JP2002356441A - 組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスワクチン - Google Patents
組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】ニワトリにおいて伝染性喉頭気管炎ウイルス
(ILTV)に対する防御を誘導するためのワクチンの
提供。 【解決手段】該新規ワクチン株は、弱毒化ILTV突然
変異体と薬学上許容される担体または希釈剤とを含んで
なり、感染宿主細胞内で天然UL0タンパク質を発現し
得ないことを特徴とする。該新規ILTVワクチンウイ
ルスは、他のトリ病原体の遺伝子のベクターとしても使
用することができる。
(ILTV)に対する防御を誘導するためのワクチンの
提供。 【解決手段】該新規ワクチン株は、弱毒化ILTV突然
変異体と薬学上許容される担体または希釈剤とを含んで
なり、感染宿主細胞内で天然UL0タンパク質を発現し
得ないことを特徴とする。該新規ILTVワクチンウイ
ルスは、他のトリ病原体の遺伝子のベクターとしても使
用することができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、弱毒化伝染性喉頭
気管炎ウイルス(ILTV)突然変異体と薬学上許容さ
れる担体または希釈剤とを含んでなる、トリ病原体によ
り引き起こされる疾患に対して家禽を防御するためのワ
クチン、弱毒化ILTV突然変異体に感染した細胞培
養、およびそのようなワクチンの製造方法に関する。
気管炎ウイルス(ILTV)突然変異体と薬学上許容さ
れる担体または希釈剤とを含んでなる、トリ病原体によ
り引き起こされる疾患に対して家禽を防御するためのワ
クチン、弱毒化ILTV突然変異体に感染した細胞培
養、およびそのようなワクチンの製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】伝染性喉頭気管炎(ILT)は、主にニ
ワトリに感染する呼吸器疾患であるが、キジおよびクジ
ャクに感染することもある。感染後2〜8日の該疾患の
急性期においては、あえぎ及び血液滲出物の喀出を伴う
呼吸困難の徴候が観察される。また、気管の粘膜が膨張
し、出血が見られる。該疾患の家畜流行性形態は急速に
広がり、感染したトリの群の100%までを冒しうる。
死亡率は、その群の10〜80%となりうる。該疾患の
より軽度な形態は、涙眼、結膜炎、持続的鼻漏および産
卵減少により特定される。また、体重減少、産卵減少、
および二次感染に対する感受性の上昇は、経済的損失の
主要原因となる。
ワトリに感染する呼吸器疾患であるが、キジおよびクジ
ャクに感染することもある。感染後2〜8日の該疾患の
急性期においては、あえぎ及び血液滲出物の喀出を伴う
呼吸困難の徴候が観察される。また、気管の粘膜が膨張
し、出血が見られる。該疾患の家畜流行性形態は急速に
広がり、感染したトリの群の100%までを冒しうる。
死亡率は、その群の10〜80%となりうる。該疾患の
より軽度な形態は、涙眼、結膜炎、持続的鼻漏および産
卵減少により特定される。また、体重減少、産卵減少、
および二次感染に対する感受性の上昇は、経済的損失の
主要原因となる。
【0003】該疾患の急性徴候が存在しない場合には、
検査による確認を行う必要がある。ウイルスは気管また
は肺組織から分離することが可能であり、気管または結
膜組織内の核内封入体の証明は伝染性喉頭気管炎ウイル
スについての診断となる。また、蛍光抗体の使用によ
り、迅速な同定を行うことが可能である。
検査による確認を行う必要がある。ウイルスは気管また
は肺組織から分離することが可能であり、気管または結
膜組織内の核内封入体の証明は伝染性喉頭気管炎ウイル
スについての診断となる。また、蛍光抗体の使用によ
り、迅速な同定を行うことが可能である。
【0004】ILTの病原体は、アルファヘルペスウイ
ルスである伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)であ
る。処置調整(management adjustm
ent)のほかに、すべての年齢およびタイプ(親の群
れ、産卵鶏または種禽)のニワトリに対する予防および
防除の方法としてワクチン接種が用いられる。現在のワ
クチン接種方法は、主に点眼(眼−鼻経路)により適用
される生弱毒化ワクチンに基づく。しかし、現在入手可
能な市販の改変生ワクチンはいくつかの欠点を有する。
それらは残存毒性により大量ワクチン接種経路で完全に
安全に適用されるわけではない。例えば、エアロゾール
ワクチン接種は著しいワクチン接種反応を引き起こし
(該動物の10%までにおいて)、二次感染を引き起こ
す。さらに、現在使用されている生ワクチンは細胞培養
内での連続継代により弱毒化されているため、無制御の
突然変異が該ウイルスゲノム内に導入されて、それらの
毒性および免疫特性において不均一なウイルス粒子の集
団を供与する。また、そのような伝統的な弱毒化生ウイ
ルスワクチンは復帰突然変異により毒性を獲得して、該
接種動物の疾患および他の動物へ該病原体の伝播を引き
起こしうることが報告されている。さらに、既存のIL
TVワクチン株でのワクチン接種は、これらの動物の血
清学的転換を引き起こし、その結果、それらはもはや、
よりビルレントな野外ILTV株に感染した(潜伏性)
キャリアーから区別できなくなる。
ルスである伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)であ
る。処置調整(management adjustm
ent)のほかに、すべての年齢およびタイプ(親の群
れ、産卵鶏または種禽)のニワトリに対する予防および
防除の方法としてワクチン接種が用いられる。現在のワ
クチン接種方法は、主に点眼(眼−鼻経路)により適用
される生弱毒化ワクチンに基づく。しかし、現在入手可
能な市販の改変生ワクチンはいくつかの欠点を有する。
それらは残存毒性により大量ワクチン接種経路で完全に
安全に適用されるわけではない。例えば、エアロゾール
ワクチン接種は著しいワクチン接種反応を引き起こし
(該動物の10%までにおいて)、二次感染を引き起こ
す。さらに、現在使用されている生ワクチンは細胞培養
内での連続継代により弱毒化されているため、無制御の
突然変異が該ウイルスゲノム内に導入されて、それらの
毒性および免疫特性において不均一なウイルス粒子の集
団を供与する。また、そのような伝統的な弱毒化生ウイ
ルスワクチンは復帰突然変異により毒性を獲得して、該
接種動物の疾患および他の動物へ該病原体の伝播を引き
起こしうることが報告されている。さらに、既存のIL
TVワクチン株でのワクチン接種は、これらの動物の血
清学的転換を引き起こし、その結果、それらはもはや、
よりビルレントな野外ILTV株に感染した(潜伏性)
キャリアーから区別できなくなる。
【0005】ILTVは、ヘルペスウイルス科のアルフ
ァヘルペスウイルス亜科の一つに分類される。ILTV
は、長い(UL)および短い(US)特異(uniqu
e)領域よりなるヘルペスウイルスD型ゲノムを有し、
その短い特異領域は逆方向反復配列(IR、TR;図
1)に隣接する。ここ数年の間に、約150kbの直鎖
状二本鎖DNA分子を含有するほぼ完全なILTVゲノ
ムのDNA配列が決定された。Wildら(Virus
Genes 12,107−116,1996)は、
該ヌクレオチド配列、ゲノム地図および該ILTVゲノ
ムのUS領域の遺伝子の構成(gD、gE、gIおよび
gp60のような糖タンパク質をコードするいくつかの
遺伝子のものを含む)を開示している。ついで、該UL
領域に関する同様の情報も種々の研究グループにより公
開された(FuchsおよびMettenleite
r,J.Gen.Virol.77,2221−222
9,1996および80,2173−2182,199
9;Johnsonら,Arch.Virol.14
2,1903−1910,1997)。
ァヘルペスウイルス亜科の一つに分類される。ILTV
は、長い(UL)および短い(US)特異(uniqu
e)領域よりなるヘルペスウイルスD型ゲノムを有し、
その短い特異領域は逆方向反復配列(IR、TR;図
1)に隣接する。ここ数年の間に、約150kbの直鎖
状二本鎖DNA分子を含有するほぼ完全なILTVゲノ
ムのDNA配列が決定された。Wildら(Virus
Genes 12,107−116,1996)は、
該ヌクレオチド配列、ゲノム地図および該ILTVゲノ
ムのUS領域の遺伝子の構成(gD、gE、gIおよび
gp60のような糖タンパク質をコードするいくつかの
遺伝子のものを含む)を開示している。ついで、該UL
領域に関する同様の情報も種々の研究グループにより公
開された(FuchsおよびMettenleite
r,J.Gen.Virol.77,2221−222
9,1996および80,2173−2182,199
9;Johnsonら,Arch.Virol.14
2,1903−1910,1997)。
【0006】同定されているILTV遺伝子の多くは保
存されており、単純ヘルペスウイルス(HSV)と比較
した場合同一直線上のアラインメントで見出されること
が示された。同定されているILTV遺伝子はHSVホ
モログ、例えばUL1(gL)〜UL5、UL6〜UL
20およびUL29〜UL42を含む。しかし、ILT
Vゲノムおよび他のヘルペスウイルスゲノムのいくつか
の部分間には類似点が多数あるにもかかわらず、該ゲノ
ムの他の部分における遺伝子含量および遺伝子配置はか
なり異なる。これらの観察、および保存されたタンパク
質コード領域の系統発生分析によれば、ILTVは、そ
の他のヘルペスウイルスと遠縁であるに過ぎないことを
示している(Ziemannら,J.Virology
72,6867−6874,1998)。さらに、他
のアルファヘルペスウイルスとは対照的に、ILTV
は、生体内および生体外の両方で、ほとんどニワトリ細
胞のみに限局した非常に狭い宿主域を示す(Bagus
tら,In:Diseases of Poultr
y,第10版,Iowa State Univers
ity Press,Ames,US,527−53
9,1997)。該ILTV特異的ゲノム特性のほとん
どは、ニワトリの上部気管の非常に特殊化した好適部位
(niche)における生存を可能にするこのウイルス
の分子進化の過程で生じたと予想される。最近同定され
た2つのILTV特異的遺伝子であるUL0およびUL
[−1]は、ILTVのこれらの特性において何らかの
役割を果たしている可能性がある。UL0またはUL
[−1]相同遺伝子は他のヘルペスウイルスにおいては
見出されていない。これらの隣接遺伝子は、発現速度
論、mRNA構造、および該タンパク質の細胞下(su
bcellular)局在に関して密接に関連してお
り、有意なアミノ酸配列相同性を示しており、このこと
は祖先遺伝子の1つが重複していることを示唆している
(Ziemannら,1998,前掲)。
存されており、単純ヘルペスウイルス(HSV)と比較
した場合同一直線上のアラインメントで見出されること
が示された。同定されているILTV遺伝子はHSVホ
モログ、例えばUL1(gL)〜UL5、UL6〜UL
20およびUL29〜UL42を含む。しかし、ILT
Vゲノムおよび他のヘルペスウイルスゲノムのいくつか
の部分間には類似点が多数あるにもかかわらず、該ゲノ
ムの他の部分における遺伝子含量および遺伝子配置はか
なり異なる。これらの観察、および保存されたタンパク
質コード領域の系統発生分析によれば、ILTVは、そ
の他のヘルペスウイルスと遠縁であるに過ぎないことを
示している(Ziemannら,J.Virology
72,6867−6874,1998)。さらに、他
のアルファヘルペスウイルスとは対照的に、ILTV
は、生体内および生体外の両方で、ほとんどニワトリ細
胞のみに限局した非常に狭い宿主域を示す(Bagus
tら,In:Diseases of Poultr
y,第10版,Iowa State Univers
ity Press,Ames,US,527−53
9,1997)。該ILTV特異的ゲノム特性のほとん
どは、ニワトリの上部気管の非常に特殊化した好適部位
(niche)における生存を可能にするこのウイルス
の分子進化の過程で生じたと予想される。最近同定され
た2つのILTV特異的遺伝子であるUL0およびUL
[−1]は、ILTVのこれらの特性において何らかの
役割を果たしている可能性がある。UL0またはUL
[−1]相同遺伝子は他のヘルペスウイルスにおいては
見出されていない。これらの隣接遺伝子は、発現速度
論、mRNA構造、および該タンパク質の細胞下(su
bcellular)局在に関して密接に関連してお
り、有意なアミノ酸配列相同性を示しており、このこと
は祖先遺伝子の1つが重複していることを示唆している
(Ziemannら,1998,前掲)。
【0007】遺伝子操作された弱毒化ILTV突然変異
体ワクチンの開発の前提条件としては該ウイルスの毒性
に関与するタンパク質をコードしておりウイルスの感染
または複製に必須でないILTVゲノム内の領域を同定
することである。さらに、このタンパク質の発現を排除
することが該ウイルス突然変異体の複製を損なわず、そ
れがワクチン接種動物における防御免疫応答を誘導し得
ないことが不可欠である。
体ワクチンの開発の前提条件としては該ウイルスの毒性
に関与するタンパク質をコードしておりウイルスの感染
または複製に必須でないILTVゲノム内の領域を同定
することである。さらに、このタンパク質の発現を排除
することが該ウイルス突然変異体の複製を損なわず、そ
れがワクチン接種動物における防御免疫応答を誘導し得
ないことが不可欠である。
【0008】いくつかの非必須ILTV遺伝子が先行技
術において開示されている。UL50遺伝子の欠失は、
細胞培養内のILTVの複製に有意な影響を及ぼさない
が、得られるILTV欠失突然変異体は、野生型ILT
Vと同じ病原性を示す(Fuchsら,J.Gen.V
irol.81,627−638,2000およびIn
ternational Herpesvirus W
orkshop,Boston 1999,13.03
3)。2つのエンベロープタンパク質をコードするUL
10またはUL49.5の欠失を有するILTV突然変
異体は、細胞培養内で生存可能であるが、これらの突然
変異体の有意な増殖欠損(>90%のウイルス力価の減
少)は該タンパク質の重要な機能を示している(Fuc
hsら,Abstr.2.45,25th Int.H
erpesvirus Workshop,Portl
and,USA,2000)。糖タンパク質gG遺伝
子、ORF AまたはORF D内に欠失を有するIL
TV突然変異体において、同様の増殖欠損が観察されて
いる(Annual Virology Meetin
g,Vienna,2000年4月,Abstr.6P
50)。また、KeelerおよびRosenberg
er(US Poultry & Egg Assoc
iation,Research project #
253,1999年11月)は、非必須US2またはg
X遺伝子にコードされるタンパク質を発現しないILT
V突然変異体を分離することができなかった。さらに、
本発明者らは、UL[−1]遺伝子内に欠失を有するI
LTV突然変異体を作製することができなかった。この
ことは、このILTV特異的遺伝子がILTVの感染ま
たは複製に不可欠であることを示している。また、もう
1つのILTV特異的オープンリーディングフレーム
(ORF A)が該ウイルスに必須であることが判明し
た(Vienna Meeting,2000年4月,
Abstr.6P50,前掲)。
術において開示されている。UL50遺伝子の欠失は、
細胞培養内のILTVの複製に有意な影響を及ぼさない
が、得られるILTV欠失突然変異体は、野生型ILT
Vと同じ病原性を示す(Fuchsら,J.Gen.V
irol.81,627−638,2000およびIn
ternational Herpesvirus W
orkshop,Boston 1999,13.03
3)。2つのエンベロープタンパク質をコードするUL
10またはUL49.5の欠失を有するILTV突然変
異体は、細胞培養内で生存可能であるが、これらの突然
変異体の有意な増殖欠損(>90%のウイルス力価の減
少)は該タンパク質の重要な機能を示している(Fuc
hsら,Abstr.2.45,25th Int.H
erpesvirus Workshop,Portl
and,USA,2000)。糖タンパク質gG遺伝
子、ORF AまたはORF D内に欠失を有するIL
TV突然変異体において、同様の増殖欠損が観察されて
いる(Annual Virology Meetin
g,Vienna,2000年4月,Abstr.6P
50)。また、KeelerおよびRosenberg
er(US Poultry & Egg Assoc
iation,Research project #
253,1999年11月)は、非必須US2またはg
X遺伝子にコードされるタンパク質を発現しないILT
V突然変異体を分離することができなかった。さらに、
本発明者らは、UL[−1]遺伝子内に欠失を有するI
LTV突然変異体を作製することができなかった。この
ことは、このILTV特異的遺伝子がILTVの感染ま
たは複製に不可欠であることを示している。また、もう
1つのILTV特異的オープンリーディングフレーム
(ORF A)が該ウイルスに必須であることが判明し
た(Vienna Meeting,2000年4月,
Abstr.6P50,前掲)。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】本発明の1つの目的
は、弱毒化されたILTVワクチン株を含むワクチンを
提供することにあり、該ILTVワクチン株は、該弱毒
化ワクチン株の毒性への復帰突然変異を妨げる遺伝子工
学技術による制御された状態で弱毒化されており、該ワ
クチン株に感染した宿主動物において防御免疫応答を誘
導しうる。
は、弱毒化されたILTVワクチン株を含むワクチンを
提供することにあり、該ILTVワクチン株は、該弱毒
化ワクチン株の毒性への復帰突然変異を妨げる遺伝子工
学技術による制御された状態で弱毒化されており、該ワ
クチン株に感染した宿主動物において防御免疫応答を誘
導しうる。
【0010】本発明のもう1つの目的は、ILTに対す
る防御を誘導しうるだけではなく、他のトリ病原体によ
り引き起こされる感染に対する防御をも誘導しうるワク
チンを提供することにある。
る防御を誘導しうるだけではなく、他のトリ病原体によ
り引き起こされる感染に対する防御をも誘導しうるワク
チンを提供することにある。
【0011】
【課題を解決するための手段】これらの目的は、弱毒化
伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)突然変異体と薬
学上許容される担体または希釈剤とを含んでなる、トリ
病原体により引き起こされる疾患に対して家禽を防御す
るためのワクチンであって、該ILTV突然変異体が、
天然UL0タンパク質を、該UL0遺伝子内の突然変異
の結果として、感染宿主細胞内で発現し得ないことを特
徴とするワクチンを提供することにより、本発明者らに
より達成された。
伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)突然変異体と薬
学上許容される担体または希釈剤とを含んでなる、トリ
病原体により引き起こされる疾患に対して家禽を防御す
るためのワクチンであって、該ILTV突然変異体が、
天然UL0タンパク質を、該UL0遺伝子内の突然変異
の結果として、感染宿主細胞内で発現し得ないことを特
徴とするワクチンを提供することにより、本発明者らに
より達成された。
【0012】本発明者らは、UL[−1]遺伝子とは対
照的にILTV特異的UL0遺伝子が細胞内でのILT
Vの感染または複製に非必須であるということだけでは
なく、さらに、UL0遺伝子の制御された遺伝子操作に
よる該天然UL0タンパク質の発現の不活性化が、野生
型親ILTVと比較して弱毒化されたILTV突然変異
体を与えることをも見出した。さらに、この弱毒化IL
TV突然変異体がまた、ビルレントILTVでの攻撃の
際にワクチン接種動物における死亡率および臨床的徴候
を減少させる感染防御免疫応答を誘導しうることを見出
した。また、本発明のワクチンは、噴霧大量ワクチン接
種により安全にニワトリに投与されうるという更なる利
点を示す。
照的にILTV特異的UL0遺伝子が細胞内でのILT
Vの感染または複製に非必須であるということだけでは
なく、さらに、UL0遺伝子の制御された遺伝子操作に
よる該天然UL0タンパク質の発現の不活性化が、野生
型親ILTVと比較して弱毒化されたILTV突然変異
体を与えることをも見出した。さらに、この弱毒化IL
TV突然変異体がまた、ビルレントILTVでの攻撃の
際にワクチン接種動物における死亡率および臨床的徴候
を減少させる感染防御免疫応答を誘導しうることを見出
した。また、本発明のワクチンは、噴霧大量ワクチン接
種により安全にニワトリに投与されうるという更なる利
点を示す。
【0013】該ILTV特異的UL0遺伝子の局在化お
よびその分子構造は先行技術において開示されている
(Ziemannら,1998,前掲)。該UL0遺伝
子は、本発明においては、オープンリーディングフレー
ム(ORF)およびそのプロモーター領域(これは、保
存されたUL1 ORF(糖タンパク質Lをコードす
る)と部分的に重複し及び上流に存在し、そしてEco
RI断片B内に位置するIR配列との結合部のULゲノ
ム領域のまさに右末端のILTV特異的UL[−1]O
RFの下流に存在する)と定義される(図1Aを参照さ
れたい)。
よびその分子構造は先行技術において開示されている
(Ziemannら,1998,前掲)。該UL0遺伝
子は、本発明においては、オープンリーディングフレー
ム(ORF)およびそのプロモーター領域(これは、保
存されたUL1 ORF(糖タンパク質Lをコードす
る)と部分的に重複し及び上流に存在し、そしてEco
RI断片B内に位置するIR配列との結合部のULゲノ
ム領域のまさに右末端のILTV特異的UL[−1]O
RFの下流に存在する)と定義される(図1Aを参照さ
れたい)。
【0014】
【発明の実施の形態】好ましくは、本発明のワクチン
は、UL0 ORF内に突然変異を含む前記の弱毒化I
LTV突然変異体を含む。
は、UL0 ORF内に突然変異を含む前記の弱毒化I
LTV突然変異体を含む。
【0015】ILTV UL0遺伝子は、約506アミ
ノ酸のUL0タンパク質をコードし、5’末端付近のイ
ントロンを含む。感染細胞内でUL0遺伝子から発現さ
れるUL0タンパク質は約63kDaの分子量を有し、
主にウイルス感染細胞の核内に局在化される。公開され
ているUL0配列(Ziemannら,1998,前
掲)に関しては、該ORFはヌクレオチド7152位か
ら始まり、5554位で終わる。該UL0プロモーター
領域はヌクレオチド7350−7151に及ぶ。
ノ酸のUL0タンパク質をコードし、5’末端付近のイ
ントロンを含む。感染細胞内でUL0遺伝子から発現さ
れるUL0タンパク質は約63kDaの分子量を有し、
主にウイルス感染細胞の核内に局在化される。公開され
ているUL0配列(Ziemannら,1998,前
掲)に関しては、該ORFはヌクレオチド7152位か
ら始まり、5554位で終わる。該UL0プロモーター
領域はヌクレオチド7350−7151に及ぶ。
【0016】ILTV株は、ヌクレオチドレベルで大部
分は保存されている。したがって、該ILTV UL0
遺伝子のDNA配列に関しては、自然変異がILTV集
団内の個々の株間に存在しうること、および本ILTV
突然変異体が由来する親ウイルスは任意のILTV株で
ありうることが理解されるであろう。該UL0遺伝子内
の1以上のヌクレオチドの変化によって株間の変異が起
こりうる。典型的には、UL0遺伝子は、公知UL0ア
ミノ酸配列(GenBankアクセッション番号X97
256)に対して少なくとも90%の相同性を示すアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を有する。2つのタンパク質間のアミノ酸相同性の
レベルは、とりわけwww.ncbi.nlm.ni
h.gov/blast/bl2seq/bl2.ht
ml.において見出されうるサブプログラム「BLAS
TP」、コンピュータープログラム「Blast 2
Sequences」で測定することができる。このプ
ログラムは、TatusovaおよびMadden,F
EMS Microbiol.Letters 17
4,247−250,1999においても言及されてい
る。用いるマトリクスは「blosum62」であり、
該パラメーターはデフォルトパラメーター:オープンギ
ャップ:11、伸長(Extension)ギャップ:
1、Gap x ドロップオフ(deopoff):50
である。そのようなILTV株に由来するILTV突然
変異体に基づくワクチンも本発明の範囲内に含まれるこ
とは明らかである。好ましくは、本発明のワクチンは、
GenBankアクセッション番号X97256におい
て公開されているアミノ酸配列を有するUL0タンパク
質をコードするヌクレオチド配列を有するUL0遺伝子
内に突然変異を含むILTV突然変異体に基づく。
分は保存されている。したがって、該ILTV UL0
遺伝子のDNA配列に関しては、自然変異がILTV集
団内の個々の株間に存在しうること、および本ILTV
突然変異体が由来する親ウイルスは任意のILTV株で
ありうることが理解されるであろう。該UL0遺伝子内
の1以上のヌクレオチドの変化によって株間の変異が起
こりうる。典型的には、UL0遺伝子は、公知UL0ア
ミノ酸配列(GenBankアクセッション番号X97
256)に対して少なくとも90%の相同性を示すアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を有する。2つのタンパク質間のアミノ酸相同性の
レベルは、とりわけwww.ncbi.nlm.ni
h.gov/blast/bl2seq/bl2.ht
ml.において見出されうるサブプログラム「BLAS
TP」、コンピュータープログラム「Blast 2
Sequences」で測定することができる。このプ
ログラムは、TatusovaおよびMadden,F
EMS Microbiol.Letters 17
4,247−250,1999においても言及されてい
る。用いるマトリクスは「blosum62」であり、
該パラメーターはデフォルトパラメーター:オープンギ
ャップ:11、伸長(Extension)ギャップ:
1、Gap x ドロップオフ(deopoff):50
である。そのようなILTV株に由来するILTV突然
変異体に基づくワクチンも本発明の範囲内に含まれるこ
とは明らかである。好ましくは、本発明のワクチンは、
GenBankアクセッション番号X97256におい
て公開されているアミノ酸配列を有するUL0タンパク
質をコードするヌクレオチド配列を有するUL0遺伝子
内に突然変異を含むILTV突然変異体に基づく。
【0017】突然変異は、天然UL0タンパク質を発現
しうる親ILTV株の野生型または未修飾UL0遺伝子
における遺伝情報の変化であると理解される。該突然変
異は該ウイルスを弱毒化し、それを、ILTに対するワ
クチン株としての使用に適したものとする。該突然変異
は、該UL0遺伝子内の1以上のヌクレオチドの挿入、
欠失および/または置換でありうる。
しうる親ILTV株の野生型または未修飾UL0遺伝子
における遺伝情報の変化であると理解される。該突然変
異は該ウイルスを弱毒化し、それを、ILTに対するワ
クチン株としての使用に適したものとする。該突然変異
は、該UL0遺伝子内の1以上のヌクレオチドの挿入、
欠失および/または置換でありうる。
【0018】生存可能な組換えILTV UL0突然変
異体の形成に対する、該UL1遺伝子と重複するUL0
ORFの3’末端における突然変異の悪影響を防ぐた
めに、「UL0遺伝子内の突然変異」なる語は、UL1
プロモーター領域およびORFとは重複しない領域内の
UL0遺伝子内の突然変異を意味する。公開されている
UL0およびUL1配列(GenBankアクセッショ
ン番号X97256)に関しては、該UL1プロモータ
ー領域はヌクレオチド約5900から開始し、該UL1
ORFは5570位から開始する。
異体の形成に対する、該UL1遺伝子と重複するUL0
ORFの3’末端における突然変異の悪影響を防ぐた
めに、「UL0遺伝子内の突然変異」なる語は、UL1
プロモーター領域およびORFとは重複しない領域内の
UL0遺伝子内の突然変異を意味する。公開されている
UL0およびUL1配列(GenBankアクセッショ
ン番号X97256)に関しては、該UL1プロモータ
ー領域はヌクレオチド約5900から開始し、該UL1
ORFは5570位から開始する。
【0019】「天然UL0タンパク質を発現し得ない」
なる語は、本発明で用いるILTVワクチン株が、野生
型ILTVにより発現される63kDaのUL0タンパ
ク質から通常の試験により区別されうるタンパク質を感
染宿主細胞内で発現すること、またはUL0タンパク質
を全く発現しないことを意味する。例えば、前者の場
合、該ILTV突然変異体は、野生型UL0タンパク質
の断片のみを発現する。好ましくは、本発明で用いるI
LTV突然変異体ワクチンは、宿主細胞における感染お
よび複製に際してUL0タンパク質を全く発現しない。
該天然UL0タンパク質の発現に関してILTV突然変
異体を血清学的試験によりアッセイするためには、まず
第1に、単一特異性UL0抗血清を産生させる。この目
的のために、該UL0 ORFまたはその一部を大腸菌
内で融合タンパク質として発現させることができる。該
融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーま
たはゲル電気泳動により精製し、それを使用して、該抗
血清の産生のためにウサギを免疫する(Ziemann
ら,1998,前掲)。第2に、ウイルスを培養細胞内
で増殖させ、回収し、細胞溶解し、免疫沈降させる(こ
れは所望により行う)。周知の方法を用いて、該タンパ
ク質をポリアクリルアミドゲル内で分離し、ニトロセル
ロースに転移する。ついで、該ゲルを、該融合タンパク
質に対して産生させた抗血清と共にインキュベートし、
天然の63kDaタンパク質の存否を判定することがで
きる。同様のアッセイにおいて、培養中および抗UL0
抗血清での該ウイルス回収物の免疫沈降中、該ILTV
タンパク質の放射能標識により、発現された天然UL0
の存否を判定することができる。
なる語は、本発明で用いるILTVワクチン株が、野生
型ILTVにより発現される63kDaのUL0タンパ
ク質から通常の試験により区別されうるタンパク質を感
染宿主細胞内で発現すること、またはUL0タンパク質
を全く発現しないことを意味する。例えば、前者の場
合、該ILTV突然変異体は、野生型UL0タンパク質
の断片のみを発現する。好ましくは、本発明で用いるI
LTV突然変異体ワクチンは、宿主細胞における感染お
よび複製に際してUL0タンパク質を全く発現しない。
該天然UL0タンパク質の発現に関してILTV突然変
異体を血清学的試験によりアッセイするためには、まず
第1に、単一特異性UL0抗血清を産生させる。この目
的のために、該UL0 ORFまたはその一部を大腸菌
内で融合タンパク質として発現させることができる。該
融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーま
たはゲル電気泳動により精製し、それを使用して、該抗
血清の産生のためにウサギを免疫する(Ziemann
ら,1998,前掲)。第2に、ウイルスを培養細胞内
で増殖させ、回収し、細胞溶解し、免疫沈降させる(こ
れは所望により行う)。周知の方法を用いて、該タンパ
ク質をポリアクリルアミドゲル内で分離し、ニトロセル
ロースに転移する。ついで、該ゲルを、該融合タンパク
質に対して産生させた抗血清と共にインキュベートし、
天然の63kDaタンパク質の存否を判定することがで
きる。同様のアッセイにおいて、培養中および抗UL0
抗血清での該ウイルス回収物の免疫沈降中、該ILTV
タンパク質の放射能標識により、発現された天然UL0
の存否を判定することができる。
【0020】本発明で使用する典型的なILTV置換突
然変異体は、終結コドンへの該ORF内(好ましくは、
該ORFの5’側の半分)の1以上のコドンの変化をも
たらす1以上のヌクレオチドの置換を含む。あるいは、
該置換は、該UL0 ORFの開始コドンの変化および
除去をもたらしうる。
然変異体は、終結コドンへの該ORF内(好ましくは、
該ORFの5’側の半分)の1以上のコドンの変化をも
たらす1以上のヌクレオチドの置換を含む。あるいは、
該置換は、該UL0 ORFの開始コドンの変化および
除去をもたらしうる。
【0021】この実施形態の好ましい態様においては、
本発明のワクチンは該UL0遺伝子の欠失を含む。該欠
失は該天然UL0タンパク質の発現を妨げ、1ヌクレオ
チドからほぼ完全なORF(UL1遺伝子と重複する部
分は除く)の範囲となりうる。個々の有効な欠失は、該
UL0遺伝子の5’側の半分に施され及び/又は該読み
取り枠のシフトを引き起こす欠失である。特に、前記の
ILTVワクチン株内に導入された欠失は、少なくとも
10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌ
クレオチド、最も好ましくは少なくとも500ヌクレオ
チドを含む。特に有用なILTV欠失突然変異体は、a
a49−231をコードする546bpのKpnI/S
spI断片、aa17−318をコードする984bp
のClaI/BsrBI断片またはaa1−352をコ
ードする1137bpのBssHII/XbaI断片の
欠失を含有する。
本発明のワクチンは該UL0遺伝子の欠失を含む。該欠
失は該天然UL0タンパク質の発現を妨げ、1ヌクレオ
チドからほぼ完全なORF(UL1遺伝子と重複する部
分は除く)の範囲となりうる。個々の有効な欠失は、該
UL0遺伝子の5’側の半分に施され及び/又は該読み
取り枠のシフトを引き起こす欠失である。特に、前記の
ILTVワクチン株内に導入された欠失は、少なくとも
10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌ
クレオチド、最も好ましくは少なくとも500ヌクレオ
チドを含む。特に有用なILTV欠失突然変異体は、a
a49−231をコードする546bpのKpnI/S
spI断片、aa17−318をコードする984bp
のClaI/BsrBI断片またはaa1−352をコ
ードする1137bpのBssHII/XbaI断片の
欠失を含有する。
【0022】また、前記の有用なILTV突然変異体
は、該UL0遺伝子内への異種核酸配列(すなわち、該
ILTVゲノムのその位置に天然に存在する核酸配列と
は異なる核酸配列)の挿入により得ることができる。好
ましくは、該異種核酸配列は、該ILTVゲノム内に存
在しないDNA断片である。該異種核酸配列は、任意
の、例えば合成、ウイルス性、原核性または真核性の起
源に由来しうる。そのような核酸配列は、とりわけ、所
望により1以上の翻訳終結コドン(米国特許第5,27
9,965号を参照されたい)またはポリペプチドコー
ド化ポリヌクレオチドをも含有する例えば約10〜60
bpのオリゴヌクレオチドでありうる。
は、該UL0遺伝子内への異種核酸配列(すなわち、該
ILTVゲノムのその位置に天然に存在する核酸配列と
は異なる核酸配列)の挿入により得ることができる。好
ましくは、該異種核酸配列は、該ILTVゲノム内に存
在しないDNA断片である。該異種核酸配列は、任意
の、例えば合成、ウイルス性、原核性または真核性の起
源に由来しうる。そのような核酸配列は、とりわけ、所
望により1以上の翻訳終結コドン(米国特許第5,27
9,965号を参照されたい)またはポリペプチドコー
ド化ポリヌクレオチドをも含有する例えば約10〜60
bpのオリゴヌクレオチドでありうる。
【0023】この実施形態のもう1つの態様において
は、本発明のワクチンは、欠失したILTV DNAの
代わりに異種核酸配列を含有するILTV欠失体を含
む。
は、本発明のワクチンは、欠失したILTV DNAの
代わりに異種核酸配列を含有するILTV欠失体を含
む。
【0024】異種核酸配列を含む前記ILTV突然変異
体はまた、家禽において異種ポリペプチドを運搬するた
めのベクターとして使用することができる。したがっ
て、本発明はまた、前記のILTV突然変異体を含むワ
クチンであって、該異種核酸配列が、ILTに対する家
禽の感染防御のためだけではなく他のトリ病原体により
引き起こされる疾患に対する感染防御にも使用されうる
トリ(特にニワトリ)病原体の抗原をコードすることを
特徴とするワクチンを提供する。また、生弱毒化ILT
Vに基づくそのようなベクターワクチンは、該ワクチン
接種動物内での該ILTV突然変異体の複製および該ワ
クチン接種動物内で免疫応答を惹起する該外来抗原の発
現により、他の病原体に対してニワトリを免疫しうる。
体はまた、家禽において異種ポリペプチドを運搬するた
めのベクターとして使用することができる。したがっ
て、本発明はまた、前記のILTV突然変異体を含むワ
クチンであって、該異種核酸配列が、ILTに対する家
禽の感染防御のためだけではなく他のトリ病原体により
引き起こされる疾患に対する感染防御にも使用されうる
トリ(特にニワトリ)病原体の抗原をコードすることを
特徴とするワクチンを提供する。また、生弱毒化ILT
Vに基づくそのようなベクターワクチンは、該ワクチン
接種動物内での該ILTV突然変異体の複製および該ワ
クチン接種動物内で免疫応答を惹起する該外来抗原の発
現により、他の病原体に対してニワトリを免疫しうる。
【0025】好ましくは、該ILTVベクター突然変異
体は、トリインフルエンザウイルス(AIV)、マレッ
ク病ウイルス(MDV)、ニューカッスル病ウイルス
(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染
性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニワトリ
貧血ウイルス、レオウイルス、トリレトロウイルス、ニ
ワトリアデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイル
ス(TRTV)、大腸菌(E.coli)、アイメリア
(Eimeria)種、クリプトスポリジウム(Cry
ptosporidia)、マイコプラズマ(Myco
plasms)、例えばマイコプラズマ・ガリナルム
(M.gallinarum)、マイコプラズマ・シノ
ビエ(M.synoviae)およびマイコプラズマ・
メレアグリディス(M.meleagridis)、サ
ルモネラ(Salmonella)−、カンピロバクタ
ー(Campylobacter)−、オルニトバクテ
リウム(Ornithobacterium)(OR
T)およびパスツレラ(Pasteurella)種の
防御抗原をコードする異種核酸配列を含む。より好まし
くは、該ILTVベクター突然変異体は、AIV、MD
V、NDV、IBV、IBDV、TRTV、大腸菌、O
RTおよびマイコプラズマの抗原をコードする異種核酸
配列を含む。
体は、トリインフルエンザウイルス(AIV)、マレッ
ク病ウイルス(MDV)、ニューカッスル病ウイルス
(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染
性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニワトリ
貧血ウイルス、レオウイルス、トリレトロウイルス、ニ
ワトリアデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイル
ス(TRTV)、大腸菌(E.coli)、アイメリア
(Eimeria)種、クリプトスポリジウム(Cry
ptosporidia)、マイコプラズマ(Myco
plasms)、例えばマイコプラズマ・ガリナルム
(M.gallinarum)、マイコプラズマ・シノ
ビエ(M.synoviae)およびマイコプラズマ・
メレアグリディス(M.meleagridis)、サ
ルモネラ(Salmonella)−、カンピロバクタ
ー(Campylobacter)−、オルニトバクテ
リウム(Ornithobacterium)(OR
T)およびパスツレラ(Pasteurella)種の
防御抗原をコードする異種核酸配列を含む。より好まし
くは、該ILTVベクター突然変異体は、AIV、MD
V、NDV、IBV、IBDV、TRTV、大腸菌、O
RTおよびマイコプラズマの抗原をコードする異種核酸
配列を含む。
【0026】特に、該ILTVベクター突然変異体は、
AIVの血球凝集素(HA)遺伝子(Flexner
ら,Nature 335,259−262,198
8;GenBankアクセッション番号AJ30530
6)、MDVのgA、gBおよびgD遺伝子(Ross
ら,J.Gen.Virol.74,371−377,
1993;WO90/02803)、NDVのHNまた
はF遺伝子(Sondermeijerら,Vacci
ne 11,349−358,1993)またはIBD
VのVP2遺伝子(Baylissら,Arch.Vi
rol.120,193−205,1991)を含みう
る。さらに一層好ましい実施形態においては、AIVの
HA遺伝子を含む弱毒化ILTV突然変異体に基づく前
記ワクチンを提供する。
AIVの血球凝集素(HA)遺伝子(Flexner
ら,Nature 335,259−262,198
8;GenBankアクセッション番号AJ30530
6)、MDVのgA、gBおよびgD遺伝子(Ross
ら,J.Gen.Virol.74,371−377,
1993;WO90/02803)、NDVのHNまた
はF遺伝子(Sondermeijerら,Vacci
ne 11,349−358,1993)またはIBD
VのVP2遺伝子(Baylissら,Arch.Vi
rol.120,193−205,1991)を含みう
る。さらに一層好ましい実施形態においては、AIVの
HA遺伝子を含む弱毒化ILTV突然変異体に基づく前
記ワクチンを提供する。
【0027】特に、AIVのH5またはH7血球凝集素
遺伝子を含む弱毒化ILTV突然変異体に基づくワクチ
ンが意図される。
遺伝子を含む弱毒化ILTV突然変異体に基づくワクチ
ンが意図される。
【0028】あるいは、該ILTVベクター突然変異体
は、免疫調整剤、例えば(トリ)インターフェロン、サ
イトカインまたはリンホカインをコードする異種核酸配
列を含む。該ILTV突然変異体により発現される免疫
調整剤は、該ILTV突然変異体により誘導される免疫
応答を増強し、そのようなものとして防御の増強に寄与
する。したがって、本発明はまた、免疫調整剤をコード
する異種核酸配列を含有する前記ILTV突然変異体を
含むワクチンを提供する。
は、免疫調整剤、例えば(トリ)インターフェロン、サ
イトカインまたはリンホカインをコードする異種核酸配
列を含む。該ILTV突然変異体により発現される免疫
調整剤は、該ILTV突然変異体により誘導される免疫
応答を増強し、そのようなものとして防御の増強に寄与
する。したがって、本発明はまた、免疫調整剤をコード
する異種核酸配列を含有する前記ILTV突然変異体を
含むワクチンを提供する。
【0029】前記のILTV突然変異体による該異種核
酸の発現のための必須の要件は、機能しうる様態で該異
種核酸配列に結合した適当な発現制御配列、好ましく
は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルであ
る。そのような発現制御配列は、特にヘルペスウイルス
ベクターの構築に関しては当業者に周知であり、該IL
TV突然変異体に感染した細胞内での遺伝子転写を指令
しうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモー
ターまたはポリアデニル化シグナルに拡張される。有用
なプロモーターの具体例としては、SV−40プロモー
ター(Science 222,524−527,19
83)、メタロチオネインプロモーター(Natur
e,296,39−42,1982)、熱ショックプロ
モーター(Voellmyら,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,82,4949−53,19
85)、PRV gXプロモーター(Mettenle
iterおよびRauh,J.Virol.Metho
ds 30,55−66,1990)、ヒトサイトメガ
ロウイルスIEプロモーター(米国特許第5,168,
062号)、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター
(Gormanら,PNAS79,6777−678
1,1982)、ヒト延長因子1α、またはILTV内
に存在するユビキチンプロモーター、特にUL0プロモ
ーターが挙げられる。有用なポリAシグナルの具体例と
しては、ウサギβ−グロビン、SV40およびウシ成長
ホルモンポリAシグナルが挙げられる。あるいは、UL
0、UL1またはUL2の内在性ポリAシグナルを用い
ることができる。
酸の発現のための必須の要件は、機能しうる様態で該異
種核酸配列に結合した適当な発現制御配列、好ましく
は、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルであ
る。そのような発現制御配列は、特にヘルペスウイルス
ベクターの構築に関しては当業者に周知であり、該IL
TV突然変異体に感染した細胞内での遺伝子転写を指令
しうる任意の真核性、原核性またはウイルス性プロモー
ターまたはポリアデニル化シグナルに拡張される。有用
なプロモーターの具体例としては、SV−40プロモー
ター(Science 222,524−527,19
83)、メタロチオネインプロモーター(Natur
e,296,39−42,1982)、熱ショックプロ
モーター(Voellmyら,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,82,4949−53,19
85)、PRV gXプロモーター(Mettenle
iterおよびRauh,J.Virol.Metho
ds 30,55−66,1990)、ヒトサイトメガ
ロウイルスIEプロモーター(米国特許第5,168,
062号)、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター
(Gormanら,PNAS79,6777−678
1,1982)、ヒト延長因子1α、またはILTV内
に存在するユビキチンプロモーター、特にUL0プロモ
ーターが挙げられる。有用なポリAシグナルの具体例と
しては、ウサギβ−グロビン、SV40およびウシ成長
ホルモンポリAシグナルが挙げられる。あるいは、UL
0、UL1またはUL2の内在性ポリAシグナルを用い
ることができる。
【0030】したがって、本発明の好ましいワクチン
は、発現制御配列の制御下にある前記ポリペプチドをコ
ードする異種核酸配列を含むILTV突然変異体に基づ
く。
は、発現制御配列の制御下にある前記ポリペプチドをコ
ードする異種核酸配列を含むILTV突然変異体に基づ
く。
【0031】本発明の更にもう1つの態様においては、
該ILTVゲノム内の更なる弱毒化突然変異を更に含む
前記ILTV突然変異体を含むワクチンを提供する。例
えば、そのようなワクチンは、修飾された生ワクチン
株、例えば、商業的に現在入手可能なもの(例えば、N
obilis ILT(登録商標)、BioTrach
(登録商標)、Trachine(登録商標))に基づ
くか、あるいは毒性に関与する更なるタンパク質(例え
ば、gE、gI、gM、TK、RR、UL21、UL5
0またはPK)を発現しない遺伝的に操作されたILT
Vに基づく(Schnitzleinら,Virolo
gy 209,304−314,1995;Mette
nleiter,Abstracts from ES
VV meeting,27−30,2000年8月,
15−17;WO 96/29396)。
該ILTVゲノム内の更なる弱毒化突然変異を更に含む
前記ILTV突然変異体を含むワクチンを提供する。例
えば、そのようなワクチンは、修飾された生ワクチン
株、例えば、商業的に現在入手可能なもの(例えば、N
obilis ILT(登録商標)、BioTrach
(登録商標)、Trachine(登録商標))に基づ
くか、あるいは毒性に関与する更なるタンパク質(例え
ば、gE、gI、gM、TK、RR、UL21、UL5
0またはPK)を発現しない遺伝的に操作されたILT
Vに基づく(Schnitzleinら,Virolo
gy 209,304−314,1995;Mette
nleiter,Abstracts from ES
VV meeting,27−30,2000年8月,
15−17;WO 96/29396)。
【0032】クローニング/発現ベクター内へのDNA
配列の挿入およびインビボ相同組換えに関する周知の方
法を用いて、該ILTVゲノム内に突然変異を導入する
ことができる。
配列の挿入およびインビボ相同組換えに関する周知の方
法を用いて、該ILTVゲノム内に突然変異を導入する
ことができる。
【0033】原則として、これは、所望の突然変異を保
持する関連ILTV DNA断片および宿主細胞内で複
製可能なベクターを含むゲノムILTV DNAとの組
換えのための組換え導入ベクターを構築することにより
達成される。そのような組換え導入ベクターは、この目
的のための当業者に公知の任意の適当なベクター、例え
ば、プラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージか
ら誘導されうるが、プラスミドが最も好ましい。適当な
クローニングベクターの具体例としては、プラスミドベ
クター、例えばpBR322、種々のpUC、pEMB
LおよびBluescriptプラスミド、バクテリオ
ファージ、例えばラムダ、シャロン28およびM13m
pファージが挙げられる。適当な導入ベクター、宿主細
胞、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングなど
のための方法は、当業界で周知の選択肢から当業者によ
り選択されうる(例えば、Rodriguez,R.
L.およびD.T.Denhardt編,Vector
s:A survey ofmoleculaar c
loning vectors and their
uses,Butterworths,1988;Cu
rrent Protocols in Molecu
lar Biology:F.M.Ausubelら
編,Wiley N.Y.,1995;Molecul
ar cloning:a laboratory m
anual,第3版:Sambrookら編,CSHL
press,2001、ならびにDNA Cloni
ng,Vol.1−4,第2版 1995:Glove
rおよびHames編,Oxford Univers
ity Pressを参照されたい)。
持する関連ILTV DNA断片および宿主細胞内で複
製可能なベクターを含むゲノムILTV DNAとの組
換えのための組換え導入ベクターを構築することにより
達成される。そのような組換え導入ベクターは、この目
的のための当業者に公知の任意の適当なベクター、例え
ば、プラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージか
ら誘導されうるが、プラスミドが最も好ましい。適当な
クローニングベクターの具体例としては、プラスミドベ
クター、例えばpBR322、種々のpUC、pEMB
LおよびBluescriptプラスミド、バクテリオ
ファージ、例えばラムダ、シャロン28およびM13m
pファージが挙げられる。適当な導入ベクター、宿主細
胞、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングなど
のための方法は、当業界で周知の選択肢から当業者によ
り選択されうる(例えば、Rodriguez,R.
L.およびD.T.Denhardt編,Vector
s:A survey ofmoleculaar c
loning vectors and their
uses,Butterworths,1988;Cu
rrent Protocols in Molecu
lar Biology:F.M.Ausubelら
編,Wiley N.Y.,1995;Molecul
ar cloning:a laboratory m
anual,第3版:Sambrookら編,CSHL
press,2001、ならびにDNA Cloni
ng,Vol.1−4,第2版 1995:Glove
rおよびHames編,Oxford Univers
ity Pressを参照されたい)。
【0034】簡単に説明すると、まず第1に、UL0核
酸配列を含むILTV DNA断片を、標準的なrec
DNA技術を用いて導入ベクター内に挿入する。該IL
TVDNA断片は、UL0 ORFの一部または完全な
UL0 ORF、および所望によりその隣接配列を含み
うる。第2に、ILTV UL0欠失突然変異体を得よ
うとする場合には、UL0 ORFの一部を該組換え導
入ベクターから欠失させる。これは、例えば、該組換え
ベクターインサートの適当なエキソヌクレアーゼIII
消化または制限酵素切断により、またはPCRプライマ
ーの注意深い選択により達成することができる。ILT
V挿入突然変異体を得ようとする場合には、異種核酸配
列と、所望により、発現制御配列を含むDNA断片と
を、該組換えベクター内に存在するUL0核酸配列内に
又は欠失したUL0核酸配列の代わりに挿入する。該I
LTV DNA内に導入された突然変異に隣接するIL
TV DNA配列は、ゲノムILTV DNAとの相同
組換えが生じうるのに適した長さのものであるべきであ
る。一般に、500bp以上の隣接配列が、効率的な相
同組換えを可能にする。
酸配列を含むILTV DNA断片を、標準的なrec
DNA技術を用いて導入ベクター内に挿入する。該IL
TVDNA断片は、UL0 ORFの一部または完全な
UL0 ORF、および所望によりその隣接配列を含み
うる。第2に、ILTV UL0欠失突然変異体を得よ
うとする場合には、UL0 ORFの一部を該組換え導
入ベクターから欠失させる。これは、例えば、該組換え
ベクターインサートの適当なエキソヌクレアーゼIII
消化または制限酵素切断により、またはPCRプライマ
ーの注意深い選択により達成することができる。ILT
V挿入突然変異体を得ようとする場合には、異種核酸配
列と、所望により、発現制御配列を含むDNA断片と
を、該組換えベクター内に存在するUL0核酸配列内に
又は欠失したUL0核酸配列の代わりに挿入する。該I
LTV DNA内に導入された突然変異に隣接するIL
TV DNA配列は、ゲノムILTV DNAとの相同
組換えが生じうるのに適した長さのものであるべきであ
る。一般に、500bp以上の隣接配列が、効率的な相
同組換えを可能にする。
【0035】ついで、細胞、例えばニワトリ胚肝細胞、
ニワトリ腎細胞、好ましくはニワトリ肝細胞癌細胞系L
MH(Schnitzleinら,Avian Dis
eases 38,211−217,1994)を、突
然変異ILTV DNAインサートを含有する組換え導
入ベクターの存在下、ILTVゲノムDNAでコトラン
スフェクトすると、それにより、このインサートと該I
LTVゲノムとの間で組換えが生じる。組換えILTV
突然変異体の構築のための特に有利な方法においては、
該突然変異ILTV DNAインサートとILTVゲノ
ムDNAとを含有する組換え導入ベクターを、調節タン
パク質ICP4および/またはヘルペスウイルストラン
スアクチベーターαTIF(UL48)のILTVホモ
ログをコードする発現ベクター(例えば、pRc−UL
48)の存在下、LMH細胞の(リン酸カルシウム媒
介)コトランスフェクションに使用する。なぜなら、そ
れらはどちらも、裸のILTV DNAの感染性を増強
するからである(Fuchsら,J.Gen.Viro
l.81,627−638,2000)。
ニワトリ腎細胞、好ましくはニワトリ肝細胞癌細胞系L
MH(Schnitzleinら,Avian Dis
eases 38,211−217,1994)を、突
然変異ILTV DNAインサートを含有する組換え導
入ベクターの存在下、ILTVゲノムDNAでコトラン
スフェクトすると、それにより、このインサートと該I
LTVゲノムとの間で組換えが生じる。組換えILTV
突然変異体の構築のための特に有利な方法においては、
該突然変異ILTV DNAインサートとILTVゲノ
ムDNAとを含有する組換え導入ベクターを、調節タン
パク質ICP4および/またはヘルペスウイルストラン
スアクチベーターαTIF(UL48)のILTVホモ
ログをコードする発現ベクター(例えば、pRc−UL
48)の存在下、LMH細胞の(リン酸カルシウム媒
介)コトランスフェクションに使用する。なぜなら、そ
れらはどちらも、裸のILTV DNAの感染性を増強
するからである(Fuchsら,J.Gen.Viro
l.81,627−638,2000)。
【0036】ついで、継代した組換えウイルスを細胞培
養内で産生させ、遺伝子型または表現型により選択する
ことができる。例えば、ハイブリダイゼーションによ
り、または該組換え導入ベクターの調製中に挿入または
除去された遺伝子にコードされる酵素活性または別のス
クリーニング可能なマーカー(例えば、グリーン蛍光タ
ンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ)の存否を検出す
ることにより、それを行うことができる。継代したトラ
ンスフェクションの後代をプラークアッセイにより分析
し、予想された遺伝子型または表現型を示すプラークを
吸引により拾い集める。ついで前記ILTV突然変異体
を、マイクロタイタープレート内で増殖させた(ニワト
リ胚肝)細胞上での限外希釈により、均一になるまで精
製することができる。
養内で産生させ、遺伝子型または表現型により選択する
ことができる。例えば、ハイブリダイゼーションによ
り、または該組換え導入ベクターの調製中に挿入または
除去された遺伝子にコードされる酵素活性または別のス
クリーニング可能なマーカー(例えば、グリーン蛍光タ
ンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ)の存否を検出す
ることにより、それを行うことができる。継代したトラ
ンスフェクションの後代をプラークアッセイにより分析
し、予想された遺伝子型または表現型を示すプラークを
吸引により拾い集める。ついで前記ILTV突然変異体
を、マイクロタイタープレート内で増殖させた(ニワト
リ胚肝)細胞上での限外希釈により、均一になるまで精
製することができる。
【0037】本発明のワクチンは、例えば、商業的に入
手可能な生および不活化ILTVワクチンに一般に用い
られているような通常の方法により製造することができ
る。簡単に説明すると、前記のとおりのILTV突然変
異体を感受性基質に接種し、該ウイルスが所望の感染価
に複製するまで増殖させ、ついでILTV含有物質を回
収する。
手可能な生および不活化ILTVワクチンに一般に用い
られているような通常の方法により製造することができ
る。簡単に説明すると、前記のとおりのILTV突然変
異体を感受性基質に接種し、該ウイルスが所望の感染価
に複製するまで増殖させ、ついでILTV含有物質を回
収する。
【0038】本発明においては、ILTウイルスの複製
を支持しうる各基質を使用することが可能であり、それ
らには、初代(トリ)細胞培養、例えばニワトリ胚肝細
胞(CEL)もしくはニワトリ胚腎細胞(CEK)、ま
たはトリ細胞系、例えばLMHが含まれる。通常、該細
胞の接種後、該ウイルスを約3〜10日間増殖させ、つ
いで該感染細胞および/または該細胞培養上清を回収す
る。該感染細胞を凍結・融解して該ウイルスを遊離さ
せ、ついで該物質を凍結ストックとして保存することが
できる。
を支持しうる各基質を使用することが可能であり、それ
らには、初代(トリ)細胞培養、例えばニワトリ胚肝細
胞(CEL)もしくはニワトリ胚腎細胞(CEK)、ま
たはトリ細胞系、例えばLMHが含まれる。通常、該細
胞の接種後、該ウイルスを約3〜10日間増殖させ、つ
いで該感染細胞および/または該細胞培養上清を回収す
る。該感染細胞を凍結・融解して該ウイルスを遊離さ
せ、ついで該物質を凍結ストックとして保存することが
できる。
【0039】あるいは、該ILTV突然変異体を孵化S
PF鶏卵内で増殖させることができる。孵化卵に、例え
ば、少なくとも101 TCID50/卵を含む0.2
mlILTV突然変異体含有懸濁液またはホモジネート
を接種し、ついで37℃でインキュベートすることがで
きる。約2〜6日後、該胚および/または該膜および/
または該尿膜腔液を集め次いでこの物質を適当にホモジ
ナイズすることにより、該ILTウイルス産物を回収す
ることができる。
PF鶏卵内で増殖させることができる。孵化卵に、例え
ば、少なくとも101 TCID50/卵を含む0.2
mlILTV突然変異体含有懸濁液またはホモジネート
を接種し、ついで37℃でインキュベートすることがで
きる。約2〜6日後、該胚および/または該膜および/
または該尿膜腔液を集め次いでこの物質を適当にホモジ
ナイズすることにより、該ILTウイルス産物を回収す
ることができる。
【0040】本発明の生ワクチンは、前記のILTV突
然変異体と、そのような組成物に通常使用される薬学上
許容される担体または希釈剤とを含有する。該ワクチン
は、懸濁液の形態または凍結乾燥形態として製造し販売
することができる。担体は、安定化剤、保存剤および緩
衝剤を含む。適当な安定化剤としては、例えば、SPG
A、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、
デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコー
ス)、タンパク質(例えば、粉乳血清、アルブミンまた
はカゼイン)またはそれらの分解産物が挙げられる。適
当な緩衝剤としては、例えば、リン酸アルカリ金属が挙
げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、メル
チオラート、ゲンタマイシンおよびネオマイシンが挙げ
られる。希釈剤には、無菌生理食塩水、水性リン酸バッ
ファー、アルコールおよび多価アルコール(例えば、グ
リセロール)が含まれる。
然変異体と、そのような組成物に通常使用される薬学上
許容される担体または希釈剤とを含有する。該ワクチン
は、懸濁液の形態または凍結乾燥形態として製造し販売
することができる。担体は、安定化剤、保存剤および緩
衝剤を含む。適当な安定化剤としては、例えば、SPG
A、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、
デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコー
ス)、タンパク質(例えば、粉乳血清、アルブミンまた
はカゼイン)またはそれらの分解産物が挙げられる。適
当な緩衝剤としては、例えば、リン酸アルカリ金属が挙
げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、メル
チオラート、ゲンタマイシンおよびネオマイシンが挙げ
られる。希釈剤には、無菌生理食塩水、水性リン酸バッ
ファー、アルコールおよび多価アルコール(例えば、グ
リセロール)が含まれる。
【0041】所望により、本発明の生ワクチンはアジュ
バントを含有しうる。
バントを含有しうる。
【0042】本発明の生ワクチンの注射による投与(例
えば、筋肉内または皮下)は可能ではあるが、該ワクチ
ンは、好ましくは、家禽のワクチン接種に一般に用いら
れる安価な大量適用技術により投与する。ILTVワク
チン接種のためのこれらの技術には、飲水およびエアロ
ゾールまたは噴霧によるワクチン接種が含まれる。
えば、筋肉内または皮下)は可能ではあるが、該ワクチ
ンは、好ましくは、家禽のワクチン接種に一般に用いら
れる安価な大量適用技術により投与する。ILTVワク
チン接種のためのこれらの技術には、飲水およびエアロ
ゾールまたは噴霧によるワクチン接種が含まれる。
【0043】本発明におけるワクチン投与のための好ま
しい方法は、1000個の動物当たり>250ml/で
の、特に、大量の希釈剤の存在下では>100μmのノ
ズル滴サイズを用いる粗(coarse)噴霧によるも
のである。適当な噴霧は該動物の眼および口に対するも
のである。これは、ワクチン接種の眼−口−鼻経路を模
倣し、所望の免疫化を誘導するであろう。
しい方法は、1000個の動物当たり>250ml/で
の、特に、大量の希釈剤の存在下では>100μmのノ
ズル滴サイズを用いる粗(coarse)噴霧によるも
のである。適当な噴霧は該動物の眼および口に対するも
のである。これは、ワクチン接種の眼−口−鼻経路を模
倣し、所望の免疫化を誘導するであろう。
【0044】あるいは、該生ワクチンの投与方法には、
卵内、点眼、口−鼻および嘴浸漬の投与が含まれる。
卵内、点眼、口−鼻および嘴浸漬の投与が含まれる。
【0045】本発明のもう1つの態様においては、不活
化形態のILTV突然変異体を含むワクチンを提供す
る。該不活化ILTV突然変異体を含有するワクチン
は、例えば、この目的に適した前記の薬学上許容される
担体または希釈剤の1以上を含みうる。好ましくは、本
発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する1
以上の化合物を含む。
化形態のILTV突然変異体を含むワクチンを提供す
る。該不活化ILTV突然変異体を含有するワクチン
は、例えば、この目的に適した前記の薬学上許容される
担体または希釈剤の1以上を含みうる。好ましくは、本
発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する1
以上の化合物を含む。
【0046】本発明のワクチンは、有効量のILTV突
然変異体(すなわち、ワクチン接種されたトリにおいて
ビルレントウイルスによる攻撃に対する感染防御誘導量
の前記の免疫化ILTV突然変異体)を該有効成分とし
て含む。本発明においては、感染防御は、ワクチン接種
後のトリ群において、非ワクチン接種群と比べて有意に
高いレベルの感染防御が誘導されることと定義される。
一般には、ILTVワクチンにより誘導される防御は、
例えば実施例3に記載のとおりに死亡率および呼吸器疾
患の臨床的徴候を測定することによりアッセイされる。
然変異体(すなわち、ワクチン接種されたトリにおいて
ビルレントウイルスによる攻撃に対する感染防御誘導量
の前記の免疫化ILTV突然変異体)を該有効成分とし
て含む。本発明においては、感染防御は、ワクチン接種
後のトリ群において、非ワクチン接種群と比べて有意に
高いレベルの感染防御が誘導されることと定義される。
一般には、ILTVワクチンにより誘導される防御は、
例えば実施例3に記載のとおりに死亡率および呼吸器疾
患の臨床的徴候を測定することによりアッセイされる。
【0047】典型的には、本発明の生ワクチンは、10
1〜107 50%組織培養感染量(TCID50)/
動物の用量、好ましくは102〜105 TCID50
の用量で投与することができる。不活化ワクチンは、1
03〜109 TCID50/動物の抗原相当量を含有
しうる。
1〜107 50%組織培養感染量(TCID50)/
動物の用量、好ましくは102〜105 TCID50
の用量で投与することができる。不活化ワクチンは、1
03〜109 TCID50/動物の抗原相当量を含有
しうる。
【0048】不活化ワクチンは、通常、非経口的に、例
えば筋肉内または皮下に投与する。
えば筋肉内または皮下に投与する。
【0049】本発明のILTVワクチンはニワトリにお
いて有効に使用することができるが、他の家禽にも該
(ベクター)ワクチンで成功裡にワクチン接種すること
ができる。ニワトリには、ブロイラー、繁殖鶏および産
卵ストックが含まれる。
いて有効に使用することができるが、他の家禽にも該
(ベクター)ワクチンで成功裡にワクチン接種すること
ができる。ニワトリには、ブロイラー、繁殖鶏および産
卵ストックが含まれる。
【0050】本発明の生または不活化ワクチンを投与す
る動物の年齢は、通常の生または不活化ILTVワクチ
ンを投与する動物の年齢と同じである。例えば、4週齢
またはそれより早期に(緊急の場合)、ニワトリにワク
チン接種することができる。種禽および繁殖鶏には、通
常、8〜16週齢で第2ワクチン接種を行う。
る動物の年齢は、通常の生または不活化ILTVワクチ
ンを投与する動物の年齢と同じである。例えば、4週齢
またはそれより早期に(緊急の場合)、ニワトリにワク
チン接種することができる。種禽および繁殖鶏には、通
常、8〜16週齢で第2ワクチン接種を行う。
【0051】本発明はまた、家禽に対して感染性の他の
病原体に由来する1以上のワクチン抗原(例えば、生ま
たは不活化ワクチンウイルスまたは細菌)を該ILTV
突然変異体と共に含む混合ワクチンを含む。好ましく
は、該混合ワクチンは更に、AIV、MDV、HVT、
IBV、NDV、TRTV、レオウイルス、大腸菌、O
RT、サルモネラ種、カンピロバクター種、マイコプラ
ズマまたはアイメリア種のワクチン株の1以上を含む。
病原体に由来する1以上のワクチン抗原(例えば、生ま
たは不活化ワクチンウイルスまたは細菌)を該ILTV
突然変異体と共に含む混合ワクチンを含む。好ましく
は、該混合ワクチンは更に、AIV、MDV、HVT、
IBV、NDV、TRTV、レオウイルス、大腸菌、O
RT、サルモネラ種、カンピロバクター種、マイコプラ
ズマまたはアイメリア種のワクチン株の1以上を含む。
【0052】
【実施例】実施例1ILTV UL0欠失および挿入突然変異体の製造 ILTV UL0遺伝子配列の欠失およびレポーター遺
伝子の挿入のための導入プラスミドの構築。初代ニワト
リ胚腎(CEK)細胞に感染したILTV株A489か
ら、N−ラウロイルサルコシナート、RNアーゼおよび
プロナーゼ処理での細胞溶解、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿により、ウイルスDNAを単離した(Fu
chsおよびMettenleiter,J.Gen.
Virol.77:2221−2229,1996)。
種々の制限エンドヌクレアーゼで消化後、得られたIL
TV DNA断片を、商業的に入手可能なプラスミドベ
クター内にクローニングした。プラスミドpILT−E
43(図1A)は、pBS(−)(Stratagen
e)中に病原性ILTV株の11298bpのEcoR
I断片Bを含有する。該クローン化DNA断片は、スプ
ライシングされたmRNAから発現されることが示され
た(Ziemannら,前掲,1998)特異ILTV
遺伝子UL0およびUL[−1]を含む。
伝子の挿入のための導入プラスミドの構築。初代ニワト
リ胚腎(CEK)細胞に感染したILTV株A489か
ら、N−ラウロイルサルコシナート、RNアーゼおよび
プロナーゼ処理での細胞溶解、フェノール抽出およびエ
タノール沈殿により、ウイルスDNAを単離した(Fu
chsおよびMettenleiter,J.Gen.
Virol.77:2221−2229,1996)。
種々の制限エンドヌクレアーゼで消化後、得られたIL
TV DNA断片を、商業的に入手可能なプラスミドベ
クター内にクローニングした。プラスミドpILT−E
43(図1A)は、pBS(−)(Stratagen
e)中に病原性ILTV株の11298bpのEcoR
I断片Bを含有する。該クローン化DNA断片は、スプ
ライシングされたmRNAから発現されることが示され
た(Ziemannら,前掲,1998)特異ILTV
遺伝子UL0およびUL[−1]を含む。
【0053】いくつかのレポーター遺伝子プラスミドを
構築し、ILTV UL0遺伝子の欠失のために使用し
た。β−ガラクトシダーゼの発現には(図1B)、仮性
狂犬病ウイルス糖タンパク質G遺伝子プロモーター(M
ettenleiterおよびRauh,J.Viro
l.Methods 30,55−66,1990)の
制御下で大腸菌LacZ遺伝子を含有する3.5kbp
のSaII−BamHI断片をpSPT−18(Roc
he)に再クローニングした。さらに、pCH110
(Amersham−Pharmacia)に由来する
450bpのEcoRI−BamHI断片による該イン
サートの3’部分の置換により、SV40ポリアデニル
化シグナルが与えられた。得られたベクターpSPT−
18Z+(図1B)を、該レポーター遺伝子の両端にお
けるILTV−DNA配列の挿入により修飾した。つい
で944bpのKpnI−PstI断片および2223
bpのKnpI−SspI断片を、それぞれPstIお
よびSalI、またはSmaIおよびKpnIで消化さ
れたpSPT−18Z+内にpILT−E43から再ク
ローニングした。連結前に、不適合性付着末端をクレノ
ウポリメラーゼでの処理により平滑化した。したがっ
て、得られた導入プラスミドpΔUL0−Z(図1B)
はUL0オープンリーディングフレーム内に546bp
の欠失を示し、損なわれたILTV遺伝子と平行の配向
でLacZ発現カセットを含有する。
構築し、ILTV UL0遺伝子の欠失のために使用し
た。β−ガラクトシダーゼの発現には(図1B)、仮性
狂犬病ウイルス糖タンパク質G遺伝子プロモーター(M
ettenleiterおよびRauh,J.Viro
l.Methods 30,55−66,1990)の
制御下で大腸菌LacZ遺伝子を含有する3.5kbp
のSaII−BamHI断片をpSPT−18(Roc
he)に再クローニングした。さらに、pCH110
(Amersham−Pharmacia)に由来する
450bpのEcoRI−BamHI断片による該イン
サートの3’部分の置換により、SV40ポリアデニル
化シグナルが与えられた。得られたベクターpSPT−
18Z+(図1B)を、該レポーター遺伝子の両端にお
けるILTV−DNA配列の挿入により修飾した。つい
で944bpのKpnI−PstI断片および2223
bpのKnpI−SspI断片を、それぞれPstIお
よびSalI、またはSmaIおよびKpnIで消化さ
れたpSPT−18Z+内にpILT−E43から再ク
ローニングした。連結前に、不適合性付着末端をクレノ
ウポリメラーゼでの処理により平滑化した。したがっ
て、得られた導入プラスミドpΔUL0−Z(図1B)
はUL0オープンリーディングフレーム内に546bp
の欠失を示し、損なわれたILTV遺伝子と平行の配向
でLacZ発現カセットを含有する。
【0054】増加したグリーン蛍光タンパク質(EGF
P)の発現に使用する全ての構築物をpEGFP−N1
(Clontech)から誘導した。このプラスミドか
ら、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモータ
ー(PHCMV−IE)とEGFPオープンリーディン
グフレームとの間のマルチクローニング部位をBglI
IおよびBamHIでの二重消化により除去し、ついで
連結した。pB1−GFP(図1C)を得るために、該
修飾発現カセットを1581bpのAseI−AflI
I断片として切り出し、クレノウポリメラーゼで処理
し、SmaIで消化されたベクターpBluescri
pt SK(−)(Stratagene)のポリリン
カー領域内に挿入した。ついでpILT−E43の30
03bpのBglII−BsrBIおよび1818bp
のClaI−XhoI断片を、BamHIおよびAfl
II、またはClaIおよびXhoIで二重消化された
pBl−GFP内に挿入することにより、導入プラスミ
ドpΔUL0−G1(図1C)を作製した。該予備形成
欠失体は、全イントロン配列を含む984bpのILT
V UL0遺伝子を含み、該レポーター遺伝子挿入体
は、この場合にも、該欠失ウイルス遺伝子と平行の配向
で存在する。
P)の発現に使用する全ての構築物をpEGFP−N1
(Clontech)から誘導した。このプラスミドか
ら、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモータ
ー(PHCMV−IE)とEGFPオープンリーディン
グフレームとの間のマルチクローニング部位をBglI
IおよびBamHIでの二重消化により除去し、ついで
連結した。pB1−GFP(図1C)を得るために、該
修飾発現カセットを1581bpのAseI−AflI
I断片として切り出し、クレノウポリメラーゼで処理
し、SmaIで消化されたベクターpBluescri
pt SK(−)(Stratagene)のポリリン
カー領域内に挿入した。ついでpILT−E43の30
03bpのBglII−BsrBIおよび1818bp
のClaI−XhoI断片を、BamHIおよびAfl
II、またはClaIおよびXhoIで二重消化された
pBl−GFP内に挿入することにより、導入プラスミ
ドpΔUL0−G1(図1C)を作製した。該予備形成
欠失体は、全イントロン配列を含む984bpのILT
V UL0遺伝子を含み、該レポーター遺伝子挿入体
は、この場合にも、該欠失ウイルス遺伝子と平行の配向
で存在する。
【0055】従来の研究はILTV感染細胞内でのUL
0タンパク質の豊富な発現を示していたため、外来遺伝
子発現に対する該UL0遺伝子プロモーターの適合性を
試験した。ついで、望ましくない制限部位を除去するた
めに、pILT−E43のインサートを、HindII
I−BstXIおよびXhoI−EcoRIでの二重消
化ならびにそれに続くクレノウ処理および連結により短
縮化した。得られたプラスミドpILT−E43BX
(図1D)から、UL0の開始コドンを含む1141b
pのXbaI−BssHII断片を除去し、いずれのプ
ロモーター配列をも伴わないでEGFPオープンリーデ
ィングフレームを含有するpEGFP−N1(Clon
tech)の802bpのXbaI−BglII断片で
置換した。pΔUL0−G2においては、ウイルスUL
0リーディングフレームの主要部分をEGFPのもので
置換したが、同時に構築したプラスミドpΔUL0は、
同じ欠失を示すが、外来DNA配列を含有しない(図1
D)。
0タンパク質の豊富な発現を示していたため、外来遺伝
子発現に対する該UL0遺伝子プロモーターの適合性を
試験した。ついで、望ましくない制限部位を除去するた
めに、pILT−E43のインサートを、HindII
I−BstXIおよびXhoI−EcoRIでの二重消
化ならびにそれに続くクレノウ処理および連結により短
縮化した。得られたプラスミドpILT−E43BX
(図1D)から、UL0の開始コドンを含む1141b
pのXbaI−BssHII断片を除去し、いずれのプ
ロモーター配列をも伴わないでEGFPオープンリーデ
ィングフレームを含有するpEGFP−N1(Clon
tech)の802bpのXbaI−BglII断片で
置換した。pΔUL0−G2においては、ウイルスUL
0リーディングフレームの主要部分をEGFPのもので
置換したが、同時に構築したプラスミドpΔUL0は、
同じ欠失を示すが、外来DNA配列を含有しない(図1
D)。
【0056】導入プラスミドおよびAIV HA発現I
LTV突然変異体の構築最近単離された高い病原性(高
病原性)のH5N2サブタイプAIV A/Italy
/8/98の血球凝集素(HA)遺伝子を逆転写させ、
真核性発現ベクターpcDNA3(Invitroge
n)内にクローニングし、配列決定した(Luscho
wら,Vaccine,vol.19,p.4249−
4259,2001,およびGenBankアクセッシ
ョン番号AJ305306)。得られた発現プラスミド
pCD−HA5から、HCMV−IEプロモーターと共
にHA遺伝子を、2646bpのNruI/NotI断
片として、EcoRI/XbaIで二重消化されたプラ
スミドpΔUL0−G2内に一本鎖突出部のクレノウ追
加後に挿入した。得られたプラスミドpΔUL0−HA
5Aにおいては、EGFPリーディングフレームはHA
発現カセット(これは、UL0、UL1およびUL2の
共通のポリアデニル化シグナルを利用するためにUL0
と平行の配向で存在する)により置換されている。最後
に、該HCMV−プロモーターを、BamHIおよびX
hoIでの消化、クレノウ処理および再連結により除去
した。したがって、今や、プラスミドpΔUL0−HA
5Bから、ILTV UL0遺伝子プロモーターの制御
下で血球凝集素が発現されうる。
LTV突然変異体の構築最近単離された高い病原性(高
病原性)のH5N2サブタイプAIV A/Italy
/8/98の血球凝集素(HA)遺伝子を逆転写させ、
真核性発現ベクターpcDNA3(Invitroge
n)内にクローニングし、配列決定した(Luscho
wら,Vaccine,vol.19,p.4249−
4259,2001,およびGenBankアクセッシ
ョン番号AJ305306)。得られた発現プラスミド
pCD−HA5から、HCMV−IEプロモーターと共
にHA遺伝子を、2646bpのNruI/NotI断
片として、EcoRI/XbaIで二重消化されたプラ
スミドpΔUL0−G2内に一本鎖突出部のクレノウ追
加後に挿入した。得られたプラスミドpΔUL0−HA
5Aにおいては、EGFPリーディングフレームはHA
発現カセット(これは、UL0、UL1およびUL2の
共通のポリアデニル化シグナルを利用するためにUL0
と平行の配向で存在する)により置換されている。最後
に、該HCMV−プロモーターを、BamHIおよびX
hoIでの消化、クレノウ処理および再連結により除去
した。したがって、今や、プラスミドpΔUL0−HA
5Bから、ILTV UL0遺伝子プロモーターの制御
下で血球凝集素が発現されうる。
【0057】第2のアプローチにおいては、高病原性H
7N1サブタイプAIV A/Italy/445/9
9のHA遺伝子を逆転写させ、PCRにより増幅した。
1711bpの産物を、SmaIで消化されたベクター
pUC18(Amersham)内にクローニングし、
配列決定した(配列番号1)。得られたプラスミドをX
baIおよびHindIIIで二重消化し、クレノウ処
理後、HCMV−IEプロモーターを、pcDNA3の
681bpのHindIII/NruI断片として、H
Aオープンリーディングフレームの5’末端に挿入し
た。ついで該HA発現カセットを、2437bpのKp
nI/HindIII断片として、Xba/HindI
II二重消化プラスミドpΔUL0−G2内に不適合性
一本鎖突出部の平滑化後に再クローニングした。最終的
に得られたプラスミドpΔUL0−HA7(図1E)
は、ILTVの欠失UL0オープンリーディングフレー
ムと平行の配向でHCMV−IEプロモーターの制御下
でH7型HA遺伝子を含有する。
7N1サブタイプAIV A/Italy/445/9
9のHA遺伝子を逆転写させ、PCRにより増幅した。
1711bpの産物を、SmaIで消化されたベクター
pUC18(Amersham)内にクローニングし、
配列決定した(配列番号1)。得られたプラスミドをX
baIおよびHindIIIで二重消化し、クレノウ処
理後、HCMV−IEプロモーターを、pcDNA3の
681bpのHindIII/NruI断片として、H
Aオープンリーディングフレームの5’末端に挿入し
た。ついで該HA発現カセットを、2437bpのKp
nI/HindIII断片として、Xba/HindI
II二重消化プラスミドpΔUL0−G2内に不適合性
一本鎖突出部の平滑化後に再クローニングした。最終的
に得られたプラスミドpΔUL0−HA7(図1E)
は、ILTVの欠失UL0オープンリーディングフレー
ムと平行の配向でHCMV−IEプロモーターの制御下
でH7型HA遺伝子を含有する。
【0058】それらの3つの導入プラスミド(図1E)
を、所望の非蛍光ILTV組換え体の選択を促進するI
LTV pΔUL0−G1のウイルスDNAと共に、細
胞のコトランスフェクションに使用した。
を、所望の非蛍光ILTV組換え体の選択を促進するI
LTV pΔUL0−G1のウイルスDNAと共に、細
胞のコトランスフェクションに使用した。
【0059】組換えILTV UL0突然変異体の作製 トランスフェクトされたCEKまたはニワトリ肝細胞癌
細胞における単離されたILTV DNAの感染性は非
常に低いため、ウイルストランスアクチベーターの発現
プラスミドを作製した。その目的のために、アルファヘ
ルペスウイルストランスアクチベーターの推定ホモログ
(VP16,αTIF;RoizmanおよびSear
s,Fields Virology 第3版:223
1−2295,1996)をコードするILTVのUL
48オープンリーディングフレーム(Ziemann
ら,J.Virology 72:847−852,1
998)を、HCMV−IEプロモーターの制御下で構
成的遺伝子発現を可能にするpRc−CMV(Invi
trogen)内に2259bpのNcoI−SpeI
断片として再クローニングした。ILTV−DNAおよ
び発現プラスミドpRc−UL48での細胞のリン酸カ
ルシウムコトランスフェクション(Grahamおよび
van der Eb,Virology 52:45
6−467,1973)の後、ウイルスプラーク数は、
対照プラスミドで得られた又はいずれのプラスミドも使
用しないで得られた結果(Fuchsら,2000,前
掲)と比較して実質的に増加した。
細胞における単離されたILTV DNAの感染性は非
常に低いため、ウイルストランスアクチベーターの発現
プラスミドを作製した。その目的のために、アルファヘ
ルペスウイルストランスアクチベーターの推定ホモログ
(VP16,αTIF;RoizmanおよびSear
s,Fields Virology 第3版:223
1−2295,1996)をコードするILTVのUL
48オープンリーディングフレーム(Ziemann
ら,J.Virology 72:847−852,1
998)を、HCMV−IEプロモーターの制御下で構
成的遺伝子発現を可能にするpRc−CMV(Invi
trogen)内に2259bpのNcoI−SpeI
断片として再クローニングした。ILTV−DNAおよ
び発現プラスミドpRc−UL48での細胞のリン酸カ
ルシウムコトランスフェクション(Grahamおよび
van der Eb,Virology 52:45
6−467,1973)の後、ウイルスプラーク数は、
対照プラスミドで得られた又はいずれのプラスミドも使
用しないで得られた結果(Fuchsら,2000,前
掲)と比較して実質的に増加した。
【0060】ウイルス組換え体の作製のために、CEK
またはLMH細胞をILTV DNA、pRc−UL4
8および所望の導入プラスミドでコトランスフェクトし
た。5〜7日後、該細胞を培地内に擦り取り、凍結およ
び融解により細胞溶解した。96ウェルプレート内で増
殖させたCEK細胞上での限界希釈により、ウイルス後
代を分析した。EGFPを発現するILTV組換え体は
蛍光顕微鏡検査により直接的に同定することができた
が、β−ガラクトシダーゼ活性は、300μg/ml
BluoGal(Gibco BRL)を含有する培地
でのインビボ染色により検出した。ウイルス組換え体を
回収し、予想された表現型を全てのプラークが示すまで
精製を繰返した。最後に、ウイルスDNAを調製し、制
限分析、サザンブロットハイブリダイゼーションおよび
PCRにより特定して、正しい欠失または挿入を確認し
た。
またはLMH細胞をILTV DNA、pRc−UL4
8および所望の導入プラスミドでコトランスフェクトし
た。5〜7日後、該細胞を培地内に擦り取り、凍結およ
び融解により細胞溶解した。96ウェルプレート内で増
殖させたCEK細胞上での限界希釈により、ウイルス後
代を分析した。EGFPを発現するILTV組換え体は
蛍光顕微鏡検査により直接的に同定することができた
が、β−ガラクトシダーゼ活性は、300μg/ml
BluoGal(Gibco BRL)を含有する培地
でのインビボ染色により検出した。ウイルス組換え体を
回収し、予想された表現型を全てのプラークが示すまで
精製を繰返した。最後に、ウイルスDNAを調製し、制
限分析、サザンブロットハイブリダイゼーションおよび
PCRにより特定して、正しい欠失または挿入を確認し
た。
【0061】病原性野生型株のウイルスDNAをコトラ
ンスフェクションに使用して、ILTV組換え体ΔUL
0−Z、ΔUL0−G1およびΔUL0−G2(図1
B、1Cおよび1D)を得た。レスキュー突然変異体
(ILTV UL0R;図1A)、外来配列を有さない
欠失突然変異体(ILTV ΔUL0;図1D)、およ
びHA発現組換え体(ILTV ΔUL0−HA5A、
ILTV ΔUL0−HA5B、ILTV ΔUL0−
HA7;図1E)の作製のために、ILTV ΔUL0
−G1、およびpILT−E43、またはΔUL0、ま
たはΔUL0−G2のそれぞれの誘導体のDNAでコト
ランスフェクションを行った。これらの場合には、該ウ
イルス後代をCEK細胞上で非蛍光プラークに関してス
クリーニングした。
ンスフェクションに使用して、ILTV組換え体ΔUL
0−Z、ΔUL0−G1およびΔUL0−G2(図1
B、1Cおよび1D)を得た。レスキュー突然変異体
(ILTV UL0R;図1A)、外来配列を有さない
欠失突然変異体(ILTV ΔUL0;図1D)、およ
びHA発現組換え体(ILTV ΔUL0−HA5A、
ILTV ΔUL0−HA5B、ILTV ΔUL0−
HA7;図1E)の作製のために、ILTV ΔUL0
−G1、およびpILT−E43、またはΔUL0、ま
たはΔUL0−G2のそれぞれの誘導体のDNAでコト
ランスフェクションを行った。これらの場合には、該ウ
イルス後代をCEK細胞上で非蛍光プラークに関してス
クリーニングした。
【0062】組換えILTV UL0突然変異体のイン
ビトロでの特定 ILTVの単離されたUL−欠失突然変異体が天然UL
0遺伝子産物を発現しないことを確認するために、CE
K細胞にそれぞれの欠失突然変異体を5pfu/細胞の
m.o.i.で感染させ、それを37℃で24時間イン
キュベートした。ついで、標準的な技術に従い、該細胞
を細胞溶解し、タンパク質を不連続SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルター
に転移した。ウエスタンブロットを、記載のとおりに
(FuchsおよびMettenleiter,J.G
en.Virol.80,2173−2182,199
9)、UL0特異的ウサギ抗血清(Ziemannら,
前掲,1998)またはモノクローナルgC特異的抗体
と共にインキュベートし加工した。すべてのレーンがM
oabとの反応を示したが、野生型ウイルスまたはUL
0レスキュー突然変異体感染細胞においてのみ、63k
DaのUL0タンパク質が検出可能であった(図2)。
該UL0欠失突然変異体のいずれかが、該遺伝子の非欠
失部分から、より小さなタンパク質を安定に発現したと
いう証拠は認められなかった。AIVサブタイプ特異的
ニワトリ抗血清での感染細胞ライセートのウエスタンブ
ロット分析は更に、ILTV ΔUL0−HA7による
H7型血球凝集素の、およびILTV ΔUL0−HA
5AによるH5型血球凝集素の、豊富な発現を証明した
が、ILTV ΔUL0−HA5Bに感染した細胞にお
いては、該外来タンパク質は明らかには検出可能でなか
った。
ビトロでの特定 ILTVの単離されたUL−欠失突然変異体が天然UL
0遺伝子産物を発現しないことを確認するために、CE
K細胞にそれぞれの欠失突然変異体を5pfu/細胞の
m.o.i.で感染させ、それを37℃で24時間イン
キュベートした。ついで、標準的な技術に従い、該細胞
を細胞溶解し、タンパク質を不連続SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルター
に転移した。ウエスタンブロットを、記載のとおりに
(FuchsおよびMettenleiter,J.G
en.Virol.80,2173−2182,199
9)、UL0特異的ウサギ抗血清(Ziemannら,
前掲,1998)またはモノクローナルgC特異的抗体
と共にインキュベートし加工した。すべてのレーンがM
oabとの反応を示したが、野生型ウイルスまたはUL
0レスキュー突然変異体感染細胞においてのみ、63k
DaのUL0タンパク質が検出可能であった(図2)。
該UL0欠失突然変異体のいずれかが、該遺伝子の非欠
失部分から、より小さなタンパク質を安定に発現したと
いう証拠は認められなかった。AIVサブタイプ特異的
ニワトリ抗血清での感染細胞ライセートのウエスタンブ
ロット分析は更に、ILTV ΔUL0−HA7による
H7型血球凝集素の、およびILTV ΔUL0−HA
5AによるH5型血球凝集素の、豊富な発現を証明した
が、ILTV ΔUL0−HA5Bに感染した細胞にお
いては、該外来タンパク質は明らかには検出可能でなか
った。
【0063】実施例2ILTV UL0突然変異体の培養および力価測定 組換え体および対照ILTウイルスの製造は、当業者に
おいて公知の技術を用いる9〜11日齢の孵化SPF鶏
卵の排泄(dropped)漿尿膜(CAM)上への接
種により行った。37℃で5〜6日間のインキュベーシ
ョンの後、該CAMを回収し、ホモジナイズし、100
μm フィルター濾過し、力価測定した。
おいて公知の技術を用いる9〜11日齢の孵化SPF鶏
卵の排泄(dropped)漿尿膜(CAM)上への接
種により行った。37℃で5〜6日間のインキュベーシ
ョンの後、該CAMを回収し、ホモジナイズし、100
μm フィルター濾過し、力価測定した。
【0064】LMH細胞における該ウイルスの力価測定
は、Leghorn雄肝細胞癌細胞(LMH)上で行っ
た。96ウェルプレート内で、LMH細胞の半コンフル
エントな単層にILTウイルスサンプルの段階希釈物を
感染させた。適当な陽性および陰性対照を含めた。該プ
レートを5日間インキュベートし、該細胞を氷冷エタノ
ールで固定し、FITCと共役した抗ニワトリIgGヤ
ギ抗体およびILTに対するポリクローナルニワトリ抗
血清を使用する標準的な免疫蛍光プロトコールにより、
ILTウイルスの存在に関して染色した。ILTウイル
スが複製されている明るい緑色の蛍光を示すウェルは陽
性とみなされる。力価は、Spearman−Karb
erアルゴリズムを使用してLog10 TCID50
値として示されている。
は、Leghorn雄肝細胞癌細胞(LMH)上で行っ
た。96ウェルプレート内で、LMH細胞の半コンフル
エントな単層にILTウイルスサンプルの段階希釈物を
感染させた。適当な陽性および陰性対照を含めた。該プ
レートを5日間インキュベートし、該細胞を氷冷エタノ
ールで固定し、FITCと共役した抗ニワトリIgGヤ
ギ抗体およびILTに対するポリクローナルニワトリ抗
血清を使用する標準的な免疫蛍光プロトコールにより、
ILTウイルスの存在に関して染色した。ILTウイル
スが複製されている明るい緑色の蛍光を示すウェルは陽
性とみなされる。力価は、Spearman−Karb
erアルゴリズムを使用してLog10 TCID50
値として示されている。
【0065】組換えILTVが大量投与のためのワクチ
ンとして適用可能であるためには、良好な増殖収量が不
可欠であるため、適用される遺伝子欠失は、それが高い
力価にまで増殖する能力を損なうものであるべきではな
い。ΔUL0のほかに、対応する遺伝子産物の不存在を
もたらす遺伝子欠失を保持するいくつかの更なるILT
組換え体が構築されており、これらは全て、CAMホモ
ジネートからウイルスを産生させるために受精卵内に接
種されている。ある組換え体に可能な最大収量を得るた
めに、いくつかのインキュベーションおよび回収を行っ
た。驚くべきことに、該UL0欠失は、未欠失野生型親
ウイルスの収量と少なくとも同程度に良好な力価までの
卵内での複製を可能にするが、その他のILTV欠失組
換え体は、それよりはるかに低いか又は検出不可能なウ
イルス収量を与える。この好ましい能力は、LacZま
たはAIV H7の遺伝子が挿入された場合に維持され
る。表1を参照されたい。
ンとして適用可能であるためには、良好な増殖収量が不
可欠であるため、適用される遺伝子欠失は、それが高い
力価にまで増殖する能力を損なうものであるべきではな
い。ΔUL0のほかに、対応する遺伝子産物の不存在を
もたらす遺伝子欠失を保持するいくつかの更なるILT
組換え体が構築されており、これらは全て、CAMホモ
ジネートからウイルスを産生させるために受精卵内に接
種されている。ある組換え体に可能な最大収量を得るた
めに、いくつかのインキュベーションおよび回収を行っ
た。驚くべきことに、該UL0欠失は、未欠失野生型親
ウイルスの収量と少なくとも同程度に良好な力価までの
卵内での複製を可能にするが、その他のILTV欠失組
換え体は、それよりはるかに低いか又は検出不可能なウ
イルス収量を与える。この好ましい能力は、LacZま
たはAIV H7の遺伝子が挿入された場合に維持され
る。表1を参照されたい。
【0066】
【表1】
【0067】実施例3ILTV UL0突然変異体の弱毒化を測定するための
動物試験 該UL0遺伝子内の欠失/挿入の導入により得られた弱
毒化のレベルを評価するために、動物実験を行った。I
LTVに関するこの目的のための標準試験は、感受性ニ
ワトリの気管内にウイルスサンプルを直接接種し、臨床
的徴候のレベルまたは死亡動物数を9〜10日間にわた
り観察するというものである。比較として、突然変異し
たウイルスDNAの供与体として働くビルレント野生型
ILT株A489のウイルスサンプル(ホモジナイズし
濾過したCAM)、および模擬感染CAMからの同様の
サンプルを調製した。ILT感染における病状は、投与
量と直接的に関連するため、種々の用量を試験すること
が重要である。
動物試験 該UL0遺伝子内の欠失/挿入の導入により得られた弱
毒化のレベルを評価するために、動物実験を行った。I
LTVに関するこの目的のための標準試験は、感受性ニ
ワトリの気管内にウイルスサンプルを直接接種し、臨床
的徴候のレベルまたは死亡動物数を9〜10日間にわた
り観察するというものである。比較として、突然変異し
たウイルスDNAの供与体として働くビルレント野生型
ILT株A489のウイルスサンプル(ホモジナイズし
濾過したCAM)、および模擬感染CAMからの同様の
サンプルを調製した。ILT感染における病状は、投与
量と直接的に関連するため、種々の用量を試験すること
が重要である。
【0068】したがって、ウイルスサンプルを増幅し、
前記のとおりにLMH細胞上で三重に力価測定し、10
日齢SPFひなニワトリへの気管内経路の0.2ml/
動物での接種に使用した。異なる処理群は、20個の動
物の群として、負圧隔離装置内に個々に収容した。該ひ
なニワトリを9日間観察し、呼吸器疾患に関連した臨床
的徴候を、以下の表に従い毎日評価した。
前記のとおりにLMH細胞上で三重に力価測定し、10
日齢SPFひなニワトリへの気管内経路の0.2ml/
動物での接種に使用した。異なる処理群は、20個の動
物の群として、負圧隔離装置内に個々に収容した。該ひ
なニワトリを9日間観察し、呼吸器疾患に関連した臨床
的徴候を、以下の表に従い毎日評価した。
【0069】スコア0:(呼吸器)疾患の徴候が無い。 スコア1:軽度の呼吸困難;動物は鈍く、元気がなく、
若干の咳をし、頭を振る。 スコア2:重度の呼吸困難;あえぎ、ポンプ呼吸、咳、
動物は横臥、結膜炎、鼻滲出。 スコア3:動物は死亡。
若干の咳をし、頭を振る。 スコア2:重度の呼吸困難;あえぎ、ポンプ呼吸、咳、
動物は横臥、結膜炎、鼻滲出。 スコア3:動物は死亡。
【0070】実験方法1においては、ΔUL0+Zを未
感染CAMおよびA489感染CAMと比較した。ΔU
L0+Zを2つの用量で試験した。
感染CAMおよびA489感染CAMと比較した。ΔU
L0+Zを2つの用量で試験した。
【0071】実験方法2においては、同じ処理プロトコ
ールで、もう一度同じ実験を繰返した。今回は、ΔUL
0組換え体を加え、それに関しても2つの用量で試験し
た。
ールで、もう一度同じ実験を繰返した。今回は、ΔUL
0組換え体を加え、それに関しても2つの用量で試験し
た。
【0072】最後に、実験方法3において、同様の実験
を行った。今回は、UL0遺伝子座にAIV HA7イ
ンサートを保持する2つの用量の組換えILTウイルス
を試験した。
を行った。今回は、UL0遺伝子座にAIV HA7イ
ンサートを保持する2つの用量の組換えILTウイルス
を試験した。
【0073】結果(表2および図3A〜Cに示す)は、
すべてのUL0欠失が、それらが由来する野生型ウイル
スと比較して相当に低い死亡率を誘導することを示して
いる。臨床的徴候の重症度は有意に減少しているが、Δ
UL0+ZおよびΔUL0においては、いくらかの残存
病原性が残っている。該AIV H7インサートの挿入
は更に、これをゼロにまで減少させる。しかし、全3個
の組換え体は、気管内において及びCAM上への接種に
際して有効に複製する特性を維持している(表1を参照
されたい)。
すべてのUL0欠失が、それらが由来する野生型ウイル
スと比較して相当に低い死亡率を誘導することを示して
いる。臨床的徴候の重症度は有意に減少しているが、Δ
UL0+ZおよびΔUL0においては、いくらかの残存
病原性が残っている。該AIV H7インサートの挿入
は更に、これをゼロにまで減少させる。しかし、全3個
の組換え体は、気管内において及びCAM上への接種に
際して有効に複製する特性を維持している(表1を参照
されたい)。
【0074】
【表2】
【0075】実施例4ビルレントILTVおよび高病原性AIVでの攻撃感染
に対するワクチン接種ニワトリの防御を測定するための
動物実験 生ウイルスワクチンとしての及び他の病原体に対してニ
ワトリを防御しうる外来抗原発現ベクターとしてのIL
TVのUL0欠失突然変異体の適合性を試験するため
に、更に動物実験を行った。その目的のために、10週
齢SPFニワトリを、103〜104プラーク形成単位
(pfu)/動物のILTV ΔUL0またはILTV
ΔUL0−HA7の点眼により免疫した。予想どお
り、免疫後もすべての動物が生存し、それらの少数で、
ILTの無視しうる臨床的徴候を示した(表3)。免疫
の2週間後、全動物から血清を集め、ILTV特異的お
よびHA特異的抗体に関して調べた。間接免疫蛍光試験
(Luschowら,2001,前掲)により、ILT
V特異的抗体が、両免疫群のサンプルの70%以上にお
いて明らかに検出された(表3)。また、ILTV Δ
UL0−HA7で免疫した全てのニワトリが、抗原供与
体としてAIV A/Italy/445/99(H7
N1)を使用する血球凝集抑制試験(HAI;Alex
ander DJ,In:OIE Manual of
Standards for Diagnostic
Tests and Vaccines,155−1
60,1996)により示されるとおり、HA特異的抗
体を産生した(表3)。
に対するワクチン接種ニワトリの防御を測定するための
動物実験 生ウイルスワクチンとしての及び他の病原体に対してニ
ワトリを防御しうる外来抗原発現ベクターとしてのIL
TVのUL0欠失突然変異体の適合性を試験するため
に、更に動物実験を行った。その目的のために、10週
齢SPFニワトリを、103〜104プラーク形成単位
(pfu)/動物のILTV ΔUL0またはILTV
ΔUL0−HA7の点眼により免疫した。予想どお
り、免疫後もすべての動物が生存し、それらの少数で、
ILTの無視しうる臨床的徴候を示した(表3)。免疫
の2週間後、全動物から血清を集め、ILTV特異的お
よびHA特異的抗体に関して調べた。間接免疫蛍光試験
(Luschowら,2001,前掲)により、ILT
V特異的抗体が、両免疫群のサンプルの70%以上にお
いて明らかに検出された(表3)。また、ILTV Δ
UL0−HA7で免疫した全てのニワトリが、抗原供与
体としてAIV A/Italy/445/99(H7
N1)を使用する血球凝集抑制試験(HAI;Alex
ander DJ,In:OIE Manual of
Standards for Diagnostic
Tests and Vaccines,155−1
60,1996)により示されるとおり、HA特異的抗
体を産生した(表3)。
【0076】25日後、ワクチン接種ニワトリの亜群
(群1A、2A)および未免疫対照動物(群3)を、2
×105 pfu/動物のビルレント野生型ILTV
(A489)の気管内投与により攻撃した。死亡率およ
びILTの臨床的徴候をモニターし、前記のとおりに定
量した(実施例3)。各群の全動物の平均臨床スコア
を、感染後2〜12日間にわたり測定した(表3)。す
べての未免疫対照動物は、4例中2例で死を招く重篤な
疾患徴候を示した。これに対して、すべてのワクチン接
種動物は生存し、それらのほとんどは健康のままであっ
た。これらの結果は、ILTVのUL0欠失突然変異体
での生ウイルスワクチン接種が、後のILTV感染に対
する防御免疫を付与することを明らかに示している。
(群1A、2A)および未免疫対照動物(群3)を、2
×105 pfu/動物のビルレント野生型ILTV
(A489)の気管内投与により攻撃した。死亡率およ
びILTの臨床的徴候をモニターし、前記のとおりに定
量した(実施例3)。各群の全動物の平均臨床スコア
を、感染後2〜12日間にわたり測定した(表3)。す
べての未免疫対照動物は、4例中2例で死を招く重篤な
疾患徴候を示した。これに対して、すべてのワクチン接
種動物は生存し、それらのほとんどは健康のままであっ
た。これらの結果は、ILTVのUL0欠失突然変異体
での生ウイルスワクチン接種が、後のILTV感染に対
する防御免疫を付与することを明らかに示している。
【0077】ILTV ΔUL0−HA7またはILT
V ΔUL0でワクチン接種したニワトリの他の2亜群
(1B、2B)を、108胚感染量(EID50)/動
物の高病原性AIV分離体A/Italy/445/9
9(H7N1)(これは同様に、ILTV ΔUL0−
H7により発現されるHA遺伝子の供与体である)を鼻
腔内投与により感染させた。未免疫動物(示されていな
い)と同様に、ILTV ΔUL0でワクチン接種され
た全てのニワトリは、AIV感染後4日以内に死亡した
(表3)。これに対して、ILTV ΔUL0−HA7
で免疫した全ての動物は致死量のAIV感染後にも生存
し、疾患の重症度は実質的に減少した。トリインフルエ
ンザの臨床的徴候を以下のとおりに個々に評価した。 スコア0:動物は健康。 スコア1:下痢、または水腫、または動物は元気がな
い。 スコア2:動物は横臥し、起き上がることができない。 スコア3:動物は死亡。
V ΔUL0でワクチン接種したニワトリの他の2亜群
(1B、2B)を、108胚感染量(EID50)/動
物の高病原性AIV分離体A/Italy/445/9
9(H7N1)(これは同様に、ILTV ΔUL0−
H7により発現されるHA遺伝子の供与体である)を鼻
腔内投与により感染させた。未免疫動物(示されていな
い)と同様に、ILTV ΔUL0でワクチン接種され
た全てのニワトリは、AIV感染後4日以内に死亡した
(表3)。これに対して、ILTV ΔUL0−HA7
で免疫した全ての動物は致死量のAIV感染後にも生存
し、疾患の重症度は実質的に減少した。トリインフルエ
ンザの臨床的徴候を以下のとおりに個々に評価した。 スコア0:動物は健康。 スコア1:下痢、または水腫、または動物は元気がな
い。 スコア2:動物は横臥し、起き上がることができない。 スコア3:動物は死亡。
【0078】攻撃後1〜10日間の各群の平均スコアを
計算した(表3)。ニワトリ胚への気管および排泄腔ス
ワブの接種による測定では(Alexander D
J,前掲,1996)、該ワクチン接種動物の多数が該
AIVウイルスを放出したが、それは、非常に限られた
期間に過ぎなかった。したがって、H7血球凝集素を発
現するUL0陰性ILTV組換え体でのニワトリへの単
一の生ウイルスワクチン接種は、対応する血清型の高病
原性AIVにより引き起こされる家禽ペストに対する感
染防御免疫の誘導に十分なものである。
計算した(表3)。ニワトリ胚への気管および排泄腔ス
ワブの接種による測定では(Alexander D
J,前掲,1996)、該ワクチン接種動物の多数が該
AIVウイルスを放出したが、それは、非常に限られた
期間に過ぎなかった。したがって、H7血球凝集素を発
現するUL0陰性ILTV組換え体でのニワトリへの単
一の生ウイルスワクチン接種は、対応する血清型の高病
原性AIVにより引き起こされる家禽ペストに対する感
染防御免疫の誘導に十分なものである。
【0079】
【表3】
【0080】
【配列表】
【0081】
【化1】
【図1】ILTVゲノムのゲノム地図および導入プラス
ミドの構築。導入プラスミドの作製のための関連制限部
位、異種配列、プロモーターおよびポリAシグナルが示
されている。ILTV組換え体(太字のイタリック体で
示されている)は、導入プラスミドおよびビリオンDN
Aでの細胞のコトランスフェクションの後に単離するこ
とができた。
ミドの構築。導入プラスミドの作製のための関連制限部
位、異種配列、プロモーターおよびポリAシグナルが示
されている。ILTV組換え体(太字のイタリック体で
示されている)は、導入プラスミドおよびビリオンDN
Aでの細胞のコトランスフェクションの後に単離するこ
とができた。
【図2】未感染(n.i.)およびILTV感染(5
pfu/細胞、24時間 p.i.)CEK細胞の溶解
物を不連続SDS−10% ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。ウエスタンブロットでUL0特異的または
gC特異的抗体と共にインキュベートした。ペルオキシ
ダーゼ共役二次抗体の結合を化学発光により検出し、X
線フィルム上でモニターした。左側に分子マーカーが示
されている。
pfu/細胞、24時間 p.i.)CEK細胞の溶解
物を不連続SDS−10% ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。ウエスタンブロットでUL0特異的または
gC特異的抗体と共にインキュベートした。ペルオキシ
ダーゼ共役二次抗体の結合を化学発光により検出し、X
線フィルム上でモニターした。左側に分子マーカーが示
されている。
【図3A】ILTV突然変異体ΔUL0、ΔUL0−L
acZおよびΔUL0−HA7ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均/処理群/日であり、実施例3に概
説されているとおりに測定される。
acZおよびΔUL0−HA7ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均/処理群/日であり、実施例3に概
説されているとおりに測定される。
【図3B】ILTV突然変異体ΔUL0、ΔUL0−L
acZおよびΔUL0−HA7ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均/処理群/日であり、実施例3に概
説されているとおりに測定される。
acZおよびΔUL0−HA7ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均/処理群/日であり、実施例3に概
説されているとおりに測定される。
【図3C】ILTV突然変異体ΔUL0、ΔUL0−L
acZおよびΔUL0−HA7ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均/処理群/日であり、実施例3に概
説されているとおりに測定される。
acZおよびΔUL0−HA7ならびに適当な対照の残
存病原性を測定するために行った動物試験において観察
された呼吸器疾患の臨床的徴候に関するスコアのグラフ
表示。スコアは平均/処理群/日であり、実施例3に概
説されているとおりに測定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 39/17 A61K 39/17 45/00 45/00 48/00 48/00 A61P 31/12 171 A61P 31/12 171 31/16 31/16 31/22 31/22 C12N 5/10 ZNA C12N 5/00 ZNAB Fターム(参考) 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 AC20 BA02 BA14 CA24 CA45 4C084 AA13 AA19 MA02 MA66 NA14 ZB331 ZC611 4C085 AA03 AA04 BA07 BA21 BA51 BA55 BA59 BA65 BA78 DD62 EE03 FF24 GG01 GG08
Claims (10)
- 【請求項1】 弱毒化伝染性喉頭気管炎ウイルス(IL
TV)突然変異体と薬学上許容される担体または希釈剤
とを含んでなる、トリ病原体により引き起こされる疾患
から家禽を防御するためのワクチンであって、該ILT
V突然変異体が、天然UL0タンパク質を、該UL0遺
伝子内の突然変異の結果として、感染宿主細胞内で発現
し得ないことを特徴とするワクチン。 - 【請求項2】 該UL0遺伝子内の突然変異が欠失であ
る、請求項1記載のワクチン。 - 【請求項3】 該UL0遺伝子内の突然変異が異種核酸
配列の挿入である、請求項1記載のワクチン。 - 【請求項4】 該突然変異体が、該欠失の代わりに異種
核酸配列を含む、請求項2記載のワクチン。 - 【請求項5】 該異種核酸配列が発現制御配列の制御下
にある、請求項3または4記載のワクチン。 - 【請求項6】 該異種核酸配列がトリ病原体の抗原をコ
ードする、請求項5記載のワクチン。 - 【請求項7】 該トリ病原体が、トリインフルエンザウ
イルス、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイル
ス、伝染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎
ウイルス、大腸菌(E.coli)、オルニトバクテリ
ウム・リノトラケアレ(Ornithobacteri
um rhinotracheale)またはマイコプ
ラズマ(Mycoplasma)である、請求項6記載
のワクチン。 - 【請求項8】 該異種核酸配列が免疫調整剤(immu
nomodulator)をコードする、請求項5記載
のワクチン。 - 【請求項9】 請求項1〜8記載のILTV突然変異体
に感染した細胞培養。 - 【請求項10】 請求項1〜8記載のILTV突然変異
体と薬学上許容される担体または希釈剤とを混合する工
程を含んでなる、トリ病原体により引き起こされる疾患
から家禽を防御するためのワクチンの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP01200975 | 2001-03-15 | ||
EP01200975.9 | 2001-03-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002356441A true JP2002356441A (ja) | 2002-12-13 |
Family
ID=8180017
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002061362A Withdrawn JP2002356441A (ja) | 2001-03-15 | 2002-03-07 | 組換え伝染性喉頭気管炎ウイルスワクチン |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20020168384A1 (ja) |
JP (1) | JP2002356441A (ja) |
AU (1) | AU784310B2 (ja) |
BR (1) | BR0200838A (ja) |
CA (1) | CA2373454A1 (ja) |
HU (1) | HU0200985D0 (ja) |
MX (1) | MXPA02002904A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005033597A1 (ja) * | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Hoshizaki Denki Kabushiki Kaisha | オーガ式製氷機 |
CN113122509A (zh) * | 2021-04-10 | 2021-07-16 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 传染性喉气管炎病毒强毒株及其应用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102643931B (zh) * | 2012-04-17 | 2013-12-18 | 中国农业大学 | 鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的rt-pcr法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2728845A1 (fr) * | 1994-12-29 | 1996-07-05 | Valeo Thermique Habitacle | Bloc de connexion centralisee pour installation de chauffage et/ou climatisation d'automobile |
FR2750866B1 (fr) * | 1996-06-27 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire |
-
2002
- 2002-03-07 JP JP2002061362A patent/JP2002356441A/ja not_active Withdrawn
- 2002-03-13 AU AU24508/02A patent/AU784310B2/en not_active Ceased
- 2002-03-14 CA CA 2373454 patent/CA2373454A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-14 BR BR0200838A patent/BR0200838A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-03-14 MX MXPA02002904A patent/MXPA02002904A/es active IP Right Grant
- 2002-03-14 HU HU0200985A patent/HU0200985D0/hu unknown
- 2002-03-15 US US10/099,619 patent/US20020168384A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005033597A1 (ja) * | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Hoshizaki Denki Kabushiki Kaisha | オーガ式製氷機 |
CN113122509A (zh) * | 2021-04-10 | 2021-07-16 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 传染性喉气管炎病毒强毒株及其应用 |
CN113122509B (zh) * | 2021-04-10 | 2022-09-27 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 传染性喉气管炎病毒强毒株及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU784310B2 (en) | 2006-03-09 |
CA2373454A1 (en) | 2002-09-15 |
MXPA02002904A (es) | 2005-10-07 |
US20020168384A1 (en) | 2002-11-14 |
BR0200838A (pt) | 2003-03-25 |
HU0200985D0 (ja) | 2002-06-29 |
AU2450802A (en) | 2002-09-19 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
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