PL202286B1 - Szczepionka do ochrony drobiu przed chorobą wywoływaną przez ptasi patogen, sposób jej wytwarzania oraz hodowla komórkowa infekowana zmutowanym ILTV - Google Patents

Abstract

. Szczepionka do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez ptasi patogen, zawierają ­ ca atenuowanego mutanta wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy (ILTV) i farmaceutycznie do ­ puszczalny nośnik albo rozcieńczalnik, znamienna tym , że mutant ILTV nie jest zdolny do ekspresji natywnego białka UL0 w zainfekowanych komórkach gospodarza w wyniku mutacji w genie UL0. 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym , że mutacją w genie UL0 jest delecja. 3. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym , że mutacją w genie UL0 jest insercja hetero- logicznej sekwencji kwasu nukleinowego. 4. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym , że mutant zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego w miejscu delecji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka do ochrony drobiu przed ptasim patogenem zawierająca atenuowanego mutanta wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy (ILTV) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo rozcieńczalnik, hodowla komórkowa infekowana atenuowanym mutantem wirusa ILTV jak również sposób wytwarzania takiej szczepionki.

Zapalenie krtani i tchawicy (ILT) jest chorobą dróg oddechowych, która głównie atakuje kurczaki, ale mogą być nią również zakażone bażanty i pawie. W ostrej fazie choroby, od 2 do 8 dni po zakażeniu, obserwuje się oznaki wyczerpania oddechowego, któremu towarzyszy dyszenie i odkrztuszanie krwawych wysięków. Ponadto, błony śluzowe tchawicy stają się opuchnięte i krwawią. Ta epizootyczna forma rozprzestrzenia się szybko i może dotknąć do 100% zakażonego stada. Śmiertelność może wahać się w zakresie od 10 do 80% stada. Łagodniejsze postacie choroby charakteryzują się łzawiącymi oczami, zapaleniem spojówek, utrzymującą się wydzieliną z nosa i zmniejszeniem produkcji jaj. Ponadto utarta masy, spadek produkcji jaj i zwiększona wrażliwość na wtórne zakażenia stanowią główny powód strat ekonomicznych. W nieobecności ostrych oznak choroby trzeba uzyskać potwierdzenie laboratoryjne. Wirusy można łatwo izolować z tkanki tchawicy albo płuc i wykazanie wewnątrzjądrowych ciał inkluzyjnych w tkankach tchawicy i spojówki jest diagnostyczne dla wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy. Ponadto, szybkiej identyfikacji można dokonać przy użyciu przeciwciał fluorescencyjnych.

Czynnikiem etiologicznym ILT jest wirus ptasiego zapalenia krtani i tchawicy (ILTV), wirus opryszczki alfa. Poza stworzeniem odpowiednich warunków, szczepienie jest stosowane jako sposób zapobiegania i kontrolowania dla kurczaków w różnym wieku i rodzaju (stada rodzicielskie, niosek albo hodowlane). Obecne strategie szczepienia opierają się na żywych atenuowanych szczepionkach, które korzystnie są podawane w kroplach do oczu (drogą oczno-nosową). Jednakże dostępne obecnie na rynku szczepionki mają szereg wad. Z powodu pozostającej wirulencji nie są one całkowicie bezpieczne do stosowania drogą masowego szczepienia; przykładowo, szczepienie aerozolowe powoduje dużą reakcję na szczepienie (aż do 10% zwierząt) i powoduje wtórne infekcje. Ponadto, ponieważ stosowane obecnie żywe szczepionki są atenuowane przez serię pasaży w hodowlach komórkowych, do genomu wirusowego wprowadzane są niekontrolowane mutacje, prowadząc do powstania populacji cząstek wirusa heterogennych pod względem ich wirulencji i właściwości immunizacyjnych. Ponadto są doniesienia, że takie tradycyjnie szczepionki w oparciu o atenuowane, żywe wirusy mogą powrócić do wirulencji powodując chorobę zaszczepionych zwierząt i możliwe rozprzestrzenienie się patogenu wśród innych zwierząt. Ponadto, szczepienie istniejącymi szczepami szczepionkowymi ILTV prowadzi do konwersji serotypu tych zwierząt, tak, że nie można ich odróżnić od (utajnionych) nosicieli zakażonych bardziej wirulentnymi szczepami ILTV z zewnątrz.

ILTV zaklasyfikowano jako przedstawiciela Alphaherpesvirinae, podrodziny Herpesviridae. ILTV posiada genom wirusa opryszczki typu D składający się z długiego (UL) i krótkiego (US) regionu unikatowego, przy czym ten ostatni jest oflankowany przez sekwencje odwróconych powtórzeń (IR, TR; Fig. 1). W ostatnich latach została ustalona sekwencja DNA prawie całego genomu ILTV zawierającego liniową, dwuniciową cząsteczkę DNA o wielkości około 150 kz. Wild i wsp. (Virus Genes 12, 107116, 1996) ujawniają sekwencję nukleotydową, mapę genomową i organizację genów z regionu US genomu ILTV włączając w to kilka genów kodujących glikoproteiny, takie jak gD, gE, gl, gG i gp60. Następnie, podobne informacje także w odniesieniu do regionu UL zostały opublikowane przez różne grupy badawcze (Fuchs i Mettenleiter, J. Gen. Virol. 77, 2221-2229, 1996 i 80, 2173-2182, 1999; Johnson i wsp., Arch. Virol. 142, 1903-1910, 1997).

Okazało się, że wiele zidentyfikowanych genów jest konserwowanych i można je znaleźć w analogicznym uł o ż eniu w porównaniu z genomem wirusa opryszczki zwykł ej (HSV). Zidentyfikowane geny ILTV obejmują homologi HSV, takie jak UL1 (gL) względem UL5, UL6-UL20 i UL29 względem UL42. Jednakże pomimo wielu podobieństw pomiędzy kilkoma częściami ILTV i innymi genomami wirusów opryszczki, zawartość i organizacja genów w innych częściach genomu różni się znacznie. Obserwacje te, jak równie analizy filogenetyczne regionów kodujących konserwowanych białek wskazują, że ILTV jest jedynie daleko spokrewniony z innymi wirusami opryszczki (Ziemann i wsp., J. Virology 72, 6867-6874, 1998). Ponadto, w odróżnieniu do innych wirusów opryszczki alfa, ILTV wykazuje zarówno in vivo, jak i in vitro, bardzo wąski zakres gospodarzy, który jest ograniczony prawie wyłącznie do komórek kurzych (Bagust i wsp., W: Diseases of Poultry, wyd. 10., Iowa State University Press, Ames, US, 527-539, 1997). Przewiduje się, że większość cech genomowych specyficznych dla ILTV

PL 202 286 B1 powstała w procesie molekularnej ewolucji tego wirusa umożliwiając przeżycie w bardzo wyspecjalizowanej niszy górnych dróg oddechowych kurczaków. Dwa ostatnio zidentyfikowane geny ILTVspecyficzne, gen UL0 i UL[-1] mogą odgrywać rolę w tych unikatowych cechach ILTV. Nie znaleziono homologów genu UL0 lub UL[-1] u innych wirusów opryszczki. Te sąsiadujące geny są ściśle spokrewnione pod względem kinetyki ekspresji, struktur mRNA i subkomórkowej lokalizacji białek i wykazują znaczącą homologię sekwencji aminokwasowej, sugerując duplikację genu od którego pochodzą (Ziemann i wsp., 1998, jak wyżej).

Warunkiem wstępnym opracowania szczepionki w oparciu o poddanego manipulacjom genetycznym atenuowanego wirusa ILTV jest identyfikacja regionu w genomie ILTV, który jest niezbędny do infekcji albo replikacji wirusowej i koduje białko, które bierze udział w wirulencji wirusa. Ponadto niezbędne jest, aby eliminacja ekspresji tego białka nie powodowała replikacji zmutowanego wirusa, takiego, że nie byłby zdolny do indukowania ochronnej odpowiedzi immunologicznej u szczepionego zwierzęcia.

Uprzednio ujawniono kilka nieistotnych genów ILTV. Delacja genu UL50 nie ma znaczącego wpływu na replikację ILTV w hodowli komórkowej, jednakże powstające w rezultacie mutanty delecyjne ILTV wykazują taką samą patogenność jak ILTV typu dzikiego (Fuchs i wsp., J. Gen. Virol. 81, 627638, 2000 oraz International Herpesvirus Workshop, Boston 1999, 13.033). Mutanty ILTV posiadające delecje genów UL10 lub UL49.5, kodujących dwa białka otoczki są żywotne w hodowli komórkowej, jednakże znaczące defekty wzrostowe (zmniejszenie miana wirusa >90%) wskazują na ważne funkcje tych białek (Fuchs i wsp., Abstr. 2.45, 25 th Int. Herpesvirus Workshop, Portland, USA, 2000). Podobne defekty wzrostowe obserwowano u mutantów ILTV mających delecję w genie glikoproteiny gG, ORF A lub ORF D (Annual Virology Meeting, Vienna, April, 2000, Abstr. 6P50). Ponadto, Keeler and Rosenberger (US Poultry & Egg Association, Research project #253, Listopad 1999) nie byli w stanie wyizolować mutantów ILTV, które nie wyrażały białek kodowanych przez nieistotne geny US2 lub gX. Ponadto, niniejszym wynalazcom nie udawało się wytworzyć mutantów ILTV z mutacjami w genie UL[-1] co wskazuje, że ten gen specyficzny dla ILTV jest niezbędny w infekcji albo replikacji ILTV. Ponadto, stwierdzono, że inna specyficzna dla ILTV otwarta ramka odczytu (ORF A) jest istotna dla wirusa (Vienna Meeting, April, 2000, Abstr. 6P50, jak wyżej).

Celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki zawierającej szczep szczepionkowy ILTV, który jest atenuowany w kontrolowany sposób na drodze technik inżynierii genetycznej, co zapobiega rewersji do wirulencji atenuowanego szczepu szczepionkowego, i jest zdolny do indukcji ochronnej odpowiedzi immunologicznej w komórkach gospodarza infekowanych szczepem szczepionkowym.

Innym celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki, która nie tylko ma zdolność do indukowania ochrony przeciw ILT, ale również chorobie powodowanej przez inne ptasie patogeny.

Powyższe cele będą spełnione przez dostarczenie szczepionki do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez patogeny ptasie, zawierającą atenuowanego mutanta wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy (ILTV) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo rozcieńczalnik, przy czym mutant ILTV nie jest zdolny do wyrażania natywnego białka UL0 w zainfekowanych komórkach w wyniku mutacji w genie UL0.

Twórcy stwierdzili, że w przeciwieństwie do genu UL[-1], specyficzny dla ILTV gen UL0 jest nie tylko niekonieczny do infekcji i replikacji w komórkach, ale że ponadto inaktywacja ekspresji natywnego białka UL0 na drodze kontrolowanej inżynierii genetycznej genu UL0 prowadzi do powstania mutanta ILTV, który został osłabiony w porównaniu ze szczepem rodzicielskim ILTV typu dzikiego. Ponadto stwierdzono, że ten atenuowany mutant ILTV ma zdolność indukowania ochronnej odpowiedzi immunologicznej, która zmniejsza śmiertelność i oznaki kliniczne u szczepionych zwierząt po prowokacji wirulentnym ILTV. Ponadto, szczepionka według obecnego wynalazku ma tą zaletę, że może być podawana bezpiecznie kurczakom przez masowe szczepienie na drodze rozpylania.

Lokalizacja genu UL0 specyficznego wobec ILTV i jego struktura molekularna została ujawniona wcześniej (Ziemann i wsp., 1998, jak wyżej). Gen UL0 jest tu zdefiniowany jako otwarta ramka odczytu (ORF) i zlokalizowany przed nią jego promotor oraz częściowo zachodząca na niego konserwowana ORF UL1 (kodująca glikoproteinę L) i położona poniżej, specyficzna wobec ILTV ORF UL[-1], na skraju prawego końca regionu genomowego UL na styku z sekwencjami IR znajdującymi się we fragmencie B EcoRI (parz Fig. 1A).

Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera atenuowanego mutanta ILTV jak zdefiniowano powyżej, który zawiera mutację w ORF UL0.

PL 202 286 B1

Gen UL0 ILTV koduje białko UL0 o wielkości około 506 aminokwasów i zawiera intron w pobliżu końca 5'. Białko UL0 wyrażone z genu UL0 w zainfekowanych komórkach ma masę cząsteczkową około 63 kDa i jest zlokalizowane głównie w jądrach zainfekowanych wirusem komórek. W odniesieniu do opublikowanej sekwencji UL0 (Ziemann i wsp., 1998, jak wyżej), ORF rozpoczyna się w pozycji nukleotydowej 7152 i kończy w pozycji 5554. Region promotorowy UL0 obejmuje nukleotydy 7350-7151.

Szczepy ILTV są konserwowane głównie na poziomie nukleotydów. A zatem jest zrozumiałe, że dla sekwencji DNA genu UL0 ILTV mogą istnieć w obrębie populacji ILTV naturalne różnice między poszczególnymi szczepami i że wirusem rodzicielskim, z którego obecny mutant ILTV pochodzi może być dowolny szczep ILTV. Różnice miedzy szczepami mogą prowadzić do zmiany jednego lub większej liczby nukleotydów w genie UL0. Zazwyczaj, gen UL0 ma sekwencję nukleotydową kodującą białko o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% homologii ze znaną sekwencją aminokwasową UL0 (GenBank nr dostępu X97256). Poziom homologii aminokwasowej między dwoma białkami można określić przy zastosowaniu programu komputerowego „BLAST 2 SEQUENCES”, podprogramu: „BLASTP”, który można znaleźć między innymi pod adresem www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Ponadto Tatusova i Madden, FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999) odnoszą się do tego programu. Zastosowaną tablicą porównań jest „blosum62”, a parametrami są parametry domyślne: open gap: 11, extention gap: 2. Gap x_dropoff: 50. Jest zrozumiałe, że szczepionka w oparciu o mutanta ILTV pochodzącego z takich szczepów ILTV jest również objęta zakresem wynalazku. Korzystnie szczepionka według wynalazku opiera się na mutancie ILTV, który zawiera mutację w genie UL0, mającym sekwencję aminokwasową opublikowaną w GenBank pod numerem dostępu X97256. Jako mutację rozumie się zmianę informacji genetycznej w genie UL0 niezmodyfikowanym albo typu dzikiego w szczepie rodzicielskim ILTV, który ma zdolność do wyrażania natywnego białka UL0. Mutacja osłabia wirusa, czyniąc go przydatnym do zastosowania jako szczepionkę przeciw ILT.

Mutacją może być inercja, delacja i/lub podstawienie jednego albo większej liczby nukleotydów w genie UL0. W celu zapobież enia szkodliwym efektom mutacji na koń cu 3' ORF UL0, który zachodzi na gen UL1, podczas wytwarzania żywych zrekombinowanych mutantów UL0 ILTV, określenie „mutacja w genie UL0” ma oznaczać mutację w genie UL0 w regionie, który nie zachodzi na region promotorowy i ORF UL1.

W odniesieniu do opublikowanych sekwencji UL0 i UL1 (GenBank nr dostępu X97256) region promotorowy UL1 rozpoczyna się około pozycji nukleotydowej 5900, a ORF UL1 rozpoczyna się w pozycji 5570.

Określenie „jest niezdolny do wyrażania natywnego białka UL0” oznacza, że stosowany tu szczep szczepionkowy ILTV wyraża białko w zainfekowanych komórkach gospodarza, które można odróżnić przez konwencjonalne testy od białka UL0 o wielkości 63 kDa wyrażanego przez ILTV typu dzikiego, albo w ogóle nie wyraża białka UL0. Przykładowo, w pierwszym przypadku mutant ILTV mutant wyraża jedynie fragment białka UL0 typu dzikiego. Korzystnie używany tu zmutowany szczep szczepionkowy ILTV nie wyraża białka UL0 po infekcji i replikacji w komórce gospodarza. W celu przetestowania mutanta ILTV pod kątem ekspresji natywnego białka UL0 przy zastosowaniu testu serologicznego, najpierw wytwarza się monospecyficzną surowicę odpornościową wobec UL0. W tym celu ORF UL0 lub jej części mogą być wyrażane jako białko fuzyjne w E. coli. Białko fuzyjne oczyszcza się przez chromatografię powinowactwa albo elektroforezę żelową i oczyszczony preparat stosuje się do immunizacji królików w celu wytworzenia surowicy odpornościowej (Ziemann i wsp., 1998, jak wyżej). Następnie wirusy hoduje się w hodowli komórkowej, zbiera, lizuje i poddaje immunoprecypitacji, jeśli to pożądane. Białka rozdziela się w żelach poliakryloamidowych i przenosi na nitrocelulozę przy zastosowaniu dobrze znanych procedur. Następnie, żele inkubuje się z surowicą odpornościową wytworzoną przeciw białku fuzyjnemu i można ustalić obecność albo nieobecność natywnego białka o wielkości 63 kDa. W podobnym teście można ustalić obecność albo nieobecność wyrażanego natywnego UL0 przez znakowanie promieniotwórcze białek ILTV w czasie hodowania i immunoprecypitacji wirusa surowicą odpornościową anty-UL0 (Ziemann i wsp., 1998, jak wyżej).

Typowy mutant ILTV z podstawieniem do zastosowania w niniejszym wynalazku zawiera podstawienie co najmniej jednego albo większej liczby nukleotydów, którego rezultatem są zmiany w jednym albo większej liczbie kodonów w OFR w kodon stop, korzystnie w połowie 5' ORF. Alternatywnie, podstawienie może prowadzić do zmiany i usunięcia kodonu startowego w ORF UL0.

W korzystnym aspekcie tego wynalazku, szczepionka według wynalazku zawiera delecję genu UL0. Delecja niszczy ekspresję natywnego białka i może obejmować od jednego nukleotydu do prawie

PL 202 286 B1 całej ORF z wyjątkiem części, która zachodzi na gen UL1. Szczególnie skutecznymi delecjami są takie, które są dokonane w połowie 5' genu UL0 i/lub prowadzą do przesunięcia otwartej ramki odczytu.

W szczególności, delecje wprowadzone do szczepu szczepionkowego ILTV opisanego powyżej obejmują co najmniej 10 nukleotydów, korzystniej co najmniej 100 nukleotydów, a najkorzystniej co najmniej 500 nukleotydów. Szczególnie przydatne mutanty delecyjne zawierają delecję fragmentu KpnI/SspI o wielkości 546 pz kodującego aminokwasy (aa) 49-231, fragmentu Clal/BsrBI o wielkości 984 pz kodującego aa 17-318 lub fragmentu BssHII/XbaI o wielkości 1137 pz kodującego aa 1-352.

Przydatnego mutanta jak zdefiniowano powyżej można również otrzymać przez wstawienie do genu UL0 heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego, tj. sekwencji kwasu nukleinowego, która różni się od sekwencji kwasu nukleinowego naturalnie występującej w tej pozycji genomu ILTV. Korzystnie heterologiczną sekwencją kwasu nukleinowego jest fragment DNA nie obecny w genomie ILV. Heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego może pochodzić z dowolnego źródła, może być np. syntetyczna, wirusowa prokariotyczna albo eukariotyczna. Taką sekwencją kwasu nukleinowego może być między innymi oligonukleotyd, na przykład około 10-60 pz, jeśli to pożądane zawierający również jeden albo większą liczbę kodonów stop dla translacji (patrz patent USA 5,279,965) albo polinukleotyd kodujący polipeptyd.

W dalszym aspekcie tego wynalazku szczepionka według niniejszego wynalazku obejmuje delecję ILTV, która w miejscu usuniętego DNA ILTV zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego.

Opisanego powyżej mutanta ILTV zawierającego heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego można również zastosować jako wektor do dostarczania ptactwu domowemu heterologicznego polipeptydu. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza również szczepionkę zawierającą mutanta ILTV jako opisano powyżej, przy czym heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje antygen ptasiego patogenu, a w szczególności patogenu kurcząt, którą można zastosować nie tylko do ochrony drobiu przeciw ILT, ale również przeciw chorobie powodowanej przez inne patogeny ptasie. Taka szczepionka wektorowa, która opiera się na żywym atenuowanym wirusie ILTV ma również zdolność do immunizowania kurcząt przeciw innym patogenom przez replikację mutanta ILTV w zaszczepionym zwierzęcym gospodarzu i ekspresję obcego antygenu wywołującego odpowiedź immunologiczną u zaszczepionego zwierzę cia.

Korzystnie mutant ILTV - wektor zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą antygen ochronny wirusa ptasiej grypy (AIV), wirusa choroby Mareka (MDV), wirusa choroby Newcastle (NDV), wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV), wirusa zakaźnej choroby kaletki (IBDV), wirusa anemii kurzej, reowirusa, ptasiego retrowirusa, adenowirusa drobiu, wirusa nieżytu nosa i tchawicy indyków (TRTV), E. coli, gatunku Eimeria, Cryptosporidia, Mycoplasmy, takie jak M. gallinarum, M. synoviae i M. meleagridis, Salmonella-, Campylobacter-, Ornithobacterium (ORT) i Pasteurella spp. Korzystniej, mutant ILTV będący wektorem zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą antygen AIV, MDV, NDV, IBV, IBDV, TRTV, E. coli, ORT i Mycoplasma.

W szczególności, mutant ILTV będ ący wektorem zawiera gen hemaglutyniny (HA) z AIV (Flexner i wsp., Nature 335, 259-262, 1988; GenBank Nr dostępu. AJ305306), gen gA, gB gD MDV (Ross i wsp., J. Gen. Virol. 74, 371-377, 1993; WO 90/02803), gen HN lub F z NDV (Sondermeijer i wsp., Vaccine 11, 349-358, 1993) albo gen z VP2 IBDV (Bayliss i wsp., Arch. Virol. 120, 193205,1991). W jeszcze korzystniejszym wykonaniu dostarczona jest opisana powyżej szczepionka, która opiera się na atenuowanym zmutowanym wirusie ILTV zawierającym gen HA z AIV.

Alternatywnie mutant ILTV - wektor zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą czynnik immunomodulujący, taki jak interferon (ptasi), cytokinę lub limfokinę. Czynnik immunomodulujący wyrażany przez mutanta ILTV wzmacnia odpowiedzi immunologiczne indukowane przez mutanta ILTV i jako taki przyczynia się do zwiększonej ochrony. A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza również szczepionki zawierającej mutanta ILTV jak opisano powyżej, która zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą czynnik immunomodulujący.

Niezbędnym wymaganiem ekspresji sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego przez mutanta ILTV jak opisano powyżej jest odpowiednia sekwencja kontrolująca ekspresję, a w szczególności promotor i sygnał poliadenylacji połączone funkcjonalnie z heterologiczną sekwencją kwasu nukleinowego. Takie sekwencje kontrolujące ekspresję są dobrze znane w tej dziedzinie, szczególnie do konstrukcji wektorów wirusa opryszczki i rozciąga się na dowolny eukariotyczny, prokariotyczny albo wirusowy promotor albo sygnał poli-A zdolny do kierowania transkrypcją genów w komórkach zakażonych mutantem ILTV. Przykładami przydatnych promotorów są promotor SV-40 (Science 222, 524-527, 1983), promotor metalotioneiny (Nature 296, 39-42, 1982), promotor szoku cieplnego

PL 202 286 B1 (Voellmy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4949-53, 1985), promotor PRV gX (Mettenleiter i Rauh, J. Virol. Methods 30, 55-66, 1990), promotor IE ludzkiego cytomegalowirusa (patent USA nr 5,168,062), promotor LTR wirusa mięsaka Rousa (Gorman i wsp., PNAS 79, 6777-6781, 1982), promotor ludzkiego czynnika elongacyjnego 1α lub ubikwityny, promotory obecne w ILTV, a w szczególności promotor UL0. Przykładami przydatnych sygnałów poli-A są sygnały poli-A króliczej β-globiny, SV40 i bydlęcego hormonu wzrostu. Alternatywnie można zastosować sygnały poli-A z UL0, UL1 lub UL2.

A zatem korzystna szczepionka według wynalazku jest wykonana w oparciu o mutanta ILTV, który zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd jak opisano powyżej, który jest pod kontrolą sekwencji kontrolującej ekspresję.

W jeszcze innym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczona jest szczepionka zawierająca mutanta ILTV jak opisano powyżej, który zawiera dodatkowo w genomie ILTV kolejną mutację osłabiającą. Przykładowo, taka szczepionka opiera się na zmodyfikowanym żywym szczepie szczepionkowym, takim jak obecnie dostępne na rynku (np. Nobilis ILT^®, BioTrach^®, Trachine^®) albo zmodyfikowanym genetycznie ILTV, który nie wyraża dodatkowych białek powodujących wirulencję, takich jak gE, gl, gM, TK, RR, UL21, UL50 lub PK (Schnitzlein i wsp., Virology 209, 304-314, 1995; Mettenleiter, Abstracts from ESVV meeting, 27-30 August, 2000, 15-17; WO 96/29396).

Do wprowadzenia mutacji do genomu ILTV można zastosować dobrze znane procedury wstawiania sekwencji DNA do wektorów do klonowania/ekspresji i homologicznej rekombinacji in vivo.

W zasadzie można tego dokonać przez konstruowanie zrekombinowanego wektora przenośnikowego do rekombinacji z genomowym DNA ILTV zawierającym wektor zdolny do replikacji w komórce gospodarza i odpowiedni fragment DNA ILTV niosący pożądaną mutacje. Taki zrekombinowany wektor przenośnikowy może pochodzić z dowolnego odpowiedniego wektora znanego i stosowanego w tej dziedzinie, takiego jak plazmid, kosmid, wirus albo fag, przy czym najkorzystniejszy jest plazmid. Przykładami przydatnych wektorów do klonowania są wektory plazmidowe, takie jak pBR322, rozmaite plazmidy pUC, pEMBL i Bluescript, bakteriofagi, np. lambda, charon 28 i fagi M13mp. Przydatne wektory przenośnikowe, komórki gospodarza i sposobny transformacji, hodowli, amplifikacji i przeszukiwania, itd. mogą być wybrane przez specjalistę w tej dziedzinie spośród dobrze znanych technik w tej dziedzinie (patrz na przykład, Rodriguez, R.L. i D.T. Denhardt, red., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Current Protocols in Molecular Biology, red.: F.M. Ausubel i wsp., Wiley N.Y., 1995; Molecular cloning: a laboratory manual, wyd. 3.; red.: Sambrook i wsp., CSHL press, 2001 and DNA Cloning, Tom 1-4, wyd.2, 1995, red.: Glover and Hames, Oxford University Press).

Pokrótce, najpierw fragment DNA ILTV zawierający sekwencję kwasu nukleinowego UL0 wstawia się do wektora przenośnikowego przy zastosowaniu standardowych technik rekombinowania DNA. Fragment DNA ILTV może zawierać część ORF UL0 albo kompletną ORF i jeśli to pożądane sekwencje flankujące. Następnie, jeżeli ma być otrzymany mutant delecyjny ILTV UL0, ze zrekombinowanego wektora przenośnikowego usuwa się część ORF UL0. Można to uzyskać na przykład przez odpowiednie trawienie egzonukleazą III albo cięcie wstawki zrekombinowanego wektora enzymem restrykcyjnym albo przez staranny dobór starterów do PCR. W przypadku, jeżeli chce się otrzymać mutanty insercyjne, heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego, a jeśli to pożądane fragmenty DNA zawierające sekwencje kontrolne ekspresji są wstawiane do sekwencji kwasu nukleinowego UL0 obecnych w zrekombinowanym wektorze albo w miejsce usuniętych sekwencji kwasu nukleinowego UL0. Sekwencje DNA ILTV, które flankują mutację wprowadzoną do DNA ILTV powinny mieć odpowiednią długość, tak aby umożliwić zajście homologicznej rekombinacji z genomowym DNA ILTV. Generalnie, sekwencje flankujące o długości 500 pz albo większe umożliwiają skuteczną homologiczną rekombinację.

Następnie komórki, na przykład komórki wątroby zarodka kurzego, komórki kurzej nerki albo, korzystniej, kurzą linię komórkową wątrobiaka LMH (Schnitzlein i wsp., Avian Diseases 38, 211-217, 1994) transfekuje się genomowym DNA ILTV w obecności zrekombinowanego wektora przenośnikowego zawierającego zmutowaną wstawkę DNA ILTV, tak, aby umożliwić zajście rekombinacji wstawki z genomowym DNA ILTV. W szczególnie korzystnym procesie wytwarzania zrekombinowanego mutanta ILTV, zrekombinowany wektor przenośnikowy zawierający zmutowaną wstawkę DNA ILTV i genomowy DNA ILTV są używane do kotransfekcji (za pośrednictwem fosforanu wapnia) komórek LMH w obecności wektora ekspresyjnego (np. pRc-UL48) kodującego homolog ILTV transaktywatora aTIF wirusa opryszczki (UL48) i/lub białka regulatorowego ICP4, ponieważ obydwa zwiększają infekcyjność nagiego DNA ILTV (Fuchs i wsp., J. Gen. Virol. 81, 627-638, 2000).

PL 202 286 B1

Zrekombinowane potomstwo wirusowe jest następnie wytwarzane w hodowli komórkowej i może podlegać selekcji genotypowej albo fenotypowej. Przykładowo, przez hybrydyzację albo przez wykrywanie obecności albo nieobecności aktywności enzymatycznej albo innego wykrywalnego znacznika, takiego jak białka o zielonej fluorescencji albo β-galaktozydazy kodowanej przez gen wstawiony albo usunięty w czasie wytwarzania zrekombinowanego wektora przenośnikowego. Potomstwo po transfekcji analizuje się przez testy łysinkowe i łysinki wykazujące spodziewany genotyp albo fenotyp pobiera się przez zasysanie. Następnie, mutant ILTV jak opisano powyżej może zostać oczyszczony do homogenności przez ograniczone rozcieńczenia na komórkach (nerki kurzego zarodka) hodowanych na płytkach do mikromiareczkowania.

Szczepionkę według wynalazku można wytwarzać przez konwencjonalne metody, takie jak na przykład powszechnie stosowane dla dostępnych na rynku żywych i inaktywowanych szczepionek ILTV. Pokrótce, podatny substrat zaszczepia się mutantem ILTV jak opisano powyżej i hoduje aż wirus replikuje się do pożądanego miana infekcyjnego, po czym zbiera się materiał zawierający ILTV.

Każdy substrat, który ma zdolność podtrzymania replikacji wirusów ILT można zastosować w niniejszym wynalazku, włączając w to pierwotne (ptasie) linie komórkowe, takie jak komórki wątroby zarodka kurzego (ang. chicken embryo liver cells, CEL) albo komórki nerki zarodka kurzego (ang. chicken embryo kidney cells, CEK) albo linie komórek ptasich, takie jak, LMH. Zwykle po zaszczepieniu komórek, wirus namnaża się przez 3-10 dni, po czym zbiera się zainfekowane komórki i/lub supernatant hodowli komórkowej. Zainfekowane komórki można zamrażać i rozmrażać w celu uwolnienia wirusa po czym przechowuje się materiał jako zamrożoną zawiesinę.

Alternatywnie, mutant ILTV może być namnażany w jajach kurzych z zarodkami SPF. Jaja kurze z zarodkami można zaszczepiać na przykład 0,2 ml zawiesiny albo homogenatu zawierającego mutanta ILTV zawierających co najmniej 10¹ TCID50 na jajo, a następnie inkubować w 37°C. Po około 2-6 dniach produkt w postaci wirusa ILT można zbierać przez zebranie zarodków i/lub błon i/lub płynu omoczniowego po czym przeprowadzana jest odpowiednia homogenizacja tego materiału.

Żywa szczepionka według wynalazku zawiera mutanta ILTV jak opisano powyżej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo rozcieńczalnik zwykle stosowany w takich kompozycjach. Szczepionkę można wytwarzać i sprzedawać w postaci zawiesiny albo w postaci liofilizowanej. Nośniki obejmują stabilizatory, środki konserwujące i bufory. Odpowiednimi stabilizatorami są na przykład SPGA, węglowodany (takie jak sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstran albo glukoza), białka (takie jak serwatka mlekowa w proszku, albumina lub kazeina) albo produkty ich rozkładu. Przydatnymi buforami są na przykład fosforany metali alkalicznych. Odpowiednimi środkami konserwującymi są timerosal, mertiolan, gentamycyna i neomycyna. Rozcieńczalniki obejmują sterylizowane roztwory soli fizjologicznej, wodne bufory fosforanowe, alkohole i poliole (takie jak glicerol).

Jeżeli jest to pożądane, żywe szczepionki według wynalazku mogą zawierać adiuwant.

Mimo, że podawanie w zastrzykach, np. domięśniowo albo podskórnie żywej szczepionki według niniejszego wynalazku jest możliwe, korzystne jest podawanie szczepionki przez niedrogie masowe techniki powszechnie stosowane do szczepienia drobiu. Do szczepienia ILTV można stosować techniki szczepienia przez wodę pitną i przez aerozol albo rozpylanie.

Korzystnym sposobem podawania szczepionki według wynalazku jest przez rozpylacz wytwarzający duże kropelki o wielkości przy wylocie >100 μm, szczególnie w obecności dużej ilości rozcieńczalnika, w ilości >250 ml na 1000 zwierząt. Odpowiednie rozpylanie jest kierowane na oczy i usta zwierząt. Naśladuje to oczno-ustno-nosowe drogi szczepienia indukuje pożądaną immunizację.

Alternatywne sposoby podawania żywej szczepionki obejmują drogę dojajową, krople do oczu, ust i nosa oraz podawanie przez moczenie dziobów.

W innym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczona jest szczepionka zawierająca mutanta ILTV w postaci inaktywowanej Szczepionka zawierająca inaktywowanego mutanta ILTV może na przykład zawierać jeden albo większą liczbę wspomnianych powyżej dopuszczalnych farmaceutycznie nośników albo rozcieńczalników odpowiednich do tego celu. Korzystnie inaktywowana szczepionka według wynalazku zawiera jeden albo większą liczbę związków o aktywności adiuwantowej.

Szczepionka według wynalazku zawiera jako składnik aktywny skuteczną dawkę mutanta ILTV, tj. ilość immunizującego mutanta ILTV jak opisano powyżej, która będzie indukować ochronę zaszczepionych ptaków przeciw prowokacji wirusem wirulentnym. Ochrona jest tu zdefiniowana jako indukcja znacząco wyższych poziomów ochrony w populacji ptaków po zaszczepieniu w porównaniu z grupą nie zaszczepioną. Generalnie, ochrona indukowana przez szczepionkę ILTV jest testowana przez określenie śmiertelności i oznak klinicznych choroby dróg oddechowych, tak jak opisano w Przykładzie 3.

PL 202 286 B1

Zazwyczaj, żywą szczepionkę według wynalazku można podawać w dawkach 10¹-10⁷ dawek infekcyjnych w hodowli tkankowej 50% (TCID50) na zwierzę, korzystniej w dawce w zakresie 10²-10⁵ TCID50. Inaktywowana szczepionka może zawierać antygenowy równoważnik 10³-10⁹ TCID50 na zwierzę.

Inaktywowane szczepionki zwykle podaje się pozajelitowo np., domięśniowo albo podskórnie.

Mimo, że szczepionka ILTV według wynalazku może być stosowana skutecznie u kurczaków, również inny drób można z powodzeniem szczepić szczepionką (wektorową). Kurczaki obejmują broilery, nioski i stada do reprodukcji.

Wiek zwierząt otrzymujących żywą albo inaktywowaną szczepionkę według wynalazku jest taki sam jak zwierząt otrzymujących konwencjonalne żywe albo inaktywowane szczepionki. Przykładowo, kurczaki można szczepić w wieku około czterech tygodni albo w nagłych przypadkach wcześniej. Reproduktory i nioski zwykle otrzymują drugie szczepienie w wieku 8-16 tygodni.

Wynalazek obejmuje również szczepionki skojarzone, zawierające poza mutantem ILV jeden albo większą liczbę antygenów szczepionkowych, takich jak żywy lub inaktywowany wirus albo bakterie, pochodzących z innych patogenów zakaźnych dla drobiu. Korzystnie szczepionka złożona zawiera dodatkowo jeden albo większą liczbę szczepów szczepionkowych AIV, MDV, HVT, IBV, NDV, TRTV, reowirusa, E. coli, ORT, Salmonella spp, Campylobacter spp, Mycoplasma lub Eimeria spp.

Legendy do Figur

Fig. 1

Genomowa mapa genomu ILTV i konstrukcja plazmidów przenośnikowych. Przedstawione są odpowiednie miejsca restrykcyjne do wytwarzania plazmidów przenośnikowych, sekwencje heterologiczne, promotory i sygnały poli-A. Zrekombinowane ILTV (nazwy wytłuszczoną kursywą) można wyizolować po kotransfekcji komórek plazmidami przenośnikowymi i DNA wirionów.

Fig. 2

Lizaty niezainfekowanych (n.i.) i zainfekowanych ILTV (5 pfu/komórkę, 24 h p.i.) komórek CEK rozdzielano w nieciągłych SDS-10% żelach poliakryloamidowych. Substraty do analizy Western inkubowano z przeciwciałami swoistymi wobec UL0 lub gC. Wiązanie drugorzędowego przeciwciała skoniugowanego z peroksydazą wykrywano przez chemiluminescencję i monitorowano na błonach rentgenowskich. Wskaźniki mas cząsteczkowych są zaznaczone po lewej stronie.

Fig. 3

Graficzne przedstawienie wyników dla objawów klinicznych choroby dróg oddechowych obserwowane u zwierząt w testach, które są przeprowadzane w celu określenia resztkowej patogenności mutantów ILTV: ΔUL0, ΔUL0-LacZ i ΔUL0-HA7, obok odpowiednich kontroli.

Wyniki są średnimi na grupę badaną na dzień i są określone jak przedstawiono w Przykładzie 3.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie mutantów delecyjnych i insercyjnych UL0 ILTV

Konstrukcja plazmidów przenośnikowych do delecji sekwencji genu UL0 ILTV i insercja genów wskaźnikowych

Wirusowy DNA wyizolowano z pierwotnych komórek nerki zarodka kurzego (CEK) zainfekowanych szczepem A489 ILTV przez lizę N-lauroilosarkozynianem, traktowanie RNazą i pronazą, ekstrakcję fenolem i wytrącanie etanolem (Fuchs i Mettenleiter, J. Gen. Virol. 77: 2221-2229, 1996). Po strawieniu różnymi endonuleazami restrykcyjnymi otrzymane fragmenty DNA ILTV klonowano w dostępnych na rynku wektorach plazmidowych. Plazmid pILT-E43 (Fig. 1A) zawiera fragment B EcoRI o wielkości 11298 pz z patogennego szczepu ILTV w pBS (-) (Stratagene). Sklonowany fragment DNA zawiera unikatowe geny UL0 i UL[-1] ILTV, dla których wykazano ekspresję z mRNA powstałych w wyniku składania (Ziemann i wsp., jak wyżej, 1998).

Skonstruowano kilka plazmidów z genami wskaźnikowymi i zastosowano je do delecji genu UL0 ILTV. Do ekspresji β-galaktozydazy (Fig. 1B) fragment Sall-BamHI o wielkości 3,5 kpz zawierający gen LacZ E. coli pod kontrolą promotora genu glikoproteiny G wirusa pseudowścieklizny (Mettenleiter i Rauh, J. Virol. Methods 30, 55-66, 1990) przeklonowano do pSPT-18 (Roche). Ponadto dostarczono sygnał poliadenylacji SV40 przez zastąpienie części 3' wstawki przez fragment EcoRI-BamHI o wielkości 450 pz pochodzący z pCH110 (Amersham-Pharmacia). Otrzymany w rezultacie wektor pSPT18Z⁺ (Fig. 1B) zmodyfikowano przez insercję sekwencji DNA ILTV na obu końcach genu wskaźnikowego. Następnie fragment KpnI-Pstl o wielkości 944 pz i fragment KpnI-SspI o wielkości 2223 pz przeklonowano z pILT-E43 do pSPT-18Z⁺, który strawiono podwójnie Pstl i SalI lub Smal i KpnI, odpowiednio. Przed ligacją, nie pasujące lepkie końce wytępiono przez traktowanie polimerazą Klenow.

PL 202 286 B1

A zatem otrzymany plazmid przenośnikowy pΔUL0-Z (Fig. 1B) ma delecję 546 pz w obrębie otwartej ramki odczytu UL0 i zawiera kasetę ekspresyjną LacZ w równoległej orientacji z poddanym zabiegom genem ILTV.

Wszystkie zastosowane do ekspresji konstrukty zawierające białko o wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) pochodziły z pEGFP-N1 (Clontech). Z plazmidu tego usunięto miejsce do klonowania dla wielu enzymów restrykcyjnych umieszczone pomiędzy promotorem najwcześniejszego genu (PHCMV-IE) ludzkiego cytomegalowirusa i otwartą ramką odczytu EGFP przez podwójne trawienie Bglll i BamHI, po czym następowała ponowna ligacja. W celu uzyskania plazmidu pBl-GFP (Fig. 1C), zmodyfikowaną kasetę ekspresyjną usunięto jako fragment Asel-Aflll o wielkości 1581 pz, traktowano polimerazą Klenow i wstawiono do regionu polilinkera w wektorze pBluescript SK(-) (Stratagene) strawionym Smal. Wektor przenośnikowy pΔUL0-G1 (Fig. 1C) wytwarzano następnie przez insercję fragmentów Bglll-BsrBI o wielkości 3003 pz i ClaI-XhoI o wielkości 1818 pz z pILT-E43 do pBl-GFP, który strawiono podwójnie BamHI i Aflll oraz ClaI i XhoI. Przeprowadzone delecje obejmują 984 pz genu ILTV UL0 łącznie z całą sekwencją intronową, a wstawienie genu wskaźnikowego jest znowu w orientacji równoległej do usuniętego genu wirusa.

Ponieważ wcześniejsze badania wykazały, wysoką ekspresję białka UL0 w zainfekowanych komórkach ILTV, testowano przydatność promotora genu UL0 do ekspresji obcego genu. W celu usunięcia niepożądanych miejsc restrykcyjnych, wstawkę pILT-E43 skrócono przez podwójne trawienia HindIII-BstXI i XhoI-EcoRI, a następnie traktowano polimerazą Klenow i poddano ponownej ligacji. Z otrzymanego plazmidu pILT-E43BX (Fig. 1D), usunięto fragment XbaI-BssHII o wielkości 1141 pz obejmujący kodon inicjacyjny UL0 i zastąpiono go fragmentem XbaI-BglII o wielkości 802 pz z pEGFP-N1 (Clontech), który zawiera otwartą ramkę odczytu EGFP bez sekwencji promotorowych. Podczas gdy w pΔUL0-G2 większa część wirusowej ramki odczytu UL0 została zastąpiona przez EGFP, równocześnie skonstruowany plazmid pΔUL0 wykazuje tą samą delecję, ale nie zawiera obcych sekwencji DNA (Fig. 1D).

Konstrukcja plazmidów przenośnikowych i mutantów ILTV wyrażających AIV HA.

Gen hemaglutyniny (HA) wyizolowany ostatnio z wysoce patogennego podtypu H5N2 AIV A/ltaly/8/98 poddano odwrotnej transkrypcji, sklonowano w eukariotycznym wektorze ekspresji pcDNA3 (Invitrogen) i zsekwencjonowano (Liischow i wsp., Vaccine, vol. 19, p. 4249-4259, 2001, GenBank nr dostępu AJ305306). HA gen łącznie z promotorem HCMV-IE z otrzymanego plazmidu ekspresyjnego pCD-HA5 wstawiono jako fragment Nrul/Notl o wielkości 2646 pz do strawionego podwójnie EcoRl/XbaI plazmidu pΔUL0-G2 po wypełnieniu pojedynczych, wystających końców polimerazą Klenow. W otrzymanym, w rezultacie plazmidzie, pΔUL0-HA5A, ramka odczytu EGFP została zastąpiona przez kasetę ekspresyjną dla HA, która jest w orientacji równoległej z UL0 aby wykorzystać wspólny sygnał poliadenylacji UL0, UL1 i UL2. Na koniec usunięto promotor HCMV przez trawienie BamHI i XhoI, traktowanie polimerazą Klenow i ligację. A zatem w plazmidzie pΔUL0-HA5B gen hemaglutyniny może ulegać ekspresji pod kontrolą promotora genu ILTV UL0.

W drugim podejściu, gen HA wysoce patogennego podtypu H7N1 AIV A/ltaly/445/99 poddano odwrotnej transkrypcji i powielono przez PCR. Produkt o wielkości 1711 pz sklonowano w wektorze pUC18 (Amersham) strawionym Smal i zsekwencjonowano (SEK NR ID: 1). Otrzymany w rezultacie plazmid stawiono podwójnie Xbal i Hindlll i po traktowaniu polimerazą Klenow, promotor HCMV-IE wstawiono na końcu 5' otwartej ramki odczytu HA jako fragment Hindlll/Nrul z pcDNA3 o wielkości 681 pz następnie kasetę ekspresyjną HA klonowano ponownie jako fragment KpnI/Hindlll o wielkości 2437 pz w plazmidzie pΔUL0-G2 strawionym podwójnie Xba/HindIII po wytępieniu nie pasujących lepkich końców. Otrzymany na zakończenie plazmid pΔUL0-HA7 (Fig. 1E) zawiera gen HA typu H7 w orientacji równoległej z usuniętą otwartą ramką odczytu UL0 ILTV, ale pod kontrolą promotora HCMV-IE.

Trzy plazmidy przenośnikowe (Fig. 1E) zastosowano do kotransfekcji komórek razem z wirusowym DNA z ILTV ΔUL0-G1, co ułatwiło selekcję pożądanych nie-fluoryzujących rekombinantów.

Wytwarzanie zrekombinowanych mutantów ILTV UL0

Ponieważ zakaźność wyizolowanego DNA w transfekowanych komórkach CEK lub kurzych komórkach wątrobiaka jest niska, wytworzono plazmidy ekspresyjne dla wirusowych transaktywatorów. W tym celu otwartą ramkę odczytu UL48 z ILTV (Ziemann i wsp., J. Virology 72: 847-852, 1998) kodującą przypuszczalny homolog transaktywatora wirusa opryszczki alfa (VP16, aTIF; Roizman i Sears, Fields Virology wyd. 3: 2231-2295, 1996) reklonowano jako fragment Ncol-Spel o wielkości 2259 pz w pRc-CMV (Invitrogen), co umożliwia konstytutywną ekspresję genu pod kontrolą promotora HCMV-IE. Po kotransfekcji komórek DNA ILTV przy użyciu fosforanu wapnia (Graham i van der Eb,

PL 202 286 B1

Virology 52: 456-467, 1973) i ekspresji plazmidu pRc-UL48, liczba łysinek wirusowych zasadniczo zwiększyła się w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla plazmidów kontrolnych albo bez plazmidów (Fuchs i wsp., 2000, jak wyżej).

W celu wytworzenia zrekombinowanych wirusów, komórki CEK lub LMH kotransfekowano DNA ILTV, pRc-UL48, i pożądanymi plazmidami przenośnikowymi. Po 5 do 7 dniach komórki zeskrobano do pożywki i poddano lizie przez zamrażanie i rozmrażanie. Potomstwo wirusa analizowano przez ograniczone rozcieńczenia na komórkach CEK hodowanych na 96-studzienkowych płytkach. Podczas gdy rekombinanty ILTV wyrażające EGFP można zidentyfikować bezpośrednio przez mikroskopię fluorescencyjną, aktywność β-galaktozydazy była wykrywana przez barwienie in vivo w pożywce zawierającej 300 μg/ml BluoGal (Gibco BRL). Rekombinanty wirusowe zbierano i oczyszczanie powtarzano aż do czasu kiedy łysinki wykazywały pożądany fenotyp. Na koniec otrzymano DNA i poddano analizie restrykcyjnej, hybrydyzacji Southern blot i PCR w celu weryfikacji prawidłowych delecji lub insercji.

Wirusowy DNA patogennego szczepu dzikiego zastosowano do kotransfekcji w celu otrzymania rekombinantów ILTV ΔUL0-Z, ΔUL0-G1 i ΔUL0-G2 (Fig. 1B, 1C i 1D). W celu wytworzenia mutantów z odzyskanym genem (ILTV UL0R; Fig. 1A), mutanta delecyjnego bez obcych sekwencji (ILTV ΔUL0; Fig. 1D) i rekombinantów wyrażających HA (ILTV ΔUL0-HA5A, ILTV ΔUL0-HA5B, ILTV ΔUL0-HA7; Fig. 1E) przeprowadzono kotransfekcję z DNA ILTV ΔUL0-G1 i pILT-E43 lub ΔUL0 lub odpowiednich pochodnych ΔUL0-G2. W tym przypadku potomstwo wirusowe przeszukiwano pod kątem nie fluoryzujących łysinek na komórkach CEK.

Charakteryzowanie zrekombinowanych mutantów ILTV UL0 in vitro

W celu potwierdzenia, że wyizolowane mutanty delecyjne UL ILTV nie wyrażają natywnego produktu genu UL0, komórki CEK infekowano przy m.o.i. 5 pfu/komórkę odpowiednimi mutantami delecyjnymi i inkubowano przez 24 godz. w 37°C. Następnie komórki poddano lizie, białka rozdzielono na nieciągłych żelach SDS-poliakryloamidowych i przenoszono na filtry nitrocelulozowe zgodnie ze standardowymi technikami. Substraty do analizy Western inkubowano i poddawano obróbce jak opisano (Fuchs and Mettenleiter, J. Gen. Virol. 80, 2173-2182, 1999) z króliczą surowicą odpornościową swoistą wobec UL0 (Ziemann i wsp., jak wyżej, 1998) albo z monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi wobec gC. Wszystkie ścieżki wykazywały reakcję z Moab, jednakże jedynie w komórkach infekowanych wirusem typu dzikiego bądź mutantem z odzyskanym genem UL0 wykrywalne było białko UL0 o wielkości 63 kDa (Fig. 2). Nie było danych, aby którykolwiek z mutantów delecyjnych stabilnie wyrażał mniejsze białko z nie usuniętej części genu. Analiza Western lizatów z zainfekowanych komórek z kurzą surowicą odpornościową swoistą wobec podtypu AIV potwierdziła dalej wysoką ekspresję hemaglutyniny typu H7 przez ILTV ΔUL0-HA7 i hemaglutyniny typu H5 przez ILTV ΔUL0-HA5A, podczas gdy obce białko nie było wyraźnie widoczne w komórkach zakażonych ILTV ΔUL0-HA5B.

P r z y k ł a d 2

Hodowla i mianowanie mutantów ILTV UL0

Otrzymywanie zrekombinowanych i kontrolnych wirusów ILT przeprowadzono przez zaszczepienie na naderwanej błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) 9 do 11 dniowych jaj kurzych SPF z zarodkami, przy zastosowaniu technik znanych w tej dziedzinie. Po inkubacji przez 5 do 6 dni w 37°C CAM zbierano, homogenizowano, filtrowano przez filtr 100 μm i mianowano.

Mianowanie wirusa w komórkach LMH przeprowadzono na komórkach wątrobiaka od samca Leghorn (LMH). W 96-studzienkowych płytkach pół konfluentne pojedyncze warstwy komórek LMH infekowano seryjnymi rozcieńczeniami próbki wirusa ILT. Dołączono odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne. Płytki inkubowano przez 5 dni, komórki utrwalano schłodzonym w lodzie etanolem i zabarwiano pod kątem obecności wirusa, stosując standardowy protokół immunofluorescencji przy użyciu poliklonalnej kurzej surowicy odpornościowej przeciw ILT i koziego przeciwciała anty-kurze IgG sprzężonego z FITC. Studzienki, które wykazywały jasną zieloną fluorescencję, gdzie wirus ILT podlegał replikacji, były uważane jako dodatnie. Miana są przedstawione jako wartości Log10 TCID50 przy zastosowaniu algorytmu Spearman-Karber.

Aby zrekombinowany wirus ILTV mógł być stosowany jako szczepionka do masowego użycia, niezbędne są dobre wydajności wzrostu, a zatem zastosowana delecja genu nie powinna przeszkadzać w zdolności do wzrostu do wysokich mian. Poza ΔUL0 skonstruowano kilka dalszych rekombinantów ILT niosących delecję genu, która powoduje brak odpowiedniego produktu genowego i wszystkie one zostały zaszczepione do zapłodnionych jaj w celu wytworzenia wirusa z homogenatu CAM. Przeprowadzono kilka inkubacji i zebrano wirusy w celu otrzymania maksymalnej możliwej wydajnoPL 202 286 B1 ści dla pewnych rekombinantów. Ku zaskoczeniu, delecja UL0 umożliwia replikację w jajach z uzyskaniem mian, które są co najmniej tak dobre jak wydajność rodzicielskiego wirusa typu dzikiego, podczas gdy inne rekombinanty delecyjne ILTV dają znacznie mniejszą albo niewykrywalną wydajność wirusa. Ta korzystna zdolność jest utrzymywana po wstawieniu genów LacZ lub AIV H7, patrz Tabela 1.

T a b e l a 1: Testowane rekombinanty delecyjne i maksymalna wydajność zrekombinowanego wirusa ILT (recILT) w homogenacie CAM maks. wydajność :

recILTV	delecja w:	insercja:	(Log10 TCID50/ml)
ΔgG+Z:	gG (Us4)	gen Lac Z	3,5
AUL10+Z	UL10 (gM)	gen Lac Z	2,7
AUL21+Z	UL21	gen Lac Z	3,7
AUL4 9.5+Z	UL4 9.5 (gN)	gen Lac Z	< 2,5
AUL0+Z	UL0	gen Lac Z	5,1
AUL0+HA7	UL0	gen AIV H7	5,9
AUL0	UL0	brak	5,7
AUL50	UL50	brak	4,7
ATK	UL23	brak	4,8
AOrf B	Orf B	brak	4,4
A489	(typ dziki)		5,2

P r z y k ł a d 3

Testy na zwierzętach w celu określenia atenuacji mutantów ILTV UL0

Przeprowadzono testy zwierzęce w celu zmierzenia poziomu atenuacji uzyskanego przez wprowadzenie delecji/insercji do genu UL0. Służącym do tego standardowym testem dla ILTV jest zaszczepienie próbki wirusa bezpośrednio do tchawicy podatnych kurczaków i obserwacja poziomu objawów klinicznych albo liczby padłych zwierząt po 9 albo 10 dniach. Jako porównanie, przygotowano próbki wirusa (homogenizowane i filtrowane CAM) wirulentnego szczepu A 489 ILT typu dzikiego, mogące służyć jako donor dla wirusowego DNA, który został zmutowany i podobną próbkę dla CAM infekowanych ślepą próbą. Ważne jest testowanie różnych dawek ponieważ patologia w infekcji ILT jest bezpośrednio uzależniona z otrzymanej dawki.

Zatem próbki wirusowe powielano i mianowano na komórkach LHM w trzech powtórzeniach jak opisano powyżej i zastosowano do zaszczepienia 10 dniowych kurcząt SPF, drogą dotchawiczną, 0,2 ml na zwierzę. Grupy różnie traktowane trzymano oddzielnie w grupach po 20 zwierząt w izolatkach podciśnieniowych. Kurczęta obserwowano przez 9 dni i oznaki kliniczne związane z chorobą dróg oddechowych oceniano codziennie, zgodnie z następującą tabelą:

wynik 0: brak objawów choroby (dróg oddechowych) wynik 2: lekka niewydolność oddechowa, zwierzę powolne, przygnębione, niektóre kaszlące, trzęsące głową wynik 3: poważna niewydolność oddechowa, sapanie, głęboki oddech, kaszel, zwierzę pokłada-jące się, zapalenie spojówek, wysięk z nosa wynik 3: zwierzę padłe

W Ścieżce eksperymentalnej 1, ΔUL0+Z porównywano do CAM nie zainfekowanych i zainfekowanych A 489. AUL0+Z testowano w dwóch dawkach.

W Ścieżce eksperymentalnej 2 to samo doświadczenie powtórzono drugi raz, z tym samym protokołem traktowania. Tym razem włączono rekombinanty ΔUL0, które również testowano w dwóch dawkach.

Wreszcie, w Ścieżce eksperymentalnej 3 przeprowadzono podobne doświadczenie, tym razem testowano 2 dawki zrekombinowanego wirusa ILT, który był nośnikiem wstawki HA7 AIV w locus genu UL0.

Wyniki te (przedstawione w Tabeli 2 i na Fig. 3A-C) pokazują, że wszystkie delecje UL0 indukują stosunkowo mniejszą śmiertelność w porównaniu z wirusem typu dzikiego z którego pochodzą. Ostrość objawów klinicznych była znacząco zmniejszona; w ΔUL0+Z i ΔUL0 pozostaje pewna resztkowa patogenność. Wstawienie wstawki H7 AIV dalej zmniejsza patogenność do zera. Jednakże wszystkie trzy rekombinanty zachowują właściwości wydajnej replikacji w tchawicy i po zaszczepieniu do CAM (patrz Tabela 1).

PL 202 286 B1

T a b e l a 2: Atenuacja mutantów UL0 ILTV

		Śmiertelność
Nazwa	Dawka *)	#/ogółem	%
Ścieżka 1	nie zainfekowane CAM	<2,5	0/20	0
A 489	3,2	9/20	45
del UL0+Z	2,8	1/20	5
4,0	0/20	0
Ścieżka 2	nie zainfekowane CAM	<2,5	1/20	5
A 489	2,6	10/19	53
del UL0+Z	2,8	0/20	0
3,8	0/20	0
dei UL0	2,1	0/20	0
3,1	0/19	0
Ścieżka 3	nie zainfekowane CAM	<2,5	0/20	0
A 489	3,2	18/18	100
del UL0	2,8	1/19	5
del UL0+H7	2,4	0/20	0
3,7	0/20	0

^*) Dawka materiału innokulacyjnego jest w Log10 TCID50 na zwierzę (0.2 ml)

P r z y k ł a d 4

Testy na zwierzętach w celu określenia ochrony zaszczepionych kurcząt przeciw prowokacyjnej infekcji wirulentnym ILTV i wysoce patogennym AIV

Przeprowadzono dalsze doświadczenia w celu przetestowania przydatności mutantów delecyjnych UL0 ILTV jako żywych szczepionek wirusowych i jako wektorów wyrażających obcy antygen, które mogą chronić kurczęta przed innymi patogenami. W tym celu 10 dniowe kurczęta SPF immunizowano przez krople do oczu 10³ do 10⁴ jednostek tworzących łysinki (pfu) na zwierzę ILTV ΔUL0 bądź ILTV ΔUL0-HA7. Jak oczekiwano, wszystkie zwierzęta przeżyły immunizację i jedynie kilka z nich wykazywało łagodne objawy kliniczne ILT (Tabela 3). Dwa tygodnie po immunizacji od wszystkich zwierząt pobrano surowicę i badano pod kątem przeciwciał swoistych wobec ILTV, jak również HA. Przy zastosowaniu testów bezpośredniej immunofluorescencji (Liischow i wsp., 2001, jak wyżej) przeciwciała swoiste wobec ILTV wykrywano bez wątpliwości w ponad 70% próbek w obu immunizowanych grupach (Tabela 3). Ponadto, wszystkie kurczęta immunizowane ILTV ΔUL0-HA7 wytwarzały przeciwciała specyficzne wobec HA, jak wykazano przez test hamowania hemaglutyniny (HAI; Alexander DJ, w: OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 155-160, 1996) przy użyciu AIV A/ltaly/445/99 (H7N1) jako antygenu donorowego (Tabela 3).

Po 25 dniach podgrupy szczepionych kurcząt (grupy 1A, 2A) i nie immunizowane zwierzęta kontrolne (grupa 3) prowokowano przez dotchawiczne podawanie 2 x 10⁵ pfu na zwierzę wirulentnego ILTV typu dzikiego (A489). Śledzono poziomy śmiertelności i objawy kliniczne ILT i oceniano je ilościowo jak wyjaśniono powyżej (Przykład 3). Średnią wyników klinicznych dla wszystkich osobników w danej grupie określano dla 2 i 12 dnia po zakażeniu (Tabela 3). Wszystkie nie immunizowane zwierzęta kontrolne wykazywały ostre oznaki choroby, które prowadziły do śmierci w dwóch na cztery przypadki. W przeciwieństwie do tego, wszystkie szczepione zwierzęta przeżyły i większość z nich pozostawała zdrowa. Wyniki te jasno pokazują, że szczepienie żywym wirusem w przypadku mutantów ILTV z delecja UL0 nadaje ochronną odporność wobec kolejnych infekcji ILTV.

Dwie inne podgrupy (1B, 2B) kurcząt szczepionych bądź ILTV ΔUL0-HA7, bądź ILTV ΔUL0 prowokowano, przez podawanie donosowe 108 zarodkowych dawek zakaźnych (EID50) na zwierzę wyPL 202 286 B1 soce patogennego izolatu AIV A/ltaly/445/99 (H7N1), które były również biorcą genu HA wyrażanego przez ILTV ΔUL0-H7. Podobnie jak w przypadku nie immunizowanych zwierząt (nie pokazano), wszystkie kurczęta immunizowane ILTV ΔUL0 umierały w przeciągu 4 dni po infekcji AIV (Tabela 3). W przeciwieństwie do tego wszystkie zwierzęta immunizowane ILTV ΔUL0-HA7 przeżywały prowokację dawką letalną AIV, a ostrość choroby była zasadniczo zmniejszona. Objawy kliniczne ptasiej grypy oceniano indywidualnie jak następuje:

wynik 0: zwierzę zdrowe, wynik 1: biegunka albo obrzęk albo zwierzę przygnębione, wynik 2: zwierzę leży i jest niezdolne aby się podnieść, wynik 3: zwierzę padłe

Średnie wyniki dla każdej grupy obliczano przez 1 do 10 dni po prowokacji (Tabela 3). Jak określono przez zaszczepienie kurzych zarodków wymazem z tchawicy i kloaki (Alexander DJ, jak wyżej, 1996), wirus którym dokonywano prowokacji był rozsiewany przez wiele zaszczepionych zwierząt, ale jedynie przez bardzo krótki okres czasu. A zatem pojedyncze szczepienie żywym wirusem kurcząt w przypadku UL0-ujemnego zrekombinowanego ILTV wyrażającego hemaglutyninę H7 jest wystarczające dla zaindukowania ochronnej odporności wobec pomoru drobiu powodowanego przez wysoce patogenny AIV o odpowiadającym serotypie.

T a b e l a 3: Testy zwierzęce dla określenia ochrony zaszczepionych kurcząt przeciw prowokacyjnej infekcji wirulentnym ILTV i wysoce patogennym AIV

	Skala czasowa
Grupa		1 (20 zwierząt)	2 (9 zwierząt)	3 (4 zwierzęta)
Immunizacja (dawka na zwierzę)	0	ILTV ΔΙΧ0-Η7 (104 pfu)	ILTV-\UL0 (103 pfu)	Nic
Liczba przypadków (wynik kliniczny)	2-12 d p.i.2)	2/20 (0,03)	1/9 (0,04)	0/4
Śmiertelność		0/20	0/9	0/4
Ab1) swoiste wobec ILTV	15 d p.i.	14/20	7/9	0/4
Ab swoiste wobec AIV (Miano 0 HAI)	15 d p.i.	20/20 (24.6)	0/9	n. t.4)

Grupa		1A (6 zwierząt)	2A (6 zwierząt)	3 (4 zwierzęta)
Prowokacja ILTV	25 d p.i.	ILTV A489
(dawka na zwierzę)		(2 x 105 pfu)
Liczba przypadków	2-12 d	1/6	1/6	4/4
(wynik kliniczny)	p.c3)	(0,08)	(0,06)	(1,84)
Śmiertelność	4-10 d p.c.	0/6	0/6	2/4
Grupa		IB (12 zwierząt)	2B (3 zwierzęta)
Prowokacja AIV (dawka na zwierzę)	25 d p.i.	AIV A/ltaly/445/99	107·8 EID50)
Liczba przypadków (wynik kliniczny)	1-10 d p.c.	12/12	3/3
		(0,63)	(2,53)
Śmiertelność	3-4 d p.c.	0/12	3/3
Rozsiewanie AIV	3 d p.c.	9/12	3/3
(wymazy z tchawicy i/lub kloaki)	6 d p.c.	1/10
	10 d p.c.	0/10

¹⁾ przeciwciała w surowicy ²⁾ dni po immunizacji ³⁾ dni po prowokacyjnej infekcji ⁴⁾ nie testowano.

NB: w czasie testu 4 zwierzęta z grupy 1 poddano sekcji w celu przeprowadzenia badań patologicznych.

PL 202 286 B1

Lista sekwencji <110> AKZO Nobel NV <120> Szczepionka do ochrony drobiu przed chorobą wywoływaną przez ptasi patogen, sposób jej wytwarzania oraz hodowla komórkowa infekowana zmutowanym ILTV <160> 2 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 1711 <212> DNA <213> Wirus ptasiej grypy <220>

<221> cDNA <222> (1)..(1711) <223> izolat A/Italy/445/99 (H7/N1) <220>

<221> CDS <222> (11)..(1705) <223>

<400> 1 gggatacaaa atg aac act caa atc ctg gta ttc gct ctg gtg gcg atc 49

Met Asn Thr Gin Ile Leu Val Phe Ala Leu Val Ala Ile 15 10

att Ile

ccg Pro 15

aca Thr

agt Ser

gca Ala

gac Asp

aaa Lys 20

atc Ile

tgc Cys

ctt Leu

999 Gly

cat His 25

cat His

gcc Ala

gtg Val

tca Ser

97

aac

ggg

act

aaa

gta

aac

aca

tta

act

gaa

aga

gga

gtg

gaa

gtc

gtt

145

Asn

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Thr

Leu

Thr

Glu

Arg

Gly

Val

Glu

Val

Val

30

35

40

45

aat Asn

gca Ala

act Thr

gaa Glu

acg Thr 50

gtg Val

gaa Glu

ega Arg

aca Thr

aac Asn 55

gtc Val

ccc Pro

agg Arg

atc Ile

tgc Cys 60

tca Ser

193

aaa

999

aaa

agg

aca

gtt

gac

ctc

ggt

caa

tgt

gga

ctt

ctg

gga

aca

241

Lys

Gly

Lys

Arg

Thr

Val

Asp

Leu

Gly

Gin

Cys

Gly

Leu

Leu

Gly

Thr

65

70

75

atc

act

999

cca

ccc

caa

tgt

gac

cag

ttc

eta

gaa

ttt

tca

gcc

gat

289

Ile

Thr

Gly

Pro

Pro

Gin

Cys

Asp

Gin

Phe

Leu

Glu

Phe

Ser

Ala

Asp

80

85

90

eta

att

att

gag

agg

ega

gaa

gga

agt

gat

gtc

tgt

tat

cct

999

aaa

337

Leu

Ile

Ile

Glu

Arg

Arg

Glu

Gly

Ser

Asp

Val

Cys

Tyr

Pro

Gly

Lys

95

100

105

PL 202 286 B1

ttc gtg Phe Val 110

aat Asn

gaa Glu

gaa Glu

gct Ala 115

ctg Leu

agg Arg

caa Gin

att Ile

ctc Leu 120

agg Arg

gag Glu

tca Ser

ggc Gly

gga Gly 125

385

att

gac

aag

gag

gca

atg

gga

ttc

aca

tac

agc

gga

ata

aga

act

aat

433

Ile

Asp

Lys

Glu

Ala

Met

Gly

Phe

Thr

Tyr

Ser

Gly

Ile

Arg

Thr

Asn

130

135

140

gga

aca

acc

agt

aca

tgt

agg

aga

tca

gga

tct

tca

ttc

tat

gca

gag

481

Gly

Thr

Thr

Ser

Thr

Cys

Arg

Arg

Ser

Gly

Ser

Ser

Phe

Tyr

Ala

Glu

145

150

155

atg

aaa

tgg

ctc

ctg

tca

aac

aca

gac

aat

gct

gct

ttc

ccg

cag

atg

529

Met

Lys

Trp

Leu

Leu

Ser

Asn

Thr

Asp

Asn

Ala

Ala

Phe

Pro

Gin

Met

160

165

170

act

aag

tca

tac

aaa

aac

aca

agg

aaa

gac

cca

gct

ctg

ata

ata

tgg

577

Thr

Lys

Ser

Tyr

Lys

Asn

Thr

Arg

Lys

Asp

Pro

Ala

Leu

Ile

Ile

Trp

175

180

185

ggg

atc

cac

cat

tcc

gga

tca

act

aca

gaa

cag

acc

aag

eta

tat

ggg

625

Gly

Ile

His

His

Ser

Gly

Ser

Thr

Thr

Glu

Gin

Thr

Lys

Leu

Tyr

Gly

190

195

200

205

agt

gga

aac

aaa

ctg

ata

aca

gtt

ggg

agt

tct

aat

tac

caa

cag

tcc

673

Ser

Gly

Asn

Lys

Leu

Ile

Thr

Val

Gly

Ser

Ser

Asn

Tyr

Gin

Gin

Ser

210

215

220

ttt

gta

ccg

agt

cca

gga

gag

aga

cca

caa

gtg

aat

ggc

caa

tct

gga

721

Phe

Val

Pro

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Pro

Gin

Val

Asn

Gly

Gin

Ser

Gly

225

230

235

aga

att

gac

ttt

cat

tgg

ctg

atg

eta

aac

ccc

aat

gac

aca

gtc

act

769

Arg

Ile

Asp

Phe

His

Trp

Leu

Met

Leu

Asn

Pro

Asn

Asp

Thr

Val

Thr

240

245

250

ttc

agt

ttc

aat

ggg

gcc

ttc

ata

gct

cca

gac

cgt

gca

agt

ttt

ctg

817

Phe

Ser

Phe

Asn

Gly

Ala

Phe

Ile

Ala

Pro

Asp

Arg

Ala

Ser

Phe

Leu

255

260

265

aga

ggg

aag

tct

atg

ggg

att

cag

agt

gga

gta

cag

gtt

gat

gcc

aat

865

Arg

Gly

Lys

Ser

Met

Gly

Ile

Gin

Ser

Gly

Val

Gin

Val

Asp

Ala

Asn

270

275

280

285

tgt

gaa

gga

gat

tgc

tat

cac

agt

gga

ggg

aca

ata

ata

agt

aat

ttg

913

Cys

Glu

Gly

Asp

Cys

Tyr

His

Ser

Gly

Gly

Thr

Ile

Ile

Ser

Asn

Leu

290

295

300

ccc

ttt

cag

aac

ata

aat

agc

agg

gca

gta

ggg

aaa

tgt

ccg

aga

tat

961

Pro

Phe

Gin

Asn

Ile

Asn

Ser

Arg

Ala

Val

Gly

Lys

Cys

Pro

Arg

Tyr

305

310

315

PL 202 286 B1

gtt Val

aag Lys

caa gag agt Gin Glu Ser 320

ctg Leu

ctg Leu

ctg Leu 325

gca aca ggg atg aag

aat Asn

gtt Val

ccc Pro

1009

Ala Thr Gly

Met

Lys 330

gaa

att

cca

aaa

gga

teg

cgt

gtg

agg

aga

ggc

eta

ttt

ggt

get

ata

1057

Glu

Ile

Pro

Lys

Gly

Ser

Arg

Val

Arg

Arg

Gly

Leu

Phe

Gly

Ala

Ile

335

340

345

gcg

ggt

ttc

att

gaa

aat

gga

tgg

gaa

ggt

ctg

att

gat

ggg

tgg

tat

1105

Ala

Gly

Phe

Ile

Glu

Asn

Gly

Trp

Glu

Gly

Leu

Ile

Asp

Gly

Trp

Tyr

350

355

360

365

ggc

ttc

agg

cat

caa

aat

gca

caa

gga

gag

gga

act

get

gca

gat

tac

1153

Gly

Phe

Arg

His

Gin

Asn

Ala

Gin

Gly

Glu

Gly

Thr

Ala

Ala

Asp

Tyr

370

375

380

aaa

agc

acc

caa

tea

gca

att

gat

caa

gta

aca

gga

aaa

ttg

aac

cgg

1201

Lys

Ser

Thr

Gin

Ser

Ala

Ile

Asp

Gin

Val

Thr

Gly

Lys

Leu

Asn

Arg

385

390

395

ctt

ata

gaa

aaa

act

aac

caa

caa

ttt

gag

tta

ata

gac

aat

gaa

ttc

1249

Leu

Ile

Glu

Lys

Thr

Asn

Gin

Gin

Phe

Glu

Leu

Ile

Asp

Asn

Glu

Phe

400

405

410

act

gag

gtt

gaa

aag

caa

att

ggc

aat

gtg

ata

aat

tgg

acc

aga

gat

1297

Thr

Glu

Val

Glu

Lys

Gin

Ile

Gly

Asn

Val

Ile

Asn

Trp

Thr

Arg

Asp

415

420

425

tcc

atg

aca

gaa

gtg

tgg

tcc

tat

aac

get

gaa

ctc

ttg

gta

gca

atg

1345

Ser

Met

Thr

Glu

Val

Trp

Ser

Tyr

Asn

Ala

Glu

Leu

Leu

Val

Ala

Met

430

435

440

445

gag

aac

cag

cat

aca

att

gat

ctg

acc

gac

tea

gaa

atg

aac

aaa

eta

1393

Glu

Asn

Gin

His

Thr

Ile

Asp

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Met

Asn

Lys

Leu

450

455

460

tac

gaa

ega

gtg

aag

aga

eta

ctg

aga

gag

aat

get

gaa

gaa

gat

ggc

1441

Tyr

Glu

Arg

Val

Lys

Arg

Leu

Leu

Arg

Glu

Asn

Ala

Glu

Glu

Asp

Gly

465

470

475

act

ggt

tgc

ttc

gaa

ata

ttt

cac

aag

tgt

gat

gac

gat

tgt

atg

gee

1489

Thr

Gly

Cys

Phe

Glu

Ile

Phe

His

Lys

Cys

Asp

Asp

Asp

Cys

Met

Ala

480

485

490

agt

att

aga

aac

aac

aca

tat

gat

cac

agc

aag

tac

agg

gaa

gag

gca

1537

Ser

Ile

Arg

Asn

Asn

Thr

Tyr

Asp

His

Ser

Lys

Tyr

Arg

Glu

Glu

Ala

495

500

505

atg

caa

aat

aga

ata

cag

att

gac

cca

gtc

aaa

eta

agc

agc

ggc

tac

1585

Met

Gin

Asn

Arg

Ile

Gin

Ile

Asp

Pro

Val

Lys

Leu

Ser

Ser

Gly

Tyr

510 515 520 525

PL 202 286 B1

aaa Lys

gat Asp

gtg Val

ata Ile

ctt Leu 530

tgg Trp

ttt Phe

agc Ser

ttc Phe

ggg Gly 535

gca Ala

tca Ser

tgt Cys

ttc Phe

ata Ile 540

ctt Leu

1633

ctg

gcc

att

gca

atg

ggc

ctt

gtc

ttc

ata

tgt

gtg

aga

aat

gga

aac

1681

Leu

Ala

Ile

Ala

Met

Gly

Leu

Val

Phe

Ile

cys

Val

Arg

Asn

Gly

Asn

545

550

555

atg

cgg

tgc

act

att

tgt

ata

taa

gtttgg

1711

Met

Arg

Cys

Thr

Ile

Cys

Ile

560

<210> <211> <212> <213> ' <400>

2 564 PRT Wirus ptasiej 2

i grypy

Met 1

Asn

Thr

Gin

Ile 5

Leu

Val

Phe

Ala

Leu 10

Val

Ala

ile

Ile

Pro 15

Thr

Ser

Ala

Asp

Lys 20

Ile

Cys

Leu

Gly

His 25

His

Ala

Val

Ser

Asn 30

Gly

Thr

Lys

Val

Asn 35

Thr

Leu

Thr

Glu

Arg 40

Gly

Val

Glu

Val

Val 45

Asn

Ala

Thr

Glu

Thr 50

Val

Glu

Arg

Thr

Asn 55

Val

Pro

Arg

Ile

Cys 60

Ser

Lys

Gly

Lys

Arg 65

Thr

Val

ASp

Leu

Gly 70

Gin

Cys

Gly

Leu

Leu 75

Gly

Thr

Ile

Thr

Gly 80

Pro

Pro

Gin

Cys

Asp 85

Gin

Phe

Leu

Glu

Phe 90

Ser

Ala

Asp

Leu

Ile 95

Ile

Glu

Arg

Arg

Glu 100

Gly

Ser

Asp

Val

Cys 105

Tyr

Pro

Gly

Lys

Phe 110

Val

Asn

Glu

Glu

Ala 115

Leu

Arg

Gin

Ile

Leu 120

Arg

Glu

Ser

Gly

Gly 125

Ile

Asp

Lys

Glu

Ala 130

Met

Gly

Phe

Thr

Tyr 135

Ser

Gly

Ile

Arg

Thr 140

Asn

Gly

Thr

Thr

Ser 145

Thr

Cys

Arg

Arg

Ser 150

Gly

Ser

Ser

Phe

Tyr 155

Ala

Glu

Met

Lys

Trp 160

Leu

Leu

Ser

Asn

Thr 165

Asp

Asn

Ala

Ala

Phe 170

Pro

Gin

Met

Thr

Lys 175

Ser

PL 202 286 B1

Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Asp Pro Ala Leu Ile Ile Trp Gly Ile His 180 185 190

His Ser Gly Ser Thr Thr Glu Gin Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn 195 200 205

Lys Leu Ile Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gin Gin Ser Phe Val Pro 210 215 220

Ser Pro Gly Glu Arg Pro Gin Val Asn Gly Gin Ser Gly Arg Ile Asp

225 230 235 240

Phe His Trp Leu Met Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe

245 250 255

Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys 260 265 270

Ser Met Gly Ile Gin Ser Gly Val Gin Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly 275 280 285

Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gin 290 295 300

Asn Ile Asn Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin

305 310 315 320

Glu Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro

325 330 335

Lys Gly Ser Arg Val Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350

Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg 355 360 365

His Gin Asn Ala Gin Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr 370 375 380

Gin Ser Ala Ile Asp Gin Val Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu

385 390 395 400

Lys Thr Asn Gin Gin Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Thr Glu Val

405 410 415

Glu Lys Gin Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr 420 425 430

Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gin 435 440 445

His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg 450 455 460

PL 202 286 B1

Val Lys Arg Leu Leu. Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys

465 470 475 480

Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg

485 490 495

Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gin Asn 500 505 510

Arg Ile Gin Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val 515 520 525

Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile 530 535 540

Ala Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Arg Asn Gly Asn Met Arg Cys 545 550 555 560

Thr Ile Cys Ile

564

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Szczepionka do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez ptasi patogen, zawierająca atenuowanego mutanta wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy (ILTV) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo rozcieńczalnik, znamienna tym, że mutant ILTV nie jest zdolny do ekspresji natywnego białka UL0 w zainfekowanych komórkach gospodarza w wyniku mutacji w genie UL0.
2. 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacją w genie UL0 jest delecja.
3. 3. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że mutacją w genie UL0 jest insercja heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego.
4. 4. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że mutant zawiera heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego w miejscu delecji.
5. 5. Szczepionka według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego jest pod kontrolą sekwencji kontrolującej ekspresję.
6. 6. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje antygen ptasiego patogenu.
7. 7. Szczepionka według zastrz. 6, znamienna tym, że ptasim patogenem jest wirus ptasiej grypy, wirus choroby Mareka, wirus choroby Newcastle, wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli, wirus nieżytu nosa i tchawicy indyków, E. coli, Ornithobacterium rhinotracheale lub Mycoplasma.
8. 8. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje czynnik immunomodulujący.
9. 9. Hodowla komórkowa infekowana mutantem ILTV zdefiniowanym w zastrzeżeniach od 1 do 8.
10. 10. Sposób wytwarzania szczepionki do ochrony drobiu przed chorobą powodowaną przez ptasi patogen, znamienny tym, że obejmuje etap mieszania mutanta ILTV według zastrz. od 1 do 8 z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem albo rozcieńczalnikiem.