JP2002356441A - 組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスワクチン - Google Patents
組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ニワトリにおいて伝染性喉頭気管炎ウイルス
（ＩＬＴＶ）に対する防御を誘導するためのワクチンの
提供。 【解決手段】該新規ワクチン株は、弱毒化ＩＬＴＶ突然
変異体と薬学上許容される担体または希釈剤とを含んで
なり、感染宿主細胞内で天然ＵＬ０タンパク質を発現し
得ないことを特徴とする。該新規ＩＬＴＶワクチンウイ
ルスは、他のトリ病原体の遺伝子のベクターとしても使
用することができる。
（ＩＬＴＶ）に対する防御を誘導するためのワクチンの
提供。 【解決手段】該新規ワクチン株は、弱毒化ＩＬＴＶ突然
変異体と薬学上許容される担体または希釈剤とを含んで
なり、感染宿主細胞内で天然ＵＬ０タンパク質を発現し
得ないことを特徴とする。該新規ＩＬＴＶワクチンウイ
ルスは、他のトリ病原体の遺伝子のベクターとしても使
用することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、弱毒化伝染性喉頭
気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）突然変異体と薬学上許容さ
れる担体または希釈剤とを含んでなる、トリ病原体によ
り引き起こされる疾患に対して家禽を防御するためのワ
クチン、弱毒化ＩＬＴＶ突然変異体に感染した細胞培
養、およびそのようなワクチンの製造方法に関する。
気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）突然変異体と薬学上許容さ
れる担体または希釈剤とを含んでなる、トリ病原体によ
り引き起こされる疾患に対して家禽を防御するためのワ
クチン、弱毒化ＩＬＴＶ突然変異体に感染した細胞培
養、およびそのようなワクチンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）は、主にニ
ワトリに感染する呼吸器疾患であるが、キジおよびクジ
ャクに感染することもある。感染後２〜８日の該疾患の
急性期においては、あえぎ及び血液滲出物の喀出を伴う
呼吸困難の徴候が観察される。また、気管の粘膜が膨張
し、出血が見られる。該疾患の家畜流行性形態は急速に
広がり、感染したトリの群の１００％までを冒しうる。
死亡率は、その群の１０〜８０％となりうる。該疾患の
より軽度な形態は、涙眼、結膜炎、持続的鼻漏および産
卵減少により特定される。また、体重減少、産卵減少、
および二次感染に対する感受性の上昇は、経済的損失の
主要原因となる。
ワトリに感染する呼吸器疾患であるが、キジおよびクジ
ャクに感染することもある。感染後２〜８日の該疾患の
急性期においては、あえぎ及び血液滲出物の喀出を伴う
呼吸困難の徴候が観察される。また、気管の粘膜が膨張
し、出血が見られる。該疾患の家畜流行性形態は急速に
広がり、感染したトリの群の１００％までを冒しうる。
死亡率は、その群の１０〜８０％となりうる。該疾患の
より軽度な形態は、涙眼、結膜炎、持続的鼻漏および産
卵減少により特定される。また、体重減少、産卵減少、
および二次感染に対する感受性の上昇は、経済的損失の
主要原因となる。
【０００３】該疾患の急性徴候が存在しない場合には、
検査による確認を行う必要がある。ウイルスは気管また
は肺組織から分離することが可能であり、気管または結
膜組織内の核内封入体の証明は伝染性喉頭気管炎ウイル
スについての診断となる。また、蛍光抗体の使用によ
り、迅速な同定を行うことが可能である。
検査による確認を行う必要がある。ウイルスは気管また
は肺組織から分離することが可能であり、気管または結
膜組織内の核内封入体の証明は伝染性喉頭気管炎ウイル
スについての診断となる。また、蛍光抗体の使用によ
り、迅速な同定を行うことが可能である。
【０００４】ＩＬＴの病原体は、アルファヘルペスウイ
ルスである伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）であ
る。処置調整（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｄｊｕｓｔｍ
ｅｎｔ）のほかに、すべての年齢およびタイプ（親の群
れ、産卵鶏または種禽）のニワトリに対する予防および
防除の方法としてワクチン接種が用いられる。現在のワ
クチン接種方法は、主に点眼（眼−鼻経路）により適用
される生弱毒化ワクチンに基づく。しかし、現在入手可
能な市販の改変生ワクチンはいくつかの欠点を有する。
それらは残存毒性により大量ワクチン接種経路で完全に
安全に適用されるわけではない。例えば、エアロゾール
ワクチン接種は著しいワクチン接種反応を引き起こし
（該動物の１０％までにおいて）、二次感染を引き起こ
す。さらに、現在使用されている生ワクチンは細胞培養
内での連続継代により弱毒化されているため、無制御の
突然変異が該ウイルスゲノム内に導入されて、それらの
毒性および免疫特性において不均一なウイルス粒子の集
団を供与する。また、そのような伝統的な弱毒化生ウイ
ルスワクチンは復帰突然変異により毒性を獲得して、該
接種動物の疾患および他の動物へ該病原体の伝播を引き
起こしうることが報告されている。さらに、既存のＩＬ
ＴＶワクチン株でのワクチン接種は、これらの動物の血
清学的転換を引き起こし、その結果、それらはもはや、
よりビルレントな野外ＩＬＴＶ株に感染した（潜伏性）
キャリアーから区別できなくなる。
ルスである伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）であ
る。処置調整（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｄｊｕｓｔｍ
ｅｎｔ）のほかに、すべての年齢およびタイプ（親の群
れ、産卵鶏または種禽）のニワトリに対する予防および
防除の方法としてワクチン接種が用いられる。現在のワ
クチン接種方法は、主に点眼（眼−鼻経路）により適用
される生弱毒化ワクチンに基づく。しかし、現在入手可
能な市販の改変生ワクチンはいくつかの欠点を有する。
それらは残存毒性により大量ワクチン接種経路で完全に
安全に適用されるわけではない。例えば、エアロゾール
ワクチン接種は著しいワクチン接種反応を引き起こし
（該動物の１０％までにおいて）、二次感染を引き起こ
す。さらに、現在使用されている生ワクチンは細胞培養
内での連続継代により弱毒化されているため、無制御の
突然変異が該ウイルスゲノム内に導入されて、それらの
毒性および免疫特性において不均一なウイルス粒子の集
団を供与する。また、そのような伝統的な弱毒化生ウイ
ルスワクチンは復帰突然変異により毒性を獲得して、該
接種動物の疾患および他の動物へ該病原体の伝播を引き
起こしうることが報告されている。さらに、既存のＩＬ
ＴＶワクチン株でのワクチン接種は、これらの動物の血
清学的転換を引き起こし、その結果、それらはもはや、
よりビルレントな野外ＩＬＴＶ株に感染した（潜伏性）
キャリアーから区別できなくなる。
【０００５】ＩＬＴＶは、ヘルペスウイルス科のアルフ
ァヘルペスウイルス亜科の一つに分類される。ＩＬＴＶ
は、長い（ＵＬ）および短い（ＵＳ）特異（ｕｎｉｑｕ
ｅ）領域よりなるヘルペスウイルスＤ型ゲノムを有し、
その短い特異領域は逆方向反復配列（ＩＲ、ＴＲ；図
１）に隣接する。ここ数年の間に、約１５０ｋｂの直鎖
状二本鎖ＤＮＡ分子を含有するほぼ完全なＩＬＴＶゲノ
ムのＤＮＡ配列が決定された。Ｗｉｌｄら（Ｖｉｒｕｓ
Ｇｅｎｅｓ １２，１０７−１１６，１９９６）は、
該ヌクレオチド配列、ゲノム地図および該ＩＬＴＶゲノ
ムのＵＳ領域の遺伝子の構成（ｇＤ、ｇＥ、ｇＩおよび
ｇｐ６０のような糖タンパク質をコードするいくつかの
遺伝子のものを含む）を開示している。ついで、該ＵＬ
領域に関する同様の情報も種々の研究グループにより公
開された（ＦｕｃｈｓおよびＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅ
ｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，２２２１−２２２
９，１９９６および８０，２１７３−２１８２，１９９
９；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４
２，１９０３−１９１０，１９９７）。
ァヘルペスウイルス亜科の一つに分類される。ＩＬＴＶ
は、長い（ＵＬ）および短い（ＵＳ）特異（ｕｎｉｑｕ
ｅ）領域よりなるヘルペスウイルスＤ型ゲノムを有し、
その短い特異領域は逆方向反復配列（ＩＲ、ＴＲ；図
１）に隣接する。ここ数年の間に、約１５０ｋｂの直鎖
状二本鎖ＤＮＡ分子を含有するほぼ完全なＩＬＴＶゲノ
ムのＤＮＡ配列が決定された。Ｗｉｌｄら（Ｖｉｒｕｓ
Ｇｅｎｅｓ １２，１０７−１１６，１９９６）は、
該ヌクレオチド配列、ゲノム地図および該ＩＬＴＶゲノ
ムのＵＳ領域の遺伝子の構成（ｇＤ、ｇＥ、ｇＩおよび
ｇｐ６０のような糖タンパク質をコードするいくつかの
遺伝子のものを含む）を開示している。ついで、該ＵＬ
領域に関する同様の情報も種々の研究グループにより公
開された（ＦｕｃｈｓおよびＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅ
ｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，２２２１−２２２
９，１９９６および８０，２１７３−２１８２，１９９
９；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４
２，１９０３−１９１０，１９９７）。
【０００６】同定されているＩＬＴＶ遺伝子の多くは保
存されており、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）と比較
した場合同一直線上のアラインメントで見出されること
が示された。同定されているＩＬＴＶ遺伝子はＨＳＶホ
モログ、例えばＵＬ１（ｇＬ）〜ＵＬ５、ＵＬ６〜ＵＬ
２０およびＵＬ２９〜ＵＬ４２を含む。しかし、ＩＬＴ
Ｖゲノムおよび他のヘルペスウイルスゲノムのいくつか
の部分間には類似点が多数あるにもかかわらず、該ゲノ
ムの他の部分における遺伝子含量および遺伝子配置はか
なり異なる。これらの観察、および保存されたタンパク
質コード領域の系統発生分析によれば、ＩＬＴＶは、そ
の他のヘルペスウイルスと遠縁であるに過ぎないことを
示している（Ｚｉｅｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
７２，６８６７−６８７４，１９９８）。さらに、他
のアルファヘルペスウイルスとは対照的に、ＩＬＴＶ
は、生体内および生体外の両方で、ほとんどニワトリ細
胞のみに限局した非常に狭い宿主域を示す（Ｂａｇｕｓ
ｔら，Ｉｎ：Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒ
ｙ，第１０版，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｅｓ，ＵＳ，５２７−５３
９，１９９７）。該ＩＬＴＶ特異的ゲノム特性のほとん
どは、ニワトリの上部気管の非常に特殊化した好適部位
（ｎｉｃｈｅ）における生存を可能にするこのウイルス
の分子進化の過程で生じたと予想される。最近同定され
た２つのＩＬＴＶ特異的遺伝子であるＵＬ０およびＵＬ
［−１］は、ＩＬＴＶのこれらの特性において何らかの
役割を果たしている可能性がある。ＵＬ０またはＵＬ
［−１］相同遺伝子は他のヘルペスウイルスにおいては
見出されていない。これらの隣接遺伝子は、発現速度
論、ｍＲＮＡ構造、および該タンパク質の細胞下（ｓｕ
ｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在に関して密接に関連してお
り、有意なアミノ酸配列相同性を示しており、このこと
は祖先遺伝子の１つが重複していることを示唆している
（Ｚｉｅｍａｎｎら，１９９８，前掲）。
存されており、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）と比較
した場合同一直線上のアラインメントで見出されること
が示された。同定されているＩＬＴＶ遺伝子はＨＳＶホ
モログ、例えばＵＬ１（ｇＬ）〜ＵＬ５、ＵＬ６〜ＵＬ
２０およびＵＬ２９〜ＵＬ４２を含む。しかし、ＩＬＴ
Ｖゲノムおよび他のヘルペスウイルスゲノムのいくつか
の部分間には類似点が多数あるにもかかわらず、該ゲノ
ムの他の部分における遺伝子含量および遺伝子配置はか
なり異なる。これらの観察、および保存されたタンパク
質コード領域の系統発生分析によれば、ＩＬＴＶは、そ
の他のヘルペスウイルスと遠縁であるに過ぎないことを
示している（Ｚｉｅｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
７２，６８６７−６８７４，１９９８）。さらに、他
のアルファヘルペスウイルスとは対照的に、ＩＬＴＶ
は、生体内および生体外の両方で、ほとんどニワトリ細
胞のみに限局した非常に狭い宿主域を示す（Ｂａｇｕｓ
ｔら，Ｉｎ：Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒ
ｙ，第１０版，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｅｓ，ＵＳ，５２７−５３
９，１９９７）。該ＩＬＴＶ特異的ゲノム特性のほとん
どは、ニワトリの上部気管の非常に特殊化した好適部位
（ｎｉｃｈｅ）における生存を可能にするこのウイルス
の分子進化の過程で生じたと予想される。最近同定され
た２つのＩＬＴＶ特異的遺伝子であるＵＬ０およびＵＬ
［−１］は、ＩＬＴＶのこれらの特性において何らかの
役割を果たしている可能性がある。ＵＬ０またはＵＬ
［−１］相同遺伝子は他のヘルペスウイルスにおいては
見出されていない。これらの隣接遺伝子は、発現速度
論、ｍＲＮＡ構造、および該タンパク質の細胞下（ｓｕ
ｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在に関して密接に関連してお
り、有意なアミノ酸配列相同性を示しており、このこと
は祖先遺伝子の１つが重複していることを示唆している
（Ｚｉｅｍａｎｎら，１９９８，前掲）。
【０００７】遺伝子操作された弱毒化ＩＬＴＶ突然変異
体ワクチンの開発の前提条件としては該ウイルスの毒性
に関与するタンパク質をコードしておりウイルスの感染
または複製に必須でないＩＬＴＶゲノム内の領域を同定
することである。さらに、このタンパク質の発現を排除
することが該ウイルス突然変異体の複製を損なわず、そ
れがワクチン接種動物における防御免疫応答を誘導し得
ないことが不可欠である。
体ワクチンの開発の前提条件としては該ウイルスの毒性
に関与するタンパク質をコードしておりウイルスの感染
または複製に必須でないＩＬＴＶゲノム内の領域を同定
することである。さらに、このタンパク質の発現を排除
することが該ウイルス突然変異体の複製を損なわず、そ
れがワクチン接種動物における防御免疫応答を誘導し得
ないことが不可欠である。
【０００８】いくつかの非必須ＩＬＴＶ遺伝子が先行技
術において開示されている。ＵＬ５０遺伝子の欠失は、
細胞培養内のＩＬＴＶの複製に有意な影響を及ぼさない
が、得られるＩＬＴＶ欠失突然変異体は、野生型ＩＬＴ
Ｖと同じ病原性を示す（Ｆｕｃｈｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．８１，６２７−６３８，２０００およびＩｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｗ
ｏｒｋｓｈｏｐ，Ｂｏｓｔｏｎ １９９９，１３．０３
３）。２つのエンベロープタンパク質をコードするＵＬ
１０またはＵＬ４９．５の欠失を有するＩＬＴＶ突然変
異体は、細胞培養内で生存可能であるが、これらの突然
変異体の有意な増殖欠損（＞９０％のウイルス力価の減
少）は該タンパク質の重要な機能を示している（Ｆｕｃ
ｈｓら，Ａｂｓｔｒ．２．４５，２５ｔｈ Ｉｎｔ．Ｈ
ｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｐｏｒｔｌ
ａｎｄ，ＵＳＡ，２０００）。糖タンパク質ｇＧ遺伝
子、ＯＲＦ ＡまたはＯＲＦ Ｄ内に欠失を有するＩＬ
ＴＶ突然変異体において、同様の増殖欠損が観察されて
いる（Ａｎｎｕａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｅｔｉｎ
ｇ，Ｖｉｅｎｎａ，２０００年４月，Ａｂｓｔｒ．６Ｐ
５０）。また、ＫｅｅｌｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ
ｅｒ（ＵＳ Ｐｏｕｌｔｒｙ ＆ Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｉｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｊｅｃｔ ＃
２５３，１９９９年１１月）は、非必須ＵＳ２またはｇ
Ｘ遺伝子にコードされるタンパク質を発現しないＩＬＴ
Ｖ突然変異体を分離することができなかった。さらに、
本発明者らは、ＵＬ［−１］遺伝子内に欠失を有するＩ
ＬＴＶ突然変異体を作製することができなかった。この
ことは、このＩＬＴＶ特異的遺伝子がＩＬＴＶの感染ま
たは複製に不可欠であることを示している。また、もう
１つのＩＬＴＶ特異的オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ Ａ）が該ウイルスに必須であることが判明し
た（Ｖｉｅｎｎａ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２０００年４月，
Ａｂｓｔｒ．６Ｐ５０，前掲）。
術において開示されている。ＵＬ５０遺伝子の欠失は、
細胞培養内のＩＬＴＶの複製に有意な影響を及ぼさない
が、得られるＩＬＴＶ欠失突然変異体は、野生型ＩＬＴ
Ｖと同じ病原性を示す（Ｆｕｃｈｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．８１，６２７−６３８，２０００およびＩｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｗ
ｏｒｋｓｈｏｐ，Ｂｏｓｔｏｎ １９９９，１３．０３
３）。２つのエンベロープタンパク質をコードするＵＬ
１０またはＵＬ４９．５の欠失を有するＩＬＴＶ突然変
異体は、細胞培養内で生存可能であるが、これらの突然
変異体の有意な増殖欠損（＞９０％のウイルス力価の減
少）は該タンパク質の重要な機能を示している（Ｆｕｃ
ｈｓら，Ａｂｓｔｒ．２．４５，２５ｔｈ Ｉｎｔ．Ｈ
ｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｐｏｒｔｌ
ａｎｄ，ＵＳＡ，２０００）。糖タンパク質ｇＧ遺伝
子、ＯＲＦ ＡまたはＯＲＦ Ｄ内に欠失を有するＩＬ
ＴＶ突然変異体において、同様の増殖欠損が観察されて
いる（Ａｎｎｕａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｅｔｉｎ
ｇ，Ｖｉｅｎｎａ，２０００年４月，Ａｂｓｔｒ．６Ｐ
５０）。また、ＫｅｅｌｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ
ｅｒ（ＵＳ Ｐｏｕｌｔｒｙ ＆ Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｉｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｊｅｃｔ ＃
２５３，１９９９年１１月）は、非必須ＵＳ２またはｇ
Ｘ遺伝子にコードされるタンパク質を発現しないＩＬＴ
Ｖ突然変異体を分離することができなかった。さらに、
本発明者らは、ＵＬ［−１］遺伝子内に欠失を有するＩ
ＬＴＶ突然変異体を作製することができなかった。この
ことは、このＩＬＴＶ特異的遺伝子がＩＬＴＶの感染ま
たは複製に不可欠であることを示している。また、もう
１つのＩＬＴＶ特異的オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ Ａ）が該ウイルスに必須であることが判明し
た（Ｖｉｅｎｎａ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２０００年４月，
Ａｂｓｔｒ．６Ｐ５０，前掲）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、弱毒化されたＩＬＴＶワクチン株を含むワクチンを
提供することにあり、該ＩＬＴＶワクチン株は、該弱毒
化ワクチン株の毒性への復帰突然変異を妨げる遺伝子工
学技術による制御された状態で弱毒化されており、該ワ
クチン株に感染した宿主動物において防御免疫応答を誘
導しうる。
は、弱毒化されたＩＬＴＶワクチン株を含むワクチンを
提供することにあり、該ＩＬＴＶワクチン株は、該弱毒
化ワクチン株の毒性への復帰突然変異を妨げる遺伝子工
学技術による制御された状態で弱毒化されており、該ワ
クチン株に感染した宿主動物において防御免疫応答を誘
導しうる。
【００１０】本発明のもう１つの目的は、ＩＬＴに対す
る防御を誘導しうるだけではなく、他のトリ病原体によ
り引き起こされる感染に対する防御をも誘導しうるワク
チンを提供することにある。
る防御を誘導しうるだけではなく、他のトリ病原体によ
り引き起こされる感染に対する防御をも誘導しうるワク
チンを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】これらの目的は、弱毒化
伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）突然変異体と薬
学上許容される担体または希釈剤とを含んでなる、トリ
病原体により引き起こされる疾患に対して家禽を防御す
るためのワクチンであって、該ＩＬＴＶ突然変異体が、
天然ＵＬ０タンパク質を、該ＵＬ０遺伝子内の突然変異
の結果として、感染宿主細胞内で発現し得ないことを特
徴とするワクチンを提供することにより、本発明者らに
より達成された。
伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）突然変異体と薬
学上許容される担体または希釈剤とを含んでなる、トリ
病原体により引き起こされる疾患に対して家禽を防御す
るためのワクチンであって、該ＩＬＴＶ突然変異体が、
天然ＵＬ０タンパク質を、該ＵＬ０遺伝子内の突然変異
の結果として、感染宿主細胞内で発現し得ないことを特
徴とするワクチンを提供することにより、本発明者らに
より達成された。
【００１２】本発明者らは、ＵＬ［−１］遺伝子とは対
照的にＩＬＴＶ特異的ＵＬ０遺伝子が細胞内でのＩＬＴ
Ｖの感染または複製に非必須であるということだけでは
なく、さらに、ＵＬ０遺伝子の制御された遺伝子操作に
よる該天然ＵＬ０タンパク質の発現の不活性化が、野生
型親ＩＬＴＶと比較して弱毒化されたＩＬＴＶ突然変異
体を与えることをも見出した。さらに、この弱毒化ＩＬ
ＴＶ突然変異体がまた、ビルレントＩＬＴＶでの攻撃の
際にワクチン接種動物における死亡率および臨床的徴候
を減少させる感染防御免疫応答を誘導しうることを見出
した。また、本発明のワクチンは、噴霧大量ワクチン接
種により安全にニワトリに投与されうるという更なる利
点を示す。
照的にＩＬＴＶ特異的ＵＬ０遺伝子が細胞内でのＩＬＴ
Ｖの感染または複製に非必須であるということだけでは
なく、さらに、ＵＬ０遺伝子の制御された遺伝子操作に
よる該天然ＵＬ０タンパク質の発現の不活性化が、野生
型親ＩＬＴＶと比較して弱毒化されたＩＬＴＶ突然変異
体を与えることをも見出した。さらに、この弱毒化ＩＬ
ＴＶ突然変異体がまた、ビルレントＩＬＴＶでの攻撃の
際にワクチン接種動物における死亡率および臨床的徴候
を減少させる感染防御免疫応答を誘導しうることを見出
した。また、本発明のワクチンは、噴霧大量ワクチン接
種により安全にニワトリに投与されうるという更なる利
点を示す。
【００１３】該ＩＬＴＶ特異的ＵＬ０遺伝子の局在化お
よびその分子構造は先行技術において開示されている
（Ｚｉｅｍａｎｎら，１９９８，前掲）。該ＵＬ０遺伝
子は、本発明においては、オープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）およびそのプロモーター領域（これは、保
存されたＵＬ１ ＯＲＦ（糖タンパク質Ｌをコードす
る）と部分的に重複し及び上流に存在し、そしてＥｃｏ
ＲＩ断片Ｂ内に位置するＩＲ配列との結合部のＵＬゲノ
ム領域のまさに右末端のＩＬＴＶ特異的ＵＬ［−１］Ｏ
ＲＦの下流に存在する）と定義される（図１Ａを参照さ
れたい）。
よびその分子構造は先行技術において開示されている
（Ｚｉｅｍａｎｎら，１９９８，前掲）。該ＵＬ０遺伝
子は、本発明においては、オープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）およびそのプロモーター領域（これは、保
存されたＵＬ１ ＯＲＦ（糖タンパク質Ｌをコードす
る）と部分的に重複し及び上流に存在し、そしてＥｃｏ
ＲＩ断片Ｂ内に位置するＩＲ配列との結合部のＵＬゲノ
ム領域のまさに右末端のＩＬＴＶ特異的ＵＬ［−１］Ｏ
ＲＦの下流に存在する）と定義される（図１Ａを参照さ
れたい）。
【００１４】
【発明の実施の形態】好ましくは、本発明のワクチン
は、ＵＬ０ ＯＲＦ内に突然変異を含む前記の弱毒化Ｉ
ＬＴＶ突然変異体を含む。
は、ＵＬ０ ＯＲＦ内に突然変異を含む前記の弱毒化Ｉ
ＬＴＶ突然変異体を含む。
【００１５】ＩＬＴＶ ＵＬ０遺伝子は、約５０６アミ
ノ酸のＵＬ０タンパク質をコードし、５’末端付近のイ
ントロンを含む。感染細胞内でＵＬ０遺伝子から発現さ
れるＵＬ０タンパク質は約６３ｋＤａの分子量を有し、
主にウイルス感染細胞の核内に局在化される。公開され
ているＵＬ０配列（Ｚｉｅｍａｎｎら，１９９８，前
掲）に関しては、該ＯＲＦはヌクレオチド７１５２位か
ら始まり、５５５４位で終わる。該ＵＬ０プロモーター
領域はヌクレオチド７３５０−７１５１に及ぶ。
ノ酸のＵＬ０タンパク質をコードし、５’末端付近のイ
ントロンを含む。感染細胞内でＵＬ０遺伝子から発現さ
れるＵＬ０タンパク質は約６３ｋＤａの分子量を有し、
主にウイルス感染細胞の核内に局在化される。公開され
ているＵＬ０配列（Ｚｉｅｍａｎｎら，１９９８，前
掲）に関しては、該ＯＲＦはヌクレオチド７１５２位か
ら始まり、５５５４位で終わる。該ＵＬ０プロモーター
領域はヌクレオチド７３５０−７１５１に及ぶ。
【００１６】ＩＬＴＶ株は、ヌクレオチドレベルで大部
分は保存されている。したがって、該ＩＬＴＶ ＵＬ０
遺伝子のＤＮＡ配列に関しては、自然変異がＩＬＴＶ集
団内の個々の株間に存在しうること、および本ＩＬＴＶ
突然変異体が由来する親ウイルスは任意のＩＬＴＶ株で
ありうることが理解されるであろう。該ＵＬ０遺伝子内
の１以上のヌクレオチドの変化によって株間の変異が起
こりうる。典型的には、ＵＬ０遺伝子は、公知ＵＬ０ア
ミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７
２５６）に対して少なくとも９０％の相同性を示すアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を有する。２つのタンパク質間のアミノ酸相同性の
レベルは、とりわけｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔ
ｍｌ．において見出されうるサブプログラム「ＢＬＡＳ
ＴＰ」、コンピュータープログラム「Ｂｌａｓｔ ２
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」で測定することができる。このプ
ログラムは、ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ，Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７
４，２４７−２５０，１９９９においても言及されてい
る。用いるマトリクスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」であり、
該パラメーターはデフォルトパラメーター：オープンギ
ャップ：１１、伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ギャップ：
１、Ｇａｐ ｘ ドロップオフ（ｄｅｏｐｏｆｆ）：５０
である。そのようなＩＬＴＶ株に由来するＩＬＴＶ突然
変異体に基づくワクチンも本発明の範囲内に含まれるこ
とは明らかである。好ましくは、本発明のワクチンは、
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７２５６におい
て公開されているアミノ酸配列を有するＵＬ０タンパク
質をコードするヌクレオチド配列を有するＵＬ０遺伝子
内に突然変異を含むＩＬＴＶ突然変異体に基づく。
分は保存されている。したがって、該ＩＬＴＶ ＵＬ０
遺伝子のＤＮＡ配列に関しては、自然変異がＩＬＴＶ集
団内の個々の株間に存在しうること、および本ＩＬＴＶ
突然変異体が由来する親ウイルスは任意のＩＬＴＶ株で
ありうることが理解されるであろう。該ＵＬ０遺伝子内
の１以上のヌクレオチドの変化によって株間の変異が起
こりうる。典型的には、ＵＬ０遺伝子は、公知ＵＬ０ア
ミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７
２５６）に対して少なくとも９０％の相同性を示すアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を有する。２つのタンパク質間のアミノ酸相同性の
レベルは、とりわけｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔ
ｍｌ．において見出されうるサブプログラム「ＢＬＡＳ
ＴＰ」、コンピュータープログラム「Ｂｌａｓｔ ２
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」で測定することができる。このプ
ログラムは、ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ，Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７
４，２４７−２５０，１９９９においても言及されてい
る。用いるマトリクスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」であり、
該パラメーターはデフォルトパラメーター：オープンギ
ャップ：１１、伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ギャップ：
１、Ｇａｐ ｘ ドロップオフ（ｄｅｏｐｏｆｆ）：５０
である。そのようなＩＬＴＶ株に由来するＩＬＴＶ突然
変異体に基づくワクチンも本発明の範囲内に含まれるこ
とは明らかである。好ましくは、本発明のワクチンは、
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７２５６におい
て公開されているアミノ酸配列を有するＵＬ０タンパク
質をコードするヌクレオチド配列を有するＵＬ０遺伝子
内に突然変異を含むＩＬＴＶ突然変異体に基づく。
【００１７】突然変異は、天然ＵＬ０タンパク質を発現
しうる親ＩＬＴＶ株の野生型または未修飾ＵＬ０遺伝子
における遺伝情報の変化であると理解される。該突然変
異は該ウイルスを弱毒化し、それを、ＩＬＴに対するワ
クチン株としての使用に適したものとする。該突然変異
は、該ＵＬ０遺伝子内の１以上のヌクレオチドの挿入、
欠失および／または置換でありうる。
しうる親ＩＬＴＶ株の野生型または未修飾ＵＬ０遺伝子
における遺伝情報の変化であると理解される。該突然変
異は該ウイルスを弱毒化し、それを、ＩＬＴに対するワ
クチン株としての使用に適したものとする。該突然変異
は、該ＵＬ０遺伝子内の１以上のヌクレオチドの挿入、
欠失および／または置換でありうる。
【００１８】生存可能な組換えＩＬＴＶ ＵＬ０突然変
異体の形成に対する、該ＵＬ１遺伝子と重複するＵＬ０
ＯＲＦの３’末端における突然変異の悪影響を防ぐた
めに、「ＵＬ０遺伝子内の突然変異」なる語は、ＵＬ１
プロモーター領域およびＯＲＦとは重複しない領域内の
ＵＬ０遺伝子内の突然変異を意味する。公開されている
ＵＬ０およびＵＬ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ン番号Ｘ９７２５６）に関しては、該ＵＬ１プロモータ
ー領域はヌクレオチド約５９００から開始し、該ＵＬ１
ＯＲＦは５５７０位から開始する。
異体の形成に対する、該ＵＬ１遺伝子と重複するＵＬ０
ＯＲＦの３’末端における突然変異の悪影響を防ぐた
めに、「ＵＬ０遺伝子内の突然変異」なる語は、ＵＬ１
プロモーター領域およびＯＲＦとは重複しない領域内の
ＵＬ０遺伝子内の突然変異を意味する。公開されている
ＵＬ０およびＵＬ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ン番号Ｘ９７２５６）に関しては、該ＵＬ１プロモータ
ー領域はヌクレオチド約５９００から開始し、該ＵＬ１
ＯＲＦは５５７０位から開始する。
【００１９】「天然ＵＬ０タンパク質を発現し得ない」
なる語は、本発明で用いるＩＬＴＶワクチン株が、野生
型ＩＬＴＶにより発現される６３ｋＤａのＵＬ０タンパ
ク質から通常の試験により区別されうるタンパク質を感
染宿主細胞内で発現すること、またはＵＬ０タンパク質
を全く発現しないことを意味する。例えば、前者の場
合、該ＩＬＴＶ突然変異体は、野生型ＵＬ０タンパク質
の断片のみを発現する。好ましくは、本発明で用いるＩ
ＬＴＶ突然変異体ワクチンは、宿主細胞における感染お
よび複製に際してＵＬ０タンパク質を全く発現しない。
該天然ＵＬ０タンパク質の発現に関してＩＬＴＶ突然変
異体を血清学的試験によりアッセイするためには、まず
第１に、単一特異性ＵＬ０抗血清を産生させる。この目
的のために、該ＵＬ０ ＯＲＦまたはその一部を大腸菌
内で融合タンパク質として発現させることができる。該
融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーま
たはゲル電気泳動により精製し、それを使用して、該抗
血清の産生のためにウサギを免疫する（Ｚｉｅｍａｎｎ
ら，１９９８，前掲）。第２に、ウイルスを培養細胞内
で増殖させ、回収し、細胞溶解し、免疫沈降させる（こ
れは所望により行う）。周知の方法を用いて、該タンパ
ク質をポリアクリルアミドゲル内で分離し、ニトロセル
ロースに転移する。ついで、該ゲルを、該融合タンパク
質に対して産生させた抗血清と共にインキュベートし、
天然の６３ｋＤａタンパク質の存否を判定することがで
きる。同様のアッセイにおいて、培養中および抗ＵＬ０
抗血清での該ウイルス回収物の免疫沈降中、該ＩＬＴＶ
タンパク質の放射能標識により、発現された天然ＵＬ０
の存否を判定することができる。
なる語は、本発明で用いるＩＬＴＶワクチン株が、野生
型ＩＬＴＶにより発現される６３ｋＤａのＵＬ０タンパ
ク質から通常の試験により区別されうるタンパク質を感
染宿主細胞内で発現すること、またはＵＬ０タンパク質
を全く発現しないことを意味する。例えば、前者の場
合、該ＩＬＴＶ突然変異体は、野生型ＵＬ０タンパク質
の断片のみを発現する。好ましくは、本発明で用いるＩ
ＬＴＶ突然変異体ワクチンは、宿主細胞における感染お
よび複製に際してＵＬ０タンパク質を全く発現しない。
該天然ＵＬ０タンパク質の発現に関してＩＬＴＶ突然変
異体を血清学的試験によりアッセイするためには、まず
第１に、単一特異性ＵＬ０抗血清を産生させる。この目
的のために、該ＵＬ０ ＯＲＦまたはその一部を大腸菌
内で融合タンパク質として発現させることができる。該
融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーま
たはゲル電気泳動により精製し、それを使用して、該抗
血清の産生のためにウサギを免疫する（Ｚｉｅｍａｎｎ
ら，１９９８，前掲）。第２に、ウイルスを培養細胞内
で増殖させ、回収し、細胞溶解し、免疫沈降させる（こ
れは所望により行う）。周知の方法を用いて、該タンパ
ク質をポリアクリルアミドゲル内で分離し、ニトロセル
ロースに転移する。ついで、該ゲルを、該融合タンパク
質に対して産生させた抗血清と共にインキュベートし、
天然の６３ｋＤａタンパク質の存否を判定することがで
きる。同様のアッセイにおいて、培養中および抗ＵＬ０
抗血清での該ウイルス回収物の免疫沈降中、該ＩＬＴＶ
タンパク質の放射能標識により、発現された天然ＵＬ０
の存否を判定することができる。
【００２０】本発明で使用する典型的なＩＬＴＶ置換突
然変異体は、終結コドンへの該ＯＲＦ内（好ましくは、
該ＯＲＦの５’側の半分）の１以上のコドンの変化をも
たらす１以上のヌクレオチドの置換を含む。あるいは、
該置換は、該ＵＬ０ ＯＲＦの開始コドンの変化および
除去をもたらしうる。
然変異体は、終結コドンへの該ＯＲＦ内（好ましくは、
該ＯＲＦの５’側の半分）の１以上のコドンの変化をも
たらす１以上のヌクレオチドの置換を含む。あるいは、
該置換は、該ＵＬ０ ＯＲＦの開始コドンの変化および
除去をもたらしうる。
【００２１】この実施形態の好ましい態様においては、
本発明のワクチンは該ＵＬ０遺伝子の欠失を含む。該欠
失は該天然ＵＬ０タンパク質の発現を妨げ、１ヌクレオ
チドからほぼ完全なＯＲＦ（ＵＬ１遺伝子と重複する部
分は除く）の範囲となりうる。個々の有効な欠失は、該
ＵＬ０遺伝子の５’側の半分に施され及び／又は該読み
取り枠のシフトを引き起こす欠失である。特に、前記の
ＩＬＴＶワクチン株内に導入された欠失は、少なくとも
１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌ
クレオチド、最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオ
チドを含む。特に有用なＩＬＴＶ欠失突然変異体は、ａ
ａ４９−２３１をコードする５４６ｂｐのＫｐｎＩ／Ｓ
ｓｐＩ断片、ａａ１７−３１８をコードする９８４ｂｐ
のＣｌａＩ／ＢｓｒＢＩ断片またはａａ１−３５２をコ
ードする１１３７ｂｐのＢｓｓＨＩＩ／ＸｂａＩ断片の
欠失を含有する。
本発明のワクチンは該ＵＬ０遺伝子の欠失を含む。該欠
失は該天然ＵＬ０タンパク質の発現を妨げ、１ヌクレオ
チドからほぼ完全なＯＲＦ（ＵＬ１遺伝子と重複する部
分は除く）の範囲となりうる。個々の有効な欠失は、該
ＵＬ０遺伝子の５’側の半分に施され及び／又は該読み
取り枠のシフトを引き起こす欠失である。特に、前記の
ＩＬＴＶワクチン株内に導入された欠失は、少なくとも
１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌ
クレオチド、最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオ
チドを含む。特に有用なＩＬＴＶ欠失突然変異体は、ａ
ａ４９−２３１をコードする５４６ｂｐのＫｐｎＩ／Ｓ
ｓｐＩ断片、ａａ１７−３１８をコードする９８４ｂｐ
のＣｌａＩ／ＢｓｒＢＩ断片またはａａ１−３５２をコ
ードする１１３７ｂｐのＢｓｓＨＩＩ／ＸｂａＩ断片の
欠失を含有する。
【００２２】また、前記の有用なＩＬＴＶ突然変異体
は、該ＵＬ０遺伝子内への異種核酸配列（すなわち、該
ＩＬＴＶゲノムのその位置に天然に存在する核酸配列と
は異なる核酸配列）の挿入により得ることができる。好
ましくは、該異種核酸配列は、該ＩＬＴＶゲノム内に存
在しないＤＮＡ断片である。該異種核酸配列は、任意
の、例えば合成、ウイルス性、原核性または真核性の起
源に由来しうる。そのような核酸配列は、とりわけ、所
望により１以上の翻訳終結コドン（米国特許第５，２７
９，９６５号を参照されたい）またはポリペプチドコー
ド化ポリヌクレオチドをも含有する例えば約１０〜６０
ｂｐのオリゴヌクレオチドでありうる。
は、該ＵＬ０遺伝子内への異種核酸配列（すなわち、該
ＩＬＴＶゲノムのその位置に天然に存在する核酸配列と
は異なる核酸配列）の挿入により得ることができる。好
ましくは、該異種核酸配列は、該ＩＬＴＶゲノム内に存
在しないＤＮＡ断片である。該異種核酸配列は、任意
の、例えば合成、ウイルス性、原核性または真核性の起
源に由来しうる。そのような核酸配列は、とりわけ、所
望により１以上の翻訳終結コドン（米国特許第５，２７
９，９６５号を参照されたい）またはポリペプチドコー
ド化ポリヌクレオチドをも含有する例えば約１０〜６０
ｂｐのオリゴヌクレオチドでありうる。
【００２３】この実施形態のもう１つの態様において
は、本発明のワクチンは、欠失したＩＬＴＶ ＤＮＡの
代わりに異種核酸配列を含有するＩＬＴＶ欠失体を含
む。
は、本発明のワクチンは、欠失したＩＬＴＶ ＤＮＡの
代わりに異種核酸配列を含有するＩＬＴＶ欠失体を含
む。
【００２４】異種核酸配列を含む前記ＩＬＴＶ突然変異
体はまた、家禽において異種ポリペプチドを運搬するた
めのベクターとして使用することができる。したがっ
て、本発明はまた、前記のＩＬＴＶ突然変異体を含むワ
クチンであって、該異種核酸配列が、ＩＬＴに対する家
禽の感染防御のためだけではなく他のトリ病原体により
引き起こされる疾患に対する感染防御にも使用されうる
トリ（特にニワトリ）病原体の抗原をコードすることを
特徴とするワクチンを提供する。また、生弱毒化ＩＬＴ
Ｖに基づくそのようなベクターワクチンは、該ワクチン
接種動物内での該ＩＬＴＶ突然変異体の複製および該ワ
クチン接種動物内で免疫応答を惹起する該外来抗原の発
現により、他の病原体に対してニワトリを免疫しうる。
体はまた、家禽において異種ポリペプチドを運搬するた
めのベクターとして使用することができる。したがっ
て、本発明はまた、前記のＩＬＴＶ突然変異体を含むワ
クチンであって、該異種核酸配列が、ＩＬＴに対する家
禽の感染防御のためだけではなく他のトリ病原体により
引き起こされる疾患に対する感染防御にも使用されうる
トリ（特にニワトリ）病原体の抗原をコードすることを
特徴とするワクチンを提供する。また、生弱毒化ＩＬＴ
Ｖに基づくそのようなベクターワクチンは、該ワクチン
接種動物内での該ＩＬＴＶ突然変異体の複製および該ワ
クチン接種動物内で免疫応答を惹起する該外来抗原の発
現により、他の病原体に対してニワトリを免疫しうる。
【００２５】好ましくは、該ＩＬＴＶベクター突然変異
体は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、マレッ
ク病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染
性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ
貧血ウイルス、レオウイルス、トリレトロウイルス、ニ
ワトリアデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイル
ス（ＴＲＴＶ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アイメリア
（Ｅｉｍｅｒｉａ）種、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙ
ｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏ
ｐｌａｓｍｓ）、例えばマイコプラズマ・ガリナルム
（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、マイコプラズマ・シノ
ビエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）およびマイコプラズマ・
メレアグリディス（Ｍ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、サ
ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−、カンピロバクタ
ー（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）−、オルニトバクテ
リウム（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＯＲ
Ｔ）およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種の
防御抗原をコードする異種核酸配列を含む。より好まし
くは、該ＩＬＴＶベクター突然変異体は、ＡＩＶ、ＭＤ
Ｖ、ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤＶ、ＴＲＴＶ、大腸菌、Ｏ
ＲＴおよびマイコプラズマの抗原をコードする異種核酸
配列を含む。
体は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、マレッ
ク病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染
性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリ
貧血ウイルス、レオウイルス、トリレトロウイルス、ニ
ワトリアデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイル
ス（ＴＲＴＶ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アイメリア
（Ｅｉｍｅｒｉａ）種、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙ
ｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏ
ｐｌａｓｍｓ）、例えばマイコプラズマ・ガリナルム
（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、マイコプラズマ・シノ
ビエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）およびマイコプラズマ・
メレアグリディス（Ｍ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、サ
ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−、カンピロバクタ
ー（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）−、オルニトバクテ
リウム（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＯＲ
Ｔ）およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種の
防御抗原をコードする異種核酸配列を含む。より好まし
くは、該ＩＬＴＶベクター突然変異体は、ＡＩＶ、ＭＤ
Ｖ、ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤＶ、ＴＲＴＶ、大腸菌、Ｏ
ＲＴおよびマイコプラズマの抗原をコードする異種核酸
配列を含む。
【００２６】特に、該ＩＬＴＶベクター突然変異体は、
ＡＩＶの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子（Ｆｌｅｘｎｅｒ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５，２５９−２６２，１９８
８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ３０５３０
６）、ＭＤＶのｇＡ、ｇＢおよびｇＤ遺伝子（Ｒｏｓｓ
ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３７１−３７７，
１９９３；ＷＯ９０／０２８０３）、ＮＤＶのＨＮまた
はＦ遺伝子（Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，Ｖａｃｃｉ
ｎｅ １１，３４９−３５８，１９９３）またはＩＢＤ
ＶのＶＰ２遺伝子（Ｂａｙｌｉｓｓら，Ａｒｃｈ．Ｖｉ
ｒｏｌ．１２０，１９３−２０５，１９９１）を含みう
る。さらに一層好ましい実施形態においては、ＡＩＶの
ＨＡ遺伝子を含む弱毒化ＩＬＴＶ突然変異体に基づく前
記ワクチンを提供する。
ＡＩＶの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子（Ｆｌｅｘｎｅｒ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５，２５９−２６２，１９８
８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ３０５３０
６）、ＭＤＶのｇＡ、ｇＢおよびｇＤ遺伝子（Ｒｏｓｓ
ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３７１−３７７，
１９９３；ＷＯ９０／０２８０３）、ＮＤＶのＨＮまた
はＦ遺伝子（Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，Ｖａｃｃｉ
ｎｅ １１，３４９−３５８，１９９３）またはＩＢＤ
ＶのＶＰ２遺伝子（Ｂａｙｌｉｓｓら，Ａｒｃｈ．Ｖｉ
ｒｏｌ．１２０，１９３−２０５，１９９１）を含みう
る。さらに一層好ましい実施形態においては、ＡＩＶの
ＨＡ遺伝子を含む弱毒化ＩＬＴＶ突然変異体に基づく前
記ワクチンを提供する。
【００２７】特に、ＡＩＶのＨ５またはＨ７血球凝集素
遺伝子を含む弱毒化ＩＬＴＶ突然変異体に基づくワクチ
ンが意図される。
遺伝子を含む弱毒化ＩＬＴＶ突然変異体に基づくワクチ
ンが意図される。
【００２８】あるいは、該ＩＬＴＶベクター突然変異体
は、免疫調整剤、例えば（トリ）インターフェロン、サ
イトカインまたはリンホカインをコードする異種核酸配
列を含む。該ＩＬＴＶ突然変異体により発現される免疫
調整剤は、該ＩＬＴＶ突然変異体により誘導される免疫
応答を増強し、そのようなものとして防御の増強に寄与
する。したがって、本発明はまた、免疫調整剤をコード
する異種核酸配列を含有する前記ＩＬＴＶ突然変異体を
含むワクチンを提供する。
は、免疫調整剤、例えば（トリ）インターフェロン、サ
イトカインまたはリンホカインをコードする異種核酸配
列を含む。該ＩＬＴＶ突然変異体により発現される免疫
調整剤は、該ＩＬＴＶ突然変異体により誘導される免疫
応答を増強し、そのようなものとして防御の増強に寄与
する。したがって、本発明はまた、免疫調整剤をコード
する異種核酸配列を含有する前記ＩＬＴＶ突然変異体を
含むワクチンを提供する。
【００２９】前記のＩＬＴＶ突然変異体による該異種核
酸の発現のための必須の要件は、機能しうる様態で該異
種核酸配列に結合した適当な発現制御配列、好ましく
は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルであ
る。そのような発現制御配列は、特にヘルペスウイルス
ベクターの構築に関しては当業者に周知であり、該ＩＬ
ＴＶ突然変異体に感染した細胞内での遺伝子転写を指令
しうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモー
ターまたはポリアデニル化シグナルに拡張される。有用
なプロモーターの具体例としては、ＳＶ−４０プロモー
ター（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，５２４−５２７，１９
８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロ
モーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９
８５）、ＰＲＶ ｇＸプロモーター（Ｍｅｔｔｅｎｌｅ
ｉｔｅｒおよびＲａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ３０，５５−６６，１９９０）、ヒトサイトメガ
ロウイルスＩＥプロモーター（米国特許第５，１６８，
０６２号）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター
（Ｇｏｒｍａｎら，ＰＮＡＳ７９，６７７７−６７８
１，１９８２）、ヒト延長因子１α、またはＩＬＴＶ内
に存在するユビキチンプロモーター、特にＵＬ０プロモ
ーターが挙げられる。有用なポリＡシグナルの具体例と
しては、ウサギβ−グロビン、ＳＶ４０およびウシ成長
ホルモンポリＡシグナルが挙げられる。あるいは、ＵＬ
０、ＵＬ１またはＵＬ２の内在性ポリＡシグナルを用い
ることができる。
酸の発現のための必須の要件は、機能しうる様態で該異
種核酸配列に結合した適当な発現制御配列、好ましく
は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルであ
る。そのような発現制御配列は、特にヘルペスウイルス
ベクターの構築に関しては当業者に周知であり、該ＩＬ
ＴＶ突然変異体に感染した細胞内での遺伝子転写を指令
しうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモー
ターまたはポリアデニル化シグナルに拡張される。有用
なプロモーターの具体例としては、ＳＶ−４０プロモー
ター（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，５２４−５２７，１９
８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロ
モーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９
８５）、ＰＲＶ ｇＸプロモーター（Ｍｅｔｔｅｎｌｅ
ｉｔｅｒおよびＲａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ３０，５５−６６，１９９０）、ヒトサイトメガ
ロウイルスＩＥプロモーター（米国特許第５，１６８，
０６２号）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター
（Ｇｏｒｍａｎら，ＰＮＡＳ７９，６７７７−６７８
１，１９８２）、ヒト延長因子１α、またはＩＬＴＶ内
に存在するユビキチンプロモーター、特にＵＬ０プロモ
ーターが挙げられる。有用なポリＡシグナルの具体例と
しては、ウサギβ−グロビン、ＳＶ４０およびウシ成長
ホルモンポリＡシグナルが挙げられる。あるいは、ＵＬ
０、ＵＬ１またはＵＬ２の内在性ポリＡシグナルを用い
ることができる。
【００３０】したがって、本発明の好ましいワクチン
は、発現制御配列の制御下にある前記ポリペプチドをコ
ードする異種核酸配列を含むＩＬＴＶ突然変異体に基づ
く。
は、発現制御配列の制御下にある前記ポリペプチドをコ
ードする異種核酸配列を含むＩＬＴＶ突然変異体に基づ
く。
【００３１】本発明の更にもう１つの態様においては、
該ＩＬＴＶゲノム内の更なる弱毒化突然変異を更に含む
前記ＩＬＴＶ突然変異体を含むワクチンを提供する。例
えば、そのようなワクチンは、修飾された生ワクチン
株、例えば、商業的に現在入手可能なもの（例えば、Ｎ
ｏｂｉｌｉｓ ＩＬＴ（登録商標）、ＢｉｏＴｒａｃｈ
（登録商標）、Ｔｒａｃｈｉｎｅ（登録商標））に基づ
くか、あるいは毒性に関与する更なるタンパク質（例え
ば、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ＴＫ、ＲＲ、ＵＬ２１、ＵＬ５
０またはＰＫ）を発現しない遺伝的に操作されたＩＬＴ
Ｖに基づく（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ ２０９，３０４−３１４，１９９５；Ｍｅｔｔｅ
ｎｌｅｉｔｅｒ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ＥＳ
ＶＶ ｍｅｅｔｉｎｇ，２７−３０，２０００年８月，
１５−１７；ＷＯ ９６／２９３９６）。
該ＩＬＴＶゲノム内の更なる弱毒化突然変異を更に含む
前記ＩＬＴＶ突然変異体を含むワクチンを提供する。例
えば、そのようなワクチンは、修飾された生ワクチン
株、例えば、商業的に現在入手可能なもの（例えば、Ｎ
ｏｂｉｌｉｓ ＩＬＴ（登録商標）、ＢｉｏＴｒａｃｈ
（登録商標）、Ｔｒａｃｈｉｎｅ（登録商標））に基づ
くか、あるいは毒性に関与する更なるタンパク質（例え
ば、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ＴＫ、ＲＲ、ＵＬ２１、ＵＬ５
０またはＰＫ）を発現しない遺伝的に操作されたＩＬＴ
Ｖに基づく（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ ２０９，３０４−３１４，１９９５；Ｍｅｔｔｅ
ｎｌｅｉｔｅｒ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ＥＳ
ＶＶ ｍｅｅｔｉｎｇ，２７−３０，２０００年８月，
１５−１７；ＷＯ ９６／２９３９６）。
【００３２】クローニング／発現ベクター内へのＤＮＡ
配列の挿入およびインビボ相同組換えに関する周知の方
法を用いて、該ＩＬＴＶゲノム内に突然変異を導入する
ことができる。
配列の挿入およびインビボ相同組換えに関する周知の方
法を用いて、該ＩＬＴＶゲノム内に突然変異を導入する
ことができる。
【００３３】原則として、これは、所望の突然変異を保
持する関連ＩＬＴＶ ＤＮＡ断片および宿主細胞内で複
製可能なベクターを含むゲノムＩＬＴＶ ＤＮＡとの組
換えのための組換え導入ベクターを構築することにより
達成される。そのような組換え導入ベクターは、この目
的のための当業者に公知の任意の適当なベクター、例え
ば、プラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージか
ら誘導されうるが、プラスミドが最も好ましい。適当な
クローニングベクターの具体例としては、プラスミドベ
クター、例えばｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＥＭＢ
ＬおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、バクテリオ
ファージ、例えばラムダ、シャロン２８およびＭ１３ｍ
ｐファージが挙げられる。適当な導入ベクター、宿主細
胞、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングなど
のための方法は、当業界で周知の選択肢から当業者によ
り選択されうる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．
Ｌ．およびＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら
編，Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．，１９９５；Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍ
ａｎｕａｌ，第３版：Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，ＣＳＨＬ
ｐｒｅｓｓ，２００１、ならびにＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ｖｏｌ．１−４，第２版 １９９５：Ｇｌｏｖｅ
ｒおよびＨａｍｅｓ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
持する関連ＩＬＴＶ ＤＮＡ断片および宿主細胞内で複
製可能なベクターを含むゲノムＩＬＴＶ ＤＮＡとの組
換えのための組換え導入ベクターを構築することにより
達成される。そのような組換え導入ベクターは、この目
的のための当業者に公知の任意の適当なベクター、例え
ば、プラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージか
ら誘導されうるが、プラスミドが最も好ましい。適当な
クローニングベクターの具体例としては、プラスミドベ
クター、例えばｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＥＭＢ
ＬおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、バクテリオ
ファージ、例えばラムダ、シャロン２８およびＭ１３ｍ
ｐファージが挙げられる。適当な導入ベクター、宿主細
胞、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングなど
のための方法は、当業界で周知の選択肢から当業者によ
り選択されうる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．
Ｌ．およびＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら
編，Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．，１９９５；Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍ
ａｎｕａｌ，第３版：Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，ＣＳＨＬ
ｐｒｅｓｓ，２００１、ならびにＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ｖｏｌ．１−４，第２版 １９９５：Ｇｌｏｖｅ
ｒおよびＨａｍｅｓ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００３４】簡単に説明すると、まず第１に、ＵＬ０核
酸配列を含むＩＬＴＶ ＤＮＡ断片を、標準的なｒｅｃ
ＤＮＡ技術を用いて導入ベクター内に挿入する。該ＩＬ
ＴＶＤＮＡ断片は、ＵＬ０ ＯＲＦの一部または完全な
ＵＬ０ ＯＲＦ、および所望によりその隣接配列を含み
うる。第２に、ＩＬＴＶ ＵＬ０欠失突然変異体を得よ
うとする場合には、ＵＬ０ ＯＲＦの一部を該組換え導
入ベクターから欠失させる。これは、例えば、該組換え
ベクターインサートの適当なエキソヌクレアーゼＩＩＩ
消化または制限酵素切断により、またはＰＣＲプライマ
ーの注意深い選択により達成することができる。ＩＬＴ
Ｖ挿入突然変異体を得ようとする場合には、異種核酸配
列と、所望により、発現制御配列を含むＤＮＡ断片と
を、該組換えベクター内に存在するＵＬ０核酸配列内に
又は欠失したＵＬ０核酸配列の代わりに挿入する。該Ｉ
ＬＴＶ ＤＮＡ内に導入された突然変異に隣接するＩＬ
ＴＶ ＤＮＡ配列は、ゲノムＩＬＴＶ ＤＮＡとの相同
組換えが生じうるのに適した長さのものであるべきであ
る。一般に、５００ｂｐ以上の隣接配列が、効率的な相
同組換えを可能にする。
酸配列を含むＩＬＴＶ ＤＮＡ断片を、標準的なｒｅｃ
ＤＮＡ技術を用いて導入ベクター内に挿入する。該ＩＬ
ＴＶＤＮＡ断片は、ＵＬ０ ＯＲＦの一部または完全な
ＵＬ０ ＯＲＦ、および所望によりその隣接配列を含み
うる。第２に、ＩＬＴＶ ＵＬ０欠失突然変異体を得よ
うとする場合には、ＵＬ０ ＯＲＦの一部を該組換え導
入ベクターから欠失させる。これは、例えば、該組換え
ベクターインサートの適当なエキソヌクレアーゼＩＩＩ
消化または制限酵素切断により、またはＰＣＲプライマ
ーの注意深い選択により達成することができる。ＩＬＴ
Ｖ挿入突然変異体を得ようとする場合には、異種核酸配
列と、所望により、発現制御配列を含むＤＮＡ断片と
を、該組換えベクター内に存在するＵＬ０核酸配列内に
又は欠失したＵＬ０核酸配列の代わりに挿入する。該Ｉ
ＬＴＶ ＤＮＡ内に導入された突然変異に隣接するＩＬ
ＴＶ ＤＮＡ配列は、ゲノムＩＬＴＶ ＤＮＡとの相同
組換えが生じうるのに適した長さのものであるべきであ
る。一般に、５００ｂｐ以上の隣接配列が、効率的な相
同組換えを可能にする。
【００３５】ついで、細胞、例えばニワトリ胚肝細胞、
ニワトリ腎細胞、好ましくはニワトリ肝細胞癌細胞系Ｌ
ＭＨ（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ ３８，２１１−２１７，１９９４）を、突
然変異ＩＬＴＶ ＤＮＡインサートを含有する組換え導
入ベクターの存在下、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡでコトラン
スフェクトすると、それにより、このインサートと該Ｉ
ＬＴＶゲノムとの間で組換えが生じる。組換えＩＬＴＶ
突然変異体の構築のための特に有利な方法においては、
該突然変異ＩＬＴＶ ＤＮＡインサートとＩＬＴＶゲノ
ムＤＮＡとを含有する組換え導入ベクターを、調節タン
パク質ＩＣＰ４および／またはヘルペスウイルストラン
スアクチベーターαＴＩＦ（ＵＬ４８）のＩＬＴＶホモ
ログをコードする発現ベクター（例えば、ｐＲｃ−ＵＬ
４８）の存在下、ＬＭＨ細胞の（リン酸カルシウム媒
介）コトランスフェクションに使用する。なぜなら、そ
れらはどちらも、裸のＩＬＴＶ ＤＮＡの感染性を増強
するからである（Ｆｕｃｈｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．８１，６２７−６３８，２０００）。
ニワトリ腎細胞、好ましくはニワトリ肝細胞癌細胞系Ｌ
ＭＨ（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ ３８，２１１−２１７，１９９４）を、突
然変異ＩＬＴＶ ＤＮＡインサートを含有する組換え導
入ベクターの存在下、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡでコトラン
スフェクトすると、それにより、このインサートと該Ｉ
ＬＴＶゲノムとの間で組換えが生じる。組換えＩＬＴＶ
突然変異体の構築のための特に有利な方法においては、
該突然変異ＩＬＴＶ ＤＮＡインサートとＩＬＴＶゲノ
ムＤＮＡとを含有する組換え導入ベクターを、調節タン
パク質ＩＣＰ４および／またはヘルペスウイルストラン
スアクチベーターαＴＩＦ（ＵＬ４８）のＩＬＴＶホモ
ログをコードする発現ベクター（例えば、ｐＲｃ−ＵＬ
４８）の存在下、ＬＭＨ細胞の（リン酸カルシウム媒
介）コトランスフェクションに使用する。なぜなら、そ
れらはどちらも、裸のＩＬＴＶ ＤＮＡの感染性を増強
するからである（Ｆｕｃｈｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．８１，６２７−６３８，２０００）。
【００３６】ついで、継代した組換えウイルスを細胞培
養内で産生させ、遺伝子型または表現型により選択する
ことができる。例えば、ハイブリダイゼーションによ
り、または該組換え導入ベクターの調製中に挿入または
除去された遺伝子にコードされる酵素活性または別のス
クリーニング可能なマーカー（例えば、グリーン蛍光タ
ンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ）の存否を検出す
ることにより、それを行うことができる。継代したトラ
ンスフェクションの後代をプラークアッセイにより分析
し、予想された遺伝子型または表現型を示すプラークを
吸引により拾い集める。ついで前記ＩＬＴＶ突然変異体
を、マイクロタイタープレート内で増殖させた（ニワト
リ胚肝）細胞上での限外希釈により、均一になるまで精
製することができる。
養内で産生させ、遺伝子型または表現型により選択する
ことができる。例えば、ハイブリダイゼーションによ
り、または該組換え導入ベクターの調製中に挿入または
除去された遺伝子にコードされる酵素活性または別のス
クリーニング可能なマーカー（例えば、グリーン蛍光タ
ンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ）の存否を検出す
ることにより、それを行うことができる。継代したトラ
ンスフェクションの後代をプラークアッセイにより分析
し、予想された遺伝子型または表現型を示すプラークを
吸引により拾い集める。ついで前記ＩＬＴＶ突然変異体
を、マイクロタイタープレート内で増殖させた（ニワト
リ胚肝）細胞上での限外希釈により、均一になるまで精
製することができる。
【００３７】本発明のワクチンは、例えば、商業的に入
手可能な生および不活化ＩＬＴＶワクチンに一般に用い
られているような通常の方法により製造することができ
る。簡単に説明すると、前記のとおりのＩＬＴＶ突然変
異体を感受性基質に接種し、該ウイルスが所望の感染価
に複製するまで増殖させ、ついでＩＬＴＶ含有物質を回
収する。
手可能な生および不活化ＩＬＴＶワクチンに一般に用い
られているような通常の方法により製造することができ
る。簡単に説明すると、前記のとおりのＩＬＴＶ突然変
異体を感受性基質に接種し、該ウイルスが所望の感染価
に複製するまで増殖させ、ついでＩＬＴＶ含有物質を回
収する。
【００３８】本発明においては、ＩＬＴウイルスの複製
を支持しうる各基質を使用することが可能であり、それ
らには、初代（トリ）細胞培養、例えばニワトリ胚肝細
胞（ＣＥＬ）もしくはニワトリ胚腎細胞（ＣＥＫ）、ま
たはトリ細胞系、例えばＬＭＨが含まれる。通常、該細
胞の接種後、該ウイルスを約３〜１０日間増殖させ、つ
いで該感染細胞および／または該細胞培養上清を回収す
る。該感染細胞を凍結・融解して該ウイルスを遊離さ
せ、ついで該物質を凍結ストックとして保存することが
できる。
を支持しうる各基質を使用することが可能であり、それ
らには、初代（トリ）細胞培養、例えばニワトリ胚肝細
胞（ＣＥＬ）もしくはニワトリ胚腎細胞（ＣＥＫ）、ま
たはトリ細胞系、例えばＬＭＨが含まれる。通常、該細
胞の接種後、該ウイルスを約３〜１０日間増殖させ、つ
いで該感染細胞および／または該細胞培養上清を回収す
る。該感染細胞を凍結・融解して該ウイルスを遊離さ
せ、ついで該物質を凍結ストックとして保存することが
できる。
【００３９】あるいは、該ＩＬＴＶ突然変異体を孵化Ｓ
ＰＦ鶏卵内で増殖させることができる。孵化卵に、例え
ば、少なくとも１０１ ＴＣＩＤ５０／卵を含む０．２
ｍｌＩＬＴＶ突然変異体含有懸濁液またはホモジネート
を接種し、ついで３７℃でインキュベートすることがで
きる。約２〜６日後、該胚および／または該膜および／
または該尿膜腔液を集め次いでこの物質を適当にホモジ
ナイズすることにより、該ＩＬＴウイルス産物を回収す
ることができる。
ＰＦ鶏卵内で増殖させることができる。孵化卵に、例え
ば、少なくとも１０１ ＴＣＩＤ５０／卵を含む０．２
ｍｌＩＬＴＶ突然変異体含有懸濁液またはホモジネート
を接種し、ついで３７℃でインキュベートすることがで
きる。約２〜６日後、該胚および／または該膜および／
または該尿膜腔液を集め次いでこの物質を適当にホモジ
ナイズすることにより、該ＩＬＴウイルス産物を回収す
ることができる。
【００４０】本発明の生ワクチンは、前記のＩＬＴＶ突
然変異体と、そのような組成物に通常使用される薬学上
許容される担体または希釈剤とを含有する。該ワクチン
は、懸濁液の形態または凍結乾燥形態として製造し販売
することができる。担体は、安定化剤、保存剤および緩
衝剤を含む。適当な安定化剤としては、例えば、ＳＰＧ
Ａ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、
デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコー
ス）、タンパク質（例えば、粉乳血清、アルブミンまた
はカゼイン）またはそれらの分解産物が挙げられる。適
当な緩衝剤としては、例えば、リン酸アルカリ金属が挙
げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、メル
チオラート、ゲンタマイシンおよびネオマイシンが挙げ
られる。希釈剤には、無菌生理食塩水、水性リン酸バッ
ファー、アルコールおよび多価アルコール（例えば、グ
リセロール）が含まれる。
然変異体と、そのような組成物に通常使用される薬学上
許容される担体または希釈剤とを含有する。該ワクチン
は、懸濁液の形態または凍結乾燥形態として製造し販売
することができる。担体は、安定化剤、保存剤および緩
衝剤を含む。適当な安定化剤としては、例えば、ＳＰＧ
Ａ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、
デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコー
ス）、タンパク質（例えば、粉乳血清、アルブミンまた
はカゼイン）またはそれらの分解産物が挙げられる。適
当な緩衝剤としては、例えば、リン酸アルカリ金属が挙
げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、メル
チオラート、ゲンタマイシンおよびネオマイシンが挙げ
られる。希釈剤には、無菌生理食塩水、水性リン酸バッ
ファー、アルコールおよび多価アルコール（例えば、グ
リセロール）が含まれる。
【００４１】所望により、本発明の生ワクチンはアジュ
バントを含有しうる。
バントを含有しうる。
【００４２】本発明の生ワクチンの注射による投与（例
えば、筋肉内または皮下）は可能ではあるが、該ワクチ
ンは、好ましくは、家禽のワクチン接種に一般に用いら
れる安価な大量適用技術により投与する。ＩＬＴＶワク
チン接種のためのこれらの技術には、飲水およびエアロ
ゾールまたは噴霧によるワクチン接種が含まれる。
えば、筋肉内または皮下）は可能ではあるが、該ワクチ
ンは、好ましくは、家禽のワクチン接種に一般に用いら
れる安価な大量適用技術により投与する。ＩＬＴＶワク
チン接種のためのこれらの技術には、飲水およびエアロ
ゾールまたは噴霧によるワクチン接種が含まれる。
【００４３】本発明におけるワクチン投与のための好ま
しい方法は、１０００個の動物当たり＞２５０ｍｌ／で
の、特に、大量の希釈剤の存在下では＞１００μｍのノ
ズル滴サイズを用いる粗（ｃｏａｒｓｅ）噴霧によるも
のである。適当な噴霧は該動物の眼および口に対するも
のである。これは、ワクチン接種の眼−口−鼻経路を模
倣し、所望の免疫化を誘導するであろう。
しい方法は、１０００個の動物当たり＞２５０ｍｌ／で
の、特に、大量の希釈剤の存在下では＞１００μｍのノ
ズル滴サイズを用いる粗（ｃｏａｒｓｅ）噴霧によるも
のである。適当な噴霧は該動物の眼および口に対するも
のである。これは、ワクチン接種の眼−口−鼻経路を模
倣し、所望の免疫化を誘導するであろう。
【００４４】あるいは、該生ワクチンの投与方法には、
卵内、点眼、口−鼻および嘴浸漬の投与が含まれる。
卵内、点眼、口−鼻および嘴浸漬の投与が含まれる。
【００４５】本発明のもう１つの態様においては、不活
化形態のＩＬＴＶ突然変異体を含むワクチンを提供す
る。該不活化ＩＬＴＶ突然変異体を含有するワクチン
は、例えば、この目的に適した前記の薬学上許容される
担体または希釈剤の１以上を含みうる。好ましくは、本
発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する１
以上の化合物を含む。
化形態のＩＬＴＶ突然変異体を含むワクチンを提供す
る。該不活化ＩＬＴＶ突然変異体を含有するワクチン
は、例えば、この目的に適した前記の薬学上許容される
担体または希釈剤の１以上を含みうる。好ましくは、本
発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する１
以上の化合物を含む。
【００４６】本発明のワクチンは、有効量のＩＬＴＶ突
然変異体（すなわち、ワクチン接種されたトリにおいて
ビルレントウイルスによる攻撃に対する感染防御誘導量
の前記の免疫化ＩＬＴＶ突然変異体）を該有効成分とし
て含む。本発明においては、感染防御は、ワクチン接種
後のトリ群において、非ワクチン接種群と比べて有意に
高いレベルの感染防御が誘導されることと定義される。
一般には、ＩＬＴＶワクチンにより誘導される防御は、
例えば実施例３に記載のとおりに死亡率および呼吸器疾
患の臨床的徴候を測定することによりアッセイされる。
然変異体（すなわち、ワクチン接種されたトリにおいて
ビルレントウイルスによる攻撃に対する感染防御誘導量
の前記の免疫化ＩＬＴＶ突然変異体）を該有効成分とし
て含む。本発明においては、感染防御は、ワクチン接種
後のトリ群において、非ワクチン接種群と比べて有意に
高いレベルの感染防御が誘導されることと定義される。
一般には、ＩＬＴＶワクチンにより誘導される防御は、
例えば実施例３に記載のとおりに死亡率および呼吸器疾
患の臨床的徴候を測定することによりアッセイされる。
【００４７】典型的には、本発明の生ワクチンは、１０
１〜１０７ ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／
動物の用量、好ましくは１０２〜１０５ ＴＣＩＤ５０
の用量で投与することができる。不活化ワクチンは、１
０３〜１０９ ＴＣＩＤ５０／動物の抗原相当量を含有
しうる。
１〜１０７ ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／
動物の用量、好ましくは１０２〜１０５ ＴＣＩＤ５０
の用量で投与することができる。不活化ワクチンは、１
０３〜１０９ ＴＣＩＤ５０／動物の抗原相当量を含有
しうる。
【００４８】不活化ワクチンは、通常、非経口的に、例
えば筋肉内または皮下に投与する。
えば筋肉内または皮下に投与する。
【００４９】本発明のＩＬＴＶワクチンはニワトリにお
いて有効に使用することができるが、他の家禽にも該
（ベクター）ワクチンで成功裡にワクチン接種すること
ができる。ニワトリには、ブロイラー、繁殖鶏および産
卵ストックが含まれる。
いて有効に使用することができるが、他の家禽にも該
（ベクター）ワクチンで成功裡にワクチン接種すること
ができる。ニワトリには、ブロイラー、繁殖鶏および産
卵ストックが含まれる。
【００５０】本発明の生または不活化ワクチンを投与す
る動物の年齢は、通常の生または不活化ＩＬＴＶワクチ
ンを投与する動物の年齢と同じである。例えば、４週齢
またはそれより早期に（緊急の場合）、ニワトリにワク
チン接種することができる。種禽および繁殖鶏には、通
常、８〜１６週齢で第２ワクチン接種を行う。
る動物の年齢は、通常の生または不活化ＩＬＴＶワクチ
ンを投与する動物の年齢と同じである。例えば、４週齢
またはそれより早期に（緊急の場合）、ニワトリにワク
チン接種することができる。種禽および繁殖鶏には、通
常、８〜１６週齢で第２ワクチン接種を行う。
【００５１】本発明はまた、家禽に対して感染性の他の
病原体に由来する１以上のワクチン抗原（例えば、生ま
たは不活化ワクチンウイルスまたは細菌）を該ＩＬＴＶ
突然変異体と共に含む混合ワクチンを含む。好ましく
は、該混合ワクチンは更に、ＡＩＶ、ＭＤＶ、ＨＶＴ、
ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＴＲＴＶ、レオウイルス、大腸菌、Ｏ
ＲＴ、サルモネラ種、カンピロバクター種、マイコプラ
ズマまたはアイメリア種のワクチン株の１以上を含む。
病原体に由来する１以上のワクチン抗原（例えば、生ま
たは不活化ワクチンウイルスまたは細菌）を該ＩＬＴＶ
突然変異体と共に含む混合ワクチンを含む。好ましく
は、該混合ワクチンは更に、ＡＩＶ、ＭＤＶ、ＨＶＴ、
ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＴＲＴＶ、レオウイルス、大腸菌、Ｏ
ＲＴ、サルモネラ種、カンピロバクター種、マイコプラ
ズマまたはアイメリア種のワクチン株の１以上を含む。
【００５２】
【実施例】実施例１ＩＬＴＶ ＵＬ０欠失および挿入突然変異体の製造 ＩＬＴＶ ＵＬ０遺伝子配列の欠失およびレポーター遺
伝子の挿入のための導入プラスミドの構築。初代ニワト
リ胚腎（ＣＥＫ）細胞に感染したＩＬＴＶ株Ａ４８９か
ら、Ｎ−ラウロイルサルコシナート、ＲＮアーゼおよび
プロナーゼ処理での細胞溶解、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを単離した（Ｆｕ
ｃｈｓおよびＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．７７：２２２１−２２２９，１９９６）。
種々の制限エンドヌクレアーゼで消化後、得られたＩＬ
ＴＶ ＤＮＡ断片を、商業的に入手可能なプラスミドベ
クター内にクローニングした。プラスミドｐＩＬＴ−Ｅ
４３（図１Ａ）は、ｐＢＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）中に病原性ＩＬＴＶ株の１１２９８ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ断片Ｂを含有する。該クローン化ＤＮＡ断片は、スプ
ライシングされたｍＲＮＡから発現されることが示され
た（Ｚｉｅｍａｎｎら，前掲，１９９８）特異ＩＬＴＶ
遺伝子ＵＬ０およびＵＬ［−１］を含む。
伝子の挿入のための導入プラスミドの構築。初代ニワト
リ胚腎（ＣＥＫ）細胞に感染したＩＬＴＶ株Ａ４８９か
ら、Ｎ−ラウロイルサルコシナート、ＲＮアーゼおよび
プロナーゼ処理での細胞溶解、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを単離した（Ｆｕ
ｃｈｓおよびＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．７７：２２２１−２２２９，１９９６）。
種々の制限エンドヌクレアーゼで消化後、得られたＩＬ
ＴＶ ＤＮＡ断片を、商業的に入手可能なプラスミドベ
クター内にクローニングした。プラスミドｐＩＬＴ−Ｅ
４３（図１Ａ）は、ｐＢＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）中に病原性ＩＬＴＶ株の１１２９８ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ断片Ｂを含有する。該クローン化ＤＮＡ断片は、スプ
ライシングされたｍＲＮＡから発現されることが示され
た（Ｚｉｅｍａｎｎら，前掲，１９９８）特異ＩＬＴＶ
遺伝子ＵＬ０およびＵＬ［−１］を含む。
【００５３】いくつかのレポーター遺伝子プラスミドを
構築し、ＩＬＴＶ ＵＬ０遺伝子の欠失のために使用し
た。β−ガラクトシダーゼの発現には（図１Ｂ）、仮性
狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ遺伝子プロモーター（Ｍ
ｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒおよびＲａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０，５５−６６，１９９０）の
制御下で大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含有する３．５ｋｂｐ
のＳａＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＰＴ−１８（Ｒｏｃ
ｈｅ）に再クローニングした。さらに、ｐＣＨ１１０
（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に由来する
４５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片による該イン
サートの３’部分の置換により、ＳＶ４０ポリアデニル
化シグナルが与えられた。得られたベクターｐＳＰＴ−
１８Ｚ＋（図１Ｂ）を、該レポーター遺伝子の両端にお
けるＩＬＴＶ−ＤＮＡ配列の挿入により修飾した。つい
で９４４ｂｐのＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片および２２２３
ｂｐのＫｎｐＩ−ＳｓｐＩ断片を、それぞれＰｓｔＩお
よびＳａｌＩ、またはＳｍａＩおよびＫｐｎＩで消化さ
れたｐＳＰＴ−１８Ｚ＋内にｐＩＬＴ−Ｅ４３から再ク
ローニングした。連結前に、不適合性付着末端をクレノ
ウポリメラーゼでの処理により平滑化した。したがっ
て、得られた導入プラスミドｐΔＵＬ０−Ｚ（図１Ｂ）
はＵＬ０オープンリーディングフレーム内に５４６ｂｐ
の欠失を示し、損なわれたＩＬＴＶ遺伝子と平行の配向
でＬａｃＺ発現カセットを含有する。
構築し、ＩＬＴＶ ＵＬ０遺伝子の欠失のために使用し
た。β−ガラクトシダーゼの発現には（図１Ｂ）、仮性
狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ遺伝子プロモーター（Ｍ
ｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒおよびＲａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０，５５−６６，１９９０）の
制御下で大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含有する３．５ｋｂｐ
のＳａＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＰＴ−１８（Ｒｏｃ
ｈｅ）に再クローニングした。さらに、ｐＣＨ１１０
（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に由来する
４５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片による該イン
サートの３’部分の置換により、ＳＶ４０ポリアデニル
化シグナルが与えられた。得られたベクターｐＳＰＴ−
１８Ｚ＋（図１Ｂ）を、該レポーター遺伝子の両端にお
けるＩＬＴＶ−ＤＮＡ配列の挿入により修飾した。つい
で９４４ｂｐのＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片および２２２３
ｂｐのＫｎｐＩ−ＳｓｐＩ断片を、それぞれＰｓｔＩお
よびＳａｌＩ、またはＳｍａＩおよびＫｐｎＩで消化さ
れたｐＳＰＴ−１８Ｚ＋内にｐＩＬＴ−Ｅ４３から再ク
ローニングした。連結前に、不適合性付着末端をクレノ
ウポリメラーゼでの処理により平滑化した。したがっ
て、得られた導入プラスミドｐΔＵＬ０−Ｚ（図１Ｂ）
はＵＬ０オープンリーディングフレーム内に５４６ｂｐ
の欠失を示し、損なわれたＩＬＴＶ遺伝子と平行の配向
でＬａｃＺ発現カセットを含有する。
【００５４】増加したグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦ
Ｐ）の発現に使用する全ての構築物をｐＥＧＦＰ−Ｎ１
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から誘導した。このプラスミドか
ら、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモータ
ー（ＰＨＣＭＶ−ＩＥ）とＥＧＦＰオープンリーディン
グフレームとの間のマルチクローニング部位をＢｇｌＩ
ＩおよびＢａｍＨＩでの二重消化により除去し、ついで
連結した。ｐＢ１−ＧＦＰ（図１Ｃ）を得るために、該
修飾発現カセットを１５８１ｂｐのＡｓｅＩ−ＡｆｌＩ
Ｉ断片として切り出し、クレノウポリメラーゼで処理
し、ＳｍａＩで消化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリン
カー領域内に挿入した。ついでｐＩＬＴ−Ｅ４３の３０
０３ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢｓｒＢＩおよび１８１８ｂｐ
のＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＢａｍＨＩおよびＡｆｌ
ＩＩ、またはＣｌａＩおよびＸｈｏＩで二重消化された
ｐＢｌ−ＧＦＰ内に挿入することにより、導入プラスミ
ドｐΔＵＬ０−Ｇ１（図１Ｃ）を作製した。該予備形成
欠失体は、全イントロン配列を含む９８４ｂｐのＩＬＴ
Ｖ ＵＬ０遺伝子を含み、該レポーター遺伝子挿入体
は、この場合にも、該欠失ウイルス遺伝子と平行の配向
で存在する。
Ｐ）の発現に使用する全ての構築物をｐＥＧＦＰ−Ｎ１
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から誘導した。このプラスミドか
ら、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモータ
ー（ＰＨＣＭＶ−ＩＥ）とＥＧＦＰオープンリーディン
グフレームとの間のマルチクローニング部位をＢｇｌＩ
ＩおよびＢａｍＨＩでの二重消化により除去し、ついで
連結した。ｐＢ１−ＧＦＰ（図１Ｃ）を得るために、該
修飾発現カセットを１５８１ｂｐのＡｓｅＩ−ＡｆｌＩ
Ｉ断片として切り出し、クレノウポリメラーゼで処理
し、ＳｍａＩで消化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリン
カー領域内に挿入した。ついでｐＩＬＴ−Ｅ４３の３０
０３ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢｓｒＢＩおよび１８１８ｂｐ
のＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＢａｍＨＩおよびＡｆｌ
ＩＩ、またはＣｌａＩおよびＸｈｏＩで二重消化された
ｐＢｌ−ＧＦＰ内に挿入することにより、導入プラスミ
ドｐΔＵＬ０−Ｇ１（図１Ｃ）を作製した。該予備形成
欠失体は、全イントロン配列を含む９８４ｂｐのＩＬＴ
Ｖ ＵＬ０遺伝子を含み、該レポーター遺伝子挿入体
は、この場合にも、該欠失ウイルス遺伝子と平行の配向
で存在する。
【００５５】従来の研究はＩＬＴＶ感染細胞内でのＵＬ
０タンパク質の豊富な発現を示していたため、外来遺伝
子発現に対する該ＵＬ０遺伝子プロモーターの適合性を
試験した。ついで、望ましくない制限部位を除去するた
めに、ｐＩＬＴ−Ｅ４３のインサートを、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢｓｔＸＩおよびＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩでの二重消
化ならびにそれに続くクレノウ処理および連結により短
縮化した。得られたプラスミドｐＩＬＴ−Ｅ４３ＢＸ
（図１Ｄ）から、ＵＬ０の開始コドンを含む１１４１ｂ
ｐのＸｂａＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を除去し、いずれのプ
ロモーター配列をも伴わないでＥＧＦＰオープンリーデ
ィングフレームを含有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）の８０２ｂｐのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ断片で
置換した。ｐΔＵＬ０−Ｇ２においては、ウイルスＵＬ
０リーディングフレームの主要部分をＥＧＦＰのもので
置換したが、同時に構築したプラスミドｐΔＵＬ０は、
同じ欠失を示すが、外来ＤＮＡ配列を含有しない（図１
Ｄ）。
０タンパク質の豊富な発現を示していたため、外来遺伝
子発現に対する該ＵＬ０遺伝子プロモーターの適合性を
試験した。ついで、望ましくない制限部位を除去するた
めに、ｐＩＬＴ−Ｅ４３のインサートを、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢｓｔＸＩおよびＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩでの二重消
化ならびにそれに続くクレノウ処理および連結により短
縮化した。得られたプラスミドｐＩＬＴ−Ｅ４３ＢＸ
（図１Ｄ）から、ＵＬ０の開始コドンを含む１１４１ｂ
ｐのＸｂａＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を除去し、いずれのプ
ロモーター配列をも伴わないでＥＧＦＰオープンリーデ
ィングフレームを含有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）の８０２ｂｐのＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ断片で
置換した。ｐΔＵＬ０−Ｇ２においては、ウイルスＵＬ
０リーディングフレームの主要部分をＥＧＦＰのもので
置換したが、同時に構築したプラスミドｐΔＵＬ０は、
同じ欠失を示すが、外来ＤＮＡ配列を含有しない（図１
Ｄ）。
【００５６】導入プラスミドおよびＡＩＶ ＨＡ発現Ｉ
ＬＴＶ突然変異体の構築最近単離された高い病原性（高
病原性）のＨ５Ｎ２サブタイプＡＩＶ Ａ／Ｉｔａｌｙ
／８／９８の血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を逆転写させ、
真核性発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）内にクローニングし、配列決定した（Ｌｕｓｃｈｏ
ｗら，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐ．４２４９−
４２５９，２００１，およびＧｅｎＢａｎｋアクセッシ
ョン番号ＡＪ３０５３０６）。得られた発現プラスミド
ｐＣＤ−ＨＡ５から、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターと共
にＨＡ遺伝子を、２６４６ｂｐのＮｒｕＩ／ＮｏｔＩ断
片として、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで二重消化されたプラ
スミドｐΔＵＬ０−Ｇ２内に一本鎖突出部のクレノウ追
加後に挿入した。得られたプラスミドｐΔＵＬ０−ＨＡ
５Ａにおいては、ＥＧＦＰリーディングフレームはＨＡ
発現カセット（これは、ＵＬ０、ＵＬ１およびＵＬ２の
共通のポリアデニル化シグナルを利用するためにＵＬ０
と平行の配向で存在する）により置換されている。最後
に、該ＨＣＭＶ−プロモーターを、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｈｏＩでの消化、クレノウ処理および再連結により除去
した。したがって、今や、プラスミドｐΔＵＬ０−ＨＡ
５Ｂから、ＩＬＴＶ ＵＬ０遺伝子プロモーターの制御
下で血球凝集素が発現されうる。
ＬＴＶ突然変異体の構築最近単離された高い病原性（高
病原性）のＨ５Ｎ２サブタイプＡＩＶ Ａ／Ｉｔａｌｙ
／８／９８の血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を逆転写させ、
真核性発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）内にクローニングし、配列決定した（Ｌｕｓｃｈｏ
ｗら，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐ．４２４９−
４２５９，２００１，およびＧｅｎＢａｎｋアクセッシ
ョン番号ＡＪ３０５３０６）。得られた発現プラスミド
ｐＣＤ−ＨＡ５から、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターと共
にＨＡ遺伝子を、２６４６ｂｐのＮｒｕＩ／ＮｏｔＩ断
片として、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで二重消化されたプラ
スミドｐΔＵＬ０−Ｇ２内に一本鎖突出部のクレノウ追
加後に挿入した。得られたプラスミドｐΔＵＬ０−ＨＡ
５Ａにおいては、ＥＧＦＰリーディングフレームはＨＡ
発現カセット（これは、ＵＬ０、ＵＬ１およびＵＬ２の
共通のポリアデニル化シグナルを利用するためにＵＬ０
と平行の配向で存在する）により置換されている。最後
に、該ＨＣＭＶ−プロモーターを、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｈｏＩでの消化、クレノウ処理および再連結により除去
した。したがって、今や、プラスミドｐΔＵＬ０−ＨＡ
５Ｂから、ＩＬＴＶ ＵＬ０遺伝子プロモーターの制御
下で血球凝集素が発現されうる。
【００５７】第２のアプローチにおいては、高病原性Ｈ
７Ｎ１サブタイプＡＩＶ Ａ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９
９のＨＡ遺伝子を逆転写させ、ＰＣＲにより増幅した。
１７１１ｂｐの産物を、ＳｍａＩで消化されたベクター
ｐＵＣ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ）内にクローニングし、
配列決定した（配列番号１）。得られたプラスミドをＸ
ｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、クレノウ処
理後、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターを、ｐｃＤＮＡ３の
６８１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｒｕＩ断片として、Ｈ
Ａオープンリーディングフレームの５’末端に挿入し
た。ついで該ＨＡ発現カセットを、２４３７ｂｐのＫｐ
ｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、Ｘｂａ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ二重消化プラスミドｐΔＵＬ０−Ｇ２内に不適合性
一本鎖突出部の平滑化後に再クローニングした。最終的
に得られたプラスミドｐΔＵＬ０−ＨＡ７（図１Ｅ）
は、ＩＬＴＶの欠失ＵＬ０オープンリーディングフレー
ムと平行の配向でＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下
でＨ７型ＨＡ遺伝子を含有する。
７Ｎ１サブタイプＡＩＶ Ａ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９
９のＨＡ遺伝子を逆転写させ、ＰＣＲにより増幅した。
１７１１ｂｐの産物を、ＳｍａＩで消化されたベクター
ｐＵＣ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ）内にクローニングし、
配列決定した（配列番号１）。得られたプラスミドをＸ
ｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、クレノウ処
理後、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターを、ｐｃＤＮＡ３の
６８１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｒｕＩ断片として、Ｈ
Ａオープンリーディングフレームの５’末端に挿入し
た。ついで該ＨＡ発現カセットを、２４３７ｂｐのＫｐ
ｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、Ｘｂａ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ二重消化プラスミドｐΔＵＬ０−Ｇ２内に不適合性
一本鎖突出部の平滑化後に再クローニングした。最終的
に得られたプラスミドｐΔＵＬ０−ＨＡ７（図１Ｅ）
は、ＩＬＴＶの欠失ＵＬ０オープンリーディングフレー
ムと平行の配向でＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下
でＨ７型ＨＡ遺伝子を含有する。
【００５８】それらの３つの導入プラスミド（図１Ｅ）
を、所望の非蛍光ＩＬＴＶ組換え体の選択を促進するＩ
ＬＴＶ ｐΔＵＬ０−Ｇ１のウイルスＤＮＡと共に、細
胞のコトランスフェクションに使用した。
を、所望の非蛍光ＩＬＴＶ組換え体の選択を促進するＩ
ＬＴＶ ｐΔＵＬ０−Ｇ１のウイルスＤＮＡと共に、細
胞のコトランスフェクションに使用した。
【００５９】組換えＩＬＴＶ ＵＬ０突然変異体の作製 トランスフェクトされたＣＥＫまたはニワトリ肝細胞癌
細胞における単離されたＩＬＴＶ ＤＮＡの感染性は非
常に低いため、ウイルストランスアクチベーターの発現
プラスミドを作製した。その目的のために、アルファヘ
ルペスウイルストランスアクチベーターの推定ホモログ
（ＶＰ１６，αＴＩＦ；ＲｏｉｚｍａｎおよびＳｅａｒ
ｓ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第３版：２２３
１−２２９５，１９９６）をコードするＩＬＴＶのＵＬ
４８オープンリーディングフレーム（Ｚｉｅｍａｎｎ
ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：８４７−８５２，１
９９８）を、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下で構
成的遺伝子発現を可能にするｐＲｃ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）内に２２５９ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｅＩ
断片として再クローニングした。ＩＬＴＶ−ＤＮＡおよ
び発現プラスミドｐＲｃ−ＵＬ４８での細胞のリン酸カ
ルシウムコトランスフェクション（Ｇｒａｈａｍおよび
ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５
６−４６７，１９７３）の後、ウイルスプラーク数は、
対照プラスミドで得られた又はいずれのプラスミドも使
用しないで得られた結果（Ｆｕｃｈｓら，２０００，前
掲）と比較して実質的に増加した。
細胞における単離されたＩＬＴＶ ＤＮＡの感染性は非
常に低いため、ウイルストランスアクチベーターの発現
プラスミドを作製した。その目的のために、アルファヘ
ルペスウイルストランスアクチベーターの推定ホモログ
（ＶＰ１６，αＴＩＦ；ＲｏｉｚｍａｎおよびＳｅａｒ
ｓ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第３版：２２３
１−２２９５，１９９６）をコードするＩＬＴＶのＵＬ
４８オープンリーディングフレーム（Ｚｉｅｍａｎｎ
ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：８４７−８５２，１
９９８）を、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下で構
成的遺伝子発現を可能にするｐＲｃ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）内に２２５９ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｅＩ
断片として再クローニングした。ＩＬＴＶ−ＤＮＡおよ
び発現プラスミドｐＲｃ−ＵＬ４８での細胞のリン酸カ
ルシウムコトランスフェクション（Ｇｒａｈａｍおよび
ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５
６−４６７，１９７３）の後、ウイルスプラーク数は、
対照プラスミドで得られた又はいずれのプラスミドも使
用しないで得られた結果（Ｆｕｃｈｓら，２０００，前
掲）と比較して実質的に増加した。
【００６０】ウイルス組換え体の作製のために、ＣＥＫ
またはＬＭＨ細胞をＩＬＴＶ ＤＮＡ、ｐＲｃ−ＵＬ４
８および所望の導入プラスミドでコトランスフェクトし
た。５〜７日後、該細胞を培地内に擦り取り、凍結およ
び融解により細胞溶解した。９６ウェルプレート内で増
殖させたＣＥＫ細胞上での限界希釈により、ウイルス後
代を分析した。ＥＧＦＰを発現するＩＬＴＶ組換え体は
蛍光顕微鏡検査により直接的に同定することができた
が、β−ガラクトシダーゼ活性は、３００μｇ／ｍｌ
ＢｌｕｏＧａｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含有する培地
でのインビボ染色により検出した。ウイルス組換え体を
回収し、予想された表現型を全てのプラークが示すまで
精製を繰返した。最後に、ウイルスＤＮＡを調製し、制
限分析、サザンブロットハイブリダイゼーションおよび
ＰＣＲにより特定して、正しい欠失または挿入を確認し
た。
またはＬＭＨ細胞をＩＬＴＶ ＤＮＡ、ｐＲｃ−ＵＬ４
８および所望の導入プラスミドでコトランスフェクトし
た。５〜７日後、該細胞を培地内に擦り取り、凍結およ
び融解により細胞溶解した。９６ウェルプレート内で増
殖させたＣＥＫ細胞上での限界希釈により、ウイルス後
代を分析した。ＥＧＦＰを発現するＩＬＴＶ組換え体は
蛍光顕微鏡検査により直接的に同定することができた
が、β−ガラクトシダーゼ活性は、３００μｇ／ｍｌ
ＢｌｕｏＧａｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含有する培地
でのインビボ染色により検出した。ウイルス組換え体を
回収し、予想された表現型を全てのプラークが示すまで
精製を繰返した。最後に、ウイルスＤＮＡを調製し、制
限分析、サザンブロットハイブリダイゼーションおよび
ＰＣＲにより特定して、正しい欠失または挿入を確認し
た。
【００６１】病原性野生型株のウイルスＤＮＡをコトラ
ンスフェクションに使用して、ＩＬＴＶ組換え体ΔＵＬ
０−Ｚ、ΔＵＬ０−Ｇ１およびΔＵＬ０−Ｇ２（図１
Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ）を得た。レスキュー突然変異体
（ＩＬＴＶ ＵＬ０Ｒ；図１Ａ）、外来配列を有さない
欠失突然変異体（ＩＬＴＶ ΔＵＬ０；図１Ｄ）、およ
びＨＡ発現組換え体（ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ５Ａ、
ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ５Ｂ、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−
ＨＡ７；図１Ｅ）の作製のために、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０
−Ｇ１、およびｐＩＬＴ−Ｅ４３、またはΔＵＬ０、ま
たはΔＵＬ０−Ｇ２のそれぞれの誘導体のＤＮＡでコト
ランスフェクションを行った。これらの場合には、該ウ
イルス後代をＣＥＫ細胞上で非蛍光プラークに関してス
クリーニングした。
ンスフェクションに使用して、ＩＬＴＶ組換え体ΔＵＬ
０−Ｚ、ΔＵＬ０−Ｇ１およびΔＵＬ０−Ｇ２（図１
Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ）を得た。レスキュー突然変異体
（ＩＬＴＶ ＵＬ０Ｒ；図１Ａ）、外来配列を有さない
欠失突然変異体（ＩＬＴＶ ΔＵＬ０；図１Ｄ）、およ
びＨＡ発現組換え体（ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ５Ａ、
ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ５Ｂ、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−
ＨＡ７；図１Ｅ）の作製のために、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０
−Ｇ１、およびｐＩＬＴ−Ｅ４３、またはΔＵＬ０、ま
たはΔＵＬ０−Ｇ２のそれぞれの誘導体のＤＮＡでコト
ランスフェクションを行った。これらの場合には、該ウ
イルス後代をＣＥＫ細胞上で非蛍光プラークに関してス
クリーニングした。
【００６２】組換えＩＬＴＶ ＵＬ０突然変異体のイン
ビトロでの特定 ＩＬＴＶの単離されたＵＬ−欠失突然変異体が天然ＵＬ
０遺伝子産物を発現しないことを確認するために、ＣＥ
Ｋ細胞にそれぞれの欠失突然変異体を５ｐｆｕ／細胞の
ｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、それを３７℃で２４時間イン
キュベートした。ついで、標準的な技術に従い、該細胞
を細胞溶解し、タンパク質を不連続ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルター
に転移した。ウエスタンブロットを、記載のとおりに
（ＦｕｃｈｓおよびＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２１７３−２１８２，１９９
９）、ＵＬ０特異的ウサギ抗血清（Ｚｉｅｍａｎｎら，
前掲，１９９８）またはモノクローナルｇＣ特異的抗体
と共にインキュベートし加工した。すべてのレーンがＭ
ｏａｂとの反応を示したが、野生型ウイルスまたはＵＬ
０レスキュー突然変異体感染細胞においてのみ、６３ｋ
ＤａのＵＬ０タンパク質が検出可能であった（図２）。
該ＵＬ０欠失突然変異体のいずれかが、該遺伝子の非欠
失部分から、より小さなタンパク質を安定に発現したと
いう証拠は認められなかった。ＡＩＶサブタイプ特異的
ニワトリ抗血清での感染細胞ライセートのウエスタンブ
ロット分析は更に、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ７による
Ｈ７型血球凝集素の、およびＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ
５ＡによるＨ５型血球凝集素の、豊富な発現を証明した
が、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ５Ｂに感染した細胞にお
いては、該外来タンパク質は明らかには検出可能でなか
った。
ビトロでの特定 ＩＬＴＶの単離されたＵＬ−欠失突然変異体が天然ＵＬ
０遺伝子産物を発現しないことを確認するために、ＣＥ
Ｋ細胞にそれぞれの欠失突然変異体を５ｐｆｕ／細胞の
ｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、それを３７℃で２４時間イン
キュベートした。ついで、標準的な技術に従い、該細胞
を細胞溶解し、タンパク質を不連続ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルター
に転移した。ウエスタンブロットを、記載のとおりに
（ＦｕｃｈｓおよびＭｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２１７３−２１８２，１９９
９）、ＵＬ０特異的ウサギ抗血清（Ｚｉｅｍａｎｎら，
前掲，１９９８）またはモノクローナルｇＣ特異的抗体
と共にインキュベートし加工した。すべてのレーンがＭ
ｏａｂとの反応を示したが、野生型ウイルスまたはＵＬ
０レスキュー突然変異体感染細胞においてのみ、６３ｋ
ＤａのＵＬ０タンパク質が検出可能であった（図２）。
該ＵＬ０欠失突然変異体のいずれかが、該遺伝子の非欠
失部分から、より小さなタンパク質を安定に発現したと
いう証拠は認められなかった。ＡＩＶサブタイプ特異的
ニワトリ抗血清での感染細胞ライセートのウエスタンブ
ロット分析は更に、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ７による
Ｈ７型血球凝集素の、およびＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ
５ＡによるＨ５型血球凝集素の、豊富な発現を証明した
が、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ５Ｂに感染した細胞にお
いては、該外来タンパク質は明らかには検出可能でなか
った。
【００６３】実施例２ＩＬＴＶ ＵＬ０突然変異体の培養および力価測定 組換え体および対照ＩＬＴウイルスの製造は、当業者に
おいて公知の技術を用いる９〜１１日齢の孵化ＳＰＦ鶏
卵の排泄（ｄｒｏｐｐｅｄ）漿尿膜（ＣＡＭ）上への接
種により行った。３７℃で５〜６日間のインキュベーシ
ョンの後、該ＣＡＭを回収し、ホモジナイズし、１００
μｍ フィルター濾過し、力価測定した。
おいて公知の技術を用いる９〜１１日齢の孵化ＳＰＦ鶏
卵の排泄（ｄｒｏｐｐｅｄ）漿尿膜（ＣＡＭ）上への接
種により行った。３７℃で５〜６日間のインキュベーシ
ョンの後、該ＣＡＭを回収し、ホモジナイズし、１００
μｍ フィルター濾過し、力価測定した。
【００６４】ＬＭＨ細胞における該ウイルスの力価測定
は、Ｌｅｇｈｏｒｎ雄肝細胞癌細胞（ＬＭＨ）上で行っ
た。９６ウェルプレート内で、ＬＭＨ細胞の半コンフル
エントな単層にＩＬＴウイルスサンプルの段階希釈物を
感染させた。適当な陽性および陰性対照を含めた。該プ
レートを５日間インキュベートし、該細胞を氷冷エタノ
ールで固定し、ＦＩＴＣと共役した抗ニワトリＩｇＧヤ
ギ抗体およびＩＬＴに対するポリクローナルニワトリ抗
血清を使用する標準的な免疫蛍光プロトコールにより、
ＩＬＴウイルスの存在に関して染色した。ＩＬＴウイル
スが複製されている明るい緑色の蛍光を示すウェルは陽
性とみなされる。力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂ
ｅｒアルゴリズムを使用してＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０
値として示されている。
は、Ｌｅｇｈｏｒｎ雄肝細胞癌細胞（ＬＭＨ）上で行っ
た。９６ウェルプレート内で、ＬＭＨ細胞の半コンフル
エントな単層にＩＬＴウイルスサンプルの段階希釈物を
感染させた。適当な陽性および陰性対照を含めた。該プ
レートを５日間インキュベートし、該細胞を氷冷エタノ
ールで固定し、ＦＩＴＣと共役した抗ニワトリＩｇＧヤ
ギ抗体およびＩＬＴに対するポリクローナルニワトリ抗
血清を使用する標準的な免疫蛍光プロトコールにより、
ＩＬＴウイルスの存在に関して染色した。ＩＬＴウイル
スが複製されている明るい緑色の蛍光を示すウェルは陽
性とみなされる。力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂ
ｅｒアルゴリズムを使用してＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０
値として示されている。
【００６５】組換えＩＬＴＶが大量投与のためのワクチ
ンとして適用可能であるためには、良好な増殖収量が不
可欠であるため、適用される遺伝子欠失は、それが高い
力価にまで増殖する能力を損なうものであるべきではな
い。ΔＵＬ０のほかに、対応する遺伝子産物の不存在を
もたらす遺伝子欠失を保持するいくつかの更なるＩＬＴ
組換え体が構築されており、これらは全て、ＣＡＭホモ
ジネートからウイルスを産生させるために受精卵内に接
種されている。ある組換え体に可能な最大収量を得るた
めに、いくつかのインキュベーションおよび回収を行っ
た。驚くべきことに、該ＵＬ０欠失は、未欠失野生型親
ウイルスの収量と少なくとも同程度に良好な力価までの
卵内での複製を可能にするが、その他のＩＬＴＶ欠失組
換え体は、それよりはるかに低いか又は検出不可能なウ
イルス収量を与える。この好ましい能力は、ＬａｃＺま
たはＡＩＶ Ｈ７の遺伝子が挿入された場合に維持され
る。表１を参照されたい。
ンとして適用可能であるためには、良好な増殖収量が不
可欠であるため、適用される遺伝子欠失は、それが高い
力価にまで増殖する能力を損なうものであるべきではな
い。ΔＵＬ０のほかに、対応する遺伝子産物の不存在を
もたらす遺伝子欠失を保持するいくつかの更なるＩＬＴ
組換え体が構築されており、これらは全て、ＣＡＭホモ
ジネートからウイルスを産生させるために受精卵内に接
種されている。ある組換え体に可能な最大収量を得るた
めに、いくつかのインキュベーションおよび回収を行っ
た。驚くべきことに、該ＵＬ０欠失は、未欠失野生型親
ウイルスの収量と少なくとも同程度に良好な力価までの
卵内での複製を可能にするが、その他のＩＬＴＶ欠失組
換え体は、それよりはるかに低いか又は検出不可能なウ
イルス収量を与える。この好ましい能力は、ＬａｃＺま
たはＡＩＶ Ｈ７の遺伝子が挿入された場合に維持され
る。表１を参照されたい。
【００６６】
【表１】
【００６７】実施例３ＩＬＴＶ ＵＬ０突然変異体の弱毒化を測定するための
動物試験 該ＵＬ０遺伝子内の欠失／挿入の導入により得られた弱
毒化のレベルを評価するために、動物実験を行った。Ｉ
ＬＴＶに関するこの目的のための標準試験は、感受性ニ
ワトリの気管内にウイルスサンプルを直接接種し、臨床
的徴候のレベルまたは死亡動物数を９〜１０日間にわた
り観察するというものである。比較として、突然変異し
たウイルスＤＮＡの供与体として働くビルレント野生型
ＩＬＴ株Ａ４８９のウイルスサンプル（ホモジナイズし
濾過したＣＡＭ）、および模擬感染ＣＡＭからの同様の
サンプルを調製した。ＩＬＴ感染における病状は、投与
量と直接的に関連するため、種々の用量を試験すること
が重要である。
動物試験 該ＵＬ０遺伝子内の欠失／挿入の導入により得られた弱
毒化のレベルを評価するために、動物実験を行った。Ｉ
ＬＴＶに関するこの目的のための標準試験は、感受性ニ
ワトリの気管内にウイルスサンプルを直接接種し、臨床
的徴候のレベルまたは死亡動物数を９〜１０日間にわた
り観察するというものである。比較として、突然変異し
たウイルスＤＮＡの供与体として働くビルレント野生型
ＩＬＴ株Ａ４８９のウイルスサンプル（ホモジナイズし
濾過したＣＡＭ）、および模擬感染ＣＡＭからの同様の
サンプルを調製した。ＩＬＴ感染における病状は、投与
量と直接的に関連するため、種々の用量を試験すること
が重要である。
【００６８】したがって、ウイルスサンプルを増幅し、
前記のとおりにＬＭＨ細胞上で三重に力価測定し、１０
日齢ＳＰＦひなニワトリへの気管内経路の０．２ｍｌ／
動物での接種に使用した。異なる処理群は、２０個の動
物の群として、負圧隔離装置内に個々に収容した。該ひ
なニワトリを９日間観察し、呼吸器疾患に関連した臨床
的徴候を、以下の表に従い毎日評価した。
前記のとおりにＬＭＨ細胞上で三重に力価測定し、１０
日齢ＳＰＦひなニワトリへの気管内経路の０．２ｍｌ／
動物での接種に使用した。異なる処理群は、２０個の動
物の群として、負圧隔離装置内に個々に収容した。該ひ
なニワトリを９日間観察し、呼吸器疾患に関連した臨床
的徴候を、以下の表に従い毎日評価した。
【００６９】スコア０：（呼吸器）疾患の徴候が無い。 スコア１：軽度の呼吸困難；動物は鈍く、元気がなく、
若干の咳をし、頭を振る。 スコア２：重度の呼吸困難；あえぎ、ポンプ呼吸、咳、
動物は横臥、結膜炎、鼻滲出。 スコア３：動物は死亡。
若干の咳をし、頭を振る。 スコア２：重度の呼吸困難；あえぎ、ポンプ呼吸、咳、
動物は横臥、結膜炎、鼻滲出。 スコア３：動物は死亡。
【００７０】実験方法１においては、ΔＵＬ０＋Ｚを未
感染ＣＡＭおよびＡ４８９感染ＣＡＭと比較した。ΔＵ
Ｌ０＋Ｚを２つの用量で試験した。
感染ＣＡＭおよびＡ４８９感染ＣＡＭと比較した。ΔＵ
Ｌ０＋Ｚを２つの用量で試験した。
【００７１】実験方法２においては、同じ処理プロトコ
ールで、もう一度同じ実験を繰返した。今回は、ΔＵＬ
０組換え体を加え、それに関しても２つの用量で試験し
た。
ールで、もう一度同じ実験を繰返した。今回は、ΔＵＬ
０組換え体を加え、それに関しても２つの用量で試験し
た。
【００７２】最後に、実験方法３において、同様の実験
を行った。今回は、ＵＬ０遺伝子座にＡＩＶ ＨＡ７イ
ンサートを保持する２つの用量の組換えＩＬＴウイルス
を試験した。
を行った。今回は、ＵＬ０遺伝子座にＡＩＶ ＨＡ７イ
ンサートを保持する２つの用量の組換えＩＬＴウイルス
を試験した。
【００７３】結果（表２および図３Ａ〜Ｃに示す）は、
すべてのＵＬ０欠失が、それらが由来する野生型ウイル
スと比較して相当に低い死亡率を誘導することを示して
いる。臨床的徴候の重症度は有意に減少しているが、Δ
ＵＬ０＋ＺおよびΔＵＬ０においては、いくらかの残存
病原性が残っている。該ＡＩＶ Ｈ７インサートの挿入
は更に、これをゼロにまで減少させる。しかし、全３個
の組換え体は、気管内において及びＣＡＭ上への接種に
際して有効に複製する特性を維持している（表１を参照
されたい）。
すべてのＵＬ０欠失が、それらが由来する野生型ウイル
スと比較して相当に低い死亡率を誘導することを示して
いる。臨床的徴候の重症度は有意に減少しているが、Δ
ＵＬ０＋ＺおよびΔＵＬ０においては、いくらかの残存
病原性が残っている。該ＡＩＶ Ｈ７インサートの挿入
は更に、これをゼロにまで減少させる。しかし、全３個
の組換え体は、気管内において及びＣＡＭ上への接種に
際して有効に複製する特性を維持している（表１を参照
されたい）。
【００７４】
【表２】
【００７５】実施例４ビルレントＩＬＴＶおよび高病原性ＡＩＶでの攻撃感染
に対するワクチン接種ニワトリの防御を測定するための
動物実験 生ウイルスワクチンとしての及び他の病原体に対してニ
ワトリを防御しうる外来抗原発現ベクターとしてのＩＬ
ＴＶのＵＬ０欠失突然変異体の適合性を試験するため
に、更に動物実験を行った。その目的のために、１０週
齢ＳＰＦニワトリを、１０３〜１０４プラーク形成単位
（ｐｆｕ）／動物のＩＬＴＶ ΔＵＬ０またはＩＬＴＶ
ΔＵＬ０−ＨＡ７の点眼により免疫した。予想どお
り、免疫後もすべての動物が生存し、それらの少数で、
ＩＬＴの無視しうる臨床的徴候を示した（表３）。免疫
の２週間後、全動物から血清を集め、ＩＬＴＶ特異的お
よびＨＡ特異的抗体に関して調べた。間接免疫蛍光試験
（Ｌｕｓｃｈｏｗら，２００１，前掲）により、ＩＬＴ
Ｖ特異的抗体が、両免疫群のサンプルの７０％以上にお
いて明らかに検出された（表３）。また、ＩＬＴＶ Δ
ＵＬ０−ＨＡ７で免疫した全てのニワトリが、抗原供与
体としてＡＩＶ Ａ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９９（Ｈ７
Ｎ１）を使用する血球凝集抑制試験（ＨＡＩ；Ａｌｅｘ
ａｎｄｅｒ ＤＪ，Ｉｎ：ＯＩＥ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｔｅｓｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１５５−１
６０，１９９６）により示されるとおり、ＨＡ特異的抗
体を産生した（表３）。
に対するワクチン接種ニワトリの防御を測定するための
動物実験 生ウイルスワクチンとしての及び他の病原体に対してニ
ワトリを防御しうる外来抗原発現ベクターとしてのＩＬ
ＴＶのＵＬ０欠失突然変異体の適合性を試験するため
に、更に動物実験を行った。その目的のために、１０週
齢ＳＰＦニワトリを、１０３〜１０４プラーク形成単位
（ｐｆｕ）／動物のＩＬＴＶ ΔＵＬ０またはＩＬＴＶ
ΔＵＬ０−ＨＡ７の点眼により免疫した。予想どお
り、免疫後もすべての動物が生存し、それらの少数で、
ＩＬＴの無視しうる臨床的徴候を示した（表３）。免疫
の２週間後、全動物から血清を集め、ＩＬＴＶ特異的お
よびＨＡ特異的抗体に関して調べた。間接免疫蛍光試験
（Ｌｕｓｃｈｏｗら，２００１，前掲）により、ＩＬＴ
Ｖ特異的抗体が、両免疫群のサンプルの７０％以上にお
いて明らかに検出された（表３）。また、ＩＬＴＶ Δ
ＵＬ０−ＨＡ７で免疫した全てのニワトリが、抗原供与
体としてＡＩＶ Ａ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９９（Ｈ７
Ｎ１）を使用する血球凝集抑制試験（ＨＡＩ；Ａｌｅｘ
ａｎｄｅｒ ＤＪ，Ｉｎ：ＯＩＥ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｔｅｓｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１５５−１
６０，１９９６）により示されるとおり、ＨＡ特異的抗
体を産生した（表３）。
【００７６】２５日後、ワクチン接種ニワトリの亜群
（群１Ａ、２Ａ）および未免疫対照動物（群３）を、２
×１０５ ｐｆｕ／動物のビルレント野生型ＩＬＴＶ
（Ａ４８９）の気管内投与により攻撃した。死亡率およ
びＩＬＴの臨床的徴候をモニターし、前記のとおりに定
量した（実施例３）。各群の全動物の平均臨床スコア
を、感染後２〜１２日間にわたり測定した（表３）。す
べての未免疫対照動物は、４例中２例で死を招く重篤な
疾患徴候を示した。これに対して、すべてのワクチン接
種動物は生存し、それらのほとんどは健康のままであっ
た。これらの結果は、ＩＬＴＶのＵＬ０欠失突然変異体
での生ウイルスワクチン接種が、後のＩＬＴＶ感染に対
する防御免疫を付与することを明らかに示している。
（群１Ａ、２Ａ）および未免疫対照動物（群３）を、２
×１０５ ｐｆｕ／動物のビルレント野生型ＩＬＴＶ
（Ａ４８９）の気管内投与により攻撃した。死亡率およ
びＩＬＴの臨床的徴候をモニターし、前記のとおりに定
量した（実施例３）。各群の全動物の平均臨床スコア
を、感染後２〜１２日間にわたり測定した（表３）。す
べての未免疫対照動物は、４例中２例で死を招く重篤な
疾患徴候を示した。これに対して、すべてのワクチン接
種動物は生存し、それらのほとんどは健康のままであっ
た。これらの結果は、ＩＬＴＶのＵＬ０欠失突然変異体
での生ウイルスワクチン接種が、後のＩＬＴＶ感染に対
する防御免疫を付与することを明らかに示している。
【００７７】ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ７またはＩＬＴ
Ｖ ΔＵＬ０でワクチン接種したニワトリの他の２亜群
（１Ｂ、２Ｂ）を、１０８胚感染量（ＥＩＤ５０）／動
物の高病原性ＡＩＶ分離体Ａ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９
９（Ｈ７Ｎ１）（これは同様に、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−
Ｈ７により発現されるＨＡ遺伝子の供与体である）を鼻
腔内投与により感染させた。未免疫動物（示されていな
い）と同様に、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０でワクチン接種され
た全てのニワトリは、ＡＩＶ感染後４日以内に死亡した
（表３）。これに対して、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ７
で免疫した全ての動物は致死量のＡＩＶ感染後にも生存
し、疾患の重症度は実質的に減少した。トリインフルエ
ンザの臨床的徴候を以下のとおりに個々に評価した。 スコア０：動物は健康。 スコア１：下痢、または水腫、または動物は元気がな
い。 スコア２：動物は横臥し、起き上がることができない。 スコア３：動物は死亡。
Ｖ ΔＵＬ０でワクチン接種したニワトリの他の２亜群
（１Ｂ、２Ｂ）を、１０８胚感染量（ＥＩＤ５０）／動
物の高病原性ＡＩＶ分離体Ａ／Ｉｔａｌｙ／４４５／９
９（Ｈ７Ｎ１）（これは同様に、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−
Ｈ７により発現されるＨＡ遺伝子の供与体である）を鼻
腔内投与により感染させた。未免疫動物（示されていな
い）と同様に、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０でワクチン接種され
た全てのニワトリは、ＡＩＶ感染後４日以内に死亡した
（表３）。これに対して、ＩＬＴＶ ΔＵＬ０−ＨＡ７
で免疫した全ての動物は致死量のＡＩＶ感染後にも生存
し、疾患の重症度は実質的に減少した。トリインフルエ
ンザの臨床的徴候を以下のとおりに個々に評価した。 スコア０：動物は健康。 スコア１：下痢、または水腫、または動物は元気がな
い。 スコア２：動物は横臥し、起き上がることができない。 スコア３：動物は死亡。
【００７８】攻撃後１〜１０日間の各群の平均スコアを
計算した（表３）。ニワトリ胚への気管および排泄腔ス
ワブの接種による測定では（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｄ
Ｊ，前掲，１９９６）、該ワクチン接種動物の多数が該
ＡＩＶウイルスを放出したが、それは、非常に限られた
期間に過ぎなかった。したがって、Ｈ７血球凝集素を発
現するＵＬ０陰性ＩＬＴＶ組換え体でのニワトリへの単
一の生ウイルスワクチン接種は、対応する血清型の高病
原性ＡＩＶにより引き起こされる家禽ペストに対する感
染防御免疫の誘導に十分なものである。
計算した（表３）。ニワトリ胚への気管および排泄腔ス
ワブの接種による測定では（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｄ
Ｊ，前掲，１９９６）、該ワクチン接種動物の多数が該
ＡＩＶウイルスを放出したが、それは、非常に限られた
期間に過ぎなかった。したがって、Ｈ７血球凝集素を発
現するＵＬ０陰性ＩＬＴＶ組換え体でのニワトリへの単
一の生ウイルスワクチン接種は、対応する血清型の高病
原性ＡＩＶにより引き起こされる家禽ペストに対する感
染防御免疫の誘導に十分なものである。
【００７９】
【表３】
【００８０】
【配列表】
【００８１】
【化１】
【図１】ＩＬＴＶゲノムのゲノム地図および導入プラス
ミドの構築。導入プラスミドの作製のための関連制限部
位、異種配列、プロモーターおよびポリＡシグナルが示
されている。ＩＬＴＶ組換え体（太字のイタリック体で
示されている）は、導入プラスミドおよびビリオンＤＮ
Ａでの細胞のコトランスフェクションの後に単離するこ
とができた。
ミドの構築。導入プラスミドの作製のための関連制限部
位、異種配列、プロモーターおよびポリＡシグナルが示
されている。ＩＬＴＶ組換え体（太字のイタリック体で
示されている）は、導入プラスミドおよびビリオンＤＮ
Ａでの細胞のコトランスフェクションの後に単離するこ
とができた。
【図２】未感染（ｎ．ｉ．）およびＩＬＴＶ感染（５
ｐｆｕ／細胞、２４時間 ｐ．ｉ．）ＣＥＫ細胞の溶解
物を不連続ＳＤＳ−１０％ ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。ウエスタンブロットでＵＬ０特異的または
ｇＣ特異的抗体と共にインキュベートした。ペルオキシ
ダーゼ共役二次抗体の結合を化学発光により検出し、Ｘ
線フィルム上でモニターした。左側に分子マーカーが示
されている。
ｐｆｕ／細胞、２４時間 ｐ．ｉ．）ＣＥＫ細胞の溶解
物を不連続ＳＤＳ−１０％ ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。ウエスタンブロットでＵＬ０特異的または
ｇＣ特異的抗体と共にインキュベートした。ペルオキシ
ダーゼ共役二次抗体の結合を化学発光により検出し、Ｘ
線フィルム上でモニターした。左側に分子マーカーが示
されている。
【図３Ａ】ＩＬＴＶ突然変異体ΔＵＬ０、ΔＵＬ０−Ｌ
ａｃＺおよびΔＵＬ０−ＨＡ７ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均／処理群／日であり、実施例３に概
説されているとおりに測定される。
ａｃＺおよびΔＵＬ０−ＨＡ７ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均／処理群／日であり、実施例３に概
説されているとおりに測定される。
【図３Ｂ】ＩＬＴＶ突然変異体ΔＵＬ０、ΔＵＬ０−Ｌ
ａｃＺおよびΔＵＬ０−ＨＡ７ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均／処理群／日であり、実施例３に概
説されているとおりに測定される。
ａｃＺおよびΔＵＬ０−ＨＡ７ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均／処理群／日であり、実施例３に概
説されているとおりに測定される。
【図３Ｃ】ＩＬＴＶ突然変異体ΔＵＬ０、ΔＵＬ０−Ｌ
ａｃＺおよびΔＵＬ０−ＨＡ７ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均／処理群／日であり、実施例３に概
説されているとおりに測定される。
ａｃＺおよびΔＵＬ０−ＨＡ７ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均／処理群／日であり、実施例３に概
説されているとおりに測定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/17 Ａ６１Ｋ 39/17 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ 31/16 31/16 31/22 31/22 Ｃ１２Ｎ 5/10 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＢ Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA02 BA14 CA24 CA45 4C084 AA13 AA19 MA02 MA66 NA14 ZB331 ZC611 4C085 AA03 AA04 BA07 BA21 BA51 BA55 BA59 BA65 BA78 DD62 EE03 FF24 GG01 GG08
Claims (10)
- 【請求項１】 弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬ
ＴＶ）突然変異体と薬学上許容される担体または希釈剤
とを含んでなる、トリ病原体により引き起こされる疾患
から家禽を防御するためのワクチンであって、該ＩＬＴ
Ｖ突然変異体が、天然ＵＬ０タンパク質を、該ＵＬ０遺
伝子内の突然変異の結果として、感染宿主細胞内で発現
し得ないことを特徴とするワクチン。 - 【請求項２】 該ＵＬ０遺伝子内の突然変異が欠失であ
る、請求項１記載のワクチン。 - 【請求項３】 該ＵＬ０遺伝子内の突然変異が異種核酸
配列の挿入である、請求項１記載のワクチン。 - 【請求項４】 該突然変異体が、該欠失の代わりに異種
核酸配列を含む、請求項２記載のワクチン。 - 【請求項５】 該異種核酸配列が発現制御配列の制御下
にある、請求項３または４記載のワクチン。 - 【請求項６】 該異種核酸配列がトリ病原体の抗原をコ
ードする、請求項５記載のワクチン。 - 【請求項７】 該トリ病原体が、トリインフルエンザウ
イルス、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイル
ス、伝染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎
ウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、オルニトバクテリ
ウム・リノトラケアレ（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）またはマイコプ
ラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）である、請求項６記載
のワクチン。 - 【請求項８】 該異種核酸配列が免疫調整剤（ｉｍｍｕ
ｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）をコードする、請求項５記載
のワクチン。 - 【請求項９】 請求項１〜８記載のＩＬＴＶ突然変異体
に感染した細胞培養。 - 【請求項１０】 請求項１〜８記載のＩＬＴＶ突然変異
体と薬学上許容される担体または希釈剤とを混合する工
程を含んでなる、トリ病原体により引き起こされる疾患
から家禽を防御するためのワクチンの製造方法。
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