HU218102B - Rekombináns vakcinák Marek-féle betegség ellen - Google Patents
Rekombináns vakcinák Marek-féle betegség ellen Download PDFInfo
- Publication number
- HU218102B HU218102B HU9201590A HU9201590A HU218102B HU 218102 B HU218102 B HU 218102B HU 9201590 A HU9201590 A HU 9201590A HU 9201590 A HU9201590 A HU 9201590A HU 218102 B HU218102 B HU 218102B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polypeptide
- acid sequence
- nucleic acid
- virus
- mdv
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 title claims description 30
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title claims description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 63
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 81
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 80
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 79
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 53
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 43
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 241001466941 Maryland calicivirus 6 Species 0.000 claims description 11
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 abstract description 52
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 15
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 14
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 20
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 13
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 11
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 11
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- 108050002093 Haemagglutinin-neuraminidases Proteins 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001664469 Tibicina haematodes Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000000676 anti-immunogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- -1 erythrocyte Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000001268 lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány a Marek-féle betegségvírus MD06-proteint kódolónukleinsavszekvenciájával foglalkozik. Ez a fehérje felhasználhatóbaromfiak MDV-fertőzése vagy betegsége elleni immunizálására. Az MD06MDV-fehérjét kódoló nukleinsavszekvencia felhasználható a fehérjerekombináns DNS-technikákkal történő előállítására vagy vektorvakcinákkészítésére. ŕ
Description
A találmány tárgya rekombináns vakcinák Marek-féle betegség ellen.
A találmány a Marek-féle betegség vírusának egy polipeptidjét kódoló nukleinsavszekvenciával, egy ilyen nukleinsavszekvenciát magában foglaló rekombináns nukleinsavmolekulával, egy ilyen nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorvírussal, egy ilyen nukleinsavszekvenciával transzformált gazdasejttel, egy, a Marek-féle betegség vírusának polipeptidjével és ezen polipeptiddel reagáló ellenanyagokkal, valamint a Marek-féle betegség elleni vakcinával foglalkozik.
A Marek-féle betegség (MD) a háziszámyasok rosszindulatú, limfoproliferatív elváltozással járó betegsége, melyet egy herpeszvírus, a Marek-féle betegség vírusa (MDV) okoz. Az MD általánosan elterjedt betegség, világszerte előfordul a baromfitermelő országokban. Intenzív termelési rendszerben nevelt csirkéknél az MD elkerülhetetlen veszteségeket okoz. Az MD körülbelül 6 hetes kortól érinti a csirkéket, leggyakoribb előfordulása a 12-24 hetes korra esik.
Klinikailag az MD három formája ismeretes: a klasszikus MD, a heveny MD és az átmeneti bénulás.
A klasszikus MD-t a limfoid beszűrődés és a mielin hüvely pusztulása által okozott perifériás idegmegvastagodás jellemzi, és fő klinikai tünete a bénulás. Az elhullás mértéke változó, de általában 10-15% alatti.
A heveny formában a zsigeri szervekben gócos és diffúz limfomatózus daganatok találhatók. Az MD ezen formájában az elhullás általában magasabb, mint a klasszikus formában. Vakcinázatlan állományokban az elhullás gyakran 10-30%-ban fordul elő, és számolhatunk az állomány 70%-át érintő járványkitöréssel. A kórbonctani leletek mind a klasszikus, mind a heveny formában lényegében hasonlóak, malignusan transzformált T-limfoblasztok szűrik át a szöveteket, a klasszikus formában a perifériás idegeket, a heveny formában a zsigeri szerveket.
Az MDV-ről kimutatták továbbá, hogy felelős a fiatal csirkék agyvelőgyulladásáért, amelyre a hirtelen bénulás jellemző.
Az MDV-vel kapcsolatos vírusok szerológiai csoportosítása három szerotípust eredményezett:
I. típus: az MD természetben előforduló virulens törzsei, amelyek csirkékben patogének, és daganatot képeznek, és az azokból származó attenuált, nem patogén törzsek;
II. típus: az MDV természetben előforduló, nem patogén törzsei;
III. típus: a pulykák herpeszvírusa („HVT”), amely csirkékben nem patogén.
Úgy találták, hogy az I. szerotípusú MDV patogén törzseinek sorozatos passzálása a kórokozó képesség és daganatképző képesség, de nem az immunogenitás elvesztését eredményezi. A HPRS-16- és CVI-988törzsből származó gyengített törzseket alkalmazták vakcinaként. Az SB-I-, és HN-I-törzsek (II. szerotípus) szintén hasznosnak bizonyultak vakcinázásra. Az először pulykákból izolált HVT nem kórokozó pulykákra és házimadarakra nézve, antigén szerkezete rokon az
I. és II. szerotípusú MD-vírusokéval, és kiterjedten alkalmazzák MD elleni vakcinaként.
Az MD kezelésére nincsenek módszerek, a betegség leküzdése a növekvő csirkéknek a fertőzés vagy betegség forrásától való elkülönítését célzó szervezési módszereken, genetikailag ellenálló állomány biztosításán és vakcinázáson alapul. A szervezési eljárások azonban rendszerint nem kifizetődőek, a genetikailag ellenőrzött, fokozott ellenállással rendelkező baromfiállományok szelekcióját illetően pedig az fejlődés csalódást okozott. Napjainkban a betegség leküzdése csaknem kizárólag a vakcinázáson alapul.
A jelenlegi vakcinák kémiailag ínaktivált vírusvakcinák vagy módosított élővírus-vakcinák. Az inaktivált vakcinák azonban további immunizálást követelnek meg, hátrányukra adjuvánst tartalmaznak, előállításuk költséges, és beadásuk munkaigényes. Továbbá, néhány fertőző vírusrészecske túlélheti az inaktivációs eljárást, és ezek betegséget okozhatnak az állatba való beadás után.
Általában a gyengített vírusvakcinák kedveltek, mivel gyakran mind humorális, mind celluláris reakcióra épülő immunválaszt váltanak ki. Mostanáig ilyen
1. szerotípusú MDV-törzseken alapuló vakcinákat a virulens törzsek szövettenyészeten való sorozatos passzázsával lehetett csak előállítani. E kezelés következtében azonban ellenőrizhetetlen mutációk jönnek létre a vírusgenomban, virulencájukat és immunizáló sajátságaikat illetően a vírusrészecskék heterológ populációját eredményezve. A szövettenyészeten való passzálások során bekövetkező túlgyengítés is probléma lehet ezeknél a vakcináknál. Kényes egyensúlyban kell biztosítani, hogy a vakcina ne legyen virulens, miközben védő hatása megmarad. Jól ismert továbbá, hogy a hagyományosan gyengített vírusvakcinák virulenciája visszaalakulhat, így a beoltott állatok megbetegedését, és a kórokozónak más állatokra való terjedését okozhatják. Mostanában igen virulens mezei MD-vírustörzsek előfordulását jelentették, amelyek ellen az élő HVT-vakcinák gyenge védettséget nyújtanak. Ezek nagyarányú veszteségekért felelősek a világ különböző részein. Bizonyos esetekben a II. szerotípusú és III. szerotípusú törzsekből álló bivalens vakcinák megfelelően hatásosak igen virulens mezei izolátumokkal szemben. I. szerotípusú antigéneket tartalmazó multivalens vakcináknak még hatásosabbaknak kell lenniük az ezen nagyon virulens izolátumokkal szembeni immunválasz kiváltásában.
Feltételezhető, hogy a rekombináns DNS-technológiára építve fejlettebb vakcinák állíthatók elő. Ezek a vakcinák csak az MDV-kórokozó ellen védő, immunválaszt kiváltani képes, szükséges és releváns MDV-immunogén anyagot vagy az említett anyagot kódoló genetikai információt tartalmaznák, és nem mutatnák az élő vagy inaktivált vakcinák fent említett hátrányos tulajdonságait.
A találmány értelmében MD06 jelű MDV-protein egy vagy több immunogén determinánsát hordozó, és a
2. szekvenciaábrán bemutatott vagy ennek funkcionális variánsa aminosav-szekvenciájával rendelkező poli2
HU 218 102 Β peptidet kódoló izolált és tisztított nukleinsavszekvenciát állítottunk elő, amely baromfiak MDV fertőzés vagy -betegség elleni immunizációjára szolgáló vakcina előállítására használható.
Az MD06 polipeptidet kódoló gén az egyedi hosszú („unique long”; UL) szakasz és a belső ismétlődő szerkezeti elem („internál repeat structural element”; IRL) találkozásához közel található az MDV-genomban, és egy körülbelül 290 aminosav hosszúságú polipeptidet kódol, ami megfelel 32 kD számított molekulatömegnek.
A „nukleinsavszekvencia” fogalmán nukleotidok bármely hosszúságú polimerizált formáját értjük, mind ribonukleinsav, mind dezoxiribonukleinsav-szekvenciákat. Az elnevezés lényegében a molekula elsődleges szerkezetére utal. így az elnevezés mind a kettős és egyszálú DNS-re, mind a kettős és egyszálú RNS-re és ezek módosulataira vonatkozik.
Általánosságban, a „polipeptid” fogalom aminosavak biológiai aktivitással rendelkező molekulaláncára utal, nem utal meghatározott hosszúságú termékre, és kívánság szerint in vivő vagy in vitro módosítható, például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel; így többek között peptideket, oligopeptideket és proteineket foglal magában.
Az „egy vagy több immunogén determinánssal rendelkező MDV-protein” fogalma egy vagy több, baromfiban MDV-fertőzés vagy -betegség ellen immunválaszt kiváltani képes epitóppal rendelkező polipeptidre utal.
A találmány tárgykörébe tartoznak a 2. szekvenciaábrán bemutatott polipeptid funkcionális variánsát kódoló nukleinsavszekvenciák is. Ezek a funkcionális variánsok a 2. szekvenciaábrán konkrétan bemutatott aminosav-szekvenciából származtatott aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidek, amelyek megtartják az MDV-protein - vagyis az említett egy vagy több epitóppal rendelkező variáns, amely képes baromfiakban MDV-fertőzés vagy -betegség ellen immunválaszt kiváltani - egy vagy több immunogén determinánsát.
Természetesen az itt ismertetett, I. szerotípusú GAtörzsből nyert polipeptidhez képest egyes vírusok vagy Marek-féle betegségtörzsek esetén természetes variációk létezhetnek. Ezek a variációk a teljes szekvencián belül aminosavkülönbségekkel, -deléciókkal, -szubsztitúciókkal, -inszerciókkal, -inverziókkal vagy aminosavaddíciókkal jellemezhetők. Leírtak olyan aminosavszubsztitúciókat, amelyek várhatóan nem változtatják meg alapjaiban a biológiai és immunológiai aktivitást. Rokon aminosavak közötti helyettesítések vagy olyan helyettesítések, amelyek gyakran fordulnak elő az evolúció során, többek között a Ser/Ala, Ser/Gly-, Asp/Gly-, Asp/Asn-, Ile/Val-helyettesítések (lásd Dayhof, M. D.: Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Rés. Found., Washington D. C., 1978, 5. kötet, 3. kiég.). Erre az információra alapozva fejlesztett ki Lipman és Pearson egy gyors és érzékeny protein-összehasonlításra és homológ polipeptidek közti funkcionális hasonlóság megállapítására szolgáló módszert [Science, 227, 1435-1441 (1985)]. Az ilyen homológ, funkcionális változatokat kódoló nukleinsavszekvenciák szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
Ezenfelül fennáll a lehetősége annak, hogy rekombináns DNS-technológia felhasználásával ezeket a különböző funkcionális változatokat kódoló nukleinsavszekvenciákat előállítsuk.
A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák olyan MDV-törzsizolátumokból nyerhetők, mint a GA, JM, HPRS-16, Conn A, RB-IB, CVI-988 vagy Md 11, ezek közül a GA-törzs [Edison és Schnitte, Avian Diseases, 72,467 (1968)] a legelőnyösebb.
Ezenkívül az MD06-polipeptidet vagy ennek fent említett funkcionális változatait kódoló nukleinsavszekvenciák a II. szerotípushoz vagy III. szerotípushoz tartozó MDV-törzsekből, például HN-, HPRS-24-, SB-1-, vagy FC126-törzsekből is nyerhetők.
Az 1. és 2. szekvenciaábrán megadott információk alapján egy, a szakmában járatos személy a fent említett, konkrétan bemutatott MD06 jelű MDV-proteinnek megfelelő immunológiai sajátságokkal rendelkező, különböző funkcionális variáns polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciák izolálását és azonosítását meg tudja valósítani. Erre a célra az általánosan alkalmazott Southern biot technika vagy a telephibridizációs technika használható [Experiments in Molecular Biology, ed.: R. J. Slater, Clifton, U.S.A., 1986; Singer-Sam, J. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 802-806 (1983); Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989]. Például úgy járhatunk el, hogy az adott MDV-törzsből származó restrikciós endonukleázzal emésztett DNS-darabokat elektroforetizáljuk, és ezután egy darab nitro-cellulóz szűrőre visszük vagy „blottoljuk”. így lehetővé válik, hogy a szűrőn a funkcionális variáns polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciákat úgy azonosítsuk, hogy a 2. szekvenciaábrán bemutatott aminosav-szekvencia alapján kikövetkeztetett, jelölt DNS-fragmentumhoz vagy „próbához” meghatározott olyan körülmények, így megfelelő sókoncentráció és hőmérséklet mellett hibridizáljuk, amelyek lehetővé teszik, hogy a próba a szűrőn található bármely homológ DNS-szekvenciához hibridizáljon. A szűrő mosása után a hibridizált anyag autoradiográfiával mutatható ki. Miután azonosítottuk a megfelelő szekvenciát, a 2. szekvenciaábrán bemutatott polipeptid funkcionális variáns polipeptidjét kódoló DNS-szakasz visszanyerhető agarózgél-elektroforézis után.
Eljárhatunk úgy is, hogy MDV cDNS-t lambdagtl 1 fágba klónozunk, amint azt Huynh és munkatársai leírták [D. Glover (szerk.), DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press Oxford, 49-78 (1985)], és baktérium-gazdaszervezetben expresszáljuk. A rekombináns fágok azután a 2. szekvenciaábrán bemutatott tisztított MD06 MDV-protein ellen termelt poliklonális szérummal átvizsgálhatok, meghatározva a megfelelő immunológiai szakaszok jelenlétét a különböző polipeptidekben. A fent említett eljárást az 1. példában ismertetjük. Az MD06 MDV-protein ellen termelt, itt használt poliklonális szérum előállítását az alábbiakban ismertetjük.
A találmány szerinti nukleinsavszekvencia adott MDV-törzsből izolálható, és rekombináns DNS-techni3
HU 218 102 Β kák segítségével, ideértve a polimeráz láncreakció(PCR) technikát, megsokszorozható vagy a gyakorlatban ismert technikák felhasználásával kémiailag szintetizálható.
A találmány szerint előnyös nukleinsavszekvencia azzal jellemezhető, hogy az 1. szekvenciaábrán bemutatott DNS-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza.
Amint az a gyakorlatból jól ismert, a genetikai kód degeneráltsága lehetővé teszi a kodonban bázisok szubsztitúcióját úgy, hogy más, de ugyanazon aminosavat kódoló kodont eredményezzen, így például a glutaminsavat mind a GAT-, mind a GAA-kodon kódolja. Következtetésképp nyilvánvaló, hogy a 2. szekvenciaábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid expressziójához felhasználható olyan nukleinsavszekvencia is, amely ilyen, az említett 1. szekvenciaábrán bemutatott nukleinsavszekvenciától különböző, alternatív kodon-összeállítással rendelkezik.
A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá a konkrétan bemutatott MD06 MDV-proteint vagy ennek funkcionális változatát kódoló nukleinsavszekvencia ffagmensei is.
A „fragmens” fogalmán olyan DNS- vagy aminosav-szekvenciát értünk, amely a találmány szerinti nukleinsavszekvenciának vagy -polipeptidnek a szubszekvenciáját tartalmazza. Az említett fragmens egy olyan polipeptid vagy azt kódolja, amely az MD06 MDV-protein egy vagy több immunogén determinánsát hordozza, vagyis az MD06-protein egy vagy több, baromfiakban immunválaszt kiváltani képes epitópjával rendelkezik. A felhasználható polipeptidfragmensek meghatározására szolgáló módszereket az alábbiakban vázoljuk. Fragmensek többek között előállíthatok a prekurzor molekula enzimatikus hasításával, restrikciós endonukleázokat használva a DNS-hez és proteázokat a polipeptidekhez. Más módszerek a ffagmensek kémiai szintézisét vagy DNS-fragmens által a polipeptidfragmensek expresszióját foglalják magukban.
A találmány tárgykörébe tartoznak mindazon módosítások, amelyek a konkrétan bemutatott polipeptid fent említett funkcionális változatait eredményezik, amennyiben a kapott polipeptidek megőrzik az MD06 MDV-protein egy vagy több immunogén determinánsát.
A találmány szerinti nukleinsavszekvencia különböző, olyan replikációt befolyásoló DNS-szekvenciákhoz kapcsolható, amelyekkel a természetben nem asszociál vagy nem kapcsolódik úgynevezett rekombináns vektormolekulát eredményezve, amely alkalmas gazdaszervezet transzformációjára felhasználható. Alkalmazható rekombináns vektormolekulák előnyösen például plazmidokból, bakteriofágokból, kozmidokból vagy vírusokból nyerhetők.
A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák klónozására felhasználható specifikus vektorok ismertek a gyakorlatból, és többek között ide tartoznak a plazmidvektorok, mint például a pBR322-, a különféle pUC-, pGEM- és Bluescript-plazmidok, -bakteriofágok, például lambda-gt-Wes-lambda B, Charon 28 és az M13 eredetű fágok vagy vírusvektorok, mint az SV40, adenovírus vagy poliomavírus [lásd Rodriquez, R. L. és D. T. Denhardt, ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J. A. és munkatársai, Arch. Virol. 110, 1-24 (1990)]. A találmány szerinti rekombináns nukleinsavmolekulák konstrukciójához használható módszerek ismertek az általános szakmai gyakorlattal rendelkezők számára, és többek között le vannak írva a Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás; Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) irodalmi helyen.
Például a találmány szerinti nukleinsavszekvencia a klónozásra használt vektorba egyszerűen inszertálható úgy, hogy mind a gént, mind a kívánt klónozási hordozót ugyanazzal a restrikciós enzimmel (enzimekkel) hasítjuk, mivel így komplementer DNS-végeket képezünk.
Más esetekben szükség lehet a restrikciós helyek módosítására, hogy tompa végeket képezzünk, vagy az egyszálú DNS leemésztésével, vagy az egyszálú végeknek megfelelő DNS-polimerázzal való feltöltésével. Ezután elvégezhető a tompa végek ligálása olyan enzimmel, mint például a T4 DNS-ligáz.
Kívánt esetben előállítható bármely DNS-restrikciós felismerőhely-linkereknek a DNS-végekhez való kapcsolásával. Ilyen linkerek tartalmazhatnak restrikciós enzimfelismerőhely-szekvenciákat kódoló specifikus oligonukleotid-szekvenciákat. A restrikciós enzimmel elvágott vektor és nukleinsavszekvencia homopolimer végekkel is módosítható.
A „transzformáció” fogalma heterológ nukleinsavszekvenciának a gazdasejtbe való bejuttatására vonatkozik, függetlenül az alkalmazott módszertől, például direkt felvétel vagy transzdukció. A heterológ nukleinsav-szekvencia fennmaradhat autonóm replikáció útján, vagy másképp integrálódhat a gazdagenomba. A rekombináns DNS-molekulák szükség szerint az adott gazdával kompatibilis, megfelelő kontrollszekvenciákkal láthatók el, amelyek az inszertált nukleinsavszekvencia expresszióját szabályozni képesek. Mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből nyert sejtkultúrák is felhasználhatók gazdaként.
A találmány szerinti rekombináns nukleinsavmolekulák előnyösen egy vagy több markeraktivitást tartalmaznak, amelyek felhasználhatók a kívánt transzformánsok szelektálására, ilyen például az ampicillin-, és tetraciklinrezisztencia a pBR322-ben és ampicillinrezisztencia, valamint béta-galaktozidáz-aktivitás a pUC8-ban.
Az alkalmas gazdasejtek a prokariota vagy eukariota sejtek, amelyek polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciával vagy ilyen nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns vektormolekulával transzformálhatok, és amelyek kívánt esetben felhasználhatók az említett nukleinsavszekvencia által kódolt, említett polipeptid expressziójára. A gazdasejt lehet prokariota eredetű, például baktérium, úm. Escherichia coli, Bacillus subtilis és Pseudomonas fajták; vagy eukariota eredetű, mint élesztők, például Saccharomyces cerevisiae, vagy magasabb rendű eukariota sejtek, mint a rovar-, növény- vagy emlőssejtek, beleértve a HeLa-sejteket és kí4
HU 218 102 Β naihörcsögovárium- (CHO) sejteket. Rovarsejtek közé tartozik a Spodoptera frugiperda Sf9 sejtvonal [Luckow és munkatársai, Biotechnology, 6, 47-55 (1988)]. A találmány szerinti nukleinsavszekvenciáknak eukariota klónozási rendszerekbe való klónozására és expressziójára vonatkozó információk megtalálhatók Esser, K. és munkatársai (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986) kiadványában.
Általánosságban elmondhatjuk, hogy előnyösen prokarioták használhatók a találmány szempontjából hasznos, DNS-szekvenciák klónozására szolgáló vektorok konstrukciójánál. Például különösen alkalmas az E. coli K12. Egyéb felhasználható mikrobák közé olyan E. coli-törzsek tartoznak, mint a DH5-alfa vagy a JM101.
A találmány szerinti nukleinsavakat expresszió céljából expressziós vektorba ligáljuk, azaz az említett szekvenciákat működőképesen expressziós kontrollszekvenciákhoz kapcsoljuk. Ilyen kontrollszekvenciák lehetnek a promoterek, enhancer (erősítő) szekvenciák, operátorok, indukálószekvenciák, riboszóma-kötőhelyek stb. A találmány értelmében tehát olyan rekombináns vektormolekulát állítunk elő, amely az MD06 MDV-proteint kódoló nukleinsavszekvenciát expressziós kontrollszekvenciákhoz működőképesen kapcsolva tartalmazza, és amely transzformált gazdasejt(ek)ben képes a benne foglalt DNS-szekvenciák expressziójára.
Természetesen magától értetődik, hogy a klónozási vektor kiválasztott helyére inszertált nukleotidszekvenciák tartalmazhatnak olyan nukleotidokat, amelyek nem képezik részét a kívánt polipeptid aktuális struktúrgénjének, vagy tartalmazhatják a kívánt polipeptid teljes struktúrgénjének csupán egy részét, amennyiben a transzformált gazdaszervezet az MD06 MDV-protein egy vagy több immunogén determinánsát hordozó polipeptidet termel.
Amennyiben a gazdasejtek baktériumok, az alkalmazható expressziós kontrollszekvenciák illusztratív példái a Trp-promoter és -operátor [Goeddel és munkatársai, Nucl. Acids. Rés., 8, 4057 (1980)]; a lac-promoter és -operátor [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978)]; a külső membránprotein promoter [Nakamura, K. és Inouge, Μ., EMBO J. 7, 771-775, (1982)]; a lambda bakteriofág-promoterek és -operátorok [Remaut, E. és munkatársai, Nucl. Acids. Rés., 77, 4677-4688 (1983)]; az alfa-amiláz-, (B. subtilis) promoter és -operátor, terminátor-szekvencia és egyéb, a választott gazdasejttel kompatibilis, expressziót fokozó és kontrollszekvenciák. Ha a gazdasejt élesztő, az alkalmazható expressziós kontrollszekvenciák illusztratív példája az alfa szaporodási („mating”) faktor. Rovarsejtek esetében a polihedrin vagy a baculovírusok plO-promotere használható [Smith, G. E. és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 2156-2165 (1983)]. Ha gazdasejt emlős eredetű, az alkalmazható expressziós kontrollszekvenciák illusztratív példái az SV40-promoter [Berman, P. W. és munkatársai, Science, 222, 524-527 (1983)] vagy például metallotionein promoter [Brinster, R. L., Natúré, 296, 39-42 (1982)], vagy egy hősokkpromoter [Voellmy és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53 (1985)]. Alternatívaként az MDV-ben jelen levő expressziós kontrollszekvenciák, különösen az MD06-protein expresszióját szabályozók ugyancsak használhatók. A génexpresszió maximalizálására lásd még Roberts és Lauer leírását [Methods in Enzymology, 68,473 (1979)].
A találmány tehát kiteljed egy nukleinsavszekvenciával vagy a fent leírt rekombináns expressziósvektor-molekulával transzformált gazdasejt(ek)re is, amelyek) a nukleinsavszekvenciák expressziója révén az MD06 MDV protein termelésére képes(ek).
A találmány értelmében előállítunk továbbá egy, a 2. szekvenciaábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező, az MD06 MDV-proteinnek vagy funkcionális változatának egy vagy több, immunogén determinánsát hordozó tisztított polipeptidet, amely alapvetően mentes az egész vírustól vagy más fehérjéktől, amelyekkel egyébként asszociálódik.
Értelemszerűen az említett aminosav-szekvenciák származékai, amelyek alapvetően azonos immunológiai sajátságokat mutatnak, vagyis funkcionális változatok, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A MD06-polipeptid itt ismertetett funkcionális változatai körébe tartoznak az egyéb, I. szerotípusú MD-vírustörzsekben (vagy II. vagy III. szerotípusú törzsekhez tartozó vírusokban) jelen levő megfelelő polipeptidek is. Az említett ekvivalensek előállíthatok az ekvivalenseket kódoló gének expressziójával, a géneknek az itt ismertetett információ felhasználásával történő azonosításával és izolálásával, amint azt a fentiekben ismertettük.
Emellett a baromfiak MDV-fertőzés vagy -betegség elleni immunizálására vagy diagnosztikai célra felhasználható, az MD06 MDV-protein immunválaszt kiváltó fragmensét lényegében tartalmazó polipeptid is a jelen találmány tárgykörébe tartozik. Különböző módszerek ismertek ilyen alkalmas polipeptidfragmensek kimutatására az aminosavszekvencián belül.
A találmány szerinti polipeptid megfelelő, immunkémiailag aktív epitópot (epitópokat) hordozó polipeptidfragmense kimutatására szolgáló módszert ismertetnek a WO 86/06487 számon közrebocsátott PCT szabadalmi bejelentésben Geysen Η. M. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 3998-4002 (1984)], Geysen Η. M. és munkatársai [J. Immunoi. Meth., 102, 259-274 (1987)], amely az úgynevezett „pepscan”- módszeren alapul, amelyben a vizsgálat tárgyát képező komplett polipeptid-szekvencia részleteinek megfelelő, részleges átfedéssel rendelkező polipeptidek sorozatát szintetizálják, és azok ellenanyagokkal szembeni reaktivitását vizsgálják.
Továbbá, elméleti meggondolások, és a már ismert epitópokkal való szerkezeti egyezés alapján epitópoknak nevezhetjük a polipeptid számos, az említett aminosav-szekvenciával rendelkező szakaszát. Ezeknek a szakaszoknak a meghatározása a Hopp és Woods szerinti hidrofilitási kritérium [Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 3824-3828 (1981)] és Chou és Fasman másodlagos szerkezetre vonatkozó megállapításainak [Advances in Enzymology, 47, 45-148 (1987)] kombinációján alapul.
HU 218 102 Β
Az esetleg szükséges T-sejt-epitópok elméleti alapon hasonló módon származtathatók Berzofsky amfifilitási kritériuma segítségével [Science, 235, 1059-62 (1987)].
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a fent említett nukleinsavszekvencia által meghatározott aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet használunk.
Baromfiak MDV-fertőzés elleni immunizálása elérhető például az állatoknak a találmány szerinti polipeptid immunológiailag releváns körülmények között való beadásával, úgynevezett alegységvakcina formájában. A találmány szerinti alegységvakcina tartalmazhat tiszta formában egy polipeptidet, adott esetben egy gyógyszertanilag elfogadható vivőanyag jelenlétében. A polipeptidet adott esetben kovalensen köthetjük egy idegen proteinhez, amely például előnyös lehet a fúziós termék tisztításánál. Ilyenek például a béta-galaktozidáz, a protein-A, prokimozin, véralvadási faktor-Xa stb.
Néhány esetben ezen polipeptidek ellen kapott neutralizációs ellenanyagok szintje alacsony lehet. A kisebb ffagmenseket immunogenitásuk fokozása érdekében lehetőleg hordozómolekulákhoz kapcsoljuk. A célnak megfelelő hordozók a makromolekulák, mint például természetes polimerek (fehéijék, mint például a kürtőscsiga-hemocianin, -albumin, -toxinok), szintetikus polimerek, mint például a poliaminosavak (polilizin, polialanin) vagy amfifilvegyületekből, például szaponinokból képzett micellák. Alternatívaként ezek a fragmensek önmaguk polimerjeiként is előállíthatok, célszerűen mint lineáris polimerek.
Az ilyen alegységvakcinákban használatos polipeptidek a gyakorlatban jól ismert módszerek szerint nyerhetők, például az MDV-ből való izolálással, rekombináns DNS-technikával vagy kémiai szintézissel. A találmány szerinti vakcina céljára használható polipeptidek szükség szerint módosíthatóak in vitro vagy in vivő, például glikozilezéssel, amidálással vagy foszforilezéssel.
Az alegységvakcinák alternatívái az élővektor-vakcinák. A találmány szerinti nukleinsavszekvenciát rekombináns DNS-technikák segítségével egy mikroorganizmusba juttatjuk (például baktériumba vagy vírusba) oly módon, hogy a rekombináns mikroorganizmus szaporodásra, így a beültetett nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptid expresszálására és a fertőzött gazdaállatban immunválasz kiváltására képes legyen.
A találmány egy előnyös megvalósítási formája egy vektorvírus, amely egy, a fent leírt heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmazza, és azt képes kifejezni (egy) gazdasejt(ek)ben vagy a rekombináns vektorvírussal fertőzött gazdaállatban. A „heterológ” kifejezés arra utal, hogy a találmány szerinti nukleinsavszekvencia a vektorvírusban normál körülmények között a természetben nem fordul elő, vagy nem azonos genetikai összefüggésben, mint a természetben előforduló vektorvírusban.
A találmány tárgya továbbá rekombináns vektorvírussal fertőzött gazdasejt(ek) vagy sejttenyészet, amelyek) a nukleinsavszekvencia expressziója révén az MDV-protein termelésére képes(ek).
A heterológ nukleinsavszekvencia, például a találmány szerinti nukleinsavszekvencia vektorvírusgenomba való bejuttatására használható a jól ismert in vivő homológ rekombinációs technika.
Először a vektorgenom inszerciós régiójának megfelelő DNS-szakaszt, vagyis egy olyan szakaszt, amely a heterológ szekvencia beépítésére felhasználható anélkül, hogy a vektor olyan létfontosságú funkcióit megszüntetnénk, amelyek például a fertőzéshez vagy szaporodáshoz szükségesek, standard rekombináns DNS-technikával a klónozáshoz használt vektorba építjük be. Inszerciós régiókat számos mikroorganizmussal kapcsolatban leírtak (például EP 80 806, EP 110 385, EP 83 286 és EP 314 569 számon közrebocsátott európai, valamint WO 88/02022 és WO 88/07088 számon közrebocsátott PCT szabadalmi bejelentések).
Másodszor, kívánt esetben az első lépésben nyert rekombináns DNS-molekulában jelen levő inszerciós szekvencia törölhető. Ez például az első lépésben kapott rekombináns DNS-molekula megfelelő exonukleáz III emésztésével vagy restrikciós enzimes kezeléssel érhető el.
Harmadszor, a heterológ nukleinsavszekvenciát az első lépésben kapott, rekombináns DNS-molekulában jelen levő inszerciós régióba vagy az említett rekombináns DNS-molekulából törölt DNS helyére építjük be. Az inszerciós régió DNS-szakaszának elegendő hosszúságúnak kell lennie, hogy lehetővé tegye a vektorgenommal való homológ rekombinációt. Ezután megfelelő sejtek fertőzhetők a vad típusú vektorvírussal, vagy transzformálhatok a vektor genomiális DNS-ével a rekombináns DNS-molekula jelenlétében, amely tartalmazza a megfelelő vektor-DNS-szekvenciával határolt inszertet, miáltal a rekombináns DNS-molekulában és a vektorgenomban lévő régiók között a rekombináció létrejöhet. Ily módon rekombináns vektorutódok állíthatók elő sejtkultúrában, és például genotípusos vagy fenotípusos jegyek alapján szelektálhatok, például hibridizációval, a heterológ nukleinsavszekvenciával együtt beépült gén által kódolt enzim aktivitásának meghatározásával vagy immunológiai módszerrel detektálva a rekombináns vektor által expresszált antigén-szerkezetileg heterológ polipeptidet.
A következő lépésben ezek a rekombináns mikroorganizmusok immunizálás céljából beadhatók a gazdaállatnak, ahol valameddig fennmaradnak, vagy még szaporodnak is a beoltott állat szervezetében, in vivő expresszálva a találmány szerinti, inszertált nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptidet, a beoltott állat immunrendszerének stimulációját eredményezve. A találmány szerinti nukleinsavszekvencia beépítésére alkalmas vektorok nyerhetők olyan vírusokból, mint a (madár-) himlővírusok, például a vakcíniavírus vagy baromfihimlő-vírus (EP 314 569 és WO 88/02022), herpeszvírusok, például a Marek-féle betegség vírusainak vakcinatörzsei, mint a HVT (WO 88/07088), vagy az I., illetve II. szerotípusú MDV-törzsek; adenovírus vagy influenzavírus, vagy olyan baktériumokból, mint az E. coli vagy bizonyos Salmonella-fajok. Ezek a vektorok megtervezhetők oly módon, hogy a polipeptidet a
HU 218 102 Β gazdaállat immunrendszere hatékonyan felismerje. Ebben az összefüggésben elképzelhető az említett polipeptidnek szintetikus szignál-, és horgonyszekvenciákkal vagy egyéb vírus vagy bakteriális kórokozó antigénjével, például a Newcastle-féle betegségvírus hemagglutinin-neuraminidáz proteinjével alkotott fúziói. Lehetséges az is, hogy kívánt esetben az immunválaszt kiváltó polipeptid egy nagyobb egész részeként az immunizálandó állatban kiszabadul. Mindezekben az esetekben lehetséges, hogy egy vagy több immunválaszt kiváltó termék expresszálódjék, amely különböző patogének és/vagy egy adott patogén különböző antigénjei ellen vált ki immunválaszt.
A találmány szerinti vakcina előállítható a találmány szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorvírussal fertőzött gazdasejt tenyészetéből, ahonnan a vírust tartalmazó sejtek és/vagy a sejtekben szaporodott vektorvírusok lehetőség szerint tiszta formában összegyűjthetők. Egy vektorvakcina előállításának egy másik lehetősége, hogy a találmány szerinti nukleinsavszekvenciát fertőzőképes baktériumba vagy parazitába juttatjuk, és az ilyen módosított fertőző ágenst tenyésztjük. Azok összegyűjtése után lehetőség szerint tisztított és liofilizált formában, vakcina készíthető.
A rekombináns vektormolekulával a találmány szerint transzformált gazdasejtek tenyészthetőek olyan körülmények között is, amelyek az említett nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptid expressziója szempontjából kedvezőek. Vakcinák előállíthatóak a nyerstenyészetből, gazdasejtlizátumból vagy gazdasejtkivonatból, más megvalósítási mód szerint viszont a polipeptid tisztább formáját állítjuk elő vakcinában való felhasználásra, a felhasználás céljától függően. Az előállított polipeptidek tisztítása céljából a találmány szerinti rekombináns vektorral transzformált gazdasejteket megfelelő térfogatban tenyésztjük, és a polipeptideket a sejtekből vagy a tápfolyadékból izoláljuk, ha azok oda kiválasztódtak.
A tápfolyadékba kiválasztott polipeptidek standard módszerek szerint izolálhatok és tisztíthatok, így például kisózással, centrifugálással, ultraszűréssel, kromatografálással, gélszűréssel, immunaffmitás-kromatográfiával, míg az intracelluláris polipeptidek izolálása esetén először a sejteket összegyűjtjük, roncsoljuk, például ultrahanggal vagy más mechanikai beavatkozással, amilyen a Fench-sajtó, ezt követően elválasztjuk a polipeptideket az egyéb intracelluláris alkotórészektől, és a polipeptidet vakcinává alakítjuk. A sejtek roncsolása megoldható kémiai úton (például EDTA-kezeléssel) vagy enzimatikusan, mint a lizozimmal való emésztéssel.
A találmány szerinti polipeptid ellen termelt ellenanyagok vagy antiszérum potenciálisan felhasználhatók passzív immunterápiában, diagnosztikai immunpróbákban és anti-idiotípusos ellenanyagok előállításában.
A fent jellemzett MD06 MDV-protein használható mind monospecifikus poliklonális, mind monoklonális ellenanyagok előállítására. Ha poliklonális ellenanyag kívánatos, azok előállításának és kezelésének technikái a gyakorlatból ismertek (például Mayer és Walter szerk., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987). Röviden, egy kiválasztott emlősnek, például nyúlnak a fent említett immunogének egyikét, immunizálásonként mintegy 20-80 pg proteint adunk (többször ismételve). Az immunizálást elfogadható adjuvánssal végezzük, általában azonos térfogatú immunogén és adjuváns keverékével oltunk. Elfogadható adjuvánsok közé tartoznak a komplett Freund, az inkomplett Freund, az alum-precipitátum vagy víz-olaj emulziók, míg a kezdő immunizáláshoz a komplett Freund-adjuváns ajánlott. Az emlékeztető oltásokhoz az inkomplett Freund-adjuváns célszerű.
A kezdeti immunizálás körülbelül 1 ml emulziónak több részletben, a hát bőre alá való beadásából áll. Az emlékeztető immunizálásokat azonos mennyiségű immunogén felhasználásával, havonta adjuk, és azokat mindaddig ismételjük, amíg az egyes nyulak szérumában megfelelő ellenanyagszint meg nem jelenik. A gyakorlatból ismert módon vért veszünk, és abból szérumot nyerünk.
Az egyes immunogének elleni monospecifíkus ellenanyagokat úgy állítjuk elő, hogy nyulakat tisztított fehérjékkel, a fentiek szerinti módon immunizálunk, és a nyert polispecifikus antiszérumot affinitástisztításnak vetjük alá Hall és munkatársai [Natúré, 311, 379-387 (1984)] módosított módszere szerint.
Monospecifíkus ellenanyagon egyetlen ellenanyagféleséget vagy a szóban forgó antigénre nézve homogén kötősajátságokkal rendelkező, több ellenanyag-féleséget értünk. Homogén kötődésen az ellenanyag-féleségnek specifikus antigénhez vagy epitóphoz való kötődési képességét értjük.
Az MDV MD06-immunogénnel szembeni reaktív monoklonális ellenanyagok beltenyésztett egereknek, leginkább Balb/c-nek az adott proteinnel való immunizálásával állíthatók elő. Az egereket 0,5 ml, az immunogénnek körülbelül 100 ng-tól 10 pg-ig terjedő dózisával immunizáljuk, a megfelelő adjuváns egyenlő mennyiségével együtt, intraperitoneálisan. Ilyen elfogadott adjuvánsok a komplett Freund, inkomplett Freund, alum-precipitátum és víz-olaj típusú emulziók. Az egereket intravénás emlékeztető immunizálásban részesítjük, az első immunizálás után körülbelül a 14., 21. és a 63. napokon, azonos mennyiségű, adjuvást nem tartalmazó immunogénnel. Az utolsó emlékeztető oltás után körülbelül a harmadik napon az egyes egereket szerológiai módszerekkel teszteljük antiimmunogén ellenanyagok jelenlétére nézve. Az ellenanyag-termelő egerekből lépsejteket izolálunk, és ezeket a gyakorlatban ismert technikák felhasználásával olyan egérmieloma-sejtekkel fuzionáltatjuk, mint az SP-2/0 vagy hasonló [Köhler és Milstein, Natúré, 256, 495-497 (1975)].
Hibridomasejteket szelektálunk hipoxantint, timidint és aminopterint tartalmazó, olyan megfelelő sejttenyésztő folyadékban, mint a Dulbecco szerinti módosított Eagle-médiumban (DMEM) való növekedés alapján. Az ellenanyagot termelő hibridómákat klónozzuk, legáltalánosabban MacPherson lágyagartechnikája felhasználásával (Soft Agár Techniques, Tissue Culture Methods and
HU 218 102 Β
Applications, szerk.: Kruse és Peterson, Academic Press, 276, 1973). Különálló kolóniákat tenyésztő lemez külön lyukaiba viszünk át, megfelelő tenyésztőfolyadékban való szaporítás céljából. Az ellenanyag-termelő sejteket a megfelelő immunogénnel való szűréssel azonosítjuk. Az immunogén pozitív hibridomasejteket a gyakorlatban ismert módszerek szerint tartjuk fenn. Specifikus monoklonális ellenanyagokat a hibridomák in vitro tenyésztésével vagy a gyakorlatban ismert eljárások szerint a hibridomák egerekbe való beadásával, és hasűri folyadék termelésével állítjuk elő.
Antiidiotípus-ellenanyagok azok az immunglobulinok, amelyek egy belső tükörképét hordozzák a patogén azon antigénjének, amely ellen védelmet kívánunk létrehozni, és vakcinában immunogénként felhasználhatók [Dreesman és munkatársai, J. Infect. Disease, 151, 761 (1985)]. Antiidiotípus-ellenanyagok létrehozására szolgáló módszerek a gyakorlatból ismertek [MacNamara és munkatársai, Science, 226, 1325 (1984)].
A találmány szerinti vakcina a szokásos aktív immunizációs séma szerint adható be: az adagolási formával összeegyeztethető módon, egyszeri vagy többszöri beadással és olyan mennyiségben, hogy az profilaktikusan és/vagy terápiásán hatásos és immunogén legyen, azaz az immunizáló antigén vagy az említett antigént expresszálni képes rekombináns mikroorganizmus mennyisége, amely a virulens MDV ellen immunitást hoz létre az állatban. Immunitáson az állatok egy populációjában a vakcinázás után magasabb szintű védettség létrejöttét értjük, a nem immunizált csoporttal összehasonlítva.
Élővírus-vakcinák esetében az egy állatra jutó dózis 1,102 -1,106 fertőzőegység között van.
A találmány szerinti tipikus alegységvakcina 10 pg és 1 mg közötti mennyiségű, találmány szerinti polipeptidet tartalmaz.
A vakcina beadható például intradermálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intravénásán vagy intranazálisan.
A vakcina továbbá tartalmazhat egy vizes közeget vagy vizet tartalmazó szuszpenziót, gyakran egyéb összetevőkkel keverve, például a hatás növelése vagy a lejárati idő növelése érdekében. Ezek az összetevők lehetnek sók, pH-pufferek, stabilizátorok (mint például sovány tej vagy kazein-hidrolizátum), az immunválaszt fokozó emulgeálóadjuvánsok (olajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok és amfipátiás anyagok) és konzerválószerek.
Természetesen a találmány szerinti vakcina tartalmazhat más, a baromfiak egyéb kórokozóira jellemző immmunogéneket vagy azokat kódoló nukleinsavszekvenciákat, mint például a fertőző bronchitis vírusa (IBV), a baromfipestis vírusa (NDV), a fertőző burzabetegség vírusa (IBDV) vagy a Marek-féle betegség vírusa, multivalens vakcina előállítása céljából.
A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá az olyan „immunkémiai reagensek”, amelyek egy, a találmány szerinti polipeptidet tartalmaznak.
Az „immunkémiai reagens” azt jelenti, hogy a találmány szerinti polipeptid megfelelő hordozóhoz van kötve, vagy egy jelölőanyaggal van ellátva.
A felhasznált hordozók lehetnek például mikrokémcső vagy küvetta belső fala, cső vagy kapilláris, membrán, filter, tesztcsík vagy egy részecske felszíne, mint például latexrészecske, vörösvérsejt, festékszemcse, fémszemcse vagy fémvegyületek mint részecskék.
A felhasználható jelölőanyag lehet többek között radioaktív izotóp, fluoreszkáló anyag, enzim, festék, fémszemcse vagy fémkomponens mint részecske.
A találmány szerinti nukleinsavszekvencia specifikus próbák tervezésére is felhasználható, hibridizációs kísérletek céljára, MDV-eredetű nukleinsavak kimutatására bármilyen szövetből.
A találmány egy, az említett nukleinsavszekvenciát tartalmazó, az MDV-fertőzés vagy -betegség diagnózisára felhasználható vizsgálókészletre is vonatkozik.
A találmány egy immunpróbára használható vizsgálókészletre is vonatkozik, amely legalább egy, találmány szerinti immunkémiai reagenst tartalmaz.
A vizsgálókészlet felhasználásakor lezajló immunkémiai reakció célszerűen szendvicsreakció, agglutinációs reakció, kompetíciós reakció vagy inhibíciós reakció.
Szendvicsreakció kivitelezése esetén a vizsgálókészlet tartalmazhatja például szilárd hordozóhoz, például mikrokémcső belső falához kötött formában a találmány szerinti polipeptidet, továbbá vagy a találmány szerinti jelölt polipeptidet vagy jelölt második ellenanyagot.
A találmány szerinti megoldást az alábbi ábrákkal és példákkal szemléltetjük.
A mellékelt 1. ábra a pMDl 1 restrikciós enzim hasítási térképe, ahol a 0,9 kb EcoRI-ffagmens elhelyezkedését jelöltük. Ez a fragmens erős hibridizációt mutatott a pMD06-inszerthez.
A 2. ábra a HVT-genomja Us-régiójának megfelelő DNS-szakasz restrikciósenzim-hasítási térképe. A négy nyitott leolvasási keretből és a köztük lévő, nem kódoló szekvenciákból álló inszerciós régió relatív helyét jelöltük.
A 3. ábra a pVEC04 restrikciós enzim hasítási térképe, amely az LTR-promotert a pMD07 1,2 kb Xhol HVT fragmense egyedi BglII hasítási helyére inszertálva mutatja.
A 4. ábra a pNDV05 restrikciós térképe. A plazmid a pVEC04 BglII hasítási helyére inzertálva tartalmazza a BamHI hasítási helyekkel határolt NDV-HN-gént (lásd 3. ábrát).
Az 5. ábra a pNDVIO restrikciós térképe. A plazmidot a pNDV05-ből kaptuk úgy, hogy az MD06-polipeptidet kódoló 0,9 kb EcoRI-fragmenst a pNDV05nek körülbelül a 3200. bázisánál elhelyezkedő EcoRI hasítási helyére inszertáltuk (lásd. 4. ábrát).
A 6. ábra a pMD58 restrikciós térképe. A plazmidot a pVEC04-ből kaptuk úgy, hogy az MD06-antigént kódoló teljes gént és a nem transzlálódó határolószekvenciákat inszertáltuk. Az 1,0 kb BamHI-fragmensen található gént pMD23-ból (lásd 1. ábrát) izoláltuk PCRamplifikációval.
A 7. ábra a vakcinázási kísérletek eredményét mutatja.
HU 218 102 Β
1. példa
Bakteriális-expressziós könyvtár átvizsgálása rekonvaleszcens csirkeszérummal A könyvtár összeállításához a lambda-gtl 1 [Young,
R. A. és Davis, R. W. Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1194-1198 (1983)] és a lambda-EMBL-3 vektorokat használtuk. A lambda-gtl 1 expressziós vektor genomja egy, a béta-galaktozidáz enzimet kódoló, funkcionális LacZ-gént tartalmaz egy egyedi EcoRI restrikciós hellyel a karboxi-vég közelében. Az MDV-genom szakaszainak e helyre történő inszerciója elvileg egy olyan fehéije expresszióját eredményezi, amely a béta-galaktozidáz egy nagyobb részéhez kapcsolt, az MDV-re jellemző polipeptidből áll. A DNS-fragmensek komplex skáláját képező könyvtárakat nagy sűrűségben vizsgálhatjuk át olyan fúziós fehérjét termelő rekombináns kiónok előfordulására nézve, amelyek egy ellenanyagpróbával, mint például MDV-vel fertőzött madarak szérumával felismerhetők.
Egy, a GA MDV-törzs genomját képviselő könyvtár körülbelül 100 különböző, átlagosan mintegy 18 kb inszert méretű lambda-EMBL-3-rekombinánsból állt. Ezeket a rekombinánsokat a GA MDV-törzzsel fertőzött csirke embrionális fibroblaszt (VCEF) teljes DNStartalmát képviselő fágköny vtár hibridizálásával választottuk ki, MDV-re jellemző szekvenciákat tartalmazó BamHI-plazmidklónok gyűjteményéből álló próbával [Fukuchi és munkatársai, J. Virol., 51, 102 (1984)]. Az amplifikált GA-specifikus EMBL-3-könyvtárból származó DNS-t Alul, Rsal és HaelII restrikciós enzimekkel való részleges emésztéssel daraboltuk. A 0,5 és 0,4 kb közé eső méretű fragmenseket izoláltuk, G-maradékokkal meghosszabbítottuk, és szintetikus adaptáló segítségével a lambda-gt 10-vektor egyedi EcoRI-helyébe inszertáltuk [LeBouc és munkatársai, FEBS lett., 196, 108 (1986); Huynh és munkatársai, Cloning techniques, szerk.: Glover, D., 49-78 (1985)], amely egy 4χ 104 pfii effektív méretű könyvtárat eredményezett.
A fágokat amplifikáltuk, és CsCl-gradiensen tisztítottuk, a DNS-t kivontuk, és az inszerteket EcoRI restrikciós enzimmel visszanyertük. Végül ezeket az inszerteket a lambda-gtl 1-vektor EcoRI hasítási helyéhez kapcsoltuk, és a rekombináns fágokat MDV elleni csirkeszérummal vizsgáltuk.
Ezt a rekonvaleszcens szérumot úgy kaptuk, hogy egytarajú, fehér Leghom-csirkéket (SPAFAS) ATCC VR-624 számon deponált, MDV-ből származó GA5-törzs virulens passzázsával fertőztük. 12 hetes perióduson át szérumot gyűjtöttünk, és a szérummintákat egyenként indirekt immunfluoreszcenciával csirkeembrió-fibroblasztok (CEF) szövettenyészetében vizsgáltuk azok MDV-plakkokhoz való kötődésére.
Titer és fajlagosság alapján a szérumok közül hatot választottunk ki. Ezen szérumminták keverékét használtuk 1:100 hígításban lambda-gtl 1-könyvtár vizsgálatára nitrocellulóz filtereken Young, R. A. és munkatársai módszere szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 2583 (1985)]. A filterek inkubálásához használt második ellenanyag alkalikus foszfatázzal jelölt nyúl anticsirkeszérum (Sigma, St. Louis, USA) volt, és a pozitív jeleket nitro blue tetrazólium 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát színreakcióval hívtuk elő [McGadey, Histochemie, 23, 180 (1970)]. A jelöltek sorozatát választottuk ki, és a rekombinánsokat homogenitásig plakk-tisztítottuk.
A lambda-gtl 1-jelöltek közül egy jelentős csoport tartalmazott a kereszthibridizációs kísérletek alapján erős hasonlóságot mutató inszertált szekvenciákat. Közülük egyet kiválasztottunk, és a körülbelül 500 bp nagyságú DNS-inszertet pGEMz3- (Promega, Madison, USA) plazmidba vittük, amely a pMD06-plazmidot eredményezte.
2. példa
Az MD06-antigént kódoló gén klónozása és szerkezeti analízise
Az előzőek során összeállított MDV GA-törzsre jellemző EMBL-3-könyvtárat tükörképfiltereken vizsgáltuk, próbaként jelölt, a pMD06-ból származó inszertet használva. A pozitív jeleket kiválasztottuk, plakk-tisztítottuk, és amplifikált fágkészítményből DNS-t vontunk ki. A jelöltek egyikét, melyet lambda-GA08-nak neveztünk, restrikciós térképezéssel és a pMD06-ból származó jelölt inszertet használva próbaként, Southern biot hibridizálással vizsgáltuk. Erős hibridizálást kaptunk a lambda-GA08 17 kb méretű inszertben lévő 5,0 kb nagyságú Sall-ffagmenshez. E fragmens szubklónozása a pGEM3Z-ben eredményezte a pMDll-et, amelynek a restrikciós térképét az 1. ábra mutatja. A pMDl 1 megfelelő fragmenseit kaptuk két, 3,3 és 0,9 kb nagyságú Pstl-fragmens szubklónozásával pGEM5Z-ben, amelyek a pMD23-at és pMD24-et eredményezték. Nukleotidszekvencia-analízist végeztünk az 1. ábrán bemutatott 0,9 kb EcoRI restrikciós fragmens régiójában.
Mindkét szálat analizáltuk exonukleáz III-kezeléssel nyert, fokozatosan deletált szubklónokra alapozva, amint azt Henikoff leírta [Gene, 28, 357 (1984)], mind a pMDll, mind a pMD23 esetében. Minden reakciót duplaszálú DNS-en végeztünk, T7 polimeráz szekvenálókészletet használva (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ). A gél leolvasásához egy Gene Master (Bio-Rad, Richmond, CA) impulzusszámlálót használtunk. Az analízis eredményét az 1. szekvenciaábra mutatja, amely egy, a 2. szekvenciaábrán bemutatott, elsődleges szerkezetű, körülbelül 290 aminosavból álló, alapvetően az MD06-antigént kódoló 830 nukleotidból álló, nyitott leolvasási keretet ábrázol.
3. példa
Az MD06-antigénnek a baromfipestis-vírusból (NDV) származó hemaglutinin-neuraminidázzal (HN) alkotott fúziós protein formájában történő expressziója, pulyka-herpeszvírust (HVT) alkalmazva élövirus-vektorként
Az antigénnek a vektororganizmusban való kifejeződése elképzelhető oly módon, hogy a sejt felszínén való hozzáférhetősége növeli azt a hatékonyságot, amellyel az immunrendszer az adott antigén hatású epitópokat felismeri. Ilyen hordozóproteinre példa az NDV HN-je. Az ezen proteint kódoló gén egy madárvírus-vektorgenomba, például a HVT-be inszertálható oly módon, hogy a
HU 218 102 Β
HN hatékonyan szintetizálódjék a sejtnek a rekombináns vírussal való fertőzése után. Ezután az MD06 jelentős részét kódoló DNS-szakasz a HN-t kódoló szakasz alkalmas pozíciójába integrálható, a helyes irányultság és olvasási keret figyelembevételével. A fertőzött sejt által így szintetizált fúziós polipeptid a külső felszínre irányítható, és megfelelően rögzülhet a plazmamembránba a HN amino-terminális szekvenciáján át.
A) Géneknek a HVT-genomba való integrációját közvetítő vektorplazmid
Igarashi, T. és munkatársai [Virology, 157, 351 (1987)] a HVT-genom felépítésére vonatkozó közleményére alapozva, a vírus „unique-short” (Us) szekvencia-részletét választottuk ki az idegen gének inszerciójára. A megfelelő DNS-szakaszt egy lambdaEMBL3-génbankból szűrtük ki, amelyet HVT-fertőzött CEF-ből nyert teljes DNS részleges emésztésével készítettünk. A lambda-izolátumok egyikének inszertjét, melyet a BamHI restrikciós hely teljes hiánya jellemzett, lambda-HVT04-nek neveztük, és fizikai térképezéssel részleteiben elemeztük (3. ábra). A 17,5 kb nagyságú inszertált fragmens az Us-régió nagyobb részét reprezentálja, beleértve a fordított, ismétlődő szekvencia(„inverted repeat”) struktúrát (Igarashi, T. és munkatársai, 1987, id. h.). A lambda-HVT04 egy 1,2 kb nagyságú Xhol restrikciós fragmensét Sall-gyel emésztett pGEM3Z-be szubklónoztuk, így kaptuk meg a pMD07-plazmidot, amely DNS-fragmens inszerciójára alkalmas egyetlen Bglll helyet tartalmazott (2. ábra). Egy erős promotert választottunk a Rous-szarkómavírus (RSV) LTR-szekvenciájából, amely a HVT-vírus genomjába való inszerciója után képes az idegen gének expresszióját irányítani. A promotert pRSVcat-ból [Gorman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 6777 (1982)] egy 580 bp Ndel/HindlII restrikciós fragmensen lokalizáltuk, és a fragmens mindkét végén dupla szálú, szintetikus linkereket alkalmazva pGEM3Z-be (Promega) a Hindlil és a Pstl helyek közé inszertáltuk. A pGEM3Z-vektor Hindlil helye és az LTR-promotert hordozó RSV-fragmens Ndel helye közti kapcsolatot, egyik végén HindlII-mal, a másik végén Ndel-gyel kompatibilis, ragadós végeket tartalmazó, 30 bp hosszúságú linkénél létesítettük. Azonban a ligáció után, a hat bázispárból álló restrikciós felismerőszekvencia külső nukleotidjai szándékos módosításának köszönhetően, egyik restrikciós hely sem őrződött meg. Továbbá, ezen két hely eltávolítása mellett, magában a linkerben meglevő új restrikciós helyet (BamHI) hoztunk létre a megfelelő pozícióban. Egy második, 20 bp hosszúságú linkért szintetizáltunk, amely az LTR-lfagmens Hindlil helyét a pGEM3Z Pstl helyével kötötte össze, ebben az esetben anélkül, hogy bármelyik végen megszüntette volna a restrikciós helyeket, és a pGEM3Z polilinker régióján már jelenlevőkhöz, például Pstl, Sáli, Xhol és BamHI még három, könnyen felhasználható, egyedi restrikciós helyet: Bglll, Xhol és EcoRV helyet adtunk. A pGEM3Z ezúton nyert pVECO 1-nek nevezett származéka, 650 bp hosszúságú restrikciós fragmenst tartalmazott, amely az LTR promoterszekvenciát és közvetlenül ezután idegen gének inszerciójára alkalmas hét restrikciós helyet hordozott. A 650 bp hosszúságú fragmenst mindkét végén BamHI restrikciós helyek határolták, ezt, mint olyant, a pMD07-ből nyert, 1,2 kb HVT inszert egyedi Bglll helyére vittük át. Az e két restrikciós enzim által létrehozott kohezív végek kompatibilisek, de a ligáció után egyik eredeti, a BglII-ből vagy a BamHI-ből származó restrikciós szekvencia sem marad meg. A kapott konstrukciók egyikét, amely az LTR-t a TR-ek felé eső orientációban hordozta, pVEC04-nek neveztük, és restrikciós térképezéssel ellenőriztük (3. ábra). Ennek az univerzális HVT-rekombinációs vektornak a szerkezete lehetővé teszi idegen géneknek közvetlenül az LTR-promotertől lefelé („downstream”) való inszercióját, és ezután a komplett expressziós kazettának in vivő rekombináció útján a HVT-genomba való inszercióját. Az LTR-től lefelé eső különböző restrikciós helyek elhelyezkedését, különösen azokat, amelyek Bglll-, Xhol- és EcoRV-enzimek számára szolgálnak, oly módon terveztük meg, hogy még többszörös géninszerció is elképzelhető legyen.
B) A HN-génnek MDV-bőlpVEC04-be való inszercióia
A HN-t kódoló gént az NDV-törzs 30-as kiónjából (Intervet Int., Hollandia) készült cDNS-könyvtárból izoláltuk. Az embrionált tojáson nőtt vírusból genomRNS-t készítettünk, és reverz transzkriptázzal előállítottuk az első cDNS-láncot, random 10 bázisú oligomert használva a reakció megindítására. A BamHI restrikciós helyekkel határolt, és a teljes HN-proteint kódoló DNS-szakaszt pGEM4Z-be klónoztuk (Promega, Madison, USA), és az így kapott plazmidot pNDV03-nak neveztük. A 2,1 kb BamHI-szakasz ezt követő transzferé a pVEC04 rekombinációs vektor Bglll helyére a pNDV05-öt eredményezte. Az inszertált génnek az LTR-promoterhez viszonyított helyes orientációját a
4. ábrán bemutatott fizikai térképre alapozva restrikciós analízissel igazoltuk.
C) Az MDVMD06-antigénjét és az NDVHN-jét kódoló gének közti fúzió létrehozása
A HN kódolószakasza szekvenciájának vizsgálata azt mutatja, hogy a gén 3’ végén jelen levő EcoRI restrikciós hely GAA-kodonja ugyanazzal a leolvasási kerettel rendelkezik, mint az 1. szekvenciaábrán bemutatott MD06-ot kódoló gén második kodonja. A pMDl 1ből vagy pMD23-ból származó 0,9 kb EcoRI-fragmens helyes irányú integrációja a pNDV05 megfelelő EcoRI restrikciós hasítási helyén olyan polipeptidet eredményez, amely tartalmazza csaknem a teljes HN-proteint, a teljes MD06-antigénhez kapcsolva. Ezt az utóbbi, a pNDV05-ből kapott plazmidkonstrukciót neveztük pNDVIO-nek, restrikciós térképét az 5. ábra mutatja. Elképzelhető egy markergén további integrációja a fúziós proteint kódoló gén 3 ’ végén található EcoRV hasítási helyre. Az olyan markergén jelenléte, mint az E. coliból származó LacZ-géné, megkönnyíti mind a béta-galaktozidáz-aktivitást, mind a kérdéses fúziós polipeptidet expresszáló rekombináns HVT-vírus észlelését.
D) Gének inszerciója a HVT genomjába
A pNDVIO-plazmidból nyert DNS-t HVT-vel fertőzött sejtekből előállított teljes DNS-sel együtt CEF-be
HU 218 102 Β juttattuk Graham és v.d. Eb szerinti kalcium-foszfát DNS-precepitációs módszer [Virology, 52, 456 (1973)] Morgan és munkatársai által leírt módosítása szerint [Avian Diseases, 34, 345 (1990)]. A konstrukciókból nyert plazmid-DNS-2 pg-ját összekevertük 15 pg HVT-fertőzött sejtekből nyert DNS-sel 560 pl végtérfogatú H2O-ban, és 750 pl HPSB-hez (20 mmol/1 K.C1, 560 mmol/1 NaCl, 24 mmol/1 glükóz, 3 mmol/1 Na2HPO4, 100 mmol/1 HEPES, pH-Ί, 0) adtuk. 109 pl 1 mol/1 CaCl2-oldat fokozatos hozzáadásával, és a keveréknek 30 percig szobahőmérsékleten való inkubálásával csapadék képződött. Eközben 15 ml, 10 napos embriókból nyert másodlagos CEF 6/B8 tápfolyadékkal készült szuszpenzióját 80 cm2 átmérőjű Petri-csészékbe vittük 5xl04 5 sejt/ml sűrűségben. (6/B8 tápfolyadék összetétele: Eagle-féle minimál táptalaj és Glasgow-féle módosított minimál táptalaj 1:1 térfogatarányú keveréke, 2 g/1 triptózzal és 2,5 g/1 laktalbuminnal kiegészítve.) A kalcium-foszfáttal kicsapott DNS-t óvatosan a sejtszuszpenzióhoz adtuk, és a Petri-csészéket 37 °C-on inkubáltuk 5% CO2-t tartalmazó nedves légtérben. Öt óra elteltével a tápfolyadékot eltávolítottuk, és 10 ml, azonos térfogatú HBSP-t és 30% glicerint tartalmazó oldatot rétegeztünk a sejtekre. Egytől két percig tartó inkubálást követően az oldatot eltávolítottuk, a sejteket 6/B8 tápfolyadékban mostuk, és a sejteket friss tápfolyadékban 3-5 napig inkubáltuk, amíg a vírusra jellemző CPE (citopatogén hatás) ki nem fejlődött.
Az NDV HN-jéhez fuzionáltatott MD06-antigént expresszáló HVT-rekombinánsokat immunfluoreszcens festéssel detektáltuk, az MDV-antigének vagy az NDV-ből származó HN-protein ellen termelt specifikus mono- vagy polivalens szérumokkal.
4. példa
A natív MD06-antigén expessziója HVT-ben
Az MD06-antigénnek mint nemfüziós polipeptidnek az expressziója elérhető az 1. szekvenciaábra teljes génjének, beleértve 5’ végi nem átíródó szekvenciákat, a pVEC04 plazmidban jelen levő LTR-promoterhez képest lefelé „downstream” való beépítésével (leírva a 3. ábrán és a 3. példában, A. alfejezet), és in vivő rekombináció révén az expressziós kazetta ezt követő integrációjával a HVT-vektor vírusgenomjába. Erre a célra a gént a pMD23-ból (lásd 2. példa) származó DNSszakaszon végzett PCR-amplifikáció segítségével izoláltuk, az ATG kezdőkodontól 60 bázispárra a 3’ vég felé és a TAA-terminátorkodontól 40 bázispárra az 5’ vég felé elhelyezkedő (1. szekvenciaábra) szintetikus „primer” oligonukleotidok felhasználásával. A mindkét printerben újonnan létrehozott GGATCC-szekvencia lehetővé tette egy 1,0 kb BamHI restrikciós szakasz izolálását, amelyet a pGEM3Z-plazmid BamHI hasítási helyére klónoztunk, a pMD56-ot eredményezve. Az inszert korrekt szekvenciaszerkezetének igazolása után a fragmenst újraizoláltuk BamHI-emésztéssel, és ezután és pVEC04 BG1II restrikciós helyére inszertáltuk, ily módon nyerve a pMD58-plazmidot (6. ábra). Az LTR-promoter ellenőrzése alatt álló, natív MD06-antigént kódoló génnek a HVT-genomba való integrációja felé irányuló további lépéseket a 3. példa D. alfejezetében leírtak szerint végeztük. Az MD06-antigént expresszáló, rekombináns HVT-vírusokat fertőzött CEF-en vizsgáltuk immunfluoreszcens festéssel, E.coli által expresszált MD06-fragmensek ellen termelt polivalens szérummal. A rekombinánsokat határhígításos eljárással és ismételt különálló plakk-izolálással homogenitásig tisztítottuk.
5. példa
Vakcinázási kísérletek
A 3. példa szerinti módon, MDV63/2/8 jelű, MD06-gént hordozó, élő, rekombináns HVT-vektorvírust állítottunk elő, azzal az eltéréssel, hogy az MD06polipeptidet nem az NDV aminoterminálisához fuzionáltattuk, hanem a szignálpeptidként alkalmazott humán IL-2 aminoterminális 28 aminosavat tartalmazó régiójához. Ezenkívül az új rekombináns HVT-vektor egy, az előállítás során a rekombináns vírus szelekcióját megkönnyítő eszközt (gpt-gént) tartalmazott.
Az új, MDV63/2/8 jelű HVT-törzsnek a specifikus patogéntől mentes naposcsirkék virulens Marek-féle betegségvírus letális dózisa ellen védő hatékonyságát hasonlítottuk össze a PB1 jelű szülőtörzs hatékonyságával. Az egyik, 30 naposcsirkét tartalmazó csoportot 1000 pfu PB 1-törzzsel vakcináztuk intramuszkulárisan. A másik csoport ugyanilyen dózisú MDV63/2/8-törzset kapott. Nemvakcinázott kontrollként egy tizenhárom állatból álló csoport szolgált. Az állatokat hat nappal később 500 pfu virulens I. szerotípusú MDV RB1Btörzzsel fertőztük, és tíz héten át megfigyeltük a Marekféle betegség tüneteire, így a mortalitásra, paralízisre és a makroszkopikus sebek fejlődésére nézve.
A nemvakcinázott kontrollcsoportban 13 madárból 11 Marek-féle betegség következtében pusztult el RBlB-törzzsel történt fertőzés után. A PB1 jelű szülő-HVT-törzzsel vakcinázott csoportban 30 madárból 9 pusztult el tíz hét után. Az MD06-antigént expresszáló, MDV62/2/8 jelű, rekombináns HVT-törzzsel vakcinázott csoportban jobb védőhatást mutattunk ki, ugyanis 30 madárból mindössze 5-nél fejlődtek ki ugyanazon megfigyelési idő alatt a Marek-féle betegség letális tünetei. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be grafikon formájában, ahol a Marek-féle betegség makroszkopikus és mikroszkopikus jeleit mutató elhullott madarak számát az összes madár %-ában ábrázoltuk.
Ez a kísérlet különösen azt igazolja, hogy az MD06-antigén immunválaszt vált ki az állatokban, és az MD06-ot kódoló gén expressziója egy élő, rekombináns HVT-vektorban jobb védelmet indukál a Marekféle betegség ellen, mint a szülő-HVT-törzs.
Claims (14)
1. MD06 MDV-protein egy vagy több immunogén determinánsát hordozó polipeptidet kódoló nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy a protein a 2. szekvenciaábrán bemutatott aminosavszekvenciával rendelkezik, vagy annak egy funkcionális változata.
HU 218 102 Β
2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvenciaábrán bemutatott DNS-szekvenciát legalább részben tartalmazza.
3. Rekombináns vektormolekula, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát.
4. A 3. igénypont szerinti rekombináns vektormolekula, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvencia működőképesen van kapcsolva expressziós kontrollszekvenciákhoz.
5. Rekombináns vektorvírus, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
6. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciával vagy egy, a 3. vagy 4. igénypont szerinti rekombináns vektormolekulával van transzformálva, vagy egy, az 5. igénypont szerinti rekombináns vektorvírussal van fertőzve.
7. Polipeptid, azzal jellemezve, hogy egy, a 2. szekvenciaábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező MD06 MDV-protein vagy funkcionális változata egy vagy több immunogén determinánsát tartalmazza.
8. MDV-polipeptid, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia kódolja.
9. Eljárás egy, a 2. szekvenciaábrán bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező MD06 MDV-protein egy vagy több immunogén determinánsát hordozó polipeptid expressziójára, azzal jellemezve, hogy egy, a
6. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztünk.
10. Ellenanyag vagy antiszérum, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. vagy a 8. igénypont szerinti polipeptiddel immunreaktív.
11. Baromfiak Marek-féle betegség elleni védelmére szolgáló vakcina, azzal jellemezve, hogy egy, az
5. igénypont szerinti rekombináns vektorvírust, egy, a
6. igénypont szerinti gazdasejtet, egy, a 7. vagy 8. igénypont szerinti polipeptidet, vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással készült polipeptidet tartalmaz, egy alkalmas hordozóval együtt.
12. Immunológiai vizsgálat céljára használható immunkémiai reagens, azzal jellemezve, hogy egy, az MDV valamely immunogén determinánsát hordozó, a
7. vagy a 8. igénypont szerinti polipeptidet tartalmaz.
13. Eljárás Marek-féle betegség elleni élővírus-vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 5. igénypont szerinti rekombináns vektorvírussal fertőzött gazdasejtet tenyésztünk, a rekombináns vektorvírusokat összegyűjtjük, és a vírusokat tartalmazó anyagot immunizálóaktivitással rendelkező gyógyászati készítménnyé alakítunk.
14. Eljárás Marek-féle betegség elleni rekombináns vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a
7. vagy a 8. igénypont szerinti polipeptidet vagy egy, a 9. igénypont szerint előállított polipeptidet immunizálóaktivitással rendelkező gyógyászati készítménnyé alakítunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69946791A | 1991-05-14 | 1991-05-14 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9201590D0 HU9201590D0 (en) | 1992-08-28 |
| HUT62330A HUT62330A (en) | 1993-04-28 |
| HU218102B true HU218102B (hu) | 2000-06-28 |
Family
ID=24809465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9201590A HU218102B (hu) | 1991-05-14 | 1992-05-13 | Rekombináns vakcinák Marek-féle betegség ellen |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6051404A (hu) |
| EP (1) | EP0513921B1 (hu) |
| JP (1) | JP3375347B2 (hu) |
| AT (1) | ATE126274T1 (hu) |
| AU (1) | AU654186B2 (hu) |
| CA (1) | CA2067469C (hu) |
| DE (1) | DE69203950T2 (hu) |
| ES (1) | ES2078642T3 (hu) |
| GR (1) | GR3017973T3 (hu) |
| HU (1) | HU218102B (hu) |
| NZ (1) | NZ242707A (hu) |
| ZA (1) | ZA923041B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5369025A (en) * | 1991-06-28 | 1994-11-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease |
| US6913751B2 (en) | 1992-06-12 | 2005-07-05 | Schering-Plough Veterinary Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| EP0750670A1 (en) * | 1994-02-07 | 1997-01-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Compositions useful in controlling marek's disease |
| FR2728794B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro |
| US6475770B1 (en) | 1997-06-10 | 2002-11-05 | Pfizer, Inc. | Processes for preparation of Marek's Disease using continuous mammalian cell lines |
| US7314715B2 (en) | 2001-06-14 | 2008-01-01 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| MX344069B (es) * | 2010-10-18 | 2016-12-02 | Intervet Int Bv | Vacuna vectorizada por el herpesvirus de los pavos contra la influenza aviar en aves de corral. |
| CN114540312B (zh) * | 2022-03-16 | 2023-03-24 | 河南省农业科学院 | 一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0332677B1 (en) * | 1987-07-27 | 1995-07-19 | Syntro Corporation | Attenuated herpes viruses, herpes viruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccines containing same |
| JP2779447B2 (ja) * | 1988-03-20 | 1998-07-23 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体 |
-
1992
- 1992-04-27 ZA ZA923041A patent/ZA923041B/xx unknown
- 1992-04-28 CA CA002067469A patent/CA2067469C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-12 NZ NZ242707A patent/NZ242707A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-05-13 AU AU16242/92A patent/AU654186B2/en not_active Expired
- 1992-05-13 HU HU9201590A patent/HU218102B/hu unknown
- 1992-05-13 EP EP92201357A patent/EP0513921B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-13 ES ES92201357T patent/ES2078642T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-13 DE DE69203950T patent/DE69203950T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-13 AT AT92201357T patent/ATE126274T1/de active
- 1992-05-14 JP JP12227292A patent/JP3375347B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-05-24 US US08/067,416 patent/US6051404A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-11-07 GR GR950403083T patent/GR3017973T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2067469C (en) | 2003-07-01 |
| DE69203950D1 (de) | 1995-09-14 |
| AU654186B2 (en) | 1994-10-27 |
| GR3017973T3 (en) | 1996-02-29 |
| US6051404A (en) | 2000-04-18 |
| EP0513921A3 (en) | 1993-06-16 |
| ES2078642T3 (es) | 1995-12-16 |
| JPH05227973A (ja) | 1993-09-07 |
| AU1624292A (en) | 1993-03-11 |
| ZA923041B (en) | 1993-04-28 |
| EP0513921A2 (en) | 1992-11-19 |
| CA2067469A1 (en) | 1992-11-15 |
| EP0513921B1 (en) | 1995-08-09 |
| DE69203950T2 (de) | 1995-12-21 |
| HUT62330A (en) | 1993-04-28 |
| ATE126274T1 (de) | 1995-08-15 |
| HU9201590D0 (en) | 1992-08-28 |
| JP3375347B2 (ja) | 2003-02-10 |
| NZ242707A (en) | 1994-03-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5187087A (en) | Recominbant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| KR100204438B1 (ko) | 치킨 아네미아 바이러스 백신 및 진단방법 | |
| JPH03504963A (ja) | 仮性狂犬病感染に対する組換えサブユニットワクチンの調製 | |
| US5283191A (en) | Mareks' disease virus vaccine | |
| JP3420258B2 (ja) | イヌコロナウイルスサブユニットワクチン | |
| EP0513921B1 (en) | Recombinant vaccine against Marek's disease | |
| JPH05509226A (ja) | Ｅｈｖ―４糖蛋白質ワクチン | |
| JP3262787B2 (ja) | 豚コレラウイルスワクチン | |
| CN109999191B (zh) | 一种鸡毒支原体新型基因工程亚单位疫苗 | |
| EP0423869B1 (en) | Infectious bronchitis virus vaccine | |
| CN112029735B (zh) | 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用 | |
| US5690939A (en) | Recombinant vaccine against marek's disease | |
| WO2000020600A1 (en) | Avian pneumovirus vaccine and diagnostic agent | |
| WO1991000352A1 (en) | Pestivirus nucleotide sequences and polypeptides | |
| JPH10507066A (ja) | ニワトリ感染性貧血ウイルスワクチン | |
| EP0905140A1 (en) | Novel fused protein, gene therefor, recombinant vector, recombinant virus, and its use | |
| JP3428666B2 (ja) | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 | |
| SONDERMEIJER et al. | Sommaire du brevet 2028045 | |
| JPH07255488A (ja) | 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL |