JP3375347B2 - マレック病に対する組換えワクチン - Google Patents
マレック病に対する組換えワクチンInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マレック病ウイルスポ
リペプチドをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含
む組換え核酸分子、前記核酸配列を含むベクターウイル
ス、かかる核酸配列を用いて形質転換された宿主細胞、
マレック病ウイルスポリペプチド、かかるポリペプチド
に反応性を示す抗体、及びマレック病に対するワクチン
に係わる。
リペプチドをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含
む組換え核酸分子、前記核酸配列を含むベクターウイル
ス、かかる核酸配列を用いて形質転換された宿主細胞、
マレック病ウイルスポリペプチド、かかるポリペプチド
に反応性を示す抗体、及びマレック病に対するワクチン
に係わる。
【０００２】
【従来の技術】マレック病（ＭＤ）は、ヘルペスウイル
スであるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起
こされる家禽の悪性リンパ増殖性疾患である。ＭＤは、
世界中の家禽生産国のいたるところで発生している。集
約生産システム下で飼育されたニワトリはＭＤによる損
失を被ることは免れ得ない。ＭＤは約６週齢以上のニワ
トリに感染するが、１２〜２４週齢の間に最も多発す
る。
スであるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起
こされる家禽の悪性リンパ増殖性疾患である。ＭＤは、
世界中の家禽生産国のいたるところで発生している。集
約生産システム下で飼育されたニワトリはＭＤによる損
失を被ることは免れ得ない。ＭＤは約６週齢以上のニワ
トリに感染するが、１２〜２４週齢の間に最も多発す
る。
【０００３】臨床的には、古典的ＭＤ、急性ＭＤ及び一
過性麻痺の３つの形態のＭＤが認識されている。
過性麻痺の３つの形態のＭＤが認識されている。
【０００４】古典的ＭＤは、リンパ球浸潤及び脱髄に起
因する末梢神経肥大を特徴としており、麻痺が主な臨床
症状である。致死率は可変であるが、通常は１０〜１５
％以下である。
因する末梢神経肥大を特徴としており、麻痺が主な臨床
症状である。致死率は可変であるが、通常は１０〜１５
％以下である。
【０００５】急性形態には、内臓臓器内の多発性及び広
汎性のリンパ腫瘍がある。この形態のＭＤによる致死率
は通常は古典的形態よりも高い。ワクチン未接種の集団
においては１０〜３０％の罹患率が一般的であり、集団
の７０％までを巻き込む発病もあり得る。古典的及び急
性ＭＤの病理学的病変は実質的に類似であって、悪性形
質転換Ｔリンパ芽球の増殖、及び、正常組織、即ち古典
的形態のケースでは末梢神経中への、また急性形態のケ
ースでは内臓臓器中への該Ｔリンパ芽球の浸潤を含む。
汎性のリンパ腫瘍がある。この形態のＭＤによる致死率
は通常は古典的形態よりも高い。ワクチン未接種の集団
においては１０〜３０％の罹患率が一般的であり、集団
の７０％までを巻き込む発病もあり得る。古典的及び急
性ＭＤの病理学的病変は実質的に類似であって、悪性形
質転換Ｔリンパ芽球の増殖、及び、正常組織、即ち古典
的形態のケースでは末梢神経中への、また急性形態のケ
ースでは内臓臓器中への該Ｔリンパ芽球の浸潤を含む。
【０００６】更に、突発性麻痺を特徴とする若いニワト
リの脳炎の原因となることも判っている。
リの脳炎の原因となることも判っている。
【０００７】ＭＤ関連ウイルスを血清学的に分類すると
以下の３つの血清型に大別される。
以下の３つの血清型に大別される。
【０００８】１型：ニワトリに対して病原性且つ腫瘍原
性であるマレック病ウイルスの天然有毒株、及びその弱
毒化非病原性株、 ２型：マレック病ウイルスの天然非病原性株、並びに ３型：ニワトリ対して非病原性であるシチメンチョウヘ
ルペスウイルスＨＶＴ。
性であるマレック病ウイルスの天然有毒株、及びその弱
毒化非病原性株、 ２型：マレック病ウイルスの天然非病原性株、並びに ３型：ニワトリ対して非病原性であるシチメンチョウヘ
ルペスウイルスＨＶＴ。
【０００９】血清型１のＭＤＶ病原性株を継代培養する
と病原性及び発癌性は失われるが、免疫原性はなくなら
ないことが判った。ＨＰＲＳ−１６及びＣＶＩ−９８８
由来の弱毒化株はワクチンとして適用されている。ＳＢ
−Ｉ及びＨＮ−Ｉ ＭＤＶ株（血清型２）も予防接種に
有効であることが示されている。最初はシチメンチョウ
から単離されたＨＶＴは、シチメンチョウ及び家禽にお
いては非病原性であり、抗原性の点で血清型１及び２の
ＭＤウイルスと関連をもち、ＭＤに対するワクチンとし
て広く使用されている。
と病原性及び発癌性は失われるが、免疫原性はなくなら
ないことが判った。ＨＰＲＳ−１６及びＣＶＩ−９８８
由来の弱毒化株はワクチンとして適用されている。ＳＢ
−Ｉ及びＨＮ−Ｉ ＭＤＶ株（血清型２）も予防接種に
有効であることが示されている。最初はシチメンチョウ
から単離されたＨＶＴは、シチメンチョウ及び家禽にお
いては非病原性であり、抗原性の点で血清型１及び２の
ＭＤウイルスと関連をもち、ＭＤに対するワクチンとし
て広く使用されている。
【００１０】ＭＤの治療方法はなく、成長期のニワトリ
を感染源即ち病源から隔離する管理方法をとったり、遺
伝的に耐性のある品種を使用したり、予防接種するなど
による対応策がとられている。しかしながら、管理方法
によるものは一般にコスト面で効率的でなく、遺伝的に
制御された優れた耐性を有する家禽品種の選択に関して
の進歩は期待されるほどでない。今日では、ＭＤの対応
策はほぼ完全に予防接種に基づいている。
を感染源即ち病源から隔離する管理方法をとったり、遺
伝的に耐性のある品種を使用したり、予防接種するなど
による対応策がとられている。しかしながら、管理方法
によるものは一般にコスト面で効率的でなく、遺伝的に
制御された優れた耐性を有する家禽品種の選択に関して
の進歩は期待されるほどでない。今日では、ＭＤの対応
策はほぼ完全に予防接種に基づいている。
【００１１】現在のワクチンは、化学的に不活化された
ウイルスワクチンまたは改変された生ウイルスワクチン
からなる。しかしながら、不活化ワクチンは追加免疫を
必要とし、不利なことにはアジュバントを含んでおり、
製造するのが高価であり、投与するのに労力を要する。
更に、ある種の感染ウイルス粒子は不活化過程において
生き残り、動物に投与した後に病気を惹起し得る。
ウイルスワクチンまたは改変された生ウイルスワクチン
からなる。しかしながら、不活化ワクチンは追加免疫を
必要とし、不利なことにはアジュバントを含んでおり、
製造するのが高価であり、投与するのに労力を要する。
更に、ある種の感染ウイルス粒子は不活化過程において
生き残り、動物に投与した後に病気を惹起し得る。
【００１２】一般に、弱毒化生ウイルスワクチンは、多
くは体液性及び細胞性の両反応に基づく免疫応答を惹起
するが故に好ましい。これまでは血清型１のＭＤＶ株を
ベースとするワクチンのみが、有毒株を組織培養体中で
数代培養することにより製造することができた。しかし
ながらこの処理のため、制御し得ない突然変異がウイル
スゲノム中に導入され、毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）及
び免疫特性に関して異種のウイルス粒子の集団をもたら
す。細胞培養物中での継代の間の過剰な弱毒化は、上記
ワクチンにとって問題となり得る。ワクチンが有毒では
ないことを保証しながらそれが依然として保護性である
ことを保証するという微妙なバランスが得られねばなら
ない。更に、このような従来の弱毒化生ウイルスワクチ
ンは毒性を取り戻して接種動物を発病させたり、病原体
を他の動物に拡散する恐れがあり得ることが良く知られ
ている。生ＨＶＴワクチンによってはあまり防御されな
いＭＤウイルスの極めて有毒な野生株の存在が報告され
ており、世界中の種々の場所で甚だしい損失の原因とな
っている。血清型２及び３の株からなる二価ワクチン
は、場合によっては極めて有毒な野生単離体に対して適
度に有効である。血清型１の血清抗原を含む多価ワクチ
ンは、上記極めて有毒な株に対する免疫を誘発すること
においてずっと有効であるはずである。
くは体液性及び細胞性の両反応に基づく免疫応答を惹起
するが故に好ましい。これまでは血清型１のＭＤＶ株を
ベースとするワクチンのみが、有毒株を組織培養体中で
数代培養することにより製造することができた。しかし
ながらこの処理のため、制御し得ない突然変異がウイル
スゲノム中に導入され、毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）及
び免疫特性に関して異種のウイルス粒子の集団をもたら
す。細胞培養物中での継代の間の過剰な弱毒化は、上記
ワクチンにとって問題となり得る。ワクチンが有毒では
ないことを保証しながらそれが依然として保護性である
ことを保証するという微妙なバランスが得られねばなら
ない。更に、このような従来の弱毒化生ウイルスワクチ
ンは毒性を取り戻して接種動物を発病させたり、病原体
を他の動物に拡散する恐れがあり得ることが良く知られ
ている。生ＨＶＴワクチンによってはあまり防御されな
いＭＤウイルスの極めて有毒な野生株の存在が報告され
ており、世界中の種々の場所で甚だしい損失の原因とな
っている。血清型２及び３の株からなる二価ワクチン
は、場合によっては極めて有毒な野生単離体に対して適
度に有効である。血清型１の血清抗原を含む多価ワクチ
ンは、上記極めて有毒な株に対する免疫を誘発すること
においてずっと有効であるはずである。
【００１３】組換えＤＮＡ技術に基づいて、改良ワクチ
ンを構築することができる。かかるワクチンは、ＭＤＶ
病原体に対する防御免疫応答を誘発し得て且つ生ワクチ
ンまたは不活化ワクチンの前述の欠点をもたない、必須
及び関連ＭＤＶ免疫原性材料、または前記材料をコード
する遺伝情報のみを含む。
ンを構築することができる。かかるワクチンは、ＭＤＶ
病原体に対する防御免疫応答を誘発し得て且つ生ワクチ
ンまたは不活化ワクチンの前述の欠点をもたない、必須
及び関連ＭＤＶ免疫原性材料、または前記材料をコード
する遺伝情報のみを含む。
【００１４】本発明は、ＭＤＶ感染または疾患に対して
家禽を免疫するためのワクチン製造に適用し得る、ＭＤ
Ｖタンパク質ＭＤ０６の１つ以上の抗原決定基（ｉｍｍ
ｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を有し、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列またはそ
の機能性変形体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎ
ｔ）を有するポリペプチドをコードする単離・精製され
た核酸配列を提供する。
家禽を免疫するためのワクチン製造に適用し得る、ＭＤ
Ｖタンパク質ＭＤ０６の１つ以上の抗原決定基（ｉｍｍ
ｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を有し、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列またはそ
の機能性変形体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎ
ｔ）を有するポリペプチドをコードする単離・精製され
た核酸配列を提供する。
【００１５】ＭＤ０６ポリペプチドをコードする遺伝子
は、ＭＤＶゲノム内の非反復長鎖（ｕｎｉｑｕｅ ｌｏ
ｎｇ，ＵＬ）領域と内部反復構造要素（ＩＲＬ）との接
合部近傍に位置しており、推定分子量３２ｋＤａに相当
するアミノ酸約２９０個の長さのポリペプチドをコード
する。
は、ＭＤＶゲノム内の非反復長鎖（ｕｎｉｑｕｅ ｌｏ
ｎｇ，ＵＬ）領域と内部反復構造要素（ＩＲＬ）との接
合部近傍に位置しており、推定分子量３２ｋＤａに相当
するアミノ酸約２９０個の長さのポリペプチドをコード
する。
【００１６】本明細書中で使用される“核酸配列”と
は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、即ちリ
ボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両方を指す。原
則として、この用語は分子の一次構造を指す。即ちこの
用語は、二重鎖及び一重鎖ＤＮＡと、二重鎖及び一重鎖
ＲＮＡと、それらの変形体とを含む。
は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、即ちリ
ボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両方を指す。原
則として、この用語は分子の一次構造を指す。即ちこの
用語は、二重鎖及び一重鎖ＤＮＡと、二重鎖及び一重鎖
ＲＮＡと、それらの変形体とを含む。
【００１７】一般に“ポリペプチド”なる用語は、生物
学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を指しており、特定
の長さの生成物を指しているわけではなく、必要であれ
ば例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化また
はホスホリル化によってｉｎｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで修飾することができるものであって、特に、ペ
プチド、オリゴペプチド及びタンパク質がこれに含まれ
る。
学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を指しており、特定
の長さの生成物を指しているわけではなく、必要であれ
ば例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化また
はホスホリル化によってｉｎｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで修飾することができるものであって、特に、ペ
プチド、オリゴペプチド及びタンパク質がこれに含まれ
る。
【００１８】“ＭＤＶタンパク質の１つ以上の抗原決定
基を有するポリペプチド”なる用語は、家禽においてＭ
ＤＶ感染または疾患に対する免疫応答を誘発し得る１つ
以上のエピトープを有するポリペプチドを指す。
基を有するポリペプチド”なる用語は、家禽においてＭ
ＤＶ感染または疾患に対する免疫応答を誘発し得る１つ
以上のエピトープを有するポリペプチドを指す。
【００１９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したポリペプ
チドの機能性変形体をコードする核酸配列もまた本発明
の範囲に含まれる。かかる機能性変形体は、ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：２に特に記載したアミノ酸配列から誘導される
アミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、ＭＤＶタ
ンパク質の１つ以上の抗原決定基を保有している。即
ち、前記変形体は、家禽においてＭＤＶ感染または疾患
に対して免疫応答を誘発し得る１つ以上のエピトープを
有する。
チドの機能性変形体をコードする核酸配列もまた本発明
の範囲に含まれる。かかる機能性変形体は、ＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：２に特に記載したアミノ酸配列から誘導される
アミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、ＭＤＶタ
ンパク質の１つ以上の抗原決定基を保有している。即
ち、前記変形体は、家禽においてＭＤＶ感染または疾患
に対して免疫応答を誘発し得る１つ以上のエピトープを
有する。
【００２０】血清型１のＧＡ株から誘導される本明細書
に含まれる特定のポリペプチドにおいて、マレック病ウ
イルスの個々のウイルスまたは株間に天然変異が存在し
得ることを理解されたい。かかる変異は、配列全体にお
けるアミノ酸相違、即ち前記配列中のアミノ酸の欠失、
置換、挿入、逆位もしくは付加によって示され得る。生
物学的及び免疫学的活性を実質的に変えないことが推定
され得るアミノ酸置換が記載されている。関連アミノ酸
間のアミノ酸置換または進化の過程で多発する置換は特
にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、
Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである〔Ｄａｙｈｏ
ｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐ
ｐｌ．３参照〕。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰ
ｅａｒｓｏｎは、迅速で且つ高感度のタンパク質比較方
法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７，１４３５−１４４１，１
９８５〕を開発し、同種ポリペプチド間の機能的類似性
（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を決
定した。このような同種の機能性変形体をコードする核
酸配列も本発明の範囲内に含まれる。更に、かかる種々
の機能性変形体をコードする核酸配列を製造するために
組換えＤＮＡ技術を使用し得る可能性もある。
に含まれる特定のポリペプチドにおいて、マレック病ウ
イルスの個々のウイルスまたは株間に天然変異が存在し
得ることを理解されたい。かかる変異は、配列全体にお
けるアミノ酸相違、即ち前記配列中のアミノ酸の欠失、
置換、挿入、逆位もしくは付加によって示され得る。生
物学的及び免疫学的活性を実質的に変えないことが推定
され得るアミノ酸置換が記載されている。関連アミノ酸
間のアミノ酸置換または進化の過程で多発する置換は特
にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、
Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである〔Ｄａｙｈｏ
ｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐ
ｐｌ．３参照〕。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰ
ｅａｒｓｏｎは、迅速で且つ高感度のタンパク質比較方
法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７，１４３５−１４４１，１
９８５〕を開発し、同種ポリペプチド間の機能的類似性
（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を決
定した。このような同種の機能性変形体をコードする核
酸配列も本発明の範囲内に含まれる。更に、かかる種々
の機能性変形体をコードする核酸配列を製造するために
組換えＤＮＡ技術を使用し得る可能性もある。
【００２１】本発明の核酸配列は、ＧＡ、ＪＭ、ＨＰＲ
Ｓ−１６、Ｃｏｎｎ Ａ、ＲＢ−ＩＢ、ＣＶＩ−９８８
またはＭｄ １１といったＭＤＶ株の単離体から誘導す
ることができるが、ＧＡ株〔Ｅｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓ
ｃｈｎｉｔｔｅ，ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ １２，
４６７，１９６８〕が最も好ましい株である。
Ｓ−１６、Ｃｏｎｎ Ａ、ＲＢ−ＩＢ、ＣＶＩ−９８８
またはＭｄ １１といったＭＤＶ株の単離体から誘導す
ることができるが、ＧＡ株〔Ｅｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓ
ｃｈｎｉｔｔｅ，ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ １２，
４６７，１９６８〕が最も好ましい株である。
【００２２】更に、ＭＤ０６ポリペプチドまたは上述の
ごときその機能性変形体をコードする核酸配列は、血清
型２または３に属するＭＤＶ株、例えばＨＮ、ＨＰＲＳ
−２４、ＳＢ−１またはＦＣ１２６から誘導することも
できる。
ごときその機能性変形体をコードする核酸配列は、血清
型２または３に属するＭＤＶ株、例えばＨＮ、ＨＰＲＳ
−２４、ＳＢ−１またはＦＣ１２６から誘導することも
できる。
【００２３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２に与えられ
た情報によって、当業者は、本明細書に特に開示するＭ
Ｄ０６ ＭＤＶタンパク質に対応する免疫学的特性を有
する上述の種々の機能性変形体ポリペプチドをコードす
る核酸配列を単離及び同定することができる。このため
には、一般に適用されているサザンブロット法またはコ
ロニーハイブリダイゼーションを使用することができる
〔Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒ．Ｊ．Ｓｌａｔｅｒ，Ｃｌ
ｉｆｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６；Ｓｉｎｇｅｒ−
Ｓａｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８０，８０２−８０６，１９８３；Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，ＵＳＡ，１９８９〕。例えば、特定のＭＤＶ
株から誘導される制限酵素消化ＤＮＡフラグメントを電
気泳動し、ニトロセルロースフィルター片上に移動さ
せ、またはその後に“ブロット”する。そうすると、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列から逆翻訳
された既知の標識ＤＮＡ、即ち“プローブ”に、フィル
ター上に存在するいずれかの同種ＤＮＡ配列にプローブ
がハイブリダイズし得る特定の塩濃度及び温度条件下で
ハイブリダイズすることにより、フィルター上の機能性
変形体ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するこ
とができる。フィルターを洗浄した後、ハイブリダイズ
した材料はオートラジオグラフィーによって検出するこ
とができる。一旦関連配列を同定したならば、アガロー
スゲル電気泳動ののちに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示
したポリペプチドに対する機能性変形体ポリペプチドを
コードするＤＮＡフラグメントを回収することができ
る。
た情報によって、当業者は、本明細書に特に開示するＭ
Ｄ０６ ＭＤＶタンパク質に対応する免疫学的特性を有
する上述の種々の機能性変形体ポリペプチドをコードす
る核酸配列を単離及び同定することができる。このため
には、一般に適用されているサザンブロット法またはコ
ロニーハイブリダイゼーションを使用することができる
〔Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒ．Ｊ．Ｓｌａｔｅｒ，Ｃｌ
ｉｆｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６；Ｓｉｎｇｅｒ−
Ｓａｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８０，８０２−８０６，１９８３；Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，ＵＳＡ，１９８９〕。例えば、特定のＭＤＶ
株から誘導される制限酵素消化ＤＮＡフラグメントを電
気泳動し、ニトロセルロースフィルター片上に移動さ
せ、またはその後に“ブロット”する。そうすると、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列から逆翻訳
された既知の標識ＤＮＡ、即ち“プローブ”に、フィル
ター上に存在するいずれかの同種ＤＮＡ配列にプローブ
がハイブリダイズし得る特定の塩濃度及び温度条件下で
ハイブリダイズすることにより、フィルター上の機能性
変形体ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するこ
とができる。フィルターを洗浄した後、ハイブリダイズ
した材料はオートラジオグラフィーによって検出するこ
とができる。一旦関連配列を同定したならば、アガロー
スゲル電気泳動ののちに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示
したポリペプチドに対する機能性変形体ポリペプチドを
コードするＤＮＡフラグメントを回収することができ
る。
【００２４】別の方法では、ＭＤＶ ｃＤＮＡを、Ｈｕ
ｙｎｈら〔Ｉｎ：Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．），ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ，４９−
７８，１９８５〕によって記載されているようにλｇｔ
１１ファージ中でクローニングし、細菌宿主中で発現さ
せることができる。次いで組換えファージを、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２に示した精製ＭＤ０６ ＭＤＶに対して
産生されたポリクローナル血清を用いてスクリーニング
し、変異ポリペプチドの対応する免疫学的領域の存在を
決定することができる。上述の方法は実施例１において
詳細を示す。ＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質に対して誘導
される、本明細書において使用されるポリクローナル血
清の製造は後述する。
ｙｎｈら〔Ｉｎ：Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ．），ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ，４９−
７８，１９８５〕によって記載されているようにλｇｔ
１１ファージ中でクローニングし、細菌宿主中で発現さ
せることができる。次いで組換えファージを、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２に示した精製ＭＤ０６ ＭＤＶに対して
産生されたポリクローナル血清を用いてスクリーニング
し、変異ポリペプチドの対応する免疫学的領域の存在を
決定することができる。上述の方法は実施例１において
詳細を示す。ＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質に対して誘導
される、本明細書において使用されるポリクローナル血
清の製造は後述する。
【００２５】本発明の核酸配列は、特定のＭＤＶ株から
単離し、それをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含
む組換えＤＮＡ技術によって複製することもできるし、
または当分野において公知の技術によってｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで化学的に合成することもできる。
単離し、それをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含
む組換えＤＮＡ技術によって複製することもできるし、
または当分野において公知の技術によってｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで化学的に合成することもできる。
【００２６】本発明の好ましい核酸配列は、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１に示したＤＮＡ配列の少なくとも一部分を
含むことを特徴とする。
Ｄ ＮＯ：１に示したＤＮＡ配列の少なくとも一部分を
含むことを特徴とする。
【００２７】当分野においては公知のように、遺伝コー
ドの縮重によって、他のコドンとなるがそれでも同じア
ミノ酸をコードするようにコドン中の塩基を置換するこ
とができる。例えばアミノ酸の１つであるグルタミン酸
に対するコドンは、ＧＡＴ及びＧＡＡの両方である。そ
の結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列
を有するポリペプチドの発現においては、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１に示した核酸配列とは異なるこのような別の
コドン組成を有する変異核酸配列を使用することができ
る。
ドの縮重によって、他のコドンとなるがそれでも同じア
ミノ酸をコードするようにコドン中の塩基を置換するこ
とができる。例えばアミノ酸の１つであるグルタミン酸
に対するコドンは、ＧＡＴ及びＧＡＡの両方である。そ
の結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列
を有するポリペプチドの発現においては、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１に示した核酸配列とは異なるこのような別の
コドン組成を有する変異核酸配列を使用することができ
る。
【００２８】更に、特に記載したＭＤ０６ ＭＤＶタン
パク質をコードする核酸配列または上述のごときその機
能性変形体のフラグメントも本発明に含まれる。
パク質をコードする核酸配列または上述のごときその機
能性変形体のフラグメントも本発明に含まれる。
【００２９】本明細書中で“フラグメント”なる用語
は、本発明の核酸配列またはポリペプチドの配列を含む
ＤＮＡまたはアミノ酸配列を意味する。前記フラグメン
トは、ＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の１つ以上の抗原決
定基を有するポリペプチドであるかまたはそれをコード
するものであり、従って、家禽における免疫応答を誘発
し得るＭＤ０６タンパク質の１つ以上のエピトープを有
する。使用可能なポリペプチドフラグメントを決定する
方法はその概略を後述する。フラグメントは特に、ＤＮ
Ａに対しては制限エンドヌクレアーゼを、またポリペプ
チドに対してはプロテアーゼを使用し、前駆分子を酵素
切断することにより作製することができる。他の方法と
しては、フラグメントの化学的合成またはＤＮＡフラグ
メントによるポリペプチドフラグメントの発現を挙げる
ことができる。
は、本発明の核酸配列またはポリペプチドの配列を含む
ＤＮＡまたはアミノ酸配列を意味する。前記フラグメン
トは、ＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の１つ以上の抗原決
定基を有するポリペプチドであるかまたはそれをコード
するものであり、従って、家禽における免疫応答を誘発
し得るＭＤ０６タンパク質の１つ以上のエピトープを有
する。使用可能なポリペプチドフラグメントを決定する
方法はその概略を後述する。フラグメントは特に、ＤＮ
Ａに対しては制限エンドヌクレアーゼを、またポリペプ
チドに対してはプロテアーゼを使用し、前駆分子を酵素
切断することにより作製することができる。他の方法と
しては、フラグメントの化学的合成またはＤＮＡフラグ
メントによるポリペプチドフラグメントの発現を挙げる
ことができる。
【００３０】得られたポリペプチドがＭＤ０６ ＭＤＶ
タンパク質の１つ以上の抗原決定基を保有している限り
は、特に例示したポリペプチドの上記機能性変形体をも
たらす全ての改変が本発明の範囲内に含まれる。
タンパク質の１つ以上の抗原決定基を保有している限り
は、特に例示したポリペプチドの上記機能性変形体をも
たらす全ての改変が本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】本発明の核酸配列は、それと関係のないま
たは本来結合していない種々の複製実施ＤＮＡ配列に連
結して、適当な宿主の形質転換に使用し得る所謂組換え
ベクター分子とすることができる。有効な組換えベクタ
ー分子は、例えばプラスミド、バクテリオファージ、コ
スミドまたはウイルスから誘導されるのが好ましい。
たは本来結合していない種々の複製実施ＤＮＡ配列に連
結して、適当な宿主の形質転換に使用し得る所謂組換え
ベクター分子とすることができる。有効な組換えベクタ
ー分子は、例えばプラスミド、バクテリオファージ、コ
スミドまたはウイルスから誘導されるのが好ましい。
【００３２】本発明の核酸配列をクローニングするのに
使用され得る特定のベクターまたはクローニングビヒク
ルは当分野において良く知られており、特に、ｐＢＲ３
２２、種々ｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びブルースクリプト（Ｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミドといったプラスミドベ
クター、λｇｔ−Ｗｅｓ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及
びＭ１３誘導ファージといったバクテリオファージ、並
びに、ＳＶ４０、アデノウイルスもしくはポリオーマウ
イルスといったウイルスベクターを挙げることができる
〔Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ，ｅｄ．，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ
ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅ
ｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．
ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１−２
４，１９９０参照〕。本発明の組換えベクター分子の構
築に使用される方法は当業者には公知であり、特に、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９〕に
記載されている。
使用され得る特定のベクターまたはクローニングビヒク
ルは当分野において良く知られており、特に、ｐＢＲ３
２２、種々ｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びブルースクリプト（Ｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミドといったプラスミドベ
クター、λｇｔ−Ｗｅｓ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及
びＭ１３誘導ファージといったバクテリオファージ、並
びに、ＳＶ４０、アデノウイルスもしくはポリオーマウ
イルスといったウイルスベクターを挙げることができる
〔Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ，ｅｄ．，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ
ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅ
ｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．
ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１−２
４，１９９０参照〕。本発明の組換えベクター分子の構
築に使用される方法は当業者には公知であり、特に、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９〕に
記載されている。
【００３３】本発明の核酸配列をクローニングベクター
中に挿入するのは、例えば遺伝子と所望のクローニング
ビヒクルとを、相補的ＤＮＡ末端を生成したのと同じ制
限酵素で切断しておけば容易に行なうことができる。
中に挿入するのは、例えば遺伝子と所望のクローニング
ビヒクルとを、相補的ＤＮＡ末端を生成したのと同じ制
限酵素で切断しておけば容易に行なうことができる。
【００３４】或いは、一重鎖ＤＮＡを消化するかまたは
適当なＤＮＡポリメラーゼを用いてその一重鎖末端に充
填することにより制限部位を改変して、ブラント末端を
形成することが必要となり得る。次いで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼのような酵素を用いてブラント末端を連結する
ことができる。
適当なＤＮＡポリメラーゼを用いてその一重鎖末端に充
填することにより制限部位を改変して、ブラント末端を
形成することが必要となり得る。次いで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼのような酵素を用いてブラント末端を連結する
ことができる。
【００３５】所望であれば、リンカーをＤＮＡ端部に連
結することにより任意の制限部位を生成することができ
る。このようなリンカーは、制限部位配列をコードする
特定のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限酵素で
切断されたベクター及び核酸配列は、ホモポリマーテー
リング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｔａｉｌｉｎ
ｇ）よって改変することもできる。
結することにより任意の制限部位を生成することができ
る。このようなリンカーは、制限部位配列をコードする
特定のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限酵素で
切断されたベクター及び核酸配列は、ホモポリマーテー
リング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｔａｉｌｉｎ
ｇ）よって改変することもできる。
【００３６】本明細書中で“形質転換”なる用語は、例
えば直接取込みまたは形質導入などの使用する方法に関
係なく、異種核酸配列を宿主細胞中に導入することを指
す。異種核酸配列は、自律的複製によって維持され得る
か、或いは宿主ゲノム中に組込まれ得る。所望であれ
ば、予定される宿主に適合し得ると共に挿入された核酸
配列の発現を調節し得る適当な制御配列を組換えベクタ
ー分子に与える。微生物に加え、多細胞生物由来の細胞
培養物も宿主として使用し得る。
えば直接取込みまたは形質導入などの使用する方法に関
係なく、異種核酸配列を宿主細胞中に導入することを指
す。異種核酸配列は、自律的複製によって維持され得る
か、或いは宿主ゲノム中に組込まれ得る。所望であれ
ば、予定される宿主に適合し得ると共に挿入された核酸
配列の発現を調節し得る適当な制御配列を組換えベクタ
ー分子に与える。微生物に加え、多細胞生物由来の細胞
培養物も宿主として使用し得る。
【００３７】本発明の組換えベクター分子は、ｐＢＲ３
２２においてはアンピシリン及びテトラサイクリン耐
性、ｐＵＣ８においてはアンピシリン耐性及びβ−ガラ
クトシダーゼ活性のような、所望の形質転換体を選択す
るのに使用し得る１種以上のマーカー活性物質を含むこ
とが好ましい。
２２においてはアンピシリン及びテトラサイクリン耐
性、ｐＵＣ８においてはアンピシリン耐性及びβ−ガラ
クトシダーゼ活性のような、所望の形質転換体を選択す
るのに使用し得る１種以上のマーカー活性物質を含むこ
とが好ましい。
【００３８】適当な宿主細胞は、ポリペプチドをコード
する核酸配列によってまたはかかる核酸配列を含む組換
えベクター分子によって形質転換され得て、且つ所望で
あればそれを使用して前記核酸配列によってコードされ
る前記ポリペプチドを発現させ得る原核または真核細胞
である。宿主細胞は、原核細胞起源のもの、例えばＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のような
細菌、または真核細胞起源のもの、例えばＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母
や、例えばＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵
巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ，Ｃ
ＨＯ）細胞を含む昆虫、植物もしくは哺乳動物細胞のよ
うなより高等の真核細胞とすることができる。昆虫細胞
としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ
のＳｆ９細胞系〔Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４７−５５，１９８８〕
を挙げることができる。真核細胞クローニング系におけ
る本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情
報は、Ｅｓｓｅｒ，Ｋ．ら〔Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ
Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，１９８６〕に見ることができる。
する核酸配列によってまたはかかる核酸配列を含む組換
えベクター分子によって形質転換され得て、且つ所望で
あればそれを使用して前記核酸配列によってコードされ
る前記ポリペプチドを発現させ得る原核または真核細胞
である。宿主細胞は、原核細胞起源のもの、例えばＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のような
細菌、または真核細胞起源のもの、例えばＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母
や、例えばＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵
巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ，Ｃ
ＨＯ）細胞を含む昆虫、植物もしくは哺乳動物細胞のよ
うなより高等の真核細胞とすることができる。昆虫細胞
としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ
のＳｆ９細胞系〔Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４７−５５，１９８８〕
を挙げることができる。真核細胞クローニング系におけ
る本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情
報は、Ｅｓｓｅｒ，Ｋ．ら〔Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ
Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，１９８６〕に見ることができる。
【００３９】一般に、本発明に有効なベクターを構築す
る上でＤＮＡ配列をクローニングするには、原核細胞が
好ましい。例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２や、ＤＨ５αま
たはＪＭ１０１のような誘導株が特に有効である。
る上でＤＮＡ配列をクローニングするには、原核細胞が
好ましい。例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２や、ＤＨ５αま
たはＪＭ１０１のような誘導株が特に有効である。
【００４０】発現のためには、本発明の核酸配列を発現
ベクター中に導入する。即ち本発明の核酸配列を発現制
御配列に操作可能なように連結する。このような制御配
列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、イ
ンデューサー、リボソーム結合部位などを含む得る。従
って本発明は、その中に含まれるＤＮＡ配列を形質転換
宿主細胞中で発現し得る、発現制御配列に操作可能なよ
うに連結されているＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質をコー
ドする核酸配列を含む組換えベクター分子を提供する。
ベクター中に導入する。即ち本発明の核酸配列を発現制
御配列に操作可能なように連結する。このような制御配
列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、イ
ンデューサー、リボソーム結合部位などを含む得る。従
って本発明は、その中に含まれるＤＮＡ配列を形質転換
宿主細胞中で発現し得る、発現制御配列に操作可能なよ
うに連結されているＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質をコー
ドする核酸配列を含む組換えベクター分子を提供する。
【００４１】勿論、クローニングベクターの選択された
部位に挿入されているヌクレオチド配列は、形質転換宿
主がＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の１つ以上の抗原決定
基を有するポリペプチドを産生する限りは、所望のポリ
ペプチドに対する実際の構造遺伝子の一部分ではないヌ
クレオチドを含むこともできるし、所望のタンパク質に
対する全構造遺伝子のフラグメントのみを含むこともで
きる。
部位に挿入されているヌクレオチド配列は、形質転換宿
主がＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の１つ以上の抗原決定
基を有するポリペプチドを産生する限りは、所望のポリ
ペプチドに対する実際の構造遺伝子の一部分ではないヌ
クレオチドを含むこともできるし、所望のタンパク質に
対する全構造遺伝子のフラグメントのみを含むこともで
きる。
【００４２】宿主細胞が細菌であるならば、有効な発現
制御配列の例としては、Ｔｒｐプロモーター及びオペレ
ーター〔Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８，４０５７，１９８０〕、ｌａｃ
プロモーター及びオペレーター〔Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１５，１９７８〕、外
膜タンパク質プロモーター〔Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及
びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１，７７１−７
７５，１９８２〕、バクテリオファージλプロモーター
及びオペレーター〔Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，４６７７−４６
８８，１９８３〕、α−アミラーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）プロモーター及びオペレーター、終結配列、並び
に選択された宿主細胞と適合し得る他の発現増強及び制
御配列を挙げることができる。宿主細胞が酵母であるな
らば、有効な発現制御配列の例としては、例えばα接合
因子を挙げることができる。昆虫細胞においてはポリヘ
ドリンまたはバキュロウイルスのｐ１０プロモーターを
使用することができる〔Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ｅｔａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６
５，１９８３〕。宿主細胞が哺乳動物起源のものである
ならば、有効な発現制御配列の例としては例えばＳＶ４
０プロモーター〔Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，５２４−５２７，１９
８３〕、メタロチオネインプロモーター〔Ｂｒｉｎｓｔ
ｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６，３９−４２，
１９８２〕、または熱ショックプロモーター〔Ｖｏｅｌ
ｌｍｙ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４９４９−５３，１９８５〕を
挙げることができる。或いは、ＭＤＶ中に存在する発現
制御配列、特にＭＤ０６タンパク質の発現を調節するも
のも適用することができる。遺伝子発現を最大にするた
めには、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ〔Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，４７３，１９
７９〕も参照されたい。
制御配列の例としては、Ｔｒｐプロモーター及びオペレ
ーター〔Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８，４０５７，１９８０〕、ｌａｃ
プロモーター及びオペレーター〔Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１５，１９７８〕、外
膜タンパク質プロモーター〔Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及
びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１，７７１−７
７５，１９８２〕、バクテリオファージλプロモーター
及びオペレーター〔Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，４６７７−４６
８８，１９８３〕、α−アミラーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）プロモーター及びオペレーター、終結配列、並び
に選択された宿主細胞と適合し得る他の発現増強及び制
御配列を挙げることができる。宿主細胞が酵母であるな
らば、有効な発現制御配列の例としては、例えばα接合
因子を挙げることができる。昆虫細胞においてはポリヘ
ドリンまたはバキュロウイルスのｐ１０プロモーターを
使用することができる〔Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ｅｔａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６
５，１９８３〕。宿主細胞が哺乳動物起源のものである
ならば、有効な発現制御配列の例としては例えばＳＶ４
０プロモーター〔Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，５２４−５２７，１９
８３〕、メタロチオネインプロモーター〔Ｂｒｉｎｓｔ
ｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６，３９−４２，
１９８２〕、または熱ショックプロモーター〔Ｖｏｅｌ
ｌｍｙ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４９４９−５３，１９８５〕を
挙げることができる。或いは、ＭＤＶ中に存在する発現
制御配列、特にＭＤ０６タンパク質の発現を調節するも
のも適用することができる。遺伝子発現を最大にするた
めには、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ〔Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８，４７３，１９
７９〕も参照されたい。
【００４３】更に本発明は、上述の核酸配列または組換
え発現ベクター分子を用いて形質転換され、該核酸配列
の発現によってＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質を産生し得
る宿主細胞をも提供する。
え発現ベクター分子を用いて形質転換され、該核酸配列
の発現によってＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質を産生し得
る宿主細胞をも提供する。
【００４４】更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に
示されたアミノ酸配列またはその機能性変形体を有する
が、ウイルス全体または通常該ウイルスに伴う他のタン
パク質は実質的に含まない、ＭＤ０６ ＭＤＶタンパク
質の１つ以上の抗原決定基を有する精製ポリペプチドを
も提供する。
示されたアミノ酸配列またはその機能性変形体を有する
が、ウイルス全体または通常該ウイルスに伴う他のタン
パク質は実質的に含まない、ＭＤ０６ ＭＤＶタンパク
質の１つ以上の抗原決定基を有する精製ポリペプチドを
も提供する。
【００４５】実質的に同じ免疫学的特性を示す前記アミ
ノ酸配列の誘導体、即ち機能性変形体もまた本発明の範
囲内にあると理解されたい。
ノ酸配列の誘導体、即ち機能性変形体もまた本発明の範
囲内にあると理解されたい。
【００４６】本明細書において開示されるＭＤ０６ポリ
ペプチドの機能性変形体としては、他の血清型１のＭＤ
ウイルス株中（または血清型２もしくは３に属するウイ
ルス株中）に存在する対応するポリペプチドを挙げるこ
とができる。前記等価物は、該等価物をコードする遺伝
子の発現により産生され得るが、この遺伝子は、本明細
書中に与えられた上述のごとき情報を使用することで同
定及び単離される。
ペプチドの機能性変形体としては、他の血清型１のＭＤ
ウイルス株中（または血清型２もしくは３に属するウイ
ルス株中）に存在する対応するポリペプチドを挙げるこ
とができる。前記等価物は、該等価物をコードする遺伝
子の発現により産生され得るが、この遺伝子は、本明細
書中に与えられた上述のごとき情報を使用することで同
定及び単離される。
【００４７】更に、ＭＤＶ感染または疾患に対する家禽
の免疫のため、またはＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の免
疫原性フラグメントを実質的に含む診断のために使用し
得るポリペプチドも本発明に含まれる。アミノ酸配列中
でこのような使用可能なポリペプチドフラグメントを検
出する種々の方法が公知である。
の免疫のため、またはＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の免
疫原性フラグメントを実質的に含む診断のために使用し
得るポリペプチドも本発明に含まれる。アミノ酸配列中
でこのような使用可能なポリペプチドフラグメントを検
出する種々の方法が公知である。
【００４８】エピトープを含む本発明ポリペプチドの適
当な免疫化学的に活性の免疫原性フラグメントは、特許
ＷＯ ８６／０６４８７号，Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３９
８８−４００２，１９８４〕、所謂ペプスキャン法（ｐ
ｅｐｓｃａｎ ｍｅｔｈｏｄ）に基づくＧｅｙｓｅｎ，
Ｈ．Ｍ．ら〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，
２５９−２７４，１９８７〕に見出すことができる。ペ
プスキャン法においては、問題の完全ポリペプチドの部
分配列に対応していて一部重複する一連のポリペプチド
を合成し、それらの抗体との反応性を調査する。
当な免疫化学的に活性の免疫原性フラグメントは、特許
ＷＯ ８６／０６４８７号，Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３９
８８−４００２，１９８４〕、所謂ペプスキャン法（ｐ
ｅｐｓｃａｎ ｍｅｔｈｏｄ）に基づくＧｅｙｓｅｎ，
Ｈ．Ｍ．ら〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，
２５９−２７４，１９８７〕に見出すことができる。ペ
プスキャン法においては、問題の完全ポリペプチドの部
分配列に対応していて一部重複する一連のポリペプチド
を合成し、それらの抗体との反応性を調査する。
【００４９】更に、アミノ酸配列が確定したポリペプチ
ドの多数の領域を、理論的考察及び既に知られているエ
ピトープとの構造的一致に基づき、エピトープとして指
定することができる。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ
及びＷｏｏｄｓ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．７８，３８２４−３８２８，１９８１〕の親水性基
準とＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ〔Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７，４５−１４８，１９
８７〕の二次構造予測の組合せに基づいて行い得る。
ドの多数の領域を、理論的考察及び既に知られているエ
ピトープとの構造的一致に基づき、エピトープとして指
定することができる。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ
及びＷｏｏｄｓ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．７８，３８２４−３８２８，１９８１〕の親水性基
準とＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ〔Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７，４５−１４８，１９
８７〕の二次構造予測の組合せに基づいて行い得る。
【００５０】必要となり得るＴ細胞エピトープは、Ｂｅ
ｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３
５，１０５９−６２，１９８７〕を用いて理論的基礎の
もとに同様に誘導することができる。
ｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３
５，１０５９−６２，１９８７〕を用いて理論的基礎の
もとに同様に誘導することができる。
【００５１】本発明の別の実施態様においては、上述の
核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドが使用される。
核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドが使用される。
【００５２】ＭＤＶ感染または疾患に対する家禽の免疫
は、例えば、本発明のポリペプチドを所謂サブユニット
ワクチンとして免疫学的に有意な状況において動物に投
与することにより行ない得る。本発明のサブユニットワ
クチンは、必要によっては医薬的に容認可能な担体の存
在下に、純粋形態のポリペプチドを含み得る。ポリペプ
チドは必要によっては、例えば融合生成物の精製におい
て有利となり得る非関連タンパク質に共有結合すること
もできる。この例としては、β−ガラクトシダーゼ、プ
ロテインＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなどを挙
げることができる。
は、例えば、本発明のポリペプチドを所謂サブユニット
ワクチンとして免疫学的に有意な状況において動物に投
与することにより行ない得る。本発明のサブユニットワ
クチンは、必要によっては医薬的に容認可能な担体の存
在下に、純粋形態のポリペプチドを含み得る。ポリペプ
チドは必要によっては、例えば融合生成物の精製におい
て有利となり得る非関連タンパク質に共有結合すること
もできる。この例としては、β−ガラクトシダーゼ、プ
ロテインＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなどを挙
げることができる。
【００５３】場合によっては、かかるポリペプチド自体
に対する中和抗体を産生する能力が低くなり得る。免疫
原性を高めるために、小フラグメントは担体分子に結合
させることが好ましい。これに適した担体としては、天
然ポリマー（ｋｅｙ ｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔヘモシア
ニン、アルブミン、毒素のようなタンパク質）、合成ポ
リマー（ポリリシン、ポリアラニンのようなポリアミノ
酸）、または両親媒性化合物（例えばサポニン）のミセ
ルような巨大分子を挙げることができる。或いはこれら
のフラグメントは、好ましくは直鎖状のポリマーとして
提供することもできる。
に対する中和抗体を産生する能力が低くなり得る。免疫
原性を高めるために、小フラグメントは担体分子に結合
させることが好ましい。これに適した担体としては、天
然ポリマー（ｋｅｙ ｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔヘモシア
ニン、アルブミン、毒素のようなタンパク質）、合成ポ
リマー（ポリリシン、ポリアラニンのようなポリアミノ
酸）、または両親媒性化合物（例えばサポニン）のミセ
ルような巨大分子を挙げることができる。或いはこれら
のフラグメントは、好ましくは直鎖状のポリマーとして
提供することもできる。
【００５４】このようなサブユニットワクチンに使用さ
れるポリペプチドは、例えば前記ポリペプチドをＭＤＶ
から単離したり、組換えＤＮＡ技術または化学的合成と
いった当分野においては公知の方法によって作製するこ
とができる。
れるポリペプチドは、例えば前記ポリペプチドをＭＤＶ
から単離したり、組換えＤＮＡ技術または化学的合成と
いった当分野においては公知の方法によって作製するこ
とができる。
【００５５】必要であれば、ワクチンに使用される本発
明に従うポリペプチドは、例えばグルコシル化、アミド
化、カルボキシル化またはホスホリル化によってｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで修飾することができ
る。
明に従うポリペプチドは、例えばグルコシル化、アミド
化、カルボキシル化またはホスホリル化によってｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで修飾することができ
る。
【００５６】サブユニットワクチンの変形態様は生ベク
ターワクチンである。本発明の核酸配列は微生物（例え
ば細菌またはウイルス）中に組換えＤＮＡ技術によっ
て、組換え微生物が尚も複製可能であり、従って挿入さ
れた核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現
し、感染宿主動物において免疫応答を誘発するように導
入される。
ターワクチンである。本発明の核酸配列は微生物（例え
ば細菌またはウイルス）中に組換えＤＮＡ技術によっ
て、組換え微生物が尚も複製可能であり、従って挿入さ
れた核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現
し、感染宿主動物において免疫応答を誘発するように導
入される。
【００５７】本発明の好ましい実施態様は、該組換えベ
クターウイルスに感染した宿主細胞または宿主動物中で
ＤＮＡ配列を発現し得る、上述の異種核酸配列を含む組
換えベクターウイルスである。“異種”なる用語は、本
発明の核酸配列がベクターウイルス中に通常は実際に存
在しないか、または天然ベクターウイルス中と同じ遺伝
的状況において存在しないことを示唆する。
クターウイルスに感染した宿主細胞または宿主動物中で
ＤＮＡ配列を発現し得る、上述の異種核酸配列を含む組
換えベクターウイルスである。“異種”なる用語は、本
発明の核酸配列がベクターウイルス中に通常は実際に存
在しないか、または天然ベクターウイルス中と同じ遺伝
的状況において存在しないことを示唆する。
【００５８】更に本発明は、核酸配列の発現によってＭ
ＤＶタンパク質を産生し得る、組換えベクターウイルス
に感染させた宿主細胞または細胞培養物をも含む。
ＤＶタンパク質を産生し得る、組換えベクターウイルス
に感染させた宿主細胞または細胞培養物をも含む。
【００５９】公知のｉｎ ｖｉｖｏ相同的組換え技術を
使用し、異種核酸配列、例えば本発明の核酸配列をベク
ターウイルスのゲノム中に導入することができる。
使用し、異種核酸配列、例えば本発明の核酸配列をベク
ターウイルスのゲノム中に導入することができる。
【００６０】第１に、ベクターゲノムの挿入領域、即
ち、感染または複製に必要なもののようなベクターの必
須機能を破壊することなく異種配列の組込みに使用し得
る領域に対応するＤＮＡフラグメントを、標準ｒｅｃＤ
ＮＡ技術に従ってクローニングベクター中に挿入する。
多数の微生物に関して挿入領域が報告されている〔例え
ば欧州特許第８０，８０６号、欧州特許第１１０，３８
５号，欧州特許第８３，２８６号、欧州特許第３１４，
５６９号、ＷＯ８８／０２０２２号及びＷＯ８８／０７
０８８号〕。
ち、感染または複製に必要なもののようなベクターの必
須機能を破壊することなく異種配列の組込みに使用し得
る領域に対応するＤＮＡフラグメントを、標準ｒｅｃＤ
ＮＡ技術に従ってクローニングベクター中に挿入する。
多数の微生物に関して挿入領域が報告されている〔例え
ば欧州特許第８０，８０６号、欧州特許第１１０，３８
５号，欧州特許第８３，２８６号、欧州特許第３１４，
５６９号、ＷＯ８８／０２０２２号及びＷＯ８８／０７
０８８号〕。
【００６１】第２に、所望であれば、第１のステップで
得られた組換えベクター分子中に存在する挿入領域中に
欠失を導入することができる。これは、例えば、第１の
ステップで得られた組換えベクター分子を適当なエキソ
ヌクレアーゼIIIで消化するか、または制限酵素処理す
ることにより行ない得る。
得られた組換えベクター分子中に存在する挿入領域中に
欠失を導入することができる。これは、例えば、第１の
ステップで得られた組換えベクター分子を適当なエキソ
ヌクレアーゼIIIで消化するか、または制限酵素処理す
ることにより行ない得る。
【００６２】第３に、第１のステップの組換えベクター
分子中に存在する挿入領域または前記組換えベクター分
子から欠失させたＤＮＡの箇所に、異種核酸配列を挿入
する。挿入領域のＤＮＡ配列は、ベクターゲノムとの相
同的組換えが起こり得るような適当な長さのものである
べきである。次いで、適当な細胞を野生型ベクターウイ
ルスに感染させるか、または、適当なベクターＤＮＡ配
列をフランキング配置させた挿入物を含む組換えベクタ
ー分子の存在下にベクターゲノムＤＮＡを用いて形質転
換し、それによって組換えベクター分子とベクターゲノ
ムの対応する領域間で組換えを起こす。組換えベクター
子孫は細胞培養液中で産生させることができ、例えばハ
イブリダイズしたり、異種核酸配列と一緒に組み込んだ
遺伝子によってコードされる酵素活性を検出したり、ま
たは組換えベクターによって発現される抗原性異種ポリ
ペプチドを免疫学的に検出することにより、遺伝子型ま
たは表現型で選択することができる。
分子中に存在する挿入領域または前記組換えベクター分
子から欠失させたＤＮＡの箇所に、異種核酸配列を挿入
する。挿入領域のＤＮＡ配列は、ベクターゲノムとの相
同的組換えが起こり得るような適当な長さのものである
べきである。次いで、適当な細胞を野生型ベクターウイ
ルスに感染させるか、または、適当なベクターＤＮＡ配
列をフランキング配置させた挿入物を含む組換えベクタ
ー分子の存在下にベクターゲノムＤＮＡを用いて形質転
換し、それによって組換えベクター分子とベクターゲノ
ムの対応する領域間で組換えを起こす。組換えベクター
子孫は細胞培養液中で産生させることができ、例えばハ
イブリダイズしたり、異種核酸配列と一緒に組み込んだ
遺伝子によってコードされる酵素活性を検出したり、ま
たは組換えベクターによって発現される抗原性異種ポリ
ペプチドを免疫学的に検出することにより、遺伝子型ま
たは表現型で選択することができる。
【００６３】次に、この組換え微生物を被免疫宿主動物
に投与し、所定時間維持し、またときには接種動物の体
内で複製させ、本発明の挿入核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現させ、接種動
物の免疫系を刺激する。本発明の核酸配列の取込みに適
したベクターは、（トリ）ポックスウイルス（例えばワ
クシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルス（欧
州特許第３１４，５６９号及びＷＯ８８／０２０２２
号））、ヘルペスウイルス（例えばＨＶＴのようなマレ
ック病ウイルスのワクチン株（ＷＯ ８８／０７０８８
号）または血清型１もしくは２のＭＤＶ株）、アデノウ
イルスもしくはインフルエンザウイルスといったウイル
ス、または、例えばＥ．ｃｏｌｉもしくは特定のサルモ
ネラ種のような細菌から誘導することができる。これら
のベクターは、ポリペプチドが宿主動物の免疫系によっ
て効率的に認識されるように設計することができる。こ
の点については、前記ポリペプチドを、合成シグナル及
びアンカー配列、または、例えばニューカッスル病ウイ
ルス由来の赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質の
ような別のウイルスもしくは細菌病原体由来の抗原と融
合することが考えられる。前記免疫原性ポリペプチド
は、所望であればより大きなものの一部として、免疫さ
れるべき動物内部で放出させることも可能である。この
ような場合には全て、１種以上の免疫原性産物が、種々
の病原体及び／または所与の病原体の種々の抗原に対す
る防御を起こす発現をなすことが可能である。
に投与し、所定時間維持し、またときには接種動物の体
内で複製させ、本発明の挿入核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現させ、接種動
物の免疫系を刺激する。本発明の核酸配列の取込みに適
したベクターは、（トリ）ポックスウイルス（例えばワ
クシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルス（欧
州特許第３１４，５６９号及びＷＯ８８／０２０２２
号））、ヘルペスウイルス（例えばＨＶＴのようなマレ
ック病ウイルスのワクチン株（ＷＯ ８８／０７０８８
号）または血清型１もしくは２のＭＤＶ株）、アデノウ
イルスもしくはインフルエンザウイルスといったウイル
ス、または、例えばＥ．ｃｏｌｉもしくは特定のサルモ
ネラ種のような細菌から誘導することができる。これら
のベクターは、ポリペプチドが宿主動物の免疫系によっ
て効率的に認識されるように設計することができる。こ
の点については、前記ポリペプチドを、合成シグナル及
びアンカー配列、または、例えばニューカッスル病ウイ
ルス由来の赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質の
ような別のウイルスもしくは細菌病原体由来の抗原と融
合することが考えられる。前記免疫原性ポリペプチド
は、所望であればより大きなものの一部として、免疫さ
れるべき動物内部で放出させることも可能である。この
ような場合には全て、１種以上の免疫原性産物が、種々
の病原体及び／または所与の病原体の種々の抗原に対す
る防御を起こす発現をなすことが可能である。
【００６４】本発明のワクチンは、本発明の核酸配列を
含む組換えベクターウイルスに感染させた宿主細胞を培
養し、その後、ウイルスを含む細胞及び／または細胞中
で増殖した組換えベクターウイルスを、必要によっては
純粋形態で回収することにより製造することができる。
ベクターワクチンを製造する別の可能性は、本発明の核
酸配列を感染性細菌または寄生生物内に取込み、かかる
改変感染体を培養することである。必要によっては純粋
形態で回収した後、必要であれば凍結乾燥形態のワクチ
ンを製造することができる。
含む組換えベクターウイルスに感染させた宿主細胞を培
養し、その後、ウイルスを含む細胞及び／または細胞中
で増殖した組換えベクターウイルスを、必要によっては
純粋形態で回収することにより製造することができる。
ベクターワクチンを製造する別の可能性は、本発明の核
酸配列を感染性細菌または寄生生物内に取込み、かかる
改変感染体を培養することである。必要によっては純粋
形態で回収した後、必要であれば凍結乾燥形態のワクチ
ンを製造することができる。
【００６５】本発明の組換えベクター分子で形質転換さ
れた宿主細胞は、前記核酸配列によってコードされるポ
リペプチドの発現に好ましい条件下に培養することがで
きる。ワクチンは、粗培養体、宿主細胞溶解物または宿
主細胞抽出物の試料を使用して製造することができる
が、別の実施態様においては、より精製された本発明の
ポリペプチドが、その用途に応じてワクチンに成形され
る。産生されたポリペプチドを精製するためには、本発
明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を適量で
培養し、産生されたポリペプチドをかかる細胞から、ま
たはタンパク質が分泌されるのであれば培地から単離す
る。培地中に分泌されたポリペプチドは、標準的な技
術、例えば塩析、遠心分離、限外濾過、クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過またはイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離及び精製することができるが、細
胞内ポリペプチドは、まず前記細胞を回収し、例えば超
音波処理またはフレンチプレスのような他の機械的破砕
手段によって細胞を破砕し、次いでポリペプチドを他の
細胞内成分から分離することにより単離することがで
き、そうしてポリペプチドをワクチンに成形する。細胞
破砕は、化学的手段（例えばＥＤＴＡ処理）またはリゾ
チーム消化のような酵素的手段によっても行ない得る。
れた宿主細胞は、前記核酸配列によってコードされるポ
リペプチドの発現に好ましい条件下に培養することがで
きる。ワクチンは、粗培養体、宿主細胞溶解物または宿
主細胞抽出物の試料を使用して製造することができる
が、別の実施態様においては、より精製された本発明の
ポリペプチドが、その用途に応じてワクチンに成形され
る。産生されたポリペプチドを精製するためには、本発
明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を適量で
培養し、産生されたポリペプチドをかかる細胞から、ま
たはタンパク質が分泌されるのであれば培地から単離す
る。培地中に分泌されたポリペプチドは、標準的な技
術、例えば塩析、遠心分離、限外濾過、クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過またはイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離及び精製することができるが、細
胞内ポリペプチドは、まず前記細胞を回収し、例えば超
音波処理またはフレンチプレスのような他の機械的破砕
手段によって細胞を破砕し、次いでポリペプチドを他の
細胞内成分から分離することにより単離することがで
き、そうしてポリペプチドをワクチンに成形する。細胞
破砕は、化学的手段（例えばＥＤＴＡ処理）またはリゾ
チーム消化のような酵素的手段によっても行ない得る。
【００６６】本発明のポリペプチドに対する抗体または
抗血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イ
ディオタイプ抗体の産生に使用し得る可能性がある。
抗血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イ
ディオタイプ抗体の産生に使用し得る可能性がある。
【００６７】上述のごときＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質
を使用し、ポリクローナル、単一特異性及びモノクロー
ナルいずれの抗体をも生産することができる。ポリクロ
ーナル抗体が所望であれば、ポリクローナル血清を作製
及び処理する技術は当分野において公知である〔例えば
Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，ｅｄｓ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌ
ｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８
７〕。簡単に述べると、選択した哺乳動物、例えばウサ
ギに上述の免疫原を、免疫１回当たり約２０μｇ〜約８
０μｇのタンパク質の量で（複数回）注射する。免疫
は、容認可能なアジュバント、一般的には等容量の免疫
原及びアジュバントを用いて与えられる。容認可能なア
ジュバントとしては、完全フロイント、不完全フロイン
ト、ミョウバン沈降物または油中水型エマルジョンを挙
げることができるが、初回免疫には完全フロイントアジ
ュバントが好ましい。不完全フロイントアジュバントは
全ての追加免疫に対して好ましい。初回免疫は、約１ｍ
ｌのエマルジョンをウサギの背部の複数の皮下部位に投
与することからなる。等容量の免疫原を使用する二次免
疫は約１カ月の間隔で、個々のウサギの血清中に適当な
レベルの抗体が現れるまで続けて与える。血液を採取
し、当分野においては公知の方法によって血清を単離す
る。
を使用し、ポリクローナル、単一特異性及びモノクロー
ナルいずれの抗体をも生産することができる。ポリクロ
ーナル抗体が所望であれば、ポリクローナル血清を作製
及び処理する技術は当分野において公知である〔例えば
Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，ｅｄｓ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌ
ｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８
７〕。簡単に述べると、選択した哺乳動物、例えばウサ
ギに上述の免疫原を、免疫１回当たり約２０μｇ〜約８
０μｇのタンパク質の量で（複数回）注射する。免疫
は、容認可能なアジュバント、一般的には等容量の免疫
原及びアジュバントを用いて与えられる。容認可能なア
ジュバントとしては、完全フロイント、不完全フロイン
ト、ミョウバン沈降物または油中水型エマルジョンを挙
げることができるが、初回免疫には完全フロイントアジ
ュバントが好ましい。不完全フロイントアジュバントは
全ての追加免疫に対して好ましい。初回免疫は、約１ｍ
ｌのエマルジョンをウサギの背部の複数の皮下部位に投
与することからなる。等容量の免疫原を使用する二次免
疫は約１カ月の間隔で、個々のウサギの血清中に適当な
レベルの抗体が現れるまで続けて与える。血液を採取
し、当分野においては公知の方法によって血清を単離す
る。
【００６８】免疫原に対する単一特異性抗体は、ウサギ
を精製タンパク質を用いて前述のごとく免疫することに
より製造した多特異性抗血清から、Ｈａｌｌらの方法
〔Ｎａｔｕｅｒ ３１１，３７９−３８７ １９８７〕
の改良法によってアフィニティー精製する。本明細書に
おいて使用される単一特異性抗体とは、単一抗体種また
は関連抗原に対して同種結合特性を有する複数抗体種と
定義される。本明細書において使用される同種結合と
は、特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能
力を指す。
を精製タンパク質を用いて前述のごとく免疫することに
より製造した多特異性抗血清から、Ｈａｌｌらの方法
〔Ｎａｔｕｅｒ ３１１，３７９−３８７ １９８７〕
の改良法によってアフィニティー精製する。本明細書に
おいて使用される単一特異性抗体とは、単一抗体種また
は関連抗原に対して同種結合特性を有する複数抗体種と
定義される。本明細書において使用される同種結合と
は、特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能
力を指す。
【００６９】ＭＤ０６ ＭＤＶ免疫原に対して反応性を
示すモノクローナル抗体は、近親交配マウス、好ましく
はＢａｌｂ／ｃを適当なタンパク質で免疫することによ
り作製することができる。マウスを、等容量の容認可能
なアジュバント中の０．５ｍｌの用量当たり約１００ｎ
ｇ〜約１０μｇの免疫原で腹腔内に免疫する。このよう
な容認可能なアジュバントとしては、完全フロイント、
不完全フロイント、ミョウバン沈降物及び油中水型エマ
ルジョンを挙げることができる。初回免疫の約１４、２
１及び６３日後、アジュバントなしで等容量の免疫原を
マウスに静脈内追加免疫する。最後の追加免疫の約３日
後、個々のマウスの抗免疫原抗体を血清学的に調査す
る。抗体を産生したマウスの脾細胞を単離し、ＳＰ−２
／０などのようなネズミ骨髄腫細胞と当分野においては
公知の技術によって融合する〔Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６；４９５−４
９７，１９７５〕。ヒポキサンチン、チミジン及びアミ
ノプテリンを含有させたダルベッコ改良イーグル培地
（ＤＭＥＭ）のような適当な細胞培地中での増殖によ
り、ハイブリドーマ細胞を選択する。抗体産生ハイブリ
ドーマを、好ましくはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天法
〔Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔ
ｅｒｓｏｎ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，
２７６，１９７３〕を使用してクローニングする。適当
な培地中で培養するために、個々のコロニーを培養プレ
ートの個別のウェル中に移す。適当な免疫原を用いてス
クリーニングすることによって抗体産生細胞を同定す
る。免疫原に陽性を示すハイブリドーマ細胞を、当分野
においては公知の技術によって維持する。特定の抗モノ
クローナル抗体は、このハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで培養するか、または、当分野においては公知の方
法によってハイブリドーマを注入してからマウスの腹水
を採取することにより製造することができる。
示すモノクローナル抗体は、近親交配マウス、好ましく
はＢａｌｂ／ｃを適当なタンパク質で免疫することによ
り作製することができる。マウスを、等容量の容認可能
なアジュバント中の０．５ｍｌの用量当たり約１００ｎ
ｇ〜約１０μｇの免疫原で腹腔内に免疫する。このよう
な容認可能なアジュバントとしては、完全フロイント、
不完全フロイント、ミョウバン沈降物及び油中水型エマ
ルジョンを挙げることができる。初回免疫の約１４、２
１及び６３日後、アジュバントなしで等容量の免疫原を
マウスに静脈内追加免疫する。最後の追加免疫の約３日
後、個々のマウスの抗免疫原抗体を血清学的に調査す
る。抗体を産生したマウスの脾細胞を単離し、ＳＰ−２
／０などのようなネズミ骨髄腫細胞と当分野においては
公知の技術によって融合する〔Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６；４９５−４
９７，１９７５〕。ヒポキサンチン、チミジン及びアミ
ノプテリンを含有させたダルベッコ改良イーグル培地
（ＤＭＥＭ）のような適当な細胞培地中での増殖によ
り、ハイブリドーマ細胞を選択する。抗体産生ハイブリ
ドーマを、好ましくはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天法
〔Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔ
ｅｒｓｏｎ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，
２７６，１９７３〕を使用してクローニングする。適当
な培地中で培養するために、個々のコロニーを培養プレ
ートの個別のウェル中に移す。適当な免疫原を用いてス
クリーニングすることによって抗体産生細胞を同定す
る。免疫原に陽性を示すハイブリドーマ細胞を、当分野
においては公知の技術によって維持する。特定の抗モノ
クローナル抗体は、このハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで培養するか、または、当分野においては公知の方
法によってハイブリドーマを注入してからマウスの腹水
を採取することにより製造することができる。
【００７０】抗イディオタイプ抗体は、防御が望まれる
病原体の抗原の“内部像（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｍａｇ
ｅ）”を保持しており、ワクチンにおいて免疫原として
使用され得る免疫グロブリンである〔Ｄｒｅｅｓｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ
１５１，７６１，１９８５〕。抗イディオタイプ抗体を
産生させる技術は当分野において公知である〔ＭａｃＮ
ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６，
１３２５，１９８４〕。
病原体の抗原の“内部像（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｍａｇ
ｅ）”を保持しており、ワクチンにおいて免疫原として
使用され得る免疫グロブリンである〔Ｄｒｅｅｓｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ
１５１，７６１，１９８５〕。抗イディオタイプ抗体を
産生させる技術は当分野において公知である〔ＭａｃＮ
ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６，
１３２５，１９８４〕。
【００７１】本発明のワクチンは、通常の能動免疫スキ
ームにおいて投与することができる。即ち、投与製剤に
適合し得る態様で且つ予防上及び／または治療上有効な
つまり免疫原性となる量、即ち有毒ＭＤＶによる攻撃に
対して動物体内で免疫を誘導する抗原またはそれを発現
し得る組換え微生物の量で、１回または複数回投与する
ことができる。免疫とは、予防接種後の動物集団におい
て、予防接種していないグループと比較してより高いレ
ベルの防御が誘導されることと定義される。
ームにおいて投与することができる。即ち、投与製剤に
適合し得る態様で且つ予防上及び／または治療上有効な
つまり免疫原性となる量、即ち有毒ＭＤＶによる攻撃に
対して動物体内で免疫を誘導する抗原またはそれを発現
し得る組換え微生物の量で、１回または複数回投与する
ことができる。免疫とは、予防接種後の動物集団におい
て、予防接種していないグループと比較してより高いレ
ベルの防御が誘導されることと定義される。
【００７２】生ウイルスベクターワクチンにおいては、
動物当たりの投与量は、１×１０2〜１×１０6注入単位
（ｉｎｊｅｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｉｔｓ）とすることが
できる。
動物当たりの投与量は、１×１０2〜１×１０6注入単位
（ｉｎｊｅｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｉｔｓ）とすることが
できる。
【００７３】本発明の典型的なサブユニットワクチン
は、１０μｇ〜１ｍｇの本発明のポリペプチドを含む。
は、１０μｇ〜１ｍｇの本発明のポリペプチドを含む。
【００７４】ワクチンの投与は、例えば皮内、皮下、筋
肉内、腹腔内、静脈内、経口または鼻腔内投与すること
ができる。
肉内、腹腔内、静脈内、経口または鼻腔内投与すること
ができる。
【００７５】更に、ワクチンは、例えば活性及び／また
は保存寿命を増大するために、多くは他の成分と混合し
た水性媒質または水含有懸濁液を含むことができる。こ
れらの成分は、塩、ｐＨ緩衝液、安定化剤（例えばスキ
ムミルクまたはカゼイン加水分解物）、免疫応答を向上
するための乳化剤アジュバント（例えばオイル、ムラミ
ルジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリア
ニオン及び両親媒性物質）、及び保存剤であり得る。
は保存寿命を増大するために、多くは他の成分と混合し
た水性媒質または水含有懸濁液を含むことができる。こ
れらの成分は、塩、ｐＨ緩衝液、安定化剤（例えばスキ
ムミルクまたはカゼイン加水分解物）、免疫応答を向上
するための乳化剤アジュバント（例えばオイル、ムラミ
ルジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリア
ニオン及び両親媒性物質）、及び保存剤であり得る。
【００７６】本発明のワクチンは、多価ワクチンを製造
するために、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニュ
ーカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性滑液嚢病ウイ
ルス（ＩＢＤＶ）または本明細書に記載のものとは異な
るマレック病ウイルスの抗原のような、他の家禽病原体
に関係する免疫原を含むこともできるし、かかる免疫原
をコードする核酸配列を含むこともできることは明らか
である。
するために、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニュ
ーカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感染性滑液嚢病ウイ
ルス（ＩＢＤＶ）または本明細書に記載のものとは異な
るマレック病ウイルスの抗原のような、他の家禽病原体
に関係する免疫原を含むこともできるし、かかる免疫原
をコードする核酸配列を含むこともできることは明らか
である。
【００７７】更に本発明は、本発明のポリペプチドを含
む“免疫化学試薬”にも係わる。
む“免疫化学試薬”にも係わる。
【００７８】“免疫化学試薬”なる用語は、本発明のポ
リペプチドを適当な支持体に結合させたり、またはそれ
に標識物質を与えることを意味している。
リペプチドを適当な支持体に結合させたり、またはそれ
に標識物質を与えることを意味している。
【００７９】使用し得る支持体としては、例えば、マイ
クロ試験ウェル、キュベット、試験管もしくは毛細管の
内壁、膜、フィルター、試験ストリップ、またはラテッ
クス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒
子としての金属化合物のような粒子の表面を挙げること
ができる。
クロ試験ウェル、キュベット、試験管もしくは毛細管の
内壁、膜、フィルター、試験ストリップ、またはラテッ
クス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒
子としての金属化合物のような粒子の表面を挙げること
ができる。
【００８０】使用し得る標識物質としては、特に、放射
性同位元素、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル、
またはゾル粒子としての金属化合物を挙げることができ
る。
性同位元素、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル、
またはゾル粒子としての金属化合物を挙げることができ
る。
【００８１】本発明の核酸配列を使用し、任意の種類の
組織中でＭＤＶ関連核酸を検出するためのハイブリダイ
ゼーション実験用の特定のプローブを設計することがで
きる。
組織中でＭＤＶ関連核酸を検出するためのハイブリダイ
ゼーション実験用の特定のプローブを設計することがで
きる。
【００８２】更に本発明は、ＭＤＶ感染または疾患の診
断に有効な前記核酸配列を含む試験キットも提供する。
断に有効な前記核酸配列を含む試験キットも提供する。
【００８３】更に本発明は、少なくとも１種の本発明の
免疫化学試薬を含む、イムノアッセイに使用される試験
キットにも係わる。
免疫化学試薬を含む、イムノアッセイに使用される試験
キットにも係わる。
【００８４】上記試験キットを使用して行われる免疫化
学反応は好ましくは、サンドイッチ反応、凝集反応、競
合反応または阻害反応である。
学反応は好ましくは、サンドイッチ反応、凝集反応、競
合反応または阻害反応である。
【００８５】サンドイッチ反応を実施するためには、試
験キットは例えば、固体支持体例えばマイクロ試験ウェ
ルの内壁に結合させた本発明のポリペプチドと、本発明
の標識ポリペプチドまたは標識抗体かのいずれかとから
なる得る。
験キットは例えば、固体支持体例えばマイクロ試験ウェ
ルの内壁に結合させた本発明のポリペプチドと、本発明
の標識ポリペプチドまたは標識抗体かのいずれかとから
なる得る。
【００８６】実施例１ 回復期ニワトリ血清による細菌発現ライブラリーのスク
リーニング ライブラリーの構築に使用したベクターはλｇｔ１１
〔Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，１１９
４−１１９８，１９８３〕及びλＥＭＢＬ−３であっ
た。λｇｔ１１発現ベクターのゲノムは、酵素β−ガラ
クトシダーゼをコードする機能的ＬａｃＺ遺伝子を含ん
でおり、カルボキシ末端近傍に唯一のＥｃｏＲＩ制限部
位を有する。ＭＤＶゲノム由来のＤＮＡ断片を前記部位
に挿入すると、β−ガラクトシダーゼの主要部分に融合
したＭＤＶ特異的ポリペプチドからなるタンパク質の発
現をもたらし得る。複雑な多数のＤＮＡ断片を表わすラ
イブラリーは、ＭＤＶ感染トリ由来の血清のような抗体
プローブによって認識される融合タンパク質を産生する
組換えクローンについて高密度でスクリーニングするこ
とができる。
リーニング ライブラリーの構築に使用したベクターはλｇｔ１１
〔Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，１１９
４−１１９８，１９８３〕及びλＥＭＢＬ−３であっ
た。λｇｔ１１発現ベクターのゲノムは、酵素β−ガラ
クトシダーゼをコードする機能的ＬａｃＺ遺伝子を含ん
でおり、カルボキシ末端近傍に唯一のＥｃｏＲＩ制限部
位を有する。ＭＤＶゲノム由来のＤＮＡ断片を前記部位
に挿入すると、β−ガラクトシダーゼの主要部分に融合
したＭＤＶ特異的ポリペプチドからなるタンパク質の発
現をもたらし得る。複雑な多数のＤＮＡ断片を表わすラ
イブラリーは、ＭＤＶ感染トリ由来の血清のような抗体
プローブによって認識される融合タンパク質を産生する
組換えクローンについて高密度でスクリーニングするこ
とができる。
【００８７】ＭＤＶ株ＧＡのゲノムを表わすライブラリ
ーは、平均サイズ約１８ｋｂｐの挿入物を含む約１００
個の独立のλＥＭＢＬ−３組換え体からなった。これら
の組換え体を、ＭＤＶ株ＧＡに感染したニワトリ胚線維
芽細胞（ＣＥＦ）の全ＤＮＡ含有物を表わすファージラ
イブラリーをＭＤＶ特異的配列を含むＢａｍＨＩプラス
ミドクローンのプールからなるプローブ〔Ｆｕｋｕｃｈ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１，１０２，１
９８４〕とハイブリダイスさせることにより選択した。
増幅したＧＡ特異的ＥＭＢＬ−３ライブラリー由来のＤ
ＮＡを、制限酵素ＡｌｕＩ、ＲｓａＩ及びＨａｅＩＩＩ
の混合物を用いて部分消化することにより断片化した。
大きさ０．５〜４．０ｋｂの断片を単離し、ｄＧ残基で
テーリングし、λｇｔ１０ベクター〔Ｌｅ Ｂｏｕｃ
ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．１９６，１０８，
１９８６；Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．，４
９−７８，１９８５〕の唯一のＥｃｏＲＩ部位中に合成
アダプターによって挿入し、有効サイズ４×１０4ｐｆ
ｕを有するライブラリーを得た。ファージを増幅し、Ｃ
ｓＣｌ勾配上で精製し、ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩに
よる制限によって挿入物を回収した。最後に、これらの
挿入物をλｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に連結
し、ＭＤＶに対するニワトリ血清を用いて組換えファー
ジをスクリーニングした。
ーは、平均サイズ約１８ｋｂｐの挿入物を含む約１００
個の独立のλＥＭＢＬ−３組換え体からなった。これら
の組換え体を、ＭＤＶ株ＧＡに感染したニワトリ胚線維
芽細胞（ＣＥＦ）の全ＤＮＡ含有物を表わすファージラ
イブラリーをＭＤＶ特異的配列を含むＢａｍＨＩプラス
ミドクローンのプールからなるプローブ〔Ｆｕｋｕｃｈ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１，１０２，１
９８４〕とハイブリダイスさせることにより選択した。
増幅したＧＡ特異的ＥＭＢＬ−３ライブラリー由来のＤ
ＮＡを、制限酵素ＡｌｕＩ、ＲｓａＩ及びＨａｅＩＩＩ
の混合物を用いて部分消化することにより断片化した。
大きさ０．５〜４．０ｋｂの断片を単離し、ｄＧ残基で
テーリングし、λｇｔ１０ベクター〔Ｌｅ Ｂｏｕｃ
ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．１９６，１０８，
１９８６；Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．，４
９−７８，１９８５〕の唯一のＥｃｏＲＩ部位中に合成
アダプターによって挿入し、有効サイズ４×１０4ｐｆ
ｕを有するライブラリーを得た。ファージを増幅し、Ｃ
ｓＣｌ勾配上で精製し、ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩに
よる制限によって挿入物を回収した。最後に、これらの
挿入物をλｇｔ１１ベクターのＥｃｏＲＩ部位に連結
し、ＭＤＶに対するニワトリ血清を用いて組換えファー
ジをスクリーニングした。
【００８８】この回復期血清は、Ｄｒ．Ｃａｌｎｅｋ
〔Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ，ＵＳ
Ａ〕から入手したＭＤＶ由来ＧＡ株の有毒性継代物で単
冠ハクショクレグホン（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｂ ｗｈ
ｉｔｅ ｌｅｇｈｏｒｎｓ，ＳＰＡＦＡＳ）を感染させ
ることにより得た。１２週間にわたって血清を採取し、
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の組織培養体中のＭＤ
Ｖプラークへの結合について、間接蛍光法によって試料
を個々に試験した。
〔Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ，ＵＳ
Ａ〕から入手したＭＤＶ由来ＧＡ株の有毒性継代物で単
冠ハクショクレグホン（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｂ ｗｈ
ｉｔｅ ｌｅｇｈｏｒｎｓ，ＳＰＡＦＡＳ）を感染させ
ることにより得た。１２週間にわたって血清を採取し、
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の組織培養体中のＭＤ
Ｖプラークへの結合について、間接蛍光法によって試料
を個々に試験した。
【００８９】力価及び特異性に基づいて６つの血清を選
択した。これら試料の混合物を１００倍に希釈して使用
し、Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ら〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，２５８３，１９８
５〕に従ってニトロセルロースフィルター上でλｇｔ１
１ライブラリーをスクリーニングした。フィルターのイ
ンキュベーションのための第２抗体は、アルカリホスフ
ァターゼ結合ウサギ抗ニワトリ血清〔Ｓｉｇｍａ，ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ〕であり、ニトロブルーテトラ
ゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェート呈色反応〔ＭｃＧａｄｅｙ，Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｅ ２３，１８０，１９７０〕によって陽性シグ
ナルを発色させた。一連の候補試料を選択し、組換え体
を均一になるまでプラーク精製した。
択した。これら試料の混合物を１００倍に希釈して使用
し、Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ら〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，２５８３，１９８
５〕に従ってニトロセルロースフィルター上でλｇｔ１
１ライブラリーをスクリーニングした。フィルターのイ
ンキュベーションのための第２抗体は、アルカリホスフ
ァターゼ結合ウサギ抗ニワトリ血清〔Ｓｉｇｍａ，ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ〕であり、ニトロブルーテトラ
ゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェート呈色反応〔ＭｃＧａｄｅｙ，Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｅ ２３，１８０，１９７０〕によって陽性シグ
ナルを発色させた。一連の候補試料を選択し、組換え体
を均一になるまでプラーク精製した。
【００９０】かかるλｇｔ１１候補試料のなかの主要グ
ループは、交差ハイブリダイゼーション実験によると、
強力な類似性を有する挿入配列を含んでいた。それらの
１つを選択し、約５００ｂｐのＤＮＡ挿入物をｐＧＥＭ
３Ｚ〔Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ〕に移
入し、プラスミドｐＭＤ０６を得た。
ループは、交差ハイブリダイゼーション実験によると、
強力な類似性を有する挿入配列を含んでいた。それらの
１つを選択し、約５００ｂｐのＤＮＡ挿入物をｐＧＥＭ
３Ｚ〔Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ〕に移
入し、プラスミドｐＭＤ０６を得た。
【００９１】実施例２ ＭＤ０６抗原をコードする遺伝子のクローニング及び構
造分析 既に構築されているＭＤＶ株ＧＡ特異的ＥＭＢＬ−３ラ
イブラリーを、ｐＭＤ０６由来の標識挿入物をプローブ
として使用し、レプリカフィルター上でスクリーニング
した。陽性シグナルを選択し、プラーク精製し、増幅し
たファージ調製物からＤＮＡを抽出した。候補試料の１
つをλＧＡ０８と称し、これを、制限マッピングと、ｐ
ＭＤ０６由来の標識挿入物をプローブとして使用するサ
ザンブロットハイブリダイゼーションによって分析し
た。λＧＡ０８の１７ｋｂの挿入物中に存在する５．０
ｋｂのＳａｌＩ断片に対して強いハイブリダイゼーショ
ンが認められた。この特定の断片をｐＧＥＭ３Ｚ中にサ
ブクローニングしてｐＭＤ１１を得、その制限マップを
図１に示す。３．３ｋｂ及び０．９ｋｂの２つのｐｓｔ
Ｉ断片をｐＧＥＭ５Ｚ中にサブクローニングにすること
によりｐＭＤ１１由来の関連断片を得て、それぞれｐＭ
Ｄ２３及びｐＭＤ２４と称した。図１に示した０．９ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ制限断片の領域のヌクレオチド配列を分
析した。
造分析 既に構築されているＭＤＶ株ＧＡ特異的ＥＭＢＬ−３ラ
イブラリーを、ｐＭＤ０６由来の標識挿入物をプローブ
として使用し、レプリカフィルター上でスクリーニング
した。陽性シグナルを選択し、プラーク精製し、増幅し
たファージ調製物からＤＮＡを抽出した。候補試料の１
つをλＧＡ０８と称し、これを、制限マッピングと、ｐ
ＭＤ０６由来の標識挿入物をプローブとして使用するサ
ザンブロットハイブリダイゼーションによって分析し
た。λＧＡ０８の１７ｋｂの挿入物中に存在する５．０
ｋｂのＳａｌＩ断片に対して強いハイブリダイゼーショ
ンが認められた。この特定の断片をｐＧＥＭ３Ｚ中にサ
ブクローニングしてｐＭＤ１１を得、その制限マップを
図１に示す。３．３ｋｂ及び０．９ｋｂの２つのｐｓｔ
Ｉ断片をｐＧＥＭ５Ｚ中にサブクローニングにすること
によりｐＭＤ１１由来の関連断片を得て、それぞれｐＭ
Ｄ２３及びｐＭＤ２４と称した。図１に示した０．９ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ制限断片の領域のヌクレオチド配列を分
析した。
【００９２】Ｈｅｎｉｋｏｆｆ〔Ｇｅｎｅ ２８，３５
７，１９８４〕によって記載されたようにエキソヌクレ
アーゼIII処理によって生成される順次欠失されたサブ
クローンに基づいて、プラスミドｐＭＤ１１またはｐＭ
Ｄ２３の両鎖を分析した。全ての反応は、Ｔ７ポリメラ
ーゼ配列決定キット〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ〕を使用し、二重鎖ＤＮＡ
調製物において実施した。Ｇｅｎｅ−Ｍａｓｔｅｒワー
クステーション〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，
ＣＡ〕製のショットガンハンドラーを使用し、ゲル読取
り値を集計した。この分析結果はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１に示し、約２９０個のアミノ酸のＭＤ０６抗原を実質
的にコードする８３０個のヌクレオチドの読み枠が明ら
かとなった。前記アミノ酸からなる一次構造をＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２に示す。
７，１９８４〕によって記載されたようにエキソヌクレ
アーゼIII処理によって生成される順次欠失されたサブ
クローンに基づいて、プラスミドｐＭＤ１１またはｐＭ
Ｄ２３の両鎖を分析した。全ての反応は、Ｔ７ポリメラ
ーゼ配列決定キット〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ〕を使用し、二重鎖ＤＮＡ
調製物において実施した。Ｇｅｎｅ−Ｍａｓｔｅｒワー
クステーション〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，
ＣＡ〕製のショットガンハンドラーを使用し、ゲル読取
り値を集計した。この分析結果はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１に示し、約２９０個のアミノ酸のＭＤ０６抗原を実質
的にコードする８３０個のヌクレオチドの読み枠が明ら
かとなった。前記アミノ酸からなる一次構造をＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２に示す。
【００９３】実施例３ シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を生ウイル
スベクターとして使用する、ニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）由来の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（Ｈ
Ｎ）タンパク質との融合ポリペプチドとしての抗原ＭＤ
０６の発現 ベクター生物中での抗原の発現については、抗原が細胞
表面に露出していれば宿主免疫系が関連抗原エプトープ
を認識する効率を増大すると考えることができる。この
ような担体タンパク質の例としてはＮＤＶ由来のＨＮを
挙げることができる。このタンパク質をコードする遺伝
子を、トリウイルスベクター、例えばＨＶＴのゲノム中
に、細胞に組換えウイルスを感染させた後にＨＮが効率
的に合成されるように挿入することができる。そうする
と、ＭＤ０６の実質的な部分をコードするＤＮＡ断片
は、ＨＮに対するコード領域内の適正な位置に、適正な
向き及び読み枠が保守されるように組み込まれる。感染
細胞によって合成された融合ポリペプチドは細胞表面に
導かれ得、ＨＮのアミノ末端配列を介して形質膜中に正
しく固定される。
スベクターとして使用する、ニューカッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）由来の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（Ｈ
Ｎ）タンパク質との融合ポリペプチドとしての抗原ＭＤ
０６の発現 ベクター生物中での抗原の発現については、抗原が細胞
表面に露出していれば宿主免疫系が関連抗原エプトープ
を認識する効率を増大すると考えることができる。この
ような担体タンパク質の例としてはＮＤＶ由来のＨＮを
挙げることができる。このタンパク質をコードする遺伝
子を、トリウイルスベクター、例えばＨＶＴのゲノム中
に、細胞に組換えウイルスを感染させた後にＨＮが効率
的に合成されるように挿入することができる。そうする
と、ＭＤ０６の実質的な部分をコードするＤＮＡ断片
は、ＨＮに対するコード領域内の適正な位置に、適正な
向き及び読み枠が保守されるように組み込まれる。感染
細胞によって合成された融合ポリペプチドは細胞表面に
導かれ得、ＨＮのアミノ末端配列を介して形質膜中に正
しく固定される。
【００９４】Ａ．遺伝子のＨＶＴゲノム中への組込みを
仲介するベクタープラスミド Ｉｇａｒａｓｈｉ、Ｔ．ら〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５
７，３５１，１９８７〕によって公表されたようなＨＶ
Ｔのゲノム構造に基づき、ウイルスの非反復短鎖配列要
素（Ｕｎｉｑｕｅ−ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅ
ｌｅｍｅｎｔ，Ｕｓ）中のある領域を、外来遺伝子の挿
入のために選択した。対応するＤＮＡ断片を、ＨＶＴ感
染ＣＥＦ由来の全ＤＮＡを部分消化することにより構築
したλＥＭＢＬ３ライブラリーからスクリーニングし
た。ＢａｍＨＩ制限部位を全く含まないことを特徴とす
るλ単離体の１つの挿入物をλＨＶＴ０４と称した。１
７．５ｋｂの挿入断片中に存在する配列は、逆反復構造
（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ）〔Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９７
８，前出〕の一部を含むＵｓ領域の大部分を表わしてい
た。λＨＶＴ０４由来の１．２ｋｂのＸｈｏＩ制限断片
の１つを、ＳａｌＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚ中にサブク
ローニングし、ＤＮＡ断片の挿入に使用し得る唯一のＢ
ｇｌＩＩ部位を含むプラスミドｐＭＤ０７を得た（図
２）。ＨＶＴウイルスのゲノム中に挿入された後に外来
遺伝子の発現を誘導し得る強力なプロモーターを、Ｒｏ
ｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）のＬＴＲ
配列から選択した。ｐＲＳＶｃａｔ〔Ｇｏｒｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
７９，６７７７，１９８２〕由来の５８０ｂｐのＮｄｅ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片においてプロモーターをマ
ッピングし、断片の両側をｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ部位間に二重鎖合成
リンカーを介して挿入した。ベクターｐＧＥＭ３Ｚ由来
のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＬＴＲプロモーターを保持する
ＲＳＶ断片のＮｄｅＩ部位の間を、一方の部位ではＨｉ
ｎｄＩＩＩと、他方の部位ではＮｄｅＩと適合する付着
端を含む３０ｂｐのリンカーで結合した。しかしなが
ら、結合後、６塩基対の認識配列の外側のヌクレオチド
が故意に改変するため、両制限部位は復元されない。こ
れら２つの部位を除去するほかに、リンカー自体の内に
存在する新たな制限部位（ＢａｍＨＩ）を対応する位置
に形成した。ＬＴＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐ
ＧＥＭ３Ｚ由来のＰｓｔＩ部位に連結するが、この場合
には両端部の認識配列を破壊することなく、３つの便宜
的な唯一の制限部位ＢｇｌＩＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏ
ＲＶをｐＧＥＭ３Ｚのポリリンカー中に既に存在するも
の、例えばＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＨｈｏＩ及びＢａｍＨ
Ｉに加えて、２０ｂｐの第２リンカーを合成した。得ら
れたｐＧＥＭ３Ｚの誘導体をｐＶＥＣ０１と称し、これ
は、ＬＴＲプロモーター配列と、その直後に、外来遺伝
子の挿入に使用し得る７つの制限部位とを保有する６５
０ｂｐの制限断片を含んでいた。６５０ｂｐ断片のいず
れか一方の端部にＢａｍＨＩ制限部位をフランキング配
置し、ｐＭＤ０７由来の１．２ｋｂＨＶＴ挿入物中に存
在する唯一のＢｇｌＩＩ部位に移入した。上記２つの制
限酵素によって生成された付着端は適合可能であるが、
ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩに対するもとの認識配列の
いずれもが連結によって復元されない。得られた構築物
のうちＴＲｓに向かう向きでＬＴＲを保有するものをｐ
ＶＥＣ０４と称し、制限マッピングによってチェックし
た（図３）。この汎用ＨＶＴ組換えベクターの構造によ
って、ＬＴＲプロモーターの直ぐ下流に外来遺伝子を挿
入することができ、従って完全な発現カセットをＨＶＴ
ゲノム中にｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって組込むことが
できる。ＬＴＲの下流にある種々の制限部位の位置、特
に酵素ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶに対するも
のは、複数の遺伝子挿入さえ行ない得るように設計され
ている。
仲介するベクタープラスミド Ｉｇａｒａｓｈｉ、Ｔ．ら〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５
７，３５１，１９８７〕によって公表されたようなＨＶ
Ｔのゲノム構造に基づき、ウイルスの非反復短鎖配列要
素（Ｕｎｉｑｕｅ−ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅ
ｌｅｍｅｎｔ，Ｕｓ）中のある領域を、外来遺伝子の挿
入のために選択した。対応するＤＮＡ断片を、ＨＶＴ感
染ＣＥＦ由来の全ＤＮＡを部分消化することにより構築
したλＥＭＢＬ３ライブラリーからスクリーニングし
た。ＢａｍＨＩ制限部位を全く含まないことを特徴とす
るλ単離体の１つの挿入物をλＨＶＴ０４と称した。１
７．５ｋｂの挿入断片中に存在する配列は、逆反復構造
（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ）〔Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９７
８，前出〕の一部を含むＵｓ領域の大部分を表わしてい
た。λＨＶＴ０４由来の１．２ｋｂのＸｈｏＩ制限断片
の１つを、ＳａｌＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚ中にサブク
ローニングし、ＤＮＡ断片の挿入に使用し得る唯一のＢ
ｇｌＩＩ部位を含むプラスミドｐＭＤ０７を得た（図
２）。ＨＶＴウイルスのゲノム中に挿入された後に外来
遺伝子の発現を誘導し得る強力なプロモーターを、Ｒｏ
ｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）のＬＴＲ
配列から選択した。ｐＲＳＶｃａｔ〔Ｇｏｒｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
７９，６７７７，１９８２〕由来の５８０ｂｐのＮｄｅ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片においてプロモーターをマ
ッピングし、断片の両側をｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ部位間に二重鎖合成
リンカーを介して挿入した。ベクターｐＧＥＭ３Ｚ由来
のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＬＴＲプロモーターを保持する
ＲＳＶ断片のＮｄｅＩ部位の間を、一方の部位ではＨｉ
ｎｄＩＩＩと、他方の部位ではＮｄｅＩと適合する付着
端を含む３０ｂｐのリンカーで結合した。しかしなが
ら、結合後、６塩基対の認識配列の外側のヌクレオチド
が故意に改変するため、両制限部位は復元されない。こ
れら２つの部位を除去するほかに、リンカー自体の内に
存在する新たな制限部位（ＢａｍＨＩ）を対応する位置
に形成した。ＬＴＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐ
ＧＥＭ３Ｚ由来のＰｓｔＩ部位に連結するが、この場合
には両端部の認識配列を破壊することなく、３つの便宜
的な唯一の制限部位ＢｇｌＩＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏ
ＲＶをｐＧＥＭ３Ｚのポリリンカー中に既に存在するも
の、例えばＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＨｈｏＩ及びＢａｍＨ
Ｉに加えて、２０ｂｐの第２リンカーを合成した。得ら
れたｐＧＥＭ３Ｚの誘導体をｐＶＥＣ０１と称し、これ
は、ＬＴＲプロモーター配列と、その直後に、外来遺伝
子の挿入に使用し得る７つの制限部位とを保有する６５
０ｂｐの制限断片を含んでいた。６５０ｂｐ断片のいず
れか一方の端部にＢａｍＨＩ制限部位をフランキング配
置し、ｐＭＤ０７由来の１．２ｋｂＨＶＴ挿入物中に存
在する唯一のＢｇｌＩＩ部位に移入した。上記２つの制
限酵素によって生成された付着端は適合可能であるが、
ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩに対するもとの認識配列の
いずれもが連結によって復元されない。得られた構築物
のうちＴＲｓに向かう向きでＬＴＲを保有するものをｐ
ＶＥＣ０４と称し、制限マッピングによってチェックし
た（図３）。この汎用ＨＶＴ組換えベクターの構造によ
って、ＬＴＲプロモーターの直ぐ下流に外来遺伝子を挿
入することができ、従って完全な発現カセットをＨＶＴ
ゲノム中にｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって組込むことが
できる。ＬＴＲの下流にある種々の制限部位の位置、特
に酵素ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶに対するも
のは、複数の遺伝子挿入さえ行ない得るように設計され
ている。
【００９５】Ｂ．ＭＤＶ由来のＨＮ遺伝子のｐＶＥＣ０
４への挿入 ＮＤＶ株Ｃｌｏｎｅ ３０のＤＮＡライブラリー〔Ｉｎ
ｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．，Ｈｏｌｌａｎｄ〕からＨＮを
コードする遺伝子を単離した。胚形成期の卵（ｅｍｂｒ
ｙｏｎａｔｅｄ ｅｇｇｓ）上で増殖させたウイルスか
らゲノムＲＮＡを調製し、ランダムな１０塩基のオリゴ
マーを使用して反応を生起し、逆転写酵素を用いて第１
ｃＤＮＡ鎖を合成した。ＢａｍＨＩ制限部位がフランキ
ング配置されており且つ完全ＨＮタンパク質をコードす
るＤＮＡ断片をｐＧＥＭ４Ｚ〔Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＵＳＡ〕中にクローニングし、得られたプラ
スミドをｐＮＤＶ０３と称した。次いで、２．１ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片を組換えベクターｐＶＥＣ０４のＢｇｌ
ＩＩ部位中に移入してｐＮＤＶ０５を得た。図４に示し
たような物理的マップに基づく制限分析によって、ＬＴ
Ｒプロモーターに対する挿入遺伝子の正しい向きを検証
した。
４への挿入 ＮＤＶ株Ｃｌｏｎｅ ３０のＤＮＡライブラリー〔Ｉｎ
ｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．，Ｈｏｌｌａｎｄ〕からＨＮを
コードする遺伝子を単離した。胚形成期の卵（ｅｍｂｒ
ｙｏｎａｔｅｄ ｅｇｇｓ）上で増殖させたウイルスか
らゲノムＲＮＡを調製し、ランダムな１０塩基のオリゴ
マーを使用して反応を生起し、逆転写酵素を用いて第１
ｃＤＮＡ鎖を合成した。ＢａｍＨＩ制限部位がフランキ
ング配置されており且つ完全ＨＮタンパク質をコードす
るＤＮＡ断片をｐＧＥＭ４Ｚ〔Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＵＳＡ〕中にクローニングし、得られたプラ
スミドをｐＮＤＶ０３と称した。次いで、２．１ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片を組換えベクターｐＶＥＣ０４のＢｇｌ
ＩＩ部位中に移入してｐＮＤＶ０５を得た。図４に示し
たような物理的マップに基づく制限分析によって、ＬＴ
Ｒプロモーターに対する挿入遺伝子の正しい向きを検証
した。
【００９６】Ｃ．ＭＤＶ抗原ＭＤ０６をコードする遺伝
子とＮＤＶ由来のＨＮとの融合体の構築 ＨＮ由来のコード領域の配列の調査により、遺伝子の
３’末端部分に存在するＥｃｏＲＩ制限部位のＧＡＡコ
ドンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示したＭＤ０６をコ
ードする遺伝子の第２コドンと同じ読み枠を有すること
が明らかとなった。ｐＭＤ１１またはｐＭＤ２３から誘
導された０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＮＤＶ０５
中の関連ＥｃｏＲＩ制限部位に正しい向きで組込むと、
完全ＭＤ０６抗原に融合されたほぼ完全なＨＮタンパク
質を含むポリペプチドが合成される。ｐＮＤＶ０５から
誘導されたこの特定のプラスミド構築物をｐＮＤＶ１０
と称し、その制限マップを図５に示す。
子とＮＤＶ由来のＨＮとの融合体の構築 ＨＮ由来のコード領域の配列の調査により、遺伝子の
３’末端部分に存在するＥｃｏＲＩ制限部位のＧＡＡコ
ドンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示したＭＤ０６をコ
ードする遺伝子の第２コドンと同じ読み枠を有すること
が明らかとなった。ｐＭＤ１１またはｐＭＤ２３から誘
導された０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＮＤＶ０５
中の関連ＥｃｏＲＩ制限部位に正しい向きで組込むと、
完全ＭＤ０６抗原に融合されたほぼ完全なＨＮタンパク
質を含むポリペプチドが合成される。ｐＮＤＶ０５から
誘導されたこの特定のプラスミド構築物をｐＮＤＶ１０
と称し、その制限マップを図５に示す。
【００９７】更に、融合ポリペプチドをコードする遺伝
子の３’末端に存在するＥｃｏＲＶ部位にマーカー遺伝
子を組込むことも考えられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａ
ｃＺ遺伝子のようなマーカー遺伝子の存在は、β−ガラ
クトシダーゼ活性及び目的の融合ポリペプチドの両方を
発現する組換えＨＶＴウイルスの検出を容易にする。
子の３’末端に存在するＥｃｏＲＶ部位にマーカー遺伝
子を組込むことも考えられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａ
ｃＺ遺伝子のようなマーカー遺伝子の存在は、β−ガラ
クトシダーゼ活性及び目的の融合ポリペプチドの両方を
発現する組換えＨＶＴウイルスの検出を容易にする。
【００９８】Ｄ．遺伝子のＨＶＴゲノムへの挿入
プラスミドｐＮＤＶ１０由来のＤＮＡをＨＶＴ感染細胞
から調製した全ＤＮＡと一緒にＣＥＦ中に、Ｍｏｒｇａ
ｎら〔Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３４，３４５，
１９９０〕によって記載された改良を含むＧｒａｈａｍ
及びｖ．ｄ．Ｅｂ〔Ｂｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６，
１９７３〕に従うリン酸カルシウムＤＮＡ沈降に基づく
方法によって導入した。構築物由来のプラスミドＤＮＡ
２μｇをＨＶＴ感染細胞由来のＤＮＡ１５μｇと、終容
量５６０μｌのＨ2Ｏ中で混合し、７５０μｌのＨＢＳ
Ｐ（２０ｍＭ ＫＣｌ，５６０ｍＭ ＮａＣｌ，２４ｍ
Ｍグルコース，３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，１００ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）に加えた。１９０μｌの１Ｍ
ＣａＣｌ2溶液を徐々に加えることにより沈澱物を形成
し、混合物を室温で３０分間インキュベートした。この
間に、２％のウシ胎児血清を補充したイーグルの最小必
須培地のグラスゴーの改良に基づく組成を有する６／Ｂ
８の培地中に１０日齢胚由来の二次ＣＥＦを含む懸濁液
１５ｍｌを、８０ｃｍ2ペトリ皿中に５×１０5細胞／ｍ
ｌの密度で播種した。リン酸カルシウム沈降ＤＮＡを細
胞懸濁液に静かに加え、空気中に５％のＣＯ2を含む加
湿インキュベーター内で３７℃でインキュベートした。
５時間後、培地を取り出し、等容量のＨＢＳＰ及び３０
％グリセロールを含む溶液１０ｍｌを細胞上に層状に流
し入れた。１〜２分間インキュベートした後、溶液を除
去し、細胞を培地６／Ｂ８で洗浄し、新たな培地を入れ
て３〜５日間、ウイルスＣＰＥが発生するまでインキュ
ベートした。ＮＤＶのＨＮに融合したＭＤ０６抗原を発
現するＨＶＴ組換え体を、ＭＤＶ抗原またはＮＤＶ由来
のＨＮタンパク質に対する特異的一価または多価血清を
使用する免疫蛍光染色法によって検出した。
から調製した全ＤＮＡと一緒にＣＥＦ中に、Ｍｏｒｇａ
ｎら〔Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３４，３４５，
１９９０〕によって記載された改良を含むＧｒａｈａｍ
及びｖ．ｄ．Ｅｂ〔Ｂｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６，
１９７３〕に従うリン酸カルシウムＤＮＡ沈降に基づく
方法によって導入した。構築物由来のプラスミドＤＮＡ
２μｇをＨＶＴ感染細胞由来のＤＮＡ１５μｇと、終容
量５６０μｌのＨ2Ｏ中で混合し、７５０μｌのＨＢＳ
Ｐ（２０ｍＭ ＫＣｌ，５６０ｍＭ ＮａＣｌ，２４ｍ
Ｍグルコース，３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，１００ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）に加えた。１９０μｌの１Ｍ
ＣａＣｌ2溶液を徐々に加えることにより沈澱物を形成
し、混合物を室温で３０分間インキュベートした。この
間に、２％のウシ胎児血清を補充したイーグルの最小必
須培地のグラスゴーの改良に基づく組成を有する６／Ｂ
８の培地中に１０日齢胚由来の二次ＣＥＦを含む懸濁液
１５ｍｌを、８０ｃｍ2ペトリ皿中に５×１０5細胞／ｍ
ｌの密度で播種した。リン酸カルシウム沈降ＤＮＡを細
胞懸濁液に静かに加え、空気中に５％のＣＯ2を含む加
湿インキュベーター内で３７℃でインキュベートした。
５時間後、培地を取り出し、等容量のＨＢＳＰ及び３０
％グリセロールを含む溶液１０ｍｌを細胞上に層状に流
し入れた。１〜２分間インキュベートした後、溶液を除
去し、細胞を培地６／Ｂ８で洗浄し、新たな培地を入れ
て３〜５日間、ウイルスＣＰＥが発生するまでインキュ
ベートした。ＮＤＶのＨＮに融合したＭＤ０６抗原を発
現するＨＶＴ組換え体を、ＭＤＶ抗原またはＮＤＶ由来
のＨＮタンパク質に対する特異的一価または多価血清を
使用する免疫蛍光染色法によって検出した。
【００９９】実施例４ ＨＶＴ中での天然ＭＤ０６抗原の発現
５’非翻訳配列を含むＳＥＱ ＩＤ：１の完全遺伝子
を、（図３及び実施例３のセクションＡに記載した）プ
ラスミドｐＶＥＣ０４中に存在するようなＬＴＲプロモ
ーターの下流に組込み、次いで発現カセットをＨＶＴベ
クターウイルスのゲノム中にｉｎ ｖｉｖｏ組換えによ
って挿入することにより、抗原ＭＤ０６を非融合ポリペ
プチドとして発現させた。このために、ＡＴＧ開始コド
ンの上流の６０ｂｐ及びＴＡＡ終結コドンの下流の４０
ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に合成プライマーを配
置させてＰＣＲ増幅することによって、ｐＭＤ２３（実
施例２参照）由来のＤＮＡ断片上に遺伝子を単離した。
両プライマー中に新たに形成されたＧＧＡＴＣＣ配列の
存在により１．０ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片を単離する
ことができ、それをプラスミドｐＧＥＭ３ＺのＢａｍＨ
Ｉ部位中にサブクローニングし、ｐＭＤ５６を得た。挿
入物の正しい配列構造を確認した後、ＢａｍＨＩで消化
することにより断片を再度単離し、次いで、ｐＶＥＣ０
４のＢｇｌＩＩ制限部位中に挿入することにより、ｐＭ
Ｄ５８を得た（図６）。次いで、ＬＴＲプロモーターの
制御下に天然ＭＤ０６抗原をコードする遺伝子のＨＶＴ
ゲノム中に組込むステップを実施例３のセクションＤに
記載のごとき実施した。ＭＤ０６抗原を発現する組換え
ＨＶＴウイルスを、ＭＤ０６のＥ．ｃｏｌｉ発現断片に
対する特異的多価血清を使用して、感染ＣＥＦ上で免疫
蛍光染色法によって検出した。限界希釈法及び単一プラ
ークの反復単離により、組換え体を均一体に精製した。
を、（図３及び実施例３のセクションＡに記載した）プ
ラスミドｐＶＥＣ０４中に存在するようなＬＴＲプロモ
ーターの下流に組込み、次いで発現カセットをＨＶＴベ
クターウイルスのゲノム中にｉｎ ｖｉｖｏ組換えによ
って挿入することにより、抗原ＭＤ０６を非融合ポリペ
プチドとして発現させた。このために、ＡＴＧ開始コド
ンの上流の６０ｂｐ及びＴＡＡ終結コドンの下流の４０
ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に合成プライマーを配
置させてＰＣＲ増幅することによって、ｐＭＤ２３（実
施例２参照）由来のＤＮＡ断片上に遺伝子を単離した。
両プライマー中に新たに形成されたＧＧＡＴＣＣ配列の
存在により１．０ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片を単離する
ことができ、それをプラスミドｐＧＥＭ３ＺのＢａｍＨ
Ｉ部位中にサブクローニングし、ｐＭＤ５６を得た。挿
入物の正しい配列構造を確認した後、ＢａｍＨＩで消化
することにより断片を再度単離し、次いで、ｐＶＥＣ０
４のＢｇｌＩＩ制限部位中に挿入することにより、ｐＭ
Ｄ５８を得た（図６）。次いで、ＬＴＲプロモーターの
制御下に天然ＭＤ０６抗原をコードする遺伝子のＨＶＴ
ゲノム中に組込むステップを実施例３のセクションＤに
記載のごとき実施した。ＭＤ０６抗原を発現する組換え
ＨＶＴウイルスを、ＭＤ０６のＥ．ｃｏｌｉ発現断片に
対する特異的多価血清を使用して、感染ＣＥＦ上で免疫
蛍光染色法によって検出した。限界希釈法及び単一プラ
ークの反復単離により、組換え体を均一体に精製した。
【０１００】
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）氏名： ＡＫＺＯ Ｎ．Ｖ．
（Ｂ）番地： Ｖｅｌｐｅｒｗｅｇ ７６
（Ｃ）市町村： Ａｒｎｈｅｍ
（Ｅ）国： オランダ
（Ｆ）郵便番号：６８２４ ＢＭ
（ii）発明の名称：マレック病に対する組換えワクチン
（iii）配列数：２
（vii）先願データ：
（Ａ）出願番号 ：ＵＳＳＮ ０７／６９９，４６７
（Ｂ）出願日 ：１９９１年５月１４日
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９７５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（vi）起源：
（Ａ）生物名：マレック病ウイルス
（Ｂ）株名：Ｇｅｏｒｇｉａ（ＧＡ）
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン：ｐＭＤ１１
（ix）特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４６・・９１８
（Ｄ）他の情報／ラベル＝ＭＤ０６抗原
（xi）配列：配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１：
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
【表３】
【０１０４】（２）配列表（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２
の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２：
の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２：
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
【表５】
【図１】０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の位置を示すｐＭ
Ｄ１１の制限酵素マップである。この断片は、ｐＭＤ０
６の挿入物に強力にハイブリダイズした。
Ｄ１１の制限酵素マップである。この断片は、ｐＭＤ０
６の挿入物に強力にハイブリダイズした。
【図２】ＨＶＴゲノムのＵｓ領域に実質的に対応するＤ
ＮＡ断片の制限酵素マップである。４つの読み枠（ＯＲ
Ｆ）及びそれらの間の非コード配列からなる挿入領域の
相対位置が示されている。
ＮＡ断片の制限酵素マップである。４つの読み枠（ＯＲ
Ｆ）及びそれらの間の非コード配列からなる挿入領域の
相対位置が示されている。
【図３】ｐＭＤ０７由来の１．２ｋｂのＸｈｏＩ ＨＶ
Ｔ断片の唯一のＢｇｌＩＩ部位中に挿入されたＬＴＲプ
ロモーターを示すｐＶＥＣ０４の制限酵素マップであ
る。
Ｔ断片の唯一のＢｇｌＩＩ部位中に挿入されたＬＴＲプ
ロモーターを示すｐＶＥＣ０４の制限酵素マップであ
る。
【図４】ｐＮＤＶ０５の制限マップである。プラスミド
は、ｐＶＥＣ０４（図３参照）のＢｇｌＩＩ部位に挿入
された、ＢａｍＨＩ部位が側部に付いた（ｆｌａｎｋｅ
ｄ）ＮＤＶ−ＨＮ遺伝子を含んでいる。
は、ｐＶＥＣ０４（図３参照）のＢｇｌＩＩ部位に挿入
された、ＢａｍＨＩ部位が側部に付いた（ｆｌａｎｋｅ
ｄ）ＮＤＶ−ＨＮ遺伝子を含んでいる。
【図５】ｐＮＤＶ１０の制限マップである。プラスミド
は、ＭＤ０６ポリペプチドを実質的にコードする０．９
ＫｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＮＤＶ０５（図４参照）の
約３２００番目の塩基に位置するＥｃｏＲＩ部位に挿入
することによりｐＮＤＶ０５から誘導される。
は、ＭＤ０６ポリペプチドを実質的にコードする０．９
ＫｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＮＤＶ０５（図４参照）の
約３２００番目の塩基に位置するＥｃｏＲＩ部位に挿入
することによりｐＮＤＶ０５から誘導される。
【図６】ｐＭＤ５８の制限マップである。プラスミド
は、抗原ＭＤ０６をコードし且つ非翻訳フランキング配
列を含む完全遺伝子を挿入することによってｐＶＥＣ０
４から誘導される。１．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片上に位
置する遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってｐＭＤ２３（図１
参照）から単離された。
は、抗原ＭＤ０６をコードし且つ非翻訳フランキング配
列を含む完全遺伝子を挿入することによってｐＶＥＣ０
４から誘導される。１．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片上に位
置する遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってｐＭＤ２３（図１
参照）から単離された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/53
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
// Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ
(72)発明者 ヨハンネス・アントニウス・ヨセフ・ク
ラエツセンス
オランダ国、5831・エル・エー・ボツク
スメール、フアン・スペイク・52
(72)発明者 パウルス・ヤコブス・アントニウス・ソ
ンデルメイエール
オランダ国、5831・ベー・エヌ・ボツク
スメール、マホニエ・21
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
C07K 14/055
C07K 16/08
C12N 1/21
C12N 5/10
C12N 7/00
C12P 21/00 - 21/08
G01N 33/53
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミ
ノ酸配列からなるＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質か、また
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列にお
いて１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、変換または
付加されたアミノ酸配列からなり、家禽において免疫応
答を誘発し得るＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質の機能的変
異体をコードする核酸。 - 【請求項２】 核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示さ
れたＤＮＡ配列を有するか、または、そのうち１以上の
核酸が欠失した変異体であることを特徴とする請求項１
に記載の核酸。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の核酸を含む組
換えベクター分子。 - 【請求項４】 核酸が、発現制御配列に操作可能なよう
に結合されていることを特徴とする請求項３に記載の組
換えベクター分子。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載の異種核酸を含
む組換えベクターウイルス。 - 【請求項６】 請求項１もしくは２に記載の核酸または
請求項３もしくは４に記載の組換えベクター分子を用い
て形質転換させたか、或いは請求項５に記載の組換えベ
クターウイルスを感染させた宿主細胞。 - 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミ
ノ酸配列からなるＭＤ０６ ＭＤＶタンパク質、かまた
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列おい
て１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、変換または付
加されている、家禽において免疫応答を誘発し得るＭＤ
０６ ＭＤＶタンパク質の機能的変異体であることを特
徴とする、ポリペプチド。 - 【請求項８】 請求項１または２に記載の核酸によって
コードされるＭＤＶポリペプチド。 - 【請求項９】 請求項６に記載の宿主細胞を培養するこ
とを含む、請求項７または８に記載のポリペプチドを発
現する方法。 - 【請求項１０】 請求項７または８に記載のポリペプチ
ドに免疫反応性を示す抗体または抗血清。 - 【請求項１１】 ＭＤＶの抗原決定基をもつ請求項７ま
たは８に記載のポリペプチドを含む、ＭＤＶ抗体の検出
のためのイムノアッセイに使用するための免疫化学試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69946791A | 1991-05-14 | 1991-05-14 | |
| US699467 | 1991-05-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227973A JPH05227973A (ja) | 1993-09-07 |
| JP3375347B2 true JP3375347B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=24809465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12227292A Expired - Fee Related JP3375347B2 (ja) | 1991-05-14 | 1992-05-14 | マレック病に対する組換えワクチン |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6051404A (ja) |
| EP (1) | EP0513921B1 (ja) |
| JP (1) | JP3375347B2 (ja) |
| AT (1) | ATE126274T1 (ja) |
| AU (1) | AU654186B2 (ja) |
| CA (1) | CA2067469C (ja) |
| DE (1) | DE69203950T2 (ja) |
| ES (1) | ES2078642T3 (ja) |
| GR (1) | GR3017973T3 (ja) |
| HU (1) | HU218102B (ja) |
| NZ (1) | NZ242707A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5369025A (en) * | 1991-06-28 | 1994-11-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease |
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| EP0750670A1 (en) * | 1994-02-07 | 1997-01-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Compositions useful in controlling marek's disease |
| FR2728794B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro |
| US6475770B1 (en) | 1997-06-10 | 2002-11-05 | Pfizer, Inc. | Processes for preparation of Marek's Disease using continuous mammalian cell lines |
| US7314715B2 (en) | 2001-06-14 | 2008-01-01 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| CN103370079B (zh) * | 2010-10-18 | 2016-08-10 | 英特维特国际股份有限公司 | 针对家禽中禽流感的火鸡疱疹病毒作为载体的疫苗 |
| CN114540312B (zh) * | 2022-03-16 | 2023-03-24 | 河南省农业科学院 | 一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用 |
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|---|---|---|---|---|
| EP0658623A3 (en) * | 1987-07-27 | 1995-09-27 | Syntro Corp | Attenuated herpes viruses, herpes viruses that contain foreign DNA encoding an amino acid sequence, and vaccines containing them. |
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- 1992-04-28 CA CA002067469A patent/CA2067469C/en not_active Expired - Lifetime
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- 1992-05-13 EP EP92201357A patent/EP0513921B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1992-05-13 DE DE69203950T patent/DE69203950T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-13 AT AT92201357T patent/ATE126274T1/de active
- 1992-05-13 HU HU9201590A patent/HU218102B/hu unknown
- 1992-05-14 JP JP12227292A patent/JP3375347B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-05-24 US US08/067,416 patent/US6051404A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-11-07 GR GR950403083T patent/GR3017973T3/el unknown
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