＥＦを精
製したＧＡｌａｃ組換え体に感染させ、約１０，０００
プラーク／フラスコを得た。組換えウィルスに感染した
培養物からの全ＤＮＡを上記のように精製した。標準法
を使用してサザーンブロットを作成し、第６図に示すよ
うにｐＭＤ１００からの4.3 kb挿入物、lacZ遺伝子の
５’末端を含有するｐＣＨ１１０の2.5 kb PvuII断片ま
たはｐＢＲ３２２でプローブした。ランダムプライムＤ
ＮＡ合成キット（Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN ）を使用して、プローブを32Ｐ−デオキシヌクレオ
チドで放射性標識した。５０％ホルムアミド、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ＳＤＳ、１００μ
ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、０．１％Ficoll 400（Si
gma Chemical Company, St. Louis, MO USA ）含有５xD
enhardt 溶液、０．１％ポリビニルピロリドン、及び６
ｘＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含有している［ｐＨ
７］）中、４２℃で１６時間ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッ
ド形成を実施した。ハイブリッド形成したニトロセルロ
ースフィルターを０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳか
らなる洗浄溶液中、６５℃で、３０分ずつ４回洗った。
【００６２】ジデオキシ配列決定法及びSequenase I
（United States Biochemical Corporation, Clevelan
d, Ohio）を使用してＲＮＡを含まないプラスミドのＤ
ＮＡ配列決定を実施した。市販のソフトウェアー「Micr
ogenie」（Beckman Instruments,Inc., Palo Alto, C
A）を使用して配列を分析した。
（United States Biochemical Corporation, Clevelan
d, Ohio）を使用してＲＮＡを含まないプラスミドのＤ
ＮＡ配列決定を実施した。市販のソフトウェアー「Micr
ogenie」（Beckman Instruments,Inc., Palo Alto, C
A）を使用して配列を分析した。
【００６３】実施例７−ＧＡｌａｃ組換え体でのサザ
ン分析 BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内で部位特異的
に組換えが起こっているかを調べるために、組換えウィ
ルス由来のＤＮＡを第６図に示すようにサザンブロット
分析にかけた。パネルＡでは、ブロットをｐＭＤ１００
から得たBamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片でプロ
ーブした。パネルＢでは、使用したプローブはlacZ遺伝
子内にある2.5 kb PvuII断片であった。各サンプルにつ
いて、１０μｇのＤＮＡをBamHI またはBamHI とEcoRI
の組合せで消化した。レーン１、６、１３はBamHI で切
断したＣＥＦ ＤＮＡであり；レーン２、７、１４はBa
mHI で切断した親ＧＡ株に感染したＣＥＦ由来のＤＮＡ
であり；レーン３、８、１５はBamHI 及びEcoRI で切断
した親ＧＡ株に感染したＣＥＦ由来のＤＮＡであり；レ
ーン４、９、１１、１６はそれぞれBamHI で切断したＧ
Ａｌａｃ１、２、３または４に各々感染したＣＥＦ由来
のＤＮＡであり；レーン５、１０、１２、１７はそれぞ
れBamHI 及びEcoRI で切断したＧＡｌａｃ１、２、３ま
たは４に感染したＣＥＦ由来のＤＮＡである。全例で組
換えは標的部位で起こっていた。ｐＭＤ１００の4.3 kb
挿入物はＧＡｌａｃ１、ＧＡｌａｃ２及びＧＡｌａｃ３
の4.6及び3.8 kbのバンドとハイブリッド形成し、親4.3
kbバンドが１つのEcoRI 部位を含有するＤＮＡの4 kb
の付加により改変されたことを示した。lacZプローブは
これらの組換え体の4.6 kbのバンドとハイブリッド形成
し、4.6 kbのバンドがlacZ配列を含有していることを示
した。使用した2.5 kb PvuIIプローブは lacZ 遺伝子の
５’末端に相同であり、lacZ遺伝子内のEcoRI 部位を超
えていないので、3.8 kbのバンドはlacZプローブでは検
出されなかった。同じプローブのＧＡｌａｃ４とのハイ
ブリッド形成は同様に組換えが起こっていることを示し
ているが、lacZ遺伝子はウィルス中で反対の配向に位置
していた（第６図）。
ン分析 BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内で部位特異的
に組換えが起こっているかを調べるために、組換えウィ
ルス由来のＤＮＡを第６図に示すようにサザンブロット
分析にかけた。パネルＡでは、ブロットをｐＭＤ１００
から得たBamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片でプロ
ーブした。パネルＢでは、使用したプローブはlacZ遺伝
子内にある2.5 kb PvuII断片であった。各サンプルにつ
いて、１０μｇのＤＮＡをBamHI またはBamHI とEcoRI
の組合せで消化した。レーン１、６、１３はBamHI で切
断したＣＥＦ ＤＮＡであり；レーン２、７、１４はBa
mHI で切断した親ＧＡ株に感染したＣＥＦ由来のＤＮＡ
であり；レーン３、８、１５はBamHI 及びEcoRI で切断
した親ＧＡ株に感染したＣＥＦ由来のＤＮＡであり；レ
ーン４、９、１１、１６はそれぞれBamHI で切断したＧ
Ａｌａｃ１、２、３または４に各々感染したＣＥＦ由来
のＤＮＡであり；レーン５、１０、１２、１７はそれぞ
れBamHI 及びEcoRI で切断したＧＡｌａｃ１、２、３ま
たは４に感染したＣＥＦ由来のＤＮＡである。全例で組
換えは標的部位で起こっていた。ｐＭＤ１００の4.3 kb
挿入物はＧＡｌａｃ１、ＧＡｌａｃ２及びＧＡｌａｃ３
の4.6及び3.8 kbのバンドとハイブリッド形成し、親4.3
kbバンドが１つのEcoRI 部位を含有するＤＮＡの4 kb
の付加により改変されたことを示した。lacZプローブは
これらの組換え体の4.6 kbのバンドとハイブリッド形成
し、4.6 kbのバンドがlacZ配列を含有していることを示
した。使用した2.5 kb PvuIIプローブは lacZ 遺伝子の
５’末端に相同であり、lacZ遺伝子内のEcoRI 部位を超
えていないので、3.8 kbのバンドはlacZプローブでは検
出されなかった。同じプローブのＧＡｌａｃ４とのハイ
ブリッド形成は同様に組換えが起こっていることを示し
ているが、lacZ遺伝子はウィルス中で反対の配向に位置
していた（第６図）。
【００６４】ＭＤＶゲノム内へのlacZの組換えは２つの
方法で起こりうる。ｐＭＤ１００内のlacZ遺伝子の両側
端に関与する二重交差により、BamHI-A の4.3 kb EcoRI
-BamHIサブ断片がlacZ含有誘導体で置き換わる。lacZ遺
伝子の側端のいずれかでの単一交差では、ｐＵＣ１９配
列を含むｐＭＴ１ＡまたはｐＭＴ１Ｂ及び親配列を全て
含有する誘導体ウィルスが生じたであろう。
方法で起こりうる。ｐＭＤ１００内のlacZ遺伝子の両側
端に関与する二重交差により、BamHI-A の4.3 kb EcoRI
-BamHIサブ断片がlacZ含有誘導体で置き換わる。lacZ遺
伝子の側端のいずれかでの単一交差では、ｐＵＣ１９配
列を含むｐＭＴ１ＡまたはｐＭＴ１Ｂ及び親配列を全て
含有する誘導体ウィルスが生じたであろう。
【００６５】サザンブロット分析の結果は二重交差によ
り組換えが起こったことを示している。先ず、単一交差
によりｐＵＣ１９配列がＭＤＶに挿入されたのであれ
ば、ｐＭＤ１００の4.3 kb挿入物が、ＧＡｌａｃ１、２
及び３の場合には4.6 、4.3 及び3.8 kbの大きさの３つ
の断片と、ＧＡｌａｃ４の場合には6.9 、4.3 及び1.5
の３つの断片とハイブリッド形成すると予想される。ｐ
ＭＤ１００由来のプローブが4.3 kbのバンドを検出しな
かったことから、ｐＵＣ１９配列はＭＤＶ組換え体には
組換えられなかったことが明らかになった。第二に、ｐ
ＵＣ１９とＤＮＡ配列を共有するｐＢＲ３２２がどの組
換え体ともハイブリッド形成しなかったことはｐＵＣ１
９配列はウィルスに組換えられなかったことを示す。
り組換えが起こったことを示している。先ず、単一交差
によりｐＵＣ１９配列がＭＤＶに挿入されたのであれ
ば、ｐＭＤ１００の4.3 kb挿入物が、ＧＡｌａｃ１、２
及び３の場合には4.6 、4.3 及び3.8 kbの大きさの３つ
の断片と、ＧＡｌａｃ４の場合には6.9 、4.3 及び1.5
の３つの断片とハイブリッド形成すると予想される。ｐ
ＭＤ１００由来のプローブが4.3 kbのバンドを検出しな
かったことから、ｐＵＣ１９配列はＭＤＶ組換え体には
組換えられなかったことが明らかになった。第二に、ｐ
ＵＣ１９とＤＮＡ配列を共有するｐＢＲ３２２がどの組
換え体ともハイブリッド形成しなかったことはｐＵＣ１
９配列はウィルスに組換えられなかったことを示す。
【００６６】実施例８−挿入部位の配列 BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片のBglII 部位へ
のlacZの挿入から、この部位は細胞培養でのウィルスの
複製に必須ではないことが示された。関連 BglII部位付
近の両方向の配列決定を実施して第２図に示すように破
壊された可能性のある遺伝子を同定した。BglII 部位へ
の挿入は左方向の読み取り枠８１０塩基対長及び右方向
の読み取り枠４６２塩基対長を破壊したであろう。
のlacZの挿入から、この部位は細胞培養でのウィルスの
複製に必須ではないことが示された。関連 BglII部位付
近の両方向の配列決定を実施して第２図に示すように破
壊された可能性のある遺伝子を同定した。BglII 部位へ
の挿入は左方向の読み取り枠８１０塩基対長及び右方向
の読み取り枠４６２塩基対長を破壊したであろう。
【００６７】実施例９−親及び組換えＭＤＶ単離体上
での成長曲線 一次ＣＥＦを調製し、７５ｃｍ2 のフラスコにプレート
した。一次培養を採取し、必要に応じて第０、１、２、
４及び６日に二次培養として再プレートした。第０日
に、１２枚の６０ｍｍ皿の二次ＣＥＦに約３００ＰＦＵ
の親ＭＤＶ株を接種し、１２枚の皿には約３００ＰＦＵ
のＧＡｌａｃ１組換え体を接種した。接種６日後に、各
株について皿のうちの２枚にあるプラークを計測し、プ
レートされたＰＦＵの実数を測定した。第０、１、２、
４及び６日目に、接種皿の２枚から採取し、存在するウ
ィルスを新しく調製した二次ＣＥＦでタイターした。タ
イターした６日後に、プラークを計測し、元の接種皿上
に存在するＰＦＵの数を測定した。
での成長曲線 一次ＣＥＦを調製し、７５ｃｍ2 のフラスコにプレート
した。一次培養を採取し、必要に応じて第０、１、２、
４及び６日に二次培養として再プレートした。第０日
に、１２枚の６０ｍｍ皿の二次ＣＥＦに約３００ＰＦＵ
の親ＭＤＶ株を接種し、１２枚の皿には約３００ＰＦＵ
のＧＡｌａｃ１組換え体を接種した。接種６日後に、各
株について皿のうちの２枚にあるプラークを計測し、プ
レートされたＰＦＵの実数を測定した。第０、１、２、
４及び６日目に、接種皿の２枚から採取し、存在するウ
ィルスを新しく調製した二次ＣＥＦでタイターした。タ
イターした６日後に、プラークを計測し、元の接種皿上
に存在するＰＦＵの数を測定した。
【００６８】６日間の期間にわたり、第７図及び第８図
に示すように３７℃でも４１℃でも二次ＣＥＦ中の２つ
の株の増殖特性に差は検出されなかった。両方の株共３
７℃より４１℃で早く増殖したが、皿当りの得られたウ
ィルスの最終収量は両方の温度で等しかった。
に示すように３７℃でも４１℃でも二次ＣＥＦ中の２つ
の株の増殖特性に差は検出されなかった。両方の株共３
７℃より４１℃で早く増殖したが、皿当りの得られたウ
ィルスの最終収量は両方の温度で等しかった。
【００６９】実施例１０−親及び組換えＭＤＶ単離体
のin vivo 分析 日齢特定病原体を含まない単冠白色レグホンチキンの羽
を縛り、親ＭＤＶ株に感染した細胞、ＧＡｌａｃ１組換
え体に感染した細胞または非感染細胞を腹腔内に接種し
た。接種後（ＰＩ）１週間に各鳥から血漿サンプルを得
た。脾臓細胞を各群から単離し、計測し、同数の生存細
胞（５×１０7 及び５×１０6 ）を新たに調製したＣＥ
Ｆ上で共培養した。リンパ球を「Histopaque 1077 」
（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO ）を用いて遠心
して精製し、計測し、同数の生存細胞（１×１０7 及び
１×１０6 ）を新たに調製したＣＥＦ上で共培養した。
これらの測定（titration ）の結果を、脾臓細胞につい
ては第２表に、リンパ球については第３表に示す。
のin vivo 分析 日齢特定病原体を含まない単冠白色レグホンチキンの羽
を縛り、親ＭＤＶ株に感染した細胞、ＧＡｌａｃ１組換
え体に感染した細胞または非感染細胞を腹腔内に接種し
た。接種後（ＰＩ）１週間に各鳥から血漿サンプルを得
た。脾臓細胞を各群から単離し、計測し、同数の生存細
胞（５×１０7 及び５×１０6 ）を新たに調製したＣＥ
Ｆ上で共培養した。リンパ球を「Histopaque 1077 」
（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO ）を用いて遠心
して精製し、計測し、同数の生存細胞（１×１０7 及び
１×１０6 ）を新たに調製したＣＥＦ上で共培養した。
これらの測定（titration ）の結果を、脾臓細胞につい
ては第２表に、リンパ球については第３表に示す。
【００７０】 表２． 脾臓からのウィルスの再単離 株 用量 得られたプラーク 得られたプラークの平均 (PFU) （プレートした細胞数） （プレートした細胞数） 5×107 5×106 5×107 5×106 親 216 54， 60 12， 19 57 16 390 17， 18 2， 5 18 4 682 4， 3 1 ， 0 4 1 GAlac 526 30， 20 1， 6 25 4 914 32， 47 6， 2 40 4 1554 62， 68 4， 7 65 5 --- 0， 0 0 ， 0 0 0 表３． リンパ球からのウィルスの再単離 株 用量 得られたプラーク 得られたプラークの平均 (PFU) （プレートした細胞数） （プレートした細胞数） 1×107 1×106 1×107 1×１０ ６ 親 ２１６ 9， 9 1， 1 9 1 390 9， 4 0， 0 7 0 682 1， 4 1 ， 0 3 1 GAlac 526 19， 35 2， 7 27 5 914 79， 93 9， 16 86 13 1554 128，142 11， 18 135 15 --- 0， 0 0 ， 0 0 0 これらの結果は、BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断
片のBglII 部位に挿入したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含有する組換えＭＤＶは脾臓細胞から再単離でき、親
ＭＤＶ株と同様にニワトリでウィルス血症を起こしうる
ことを示している。測定皿のいくつかをβ−ガラクトシ
ダーゼ活性に関して基質としてBluogalを使用して染色
し、ニワトリで増殖した後のＧＡｌａｃ組換え体の安定
性を評価した。ＧＡｌａｃ測定物の染色した４７３のプ
ラークの内、全てがβ−ガラクトシダーゼ活性陽性であ
った。ＰＩ３及び６週に、再度血漿サンプルを得、リン
パ球を精製し、ＭＤＶの存在についてアッセイしで各株
についてのウィルス血症の持続期間を評価した。３週間
目の観察の時点でウィルス血症は顕著に減少したが、両
ウィルス共リンパ球内で少なくともＰＩ６週間持続し
た。間接免疫蛍光アッセイで、ＰＩ１週、３週及び６週
の各血漿サンプルの全てについてＭＤＶに対する抗体応
答をアッセイした。親ウィルスまたはＧＡｌａｃ組換え
体のいずれかを注射した群全てで抗ＭＤＶ抗体応答が観
察された。抗体応答は３週目のサンプル採取時に現れ、
６週目のサンプル採取時に強度が強まった。 これらの実
施例から、BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内に
あるBglII部位は感染及び複製に必要な本質的なＭＤＶ
の機能に顕著な作用を与えることなく外来配列を安定に
統合するために使用できると結論できる。さらに、ウィ
ルスの抗−ＭＤＶ免疫応答誘導能は挿入部位への外来配
列の統合により損なわれることはないと結論できる。
片のBglII 部位に挿入したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含有する組換えＭＤＶは脾臓細胞から再単離でき、親
ＭＤＶ株と同様にニワトリでウィルス血症を起こしうる
ことを示している。測定皿のいくつかをβ−ガラクトシ
ダーゼ活性に関して基質としてBluogalを使用して染色
し、ニワトリで増殖した後のＧＡｌａｃ組換え体の安定
性を評価した。ＧＡｌａｃ測定物の染色した４７３のプ
ラークの内、全てがβ−ガラクトシダーゼ活性陽性であ
った。ＰＩ３及び６週に、再度血漿サンプルを得、リン
パ球を精製し、ＭＤＶの存在についてアッセイしで各株
についてのウィルス血症の持続期間を評価した。３週間
目の観察の時点でウィルス血症は顕著に減少したが、両
ウィルス共リンパ球内で少なくともＰＩ６週間持続し
た。間接免疫蛍光アッセイで、ＰＩ１週、３週及び６週
の各血漿サンプルの全てについてＭＤＶに対する抗体応
答をアッセイした。親ウィルスまたはＧＡｌａｃ組換え
体のいずれかを注射した群全てで抗ＭＤＶ抗体応答が観
察された。抗体応答は３週目のサンプル採取時に現れ、
６週目のサンプル採取時に強度が強まった。 これらの実
施例から、BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断片内に
あるBglII部位は感染及び複製に必要な本質的なＭＤＶ
の機能に顕著な作用を与えることなく外来配列を安定に
統合するために使用できると結論できる。さらに、ウィ
ルスの抗−ＭＤＶ免疫応答誘導能は挿入部位への外来配
列の統合により損なわれることはないと結論できる。
【図１】 第１図。マレック病ウィルス血清型１のＤＮＡ
ゲノムの非反復短領域中のBamHI-A の末端4.3kb EcoRI-
BamHI サブ断片にある読み取り枠の制限地図。 使用した略号：ＯＲＦ−読み取り枠；Ｂ−ＢａｍＨＩ；
Ｅ−ＥｃｏＲＩ； ＴＲ−Ｉ−非反復長領域末端リピー
ト；ＩＲ−Ｉ−非反復長領域逆方向リピート；ＴＲ−Ｓ
−非反復短領域末端リピート；ＩＲ−Ｓ−非反復短領域
逆方向リピート。
ゲノムの非反復短領域中のBamHI-A の末端4.3kb EcoRI-
BamHI サブ断片にある読み取り枠の制限地図。 使用した略号：ＯＲＦ−読み取り枠；Ｂ−ＢａｍＨＩ；
Ｅ−ＥｃｏＲＩ； ＴＲ−Ｉ−非反復長領域末端リピー
ト；ＩＲ−Ｉ−非反復長領域逆方向リピート；ＴＲ−Ｓ
−非反復短領域末端リピート；ＩＲ−Ｓ−非反復短領域
逆方向リピート。
【図２】第２図。マレック病ウィルス血清型１挿入領域
のＤＮＡ配列。
のＤＮＡ配列。
【図３】第２図（続き）。
【図４】第２図（続き）。
【図５】第２図（続き）。
【図６】第３図。プラスミドベクター pUC19にクローニ
ングしたBamHI-A の末端4.3kbEcoRI-BamHI サブ断片を
含有するプラスミド pMD100 。BamHI-A の4.3kb EcoRI-
BamHI サブ断片は非反復 BglII部位を含有する。
ングしたBamHI-A の末端4.3kbEcoRI-BamHI サブ断片を
含有するプラスミド pMD100 。BamHI-A の4.3kb EcoRI-
BamHI サブ断片は非反復 BglII部位を含有する。
【図７】第４図。ＳＶ４０初期プロモータから発現し
た、β−ガラクトシダーゼをコードする、lacZ遺伝子を
含有するカセットのダイアグラム。
た、β−ガラクトシダーゼをコードする、lacZ遺伝子を
含有するカセットのダイアグラム。
【図８】第５図。BamHI-A の4.3 kb EcoRI-BamHIサブ断
片内にある BglII部位に挿入したＳＶ４０初期プロモー
タから発現されたlacZ遺伝子を含有するプラスミドｐＭ
Ｔ１Ａ及びｐＭＴ１Ｂ。
片内にある BglII部位に挿入したＳＶ４０初期プロモー
タから発現されたlacZ遺伝子を含有するプラスミドｐＭ
Ｔ１Ａ及びｐＭＴ１Ｂ。
【図９】第６図。組換えが部位特異的であることを示し
ている、ＧＡ親及びＧＡｌａｃ組換えＭＤＶ−１単離体
からのＤＮＡのサザンブロット分析。
ている、ＧＡ親及びＧＡｌａｃ組換えＭＤＶ−１単離体
からのＤＮＡのサザンブロット分析。
【図１０】第７図。親（ＧＡ親）及び組換えＭＤＶ−１
（GAlac1）単離体の３７℃での増殖曲線。
（GAlac1）単離体の３７℃での増殖曲線。
【図１１】第８図。親（ＧＡ親）及び組換えＭＤＶ−１
（GAlac1）単離体の４１℃での増殖曲線。
（GAlac1）単離体の４１℃での増殖曲線。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月２３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図。マレック病ウィルス血清型１のＤＮＡ
ゲノムの非反復短領域中のＢａｍＨＩ−Ａの末端４．３
ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサブ断片にある読み取り
枠の制限地図。使用した略号：ＯＲＦ−読み取り枠；Ｂ
−ＢａｍＨＩ；Ｅ−ＥｃｏＲＩ；ＴＲ−Ｉ−非反復長領
域末端リピート；ＩＲ−Ｉ−非反復長領域逆方向リピー
ト；ＴＲ−Ｓ−非反復短領域末端リピート；ＩＲ−Ｓ−
非反復短領域逆方向リピート。
ゲノムの非反復短領域中のＢａｍＨＩ−Ａの末端４．３
ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサブ断片にある読み取り
枠の制限地図。使用した略号：ＯＲＦ−読み取り枠；Ｂ
−ＢａｍＨＩ；Ｅ−ＥｃｏＲＩ；ＴＲ−Ｉ−非反復長領
域末端リピート；ＩＲ−Ｉ−非反復長領域逆方向リピー
ト；ＴＲ−Ｓ−非反復短領域末端リピート；ＩＲ−Ｓ−
非反復短領域逆方向リピート。
【図２Ａ】マレック病ウィルス血清型１挿入領域のＤＮ
Ａ配列。
Ａ配列。
【図２Ｂ】マレック病ウィルス血清型１挿入領域のＤＮ
Ａ配列。
Ａ配列。
【図２Ｃ】マレック病ウィルス血清型１挿入領域のＤＮ
Ａ配列。
Ａ配列。
【図２Ｄ】マレック病ウィルス血清型１挿入領域のＤＮ
Ａ配列。
Ａ配列。
【図３】プラスミドベクターｐＵＣ１９にクローニング
したＢａｍＨＩ−Ａの末端４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩサブ断片を含有するプラスミドｐＭＤ１００。
ＢａｍＨＩ−Ａの４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
サブ断片は非反復ＢｇｌＩＩ部位を含有する。
したＢａｍＨＩ−Ａの末端４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩサブ断片を含有するプラスミドｐＭＤ１００。
ＢａｍＨＩ−Ａの４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
サブ断片は非反復ＢｇｌＩＩ部位を含有する。
【図４】ＳＶ４０初期プロモータから発現した、β−ガ
ラクトシダーゼをコードする、ｌａｃＺ遺伝子を含有す
るカセットのダイアグラム。
ラクトシダーゼをコードする、ｌａｃＺ遺伝子を含有す
るカセットのダイアグラム。
【図５】ＢａｍＨＩ−Ａの４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩサブ断片内にあるＢｇｌＩＩ部位に挿入したＳ
Ｖ４０初期プロモータから発現されたｌａｃＺ遺伝子を
含有するプラスミドｐＭＴ１Ａ及びｐＭＴ１Ｂ。
ａｍＨＩサブ断片内にあるＢｇｌＩＩ部位に挿入したＳ
Ｖ４０初期プロモータから発現されたｌａｃＺ遺伝子を
含有するプラスミドｐＭＴ１Ａ及びｐＭＴ１Ｂ。
【図６】組換えが部位特異的であることを示している、
ＧＡ親及びＧＡｌａｃ組換えＭＤＶ−１単離体からのＤ
ＮＡのサザンブロット分析による電気泳動の写真。
ＧＡ親及びＧＡｌａｃ組換えＭＤＶ−１単離体からのＤ
ＮＡのサザンブロット分析による電気泳動の写真。
【図７】親（ＧＡ親）及び組換えＭＤＶ−１（ＧＡｌａ
ｃ１）単離体の３７℃での増殖曲線。
ｃ１）単離体の３７℃での増殖曲線。
【図８】親（ＧＡ親）及び組換えＭＤＶ−１（ＧＡｌａ
ｃ１）単離体の４１℃での増殖曲線。
ｃ１）単離体の４１℃での増殖曲線。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 7/01 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (17)
- 【請求項１】 本質的に第１図に示す制限酵素部位地図
を有する、マレック病ウィルス血清型１（「ＭＤＶ−
１」）ＤＮＡゲノムの非反復短領域のBamHI-Aの末端4.3
kb EcoRI-BamHIサブ断片内の読み取り枠を含むマレッ
ク病ウィルス血清型１（「ＭＤＶ−１」）ＤＮＡゲノム
の挿入領域。 - 【請求項２】 第２図に示すヌクレオチド位置２３８−
１０５０のＤＮＡ配列を含む請求項１に記載の挿入領
域。 - 【請求項３】 前記領域がBglII 制限酵素認識配列を含
有する挿入部位を含む請求項２に記載の挿入領域。 - 【請求項４】 請求項１に記載の挿入領域を含むプラス
ミド。 - 【請求項５】 プラスミドがｐＭＤ１００である請求項
４に記載のプラスミド。 - 【請求項６】 家禽疾患原因体由来の外来遺伝子が前記
挿入領域に挿入されている請求項４に記載のプラスミ
ド。 - 【請求項７】 本質的にマレック病ウィルス、感染性気
管支炎ウィルス、ニューキャッスル病ウィルス、感染性
ファブリキウス嚢病ウィルス、ニワトリ貧血病原体、レ
オウィルス、トリレトロウィルス、家禽アデノウィル
ス、七面鳥鼻気管炎ウィルス、感染性咽頭気管炎ウィル
ス、エイメリア、サルモネラ、大腸菌及びマイコプラズ
マガリセプチクムからなる群から前記外来遺伝子を選択
し、前記外来遺伝子が前記配列を発現させることのでき
るプロモータの制御下にある請求項６に記載のプラスミ
ド。 - 【請求項８】 前記外来遺伝子が前記配列を発現させる
ことのできるプロモータの制御下にある請求項６に記載
のプラスミド。 - 【請求項９】 前記プロモータがＳＶ４０初期プロモー
タである請求項８に記載のプラスミド。 - 【請求項１０】 請求項４に記載のプラスミドを含む宿
主細胞。 - 【請求項１１】 ＭＤＶ−１のゲノムＤＮＡ及び少なく
とも１つの家禽疾患原因体由来外来遺伝子を含み、前記
外来遺伝子が請求項１に記載の挿入領域のゲノムＤＮＡ
に挿入されている組換えＭＤＶ−１。 - 【請求項１２】 挿入領域のためのプロモータを含み、
前記プロモータが宿主細胞中で前記外来遺伝子発現機能
を有している請求項１１に記載の組換えＭＤＶ−１。 - 【請求項１３】 前記外来遺伝子がBamHI-A の4.3 kb E
coRI-BamHIサブ断片のBglII 制限部位に導入されている
請求項１１に記載の組換えＭＤＶ−１。 - 【請求項１４】 前記外来遺伝子がコードする少なくと
も１種のポリペプチド及び前記ＭＤＶ−１の前記ゲノム
ＤＮＡがコードする少なくとも１種のポリペプチドが発
現される請求項１２に記載の組換えＭＤＶ−１。 - 【請求項１５】 請求項１２に記載の組換えＭＤＶ−１
ベクターが発現するポリペプチドを含むワクチン。 - 【請求項１６】 請求項１２に記載の組換えＭＤＶ−１
を含むワクチン。 - 【請求項１７】 前記ＭＤＶ−１が発現する少なくとも
１種のポリペプチドを含む請求項１６に記載のワクチ
ン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55973590A | 1990-07-30 | 1990-07-30 | |
| US559735 | 1990-07-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06233682A true JPH06233682A (ja) | 1994-08-23 |
| JP3159476B2 JP3159476B2 (ja) | 2001-04-23 |
Family
ID=24234797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19033291A Expired - Lifetime JP3159476B2 (ja) | 1990-07-30 | 1991-07-30 | 組換えマレック病ウィルス |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0473210B1 (ja) |
| JP (1) | JP3159476B2 (ja) |
| KR (1) | KR0153005B1 (ja) |
| CN (1) | CN1056879C (ja) |
| AU (1) | AU645333B2 (ja) |
| CA (1) | CA2047290C (ja) |
| DE (1) | DE69101683T2 (ja) |
| ES (1) | ES2056565T3 (ja) |
| HU (1) | HU219377B (ja) |
| NZ (1) | NZ239146A (ja) |
| ZA (1) | ZA915563B (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5928648A (en) * | 1985-09-06 | 1999-07-27 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| US5965138A (en) * | 1985-09-06 | 1999-10-12 | Syntro Corporation | Recombinant chimeric virus and uses thereof |
| US6087127A (en) * | 1990-08-24 | 2000-07-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Marek's disease herpesvirus DNA segment encoding glycoproteins, gD, gI and gE |
| FR2666589B1 (fr) * | 1990-09-07 | 1994-08-05 | Rhone Merieux | Nouveaux virus herpes recombinants, vaccin a base de ces recombinants, leur procede de preparation, genes, vecteurs et plasmides utilises dans ce procede. |
| US6913751B2 (en) | 1992-06-12 | 2005-07-05 | Schering-Plough Veterinary Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| US5853733A (en) * | 1993-02-26 | 1998-12-29 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| US6875856B2 (en) | 1993-09-24 | 2005-04-05 | Syntro Corporation | Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof |
| EP0750670A1 (en) * | 1994-02-07 | 1997-01-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Compositions useful in controlling marek's disease |
| FR2728795B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire |
| EP0822980A4 (en) * | 1995-03-23 | 2000-04-26 | Syntro Corp | RECOMBINANT INFECTIOUS LARYNGOTRACHEITIS VIRUS AND USES THEREOF |
| CN1194001A (zh) * | 1995-06-07 | 1998-09-23 | 埃斯库拉普公司 | 鸡贫血症病毒的中和构象表位 |
| FR2767335B1 (fr) * | 1997-08-14 | 2001-09-28 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Adenovirus aviaire celo recombinant comme vecteur vaccinant |
| PT1219711E (pt) | 2000-12-20 | 2006-10-31 | Intervet Int Bv | Vacina de lawsonia intracellularis |
| US7314715B2 (en) | 2001-06-14 | 2008-01-01 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| CA2494197C (en) | 2002-08-12 | 2012-10-09 | Akzo Nobel N.V. | Streptococcus uberis protein, nucleic acid sequence encoding the same and its use in a mastitis vaccine |
| CN100334217C (zh) * | 2005-08-15 | 2007-08-29 | 北京市农林科学院 | 重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用 |
| EP2412382A1 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-01 | University Court of the University of Edinburgh | Recombinant Trypanosoma theileri parasite |
| US9139824B2 (en) | 2011-04-21 | 2015-09-22 | The University Court Of The University Of Aberdeen | Sapolegina protein in for use as a medicament |
| ES2717441T3 (es) | 2012-10-09 | 2019-06-21 | Univ Gent | Vacuna contra Cooperia |
| EP2845904A1 (en) * | 2013-09-06 | 2015-03-11 | Ceva Sante Animale | Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof |
| EP3050572A1 (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-03 | Ceva Sante Animale | Recombinant MDV1 and the uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2779447B2 (ja) * | 1988-03-20 | 1998-07-23 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体 |
| DE69016956T2 (de) * | 1989-12-04 | 1995-07-20 | Akzo Nobel Nv | Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus und davon abgeleiteter Lebendimpfstoffvektor. |
| US6087127A (en) * | 1990-08-24 | 2000-07-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Marek's disease herpesvirus DNA segment encoding glycoproteins, gD, gI and gE |
-
1991
- 1991-07-10 ES ES91201796T patent/ES2056565T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 DE DE69101683T patent/DE69101683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 EP EP91201796A patent/EP0473210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-16 ZA ZA915563A patent/ZA915563B/xx unknown
- 1991-07-17 CA CA002047290A patent/CA2047290C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-26 NZ NZ239146A patent/NZ239146A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 CN CN91105196A patent/CN1056879C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-29 HU HU526/91A patent/HU219377B/hu unknown
- 1991-07-29 AU AU81437/91A patent/AU645333B2/en not_active Expired
- 1991-07-29 KR KR1019910012990A patent/KR0153005B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-30 JP JP19033291A patent/JP3159476B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69101683D1 (de) | 1994-05-19 |
| CA2047290C (en) | 2002-12-10 |
| DE69101683T2 (de) | 1994-07-21 |
| EP0473210A2 (en) | 1992-03-04 |
| CN1056879C (zh) | 2000-09-27 |
| HUT58371A (en) | 1992-02-28 |
| KR920002782A (ko) | 1992-02-28 |
| CA2047290A1 (en) | 1992-01-31 |
| ZA915563B (en) | 1992-07-29 |
| HU219377B (en) | 2001-03-28 |
| AU645333B2 (en) | 1994-01-13 |
| KR0153005B1 (ko) | 1998-10-15 |
| NZ239146A (en) | 1992-12-23 |
| CN1060680A (zh) | 1992-04-29 |
| HU912526D0 (en) | 1992-01-28 |
| ES2056565T3 (es) | 1994-10-01 |
| EP0473210A3 (en) | 1992-06-10 |
| JP3159476B2 (ja) | 2001-04-23 |
| EP0473210B1 (en) | 1994-04-13 |
| AU8143791A (en) | 1992-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2031164C (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| JP3159476B2 (ja) | 組換えマレック病ウィルス | |
| US5905040A (en) | Parvovirus empty capsids | |
| CN102405058B (zh) | 用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗 | |
| JPH10506782A (ja) | 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用 | |
| US5733554A (en) | Avian herpesvirus-based live recombinant avian vaccine, in particular against Gumboro disease | |
| JPH08500969A (ja) | 七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用 | |
| US6866852B2 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof | |
| US6913751B2 (en) | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production | |
| US20100008948A1 (en) | Recombinant herpesvirus useful in vaccine production | |
| US5231023A (en) | Recombinant Marek's disease virus | |
| JP3375347B2 (ja) | マレック病に対する組換えワクチン | |
| JP3284118B2 (ja) | 連続的鳥類細胞株を用いるマレック病ウイルスの製造方法 | |
| US5279965A (en) | Recombinant infectious laryngotracheitis virus | |
| JPH10501964A (ja) | 試験管内でｇＤ遺伝子を発現するように形質転換されたヘルペスウィルス | |
| JPH09505726A (ja) | 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用 | |
| JP3926887B2 (ja) | 多分子発現カセット及びその利用 | |
| JPH06141853A (ja) | 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法 | |
| JP3924328B2 (ja) | 新規ｄｎａベクター、及び組み換え新規ｄｎａベクターを有効成分とするワクチン | |
| JP2002356441A (ja) | 組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090216 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100216 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100216 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110216 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120216 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120216 Year of fee payment: 11 |