JPH05509226A

JPH05509226A - Ｅｈｖ―４糖蛋白質ワクチン

Info

Publication number: JPH05509226A
Application number: JP3512017A
Authority: JP
Inventors: ニコルスン、レズリー; アニアンズ、デイヴィッド　エドワード
Original assignee: University of Glasgow; Equine Virology Research Foundation
Current assignee: University of Glasgow; Equine Virology Research Foundation
Priority date: 1990-07-06
Filing date: 1991-07-04
Publication date: 1993-12-22
Also published as: ATE147100T1; HUT69920A; GR3023297T3; ES2099164T3; AU8200791A; DE69123970D1; DE69123970T2; US6083511A; CA2086739A1; DK0538341T3; EP0538341B1; NZ238833A; WO1992001057A1; HU9300009D0; EP0538341A1; HU217211B; ZA915230B; GB9014950D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】７、　ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇｃポリペプチドまたはその抗原性断片。

８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１部からなる請求の範囲第７項に記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。

９、　請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の核酸配列によりコードされるＥＨＶ−４ポリペプチド。

１０、請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のポリペプチドに対し免疫反応性である抗体もしくは抗血清。

１１、　ＥＨＶ−４感染に対し馬を保護するワクチンにおいて、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の核酸配列、請求の範囲第４項に記載の組換核酸分子、請求の範囲第５項に記載のベクターウィルス、請求の範囲第６項に記載の宿主細胞または請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のポリペプチドからなることを特徴とするワクチン。

１２、　請求の範囲第６項に記載の宿主細胞を培養し、次いでＥＨＶ−４含有物質を回収すると共に免疫活性を有する医薬製剤まで処理することを特徴とするＥＨＶ−４ワクチンの製造方法。

１３、　請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のポリペプチドを免疫活性を有する医薬製剤まで処理することを特徴とするＥＨＶ−４ワクチンの製造方法。

１４、　有効量の請求の範囲第１１項に記載のワクチンを動物に投与することを特徴とするＥＨＶ−４感染に対する馬の保護方法。

明細書ＥＨＶ−４糖蛋白質ワクチン本発明は、馬（Ｅｑｕｉｎｅ）ヘルペスウィルス−４ポリペプチドをコードする核酸配列、この種の核酸配列組換核酸分子、前記核酸配列を含有するベクターウィルスもしくは宿主細胞、ＥＨＶ−４ポリペプチド、前記ポリペプチドに対し免疫反応性の抗体、ＥＨＶ−４感染に対するワクチン、並びにこの種のワクチンの製造方法に関するものである。

馬ヘルペスウィルス−４（ＥＨＶ−４）は、関連の馬ヘルペスウィルス−１と同様に、馬産業にて重大な経済的損失の原因となるα−ヘルペスウィルスである。

ＥＨＶ−４は主として呼吸器病に関連するが、ＥＨＶ−４誘発の流産がしばしば報告される。

ＥＨＶ−４のゲノムは、２個の共有結合断片（Ｌ１１０９ｋｂｐ　；　ｓ、３５ｋｂｐ）（後者はインバーテツドリピートにより整列する）よりなる二本鎖線状ＤＮＡ分子として特性化されている。

ヘルペスウィルスの糖蛋白は、たとえば細胞付着、細胞中への浸透、および病原性のような本質的ウィルス機能を媒介する。さらにヘルペスウィルス糖量□白は、ウィルスと宿主免疫系との相互作用における重要な成分である。主として単純庖疹ウィルス（ＨＳ　ｌの充分特性化された糖蛋白に関する多くの研究は、抗体反応および細胞免疫反応の両者におけるヘルペスウィルス糖蛋白の重要性を示している。ヘルペスウィルス糖蛋白には構造および機能において相当な多様性も存在するが、ＤＮＡおよび蛋白配列には成る程度の類似性が確認されている。

これは、それぞれ特定保持領域もしくは部位の存在により関連する相同蛋白で構成された種々異なる群への数種のヘルペスウィルス蛋白の分類をもたらした。この種の同族体の群はたとえば次の通りである。単純庖疹ウィルス−１（Ｈ５Ｖ− １）ｇＢ、偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）ｇｌＩ、牛ヘルペスウィルス（ＢＨｖ）ｇＩ：Ｈ８■−１、ｇＤ、ＰＲＶ　ｇｐ５０、ＢＨＶｇ　Ｉ　Ｖ　、ＥＨＶ−１ｇｐ１４、ＰＲＶ　ｇｒ、水痘−帯状庖疹ウィルス（ＶＺＶ）ｇ　Ｉ　Ｉ０単純庖疹ウィルス型１、水痘−帯状庖疹ウィルス、および偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）のｇＨ蛋白が地図化および配列決定され、ウィルスに対する保護に関与することが示されている［Ｕ、　ボンペルスおよびＡ、ミンソン（１９８６）、パイロロジー、第１５３巻、第２３０頁、Ｐ、Ｍ、ケラ−等（１９８７）、パイロロジー、第１５７巻、第５２６頁：国際特許出願Ｗ○　８９／１０９６５号］。数種のヘルペスウィルス、たとえばＨ３Ｖ−１、ＰＲＶ、ＥＨＶ−１のｇＣ型糖蛋白配列が開示されている［Ｒ，Ｊ、フリンク等（１９８３）、ジャーナル・パイロロジー、第４５巻、第６３４頁；Ａ、に、　ロビンス等（１９８６）、ジャーナル・バイロロジー、第５８巻、第３３９頁；Ｇ、Ｐ、アレンおよびり、Ｄ、クーグル（１９８８）、ジャーナル・パイロロン−１第６２巻、第２８５０頁］。しかしながら、これら刊行物はいずれも、ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣ同族体の特性化またはそのＥＨＶ−４ゲノムにおける正確な位置決定を開示しておらず、またＥＨＶ−４感染を防止するワクチンを製造するための前記蛋白またはこれら蛋白をコードする遺伝子の使用につき開示も教示もしていない。ここで、ＥＨＶ− ４ｇＨ型蛋白およびｇＣ型蛋白はそれぞれＥＨＶ−４ｇＨおよびＥＨＶ−４ｇＣと称する。

ワクチン接種によるＥＨＶ−４感染の抑制が長い間追及された目標である。現在のワクチンは、化学的に失活させたウィルスワクチンおよび改質された生ウイルスワクチンからなっている。しかしながら、失活ワクチンは一般に低レベルの免疫性しか誘発せずに追加の免疫処理を必要とし、不利なことにアジュバントを必要としかつ生産が高価につく。さらに成る程度の感染性ウィルス粒子が失活処理の後にも生存し、動物に投与した後に病気をもたらす。一般に弱化した生ウイルスワクチンが好適である。何故なら、これらはより長持続性の免疫反応（しばしば体液性および細胞性の両者）を発揮すると共に生産が容易であるからである。

現在まで組織培養における毒性株の一連の通過により弱化された生ＥＨＶ−４ウィルスに基づく弱化生ウイルスワクチンしか入手てきない。しかしなから、この処理のため無制御の突然変異がウィルスゲノムに導入され、毒性および免疫特性にて異質であるウィルス粒子の集団をもたらす。さらに、この種の従来の弱化生ウイルスワクチンは毒性に復帰して接種動物の発病をもたらすと共に他の動物に対する病原体の伝染を可能にする。

病原体に対し免疫反応を示しつる必要かつ適切なＥＨＶ−４免疫原住物質またはこの物質をコードする遺伝子情報のみを含むワクチンは、生ワクチンもしくは失活ワクチンの上記欠点を示さない。

本発明によれば、ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドまたはその抗原性断片をコードする核酸配列をＥＨＶ−４感染に対し馬を免疫化するためのワクチンの製造に用いることができ、これは失活ワクチンもしくは弱化生ワクチンの上記欠点を示さない。

ここで用いる「核酸配列」と言う用語は任意の長さの高分子型のヌクレオチド、すなわちリボ核酸配列およびデオキシリボ核酸配列の両者を意味する。原則としてこの用語は分子の一次構造を意味する。すなわち、この用語は二本鎖および一末鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖および一末鎖ＲＮＡ、さらにその改質物を包含する。

一般にＵポリペプチド」と言う用語は生物学的活性を有するアミノ酸の分枝鎖を意味し、生産物の特定長さを意味せず、必要に応したとえばグリコジル化、アミド化、カルボキシル化またはホスホリル化によりインビボもしくはインビトロにて改質することができ、したがって特にペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白が包含される・前記ｇＨもしくはｇＣポリペプチドは他のヘルペスウィルスのｇＨもしくはｇＣ対応物と相同であって、ｇＨもしくはｇＣポリペプチド同族体における保持領域および部位により確認かつ特性化することができる。

ＥＨＶ−４ｇＨポリペプチドをコードする遺伝子はＢａｒｎＨＩ　Ｃ断片（第１図）に位置し、９４．１００Ｄの推定分子量を有する長さ８５５アミノ酸の蛋白をコードする。アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１）から、膜糖蛋白の特徴である次の構造特性を推論することができる：疎水性アミノ酸残基の範囲からなる一次翻訳生産物の最終Ｎ−末端領域における信号ペプチドが確認される。切断部位はほぼＡｌａ、９に位置し、信号ペプチドの切断後におけるｇＨの推定分子量は約９２，１３０Ｄである。

残基２０〜８１６は親水性外部領域を構成し、１１個のＮ−結合グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を有する。

約２０個のアミノ酸残基よりなる疎水性経膜領域はほぼ位置８３７〜８５５におけるＣ末端方向に位置する。

ＥＨＶ−４ｇＨの細胞質領域はほぼアミノ酸位置８３７〜８５５の範囲に存在する。

ボンペルス等［ジャーナル・ゼネラルクーノくイロロジー、第６９巻、第２８１９頁（１９８８）］およびクラネージ等［ジャーナル・パイロロジー、第６２巻、第１４１６頁（１９８８）］によるα、βおよびγヘルペスウィルスのｇＨ蛋白におけるアミノ配列の比較は、ヘルペスウィルス族の全体に保持されるｇＨ蛋白の数種の特徴を強調した：α−ヘルペスウィルスにおける１４個もしくは１５個のアミノ酸とβ−およびγ−ヘルペスウィルスにおける７個もしくは８個のアミノ酸の異常に短（′Ｉ細胞質領域；推定の経膜領域に関し同様な位置および保持された局部配列における４個の保持システィン残基；および経膜領域に対しＮ−末端である保持グリコジル化部位配列ＮＧＴＶ１３〜１８アミノ酸。ＥＨＶ−４ｇＨは上記全ての特徴を示す：すなわち提案された細胞質領域は長さ２０個未満のアミノ酸であり、４個の保持システィンは位置５５６．５９１．６６３および７１６に存在し、さらにＣ−末端グリコシル化部位は配列ＮＧＴＶ　（７ミ／酸７９６〜７９９）に位置し、この配列ＮＧＴＶは推定ＥＨＶ−４経膜領域に対し１９アミノ酸Ｎ−末端に位置する。

ＥＨＶ−４ｇＨにおける位置７３７および７４０（７）Ｃｙｓ残基は、Ｈ３Ｖ− １を例外とし殆どのヘルペスウィルスｇＨにおいてシスティン保持の部位に存在する。ＥＨＶ−４ｇＨとＨ３Ｖ−１ｇＨとの間、および実際には検討したα、β およびγヘルペスウィルスｇＨの全体におけるシスティン残基の強力な保持は、恐らくジスルフィド結合に関与するこれら蛋白の二次および三次構造に関する成る捏度の保持を意味する［ボンペルス等、１９８８、同上）］。

ＥＨＶ−４ｇＣポリペプチドをコードする遺伝子はＢａｍＨＩＧ断片（第２図）に位置し、約５２，５００Ｄの分子量を有する長さ４８５アミノ酸の蛋白をコードする。アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）から、膜糖蛋白の特徴である次の構造特性を推論することができる。

信号ペプチドは約３２アミノ酸にわたるＮ−末端に確認され、切断はそれぞれ位置３２および３３におけるＡｌａ残基とＳｅｒ残基との間で生ずる。

ＥＨＶ−４ｇＣの外部領域はほぼ残基３３〜４４４にまたがり、１１個のＮ−結合グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−３／Ｔ）を有する。

ＥＨＶ−４ｇＣの抗原決定子はほぼ残基４０９（Ａｓｎ）に位置する［ホップおよびウソズ（１９８１）、ＰＮＡＳ、第７８巻、第３８２４頁］。

アミノ酸４４５〜４６８が糖蛋白の経膜領域を構成する。

Ｃ−末端細胞質領域は残基４６９〜４８５にわたって存在し、親水性であって正味で２の正電荷を有する。

ｇＣ同族体は、特にシスティン保持の約６個の部位に位置するＣ−末端の半分における保持アミノ酸を含む。

僅かなＮ−結合グリコシル化部位も同様な位置に存在するが厳密には保持されない。さらにｇＣの共通の特徴は、Ｃ−末端細胞質領域か短くかつ正帯電している点にある［Ｄ、Ｒ，フィッッパトリック等（１９８９）、パイロロジー、第１７３巻、第４６頁、Ｇ、Ｐ、アレンおよびり、Ｄ、クーグル、同上］。

特異的に保持される特徴の点でＥＨＶ−４ｇＣを他のｇＣと比較する目的で、ＥＨＶ−４ｇＣとＢＨＶ−１ｇＩＩＩとＰＲＶ　ｇＩＩＩとＨ３Ｖ−１ｇＣとＭＤＶ　Ａ抗原との整列を行なう。ＥＨＶ−４ｇＣは６個の各保持位置、すなわちアミノ酸２５６．３１８．３５７．３６１．３９０および４１６にシスティン残基を有する。９個の推定ＥＨＶ−４ｇＣグリコジル化部位がＥＨＶ−１ｇｐ１３１ｍ保持され、３個がＰＲＶｇｌｌｌで保持される。

さらにＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドの抗原性断片、すなわち適する形態で提示されれば敏感な動物にて前記ｇＨもしくはｇＣポリペプチドに対し任意の種類の粘液反応（体液型および／または細胞型）を示しうる分子配置からなる前記ｇＨもしくはｇＣポリペプチドの断片をコードする核酸配列も本発明に包含される。

さらに、前記断片はｌ：ＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドの特徴を有する。

特に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはＳＥＱ　ＩＤＮＯ２で示されるアミノ酸配列を持ったＥＨＶ−４ポリペプチドまたはこのポリペプチドの誘導体をコードする本発明による核酸配列を使用することができる。

ＥＨＶ−４ｇＨおよびｇＣポリペプチドをコードする遺伝子はＥＨＶ−４ゲノムに位置し、そのヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｏｌおよび５ＥＱＩＤ　ＮＯ：２でそれぞれ示される。この情報を用いて前記遺伝子もしくはその誘導体を遺伝子処理することにより、たとえば一般に当業界で知られた組換ＤＮＡ技術で各遺伝子をクローン化すると共にコードされたポリペプチドをインビトロまたはインビボにて発現させることができる。上記ヌクレオチド配列を有する核酸配列またはその誘導体は、好ましくはＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドの発現に使用される。

ここに包含される特定ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドにつき、個々のＥＨＶ−４ウイルスもしくは種類の間には天然の変種も存在しうろことが理解されよう。これら変種は、全配列におけるアミノ酸の相違により或いは前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、装置もしくは付加により示すことができる。この種の全誘導体も本発明の範囲内に包含される。さらに、これら各種の誘導体をコードする核酸配列を製造するには組換ＤＮＡ技術を使用する可能性も存在する。

当業界で周知されているように、遺伝子コードの縮退はコドンにおける塩基の置換を可能にし、他のコドンを与えうるがまだ同一アミノ酸をコードすることができ、たとえばアミノ酸であるグルタミン酸のコドンはＧＡＴおよびＧＡＡの両者である。したがって、ＳＥＱ　ＩＤＮ０１もしくはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその抗原性断片を発現するには、前記ＳＥＱ　ＩＤで示した核酸配列とは異なるような他のコドン組成を有する誘導核酸配列を使用することができる。

さらに、ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドから或いはＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣ抗原特性を示すＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ：２で示したアミノ酸配列から誘導される断片、またはＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から或いは前記ｇＨもしくはｇＣポリペプチドの抗原性断片をコードする前記ＳＥＱ　ＩＤで示されるヌクレオチド配列から誘導される断片も本発明に包含される。

この種のＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドまたは遺伝子の誘導体をもたらす全ての上記改変は、特徴的なＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣ構成が本質的に影響せずに保たれる限り、本発明に包含される。

本発明による核酸配列は、必要に応じたとえばβ−ガラクトシダーゼのような融合蛋白配列をコードするＤＮＡの部分を含んだ各種の発現を行なうＤＮＡ配列に結合させ、適する宿主の形質転換に使用しつる、いわゆる組換核酸分子を生成させることかできる。この種のハイブリッドＤＮＡ分子は、好ましくはたとえばプラスミドから或いはバクテリオファーンもしくはウィルスに存在する核酸配列から誘導される。本発明による核酸配列をクローン化するのに使用しうる特定ベクターは当業界にて公知である［たとえばＲ，Ｌ、ロドリゲスおよびり、Ｔ。

デンハルト編、「ベクター・分子状クローン化ベクターの検討およびその使用」、バッターワース（１９８８）］。本発明による組換核酸分子の作成に使用しつる方法は当業者に公知であっＣ１特にＴ、マニアチス等［モレキュラ・クローニング　ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２）コに示されている。ここで用いる「形質転換」と言う用語は、用いる方法とは無関係に宿主細胞中への異種核酸配列の挿入、たとえば直接的組込み、すなわちトランスダクションを意味する。異種核酸配列は自主複製によって維持することができ、或いは宿主ゲノム中に組込むこともできる。好ましくは組換ＤＮＡ分子には、挿入された核酸配列の発現を制御しつる所定の宿主に対し適合性の適する制御配列が与えられる。

適する宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列により或いはこの種の核酸配列を含む組換核酸分子により形質転換することができかつ前記核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現すべく使用しうる細胞である。宿主細胞は、たとえば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ、ｏｍｏｎａｓ）菌種のような原核細胞、たとえば細菌、またはたとえばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核細胞、たとえば酵母またはたとえば昆虫、植物もしくは哺乳動物細胞（ヘラ細胞および支那ハムスター卵（ＣＨＯ）細胞を包含する）のような高級真核細胞とすることができる。昆虫細胞はスボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐ６ｒｄａ）のＳｆ９細胞ラインを包含する。真核性クローン化システムにおける本発明の核酸配列のクローン化および発現に関する情報はに、エツサー等、［真核細胞のプラスミド、スプリンガー・フエアラーク出版（１９８６）］に見ることができる。

本発明の核酸配列は好ましくは発現制御配列に作用結合される。この種の制御配列はプロモータ、オペレータ、インジューサ、リポソーム結合部位などで構成することができる。

宿主細胞が細菌である場合、有用な発現制御配列の例はｔｒｐプロモータおよびオペレータ［ゲデル等、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第８巻、第４０５７頁（１９８０）；ｌａｃプロモータおよびオペレータ［チャンク等、ネイチャー、第２７５巻、第６１５頁（１９７８）、外膜蛋白プロモータ［ＥＭＢＯジャーナル、第１巻、第７７１〜７７５頁（１９８２）、バクテリオファージλプロモータおよびオペレータ［ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１１巻、第４６７７〜４６８８頁（１９８３）］　；］α−アミラーゼ枯草菌）プロモータおよびオペレータ：停止配列：並びに選択された宿主細胞に対し適合しつる他の発現促進および制御配列を包含する。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御配列の例はたとえばα−接合因子を包含する。昆虫細胞については、バキュロウィルスのポリへドリンプロモータを使用することができる［モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第３巻、第２１５６〜６５頁（１９８３）コ。

宿主細胞が昆虫源もしくは哺乳動物源である場合、有用な発現制御配列の例はたとえば５Ｖ−４０プロモータ［サイエンス、第２２２巻、第５２４〜５２７頁（１９８３）］またはたとえばメタロチオネインプロモータ［ネイチャー、第２９６巻、第３９〜４２頁（１９８２）コまたは熱シヨツクプロモータ［ベルミー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ１第８２巻、第４９４９〜５３頁（１９８５）］を包含する。或いはＥＨＶ−４に存在する発現制御配列、特にｇＨもしくはｇＣの発現を調整する配列を用いることもできる。

さらに本発明は、ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチド、または実質的に全ウィルスもしくは元来結合した他の蛋白を実施的に含まない抗原性断片をも包含する。

特にＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１もしくはＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１部またはその誘導体を含むポリペプチドも本発明に包含される。

本発明の他の具体例においては、上記核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を持ったポリペプチドが使用される。

ＥＨＶ−４感染に対する馬の免疫化は、たとえば本発明によるポリペプチドをいわゆるサブユニットワクチンとて馬に投与することにより達成することができる。本発明によるサブユニットワクチンは純粋型のポリペプチドで構成することができ、必要に応じ医薬上許容しうるキャリヤを存在させることもできる。ポリペプチドは必要に応じ無関係の蛋白に共有結合させることができ、これはたとえば融合生成物を精製する際に有利である。その例はβ−ガラクトシダーゼ、蛋白Ａ、プロキモシン、凝血因子Ｘａなどである。

成る種の場合、これらポリペプチド自身に対し中和性抗体を発生する能力は低くてもよい。好ましくは小断片をキャリヤ分子に結合させて、その免疫性を高める。この目的に適するキャリヤは巨大分子、たとえば天然ポリマー（蛋白、たとえば鍵穴カサガイヘモシアニン、アルブミン、毒素）、合成ポリマー、たとえばポリアミノ酸（ポリリジン、ポリアラニン）、またはたとえばサポニンのような両親媒性化合物のミセルである。或いは、これら断片をそのポリマーとして、好ましくは線状ポリマーとして与えることもできる。

この種のサブユニットワクチンに使用しうるポリペプチドは、当業界で知られた方法により、たとえばＥＨＶ−４からの前記ポリペプチドの単離、組換ＤＮＡ技術または化学合成により製造することかできる。

必要に応じ、ワクチンに使用しうる本発明のポリペプチドはインビトロ或いはインビボでたとえばグリコジル化、アミド化、カルボキシド化またはホスホリル化により改質することができる。

サブユニットワクチンの代案は生ベクターワクチンである。本発明による核酸配列は組換ＤＮＡ技術により微生物（たとえば細菌もしくはウィルス）中に組換微生物がまだ複製しうるよう導入されて、挿入核酸配列によりコードされたポリペプチドを発現する。次いで、この組換微生物を免疫化する馬に投与し、次いでこれを暫く維持し或いは接種した馬の体内で複製させて本発明による挿入核酸配列によりコードされたポリペプチドをインビボで発現させ、接種した馬の免疫系を刺激することができる。本発明による核酸配列を組込むのに適するベクターは、たとえばＥ　ＨＶ　−１’ｔアデノウィルス、ワクチンウィルスまたは他の天然痘ウィルス、乳頭腫ウィルスのようなウィルス類またはたとえば大腸菌もしくは特定のサルモネラ菌種のような細菌から誘導される。この種の組換微生物を用い、宿主細胞で合成されたポリペプチドは表面抗原として露出することができる。

この意味で、前記ポリペプチドとＯＭＰ蛋白または大腸菌のピルス蛋白または生物により１別される信号配列およびアンカー配列の合成物との融合も考えられる。さらに所望ならば、大きい全体の１部としての前記免疫原性ポリペプチドを、免疫化すべき動物の内部で放出させることも可能である。

これら全ての場合、１種もしくはそれ以上の免疫原生産物を発現させて各種の病原体に対しおよび／または所定病原体の各種抗原に対し保護を与えることも可能である。

本発明によるワクチンは、本発明による核酸配列からなる宿主細胞を培養し、次いで細胞および／または細胞内に増殖したベクターウィルスを必要に応じ純粋な形態で回収し、さらに必要に応じ凍結乾燥型でワクチンを生成させることにより製造することができる。

本発明による核酸配列からなる上記宿主細胞はさらに、前記核酸配列によりコードされたポリペプチドを発現するのに好適な条件下で培養することもできる。ワクチンは粗製培養物、宿主細胞溶解物または宿主細胞抽出物の試料を用いて製造することもできるが、他の具体例においては本発明による一層精製されたポリペプチドを目的用途に応じワクチンにする。生成したポリペプチドを精製するには本発明による核酸配列を含有した宿主細胞を充分な容量で培養し、生成したポリペプチドをこの種の細胞から或いは蛋白が分泌される場合は媒体から分離する。

媒体中に分泌されたポリペプチドは標準技術（たとえば塩分面、クロマトグラフィー、遠心分離）により単離および精製しうるのに対し、細胞内ポリペプチドは先ず最初に前記細胞を回収し、これら細胞を溶解させ、次いでポリペプチドを他の細胞内成分から分離すると共にポリペプチドをワクチンに形成することにより分離することができる。

既にＥＨＶ−４により感染した馬を、前記ＥＨＶ−４に向けられた抗体で処理しうることは言うまでもない。

本発明によるポリペプチドに特徴的な抗血清もしくは抗体をＥＨＶ−４感染の治療処置に使用することができる。

前記特徴的な抗血清もしくは抗体は、動物を有効量のＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドで免疫処理して適する免疫反応を発生させることにより得ることができる。その後、動物を出血させると共に抗血清を作成することができる。

本発明によるポリペプチドに向けられたモノクローナル抗体を、Ｅ、　ＨＶ　− ４で感染した馬の治療に使用することもできる。前記モノクローナル抗体は、この目的に当業界で知られた方法により、たとえばネズミを前記ポリペプチドで免疫化し、ネズミ牌細胞を不滅にし、次いでハイブリドーマを選択して有用な抗体を産生させることにより製造することができる。死滅しない抗体生産性細胞ラインは、オンコゲンＤＮＡによる８９２８球の直接的形質転換またはエプスタイン・バールウィルスでのトランスフェクションによって生成させることもできる。

特にモノクローナル抗体は、当業界で知られた方法により抗イデイオタイプ抗体を発生させるべく使用することができる。これら抗イデイオタイプ抗体は、さらに馬におけるＥＨＶ−４感染の予防に用いることもできる。

上記抗血清およびモノクローナル抗体は、さらにＥＨＶ−４で感染した馬の免疫学的診断に使用することもできる。

本発明によるワクチンは慣用の活性免疫化方式で投与することができる：すなわち投与処方に適合しうるよう、さらに予防上および／または治療上有効かつ免疫性となるような量にて１回で或いは反復して投与することができる。ワクチンの投与はたとえば皮内、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内で行なうことができる。

さらにワクチンは水性媒体または水含有懸濁物をしばしば他の成分と混合して含有し、活性および／または貯蔵寿命を高めることもできる。これら成分は塩類、ｐＨ緩衝剤、安定化剤（たとえばスキムミルクもしくはカゼイン加水分解物）、乳化剤、免疫反応を改善するアジュバント（たとえば油、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリアニオンおよび両親媒性物質）および保存料とすることができる。

本発明によるワクチンは馬の他の病原体に関連するイミュノゲンを含有することもでき、或いはたとえばＥＨｖ−１の抗原、馬インフルエンザウィルス、ロータウィルス、感染性貧血性ウィルス、動脈炎ウィルス、脳炎ウィルス、馬のボルナ病ウィルス、馬のペルーウィルス、多価ワクチンを形成する大腸菌もしくはストレプトコッカス・エクイなどの抗原のようなこれらイミューノゲンをコードする核酸配列を含有しうろことも明かである。

実施例　１ｇＨ遺伝子の分離および特性化１、ＥＨＶ−４ウイルスの培養０．２％の重炭酸ナトリウムと１％の非必須アミノ酸中血清とを補充したアールス最小必須培地（フロー）で成長させた馬皮膚細胞（ＮＢＬ−６）の僅かサブ融合性の単層を含むローラ瓶にＥｌ（Ｖ−４菌株１９４２のウィルスを０．００３のｍ、ｏ、ｉ、にて感染させ、３７°Ｃにて６０分間にわたり吸着させた。これらを激しいＣ１ｐ、ｅ、が出現するまで３１℃にて培養し、細胞の大部分を肌表面から剥離させた（２〜６日間）。感染した細胞培地を５．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、にて５分間にわたり遠心分離して細胞をペレット化させると共に、上澄液を１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、　にて２時間にわたりツルバールＧＳＡ６ｘ２００ｍｌロータで遠心分離した。ペレットを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、音波処理し、次いで１１．００Ｏｒ、、ｐ、ｍ、にてツルバール５Ｓ３４ｏ−夕で５分間遠心分離して細胞残骸を除去した。次いでウィルスを１８，０００ｒ、ｐ、ｍ、てのツルバール５Ｓ３４０−夕における１時間の遠心分離によりペレット化させた。ウィルス粒子とプラーク形成単位との比は約１゜０００〜５．０００であった。

２、ＥＨＶ−４ＤＮＡの作成ペレット化したウィルスを１０ｍ１のＮＴＥ　（ＮａＣ１／トリス／ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、簡単に音波処理した。汚染性の細胞ＤＮＡを１０μｇ　／　ｍ　ｌのＤＮアーゼの添加および３７゛Ｃにおける１時間の培養により分解させた。

ＳＤＳを２％の最終濃度まで添加し、調製物をＮＴＥ平衡化フェノールにより透明な中間相が得られるまで約３回抽出した。クロロホルム抽出に続き上記したようにＤＮＡのエタノール沈澱を行なった。ＤＮＡをペレット化させ、７０％エタノールで洗浄し、１０ｍ１の１００ｍＭのＮａＣ１および１０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼに再懸濁させ、次いで１晩わたり室温にて放置した。

１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼにで３１℃にて２時間処理することにより、さらに精製を行なった。ＤＮＡをフェノール、クロロホルム（１：１容量／容量）で１回抽出し、さらにクロロホルムで１回抽出し、エタノール沈澱させ、充分に排液し、次いでｏ、１ｘｓｓｃに再懸濁さＥＨＶ−４ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片をベクターｐＵＣ９、すなわちｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝子とＭｌ　３ｍｐ　９からのポリリンカー領域とを含むプラスミド［Ｊ、ビエイラおよびＪ９　メッシング（１９８２）、ジーン、第１９巻、第２５９頁コに結合させた。

５μｇ（７）ＥＨＶ−４ＤＮＡと５μｇのｐＵＣＱ　ＤＮＡとを別々にＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切断した。反応物の１部をゲル電気泳動にかけて完全な切断を証明し、次いでＤＮＡを等容積のフェノール：クロロホルム（１：　１）で２回抽出し、次いでエタノール沈澱させた。実質的にタナ力およびワイスブルムの方法［ジャーナル・バクテリオロジー、第１２１巻、第３５４頁（１９７５）］によって結合を行なった。約０．１μｇのＢａｍＨＩ切断ｐＵＣ９と１ｔｔｇのＢａｍＨＩ切断ＥＨＶ−４ＤＮＡとを５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、８ｍＭのＭｇＣＬ　、１０ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＡＴＰにて４０μ ｌの最終容積で混合した。次いで２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（０，５μＩ）を添加した。反応物を４℃にて１６時間にわたり培養した。

カルシウムでショック処理した大腸菌ＤＨＩ細胞［Ｄ。

ハナハン（１９８３）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１６６巻、第５５フヘン等Ｕプロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ，第６９巻、第２１１０頁（１９７２）］により記載された組換プラスミドで形質転換させた。ＢａｍＨＩ　Ｃ％片を含む組換プラスミドｐＵｃ９の制限切断（第１図）に続く特定ＥＨＶ−４制限断片の回収および配列分析のためのブルースクリプトＭ１３＋プラスミドベクター（ストラタジーンのマルチクローニング部位におけるサブクローン化［Ｔ．マニアチス等、同上］によって追加クローンを得た。

ｇＨ遺伝子にまたがるＢａｍＨＩ　Ｃ断片の領域のヌクレオチド配列を、−末鎖プラスミドＤＮＡを雛型として用いると共にブルースクリプト誘導の特注オリゴヌクレオチドをサンガージデオキシ配列決定法にプライマーとして使用することにより決定したｃサンガー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７４巻、第５４６３頁（１９７７）］　（第１図）。正確な位置決定、すなわちｇＨ遺伝子の核酸配列および対応のアミノ酸配列をＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌで示す。

ＥＨＶ−４１イルスの培養、ＥＨＶ−４　ＤＮＡの作成およびｐＵＣＱにおけるＢａｍＨＩ保存物の作成を上記と同様に行なった。組換プラスミドｐＵＣ９　：　ＥＨＶ−４　ＢａｍＨＩ　Ｇを制限酵素切断してＥＨＶ〜４ＢａｍＨＩ　Ｇのザブ断片を生ぜしめ、次いでこれを０。

７％アガロースゲルから分離し、標準技術［Ｔ．マニアチス等、同上〕によりブルースクリプトＭ１３＋プラスミドベクター（ストラタジーン）にクローン化させた。

組換プラスミドを、大腸菌の菌株ＪＭ８３でアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が補充された１リツトルのブロスにて増殖させた。プラスミドＤＮＡを５００ｍ１の細菌培養物からアルカリ溶菌法によって抽出し、ＣｓＣ１特異性もしくは特注のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、サンガージブオキ技術［サンガー等、同上］てＤＮＡ配列決定を行なった。ｇＣ遺伝にまたがるＢａｍＨＩ　Ｇ断片の領域のヌクレオチド配列を、第２図に示した方法にしたがい重なり配列の分析で決定した。正確な位置決定、すなわちｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列をＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２で示す。

（ａ）ＥＨＶ−４ゲノムのＢａｍＨＩ制限地図［Ａ．Ａ。

クリナン等、ジャーナル・ゼネラル・パイロロジー、第６９巻、第１５７５頁（１９８８）］。

（ｂ）ＥＨＶ−４　ｇＨ遺伝子の配列決定法および位置（ａ）第１図と同様。

（ｂ）Ｓａｌｌ、ＥｃｏＲＩ，Ｂｇｌ　ＩおよびＢｇｌＩ工の切断部位を示すＢａｍＨＩ　Ｇの制限地図。

（Ｃ）配列決定法およびＢａｍＨＩ　Ｇ断片における開放読粋の範囲。

配列リストＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１配列型　・蛋白対応ヌクレオチド配列長さ　：　２７３０塩基対；８５５アミノ酸鎖型　ニー末鎖トポロジー　二線状分子型　ニゲツムＤＮＡ初期原料生物　：馬ヘルペスウィルスー４直接的実験原料ニゲツムＢａｍＨＩ保存物性質　：ＥＨＶ−４　ｇＨ遺伝子ＣＡＧこＧＣＧＧこＣ　ＧＡＧＡＴＡＣＴＣＧ　ＡＧＧＴＡＴＣＣＡＧ　ＴＧＧＴＴＧＴＡＴＡ　ｎＧＧＦ：５ＡＡＴＡＡ　ＡＴＡＣＴＧＣsＧＣ　６０ＧＡＴＴ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＣＡＡ’　ＣＣ．ＪＴＡＴ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ｎＡ　ＧＴＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＡＣs Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙ＜　ＩＴｅ　Ａｈａ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　＆ａ＋　ＡＩａ　ＡＩａ１。、　１？９ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＧ　Ａｎ　ＣＣＣ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＣＣＧ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　P５７ ■１ｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｅｌｅ　Ｐｒ＋　Ｖｈｌ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ@２１ＣＣＣ　Ｃ；ａ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＣＡＣ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＡＡ．Ｔ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＣＡb　２０５Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｉｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｈａｓ@１７ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＡＣＡ　ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＧＴＡ　ＡＣＣ　ＡＧＧ　丁ＡＴ　ＧＡＣ　ＡＧＧ　ＡＴＡ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＣＡ@２Ｅ！Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｖａ］Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　U３Ｇｎ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ｎＡ　ＴＣＣ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴｒ　ｎＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＡＴＡ　ＴＣＣ　３０P Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　ＶａＴ　Ａｌａ　１１ｓ　Ｓｅｒ@７９ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＣＧＣ　ＡＣＧ　ＧＴＴ　ＡＡＣ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＴＣＣ　ＧＴＡ　ＴＴＴ@３４９Ｇ＋ｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ＶａＴ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　ｌ：＋ｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐ■■@９５ＴＧＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＡ丁Ａ３９７Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　１１ｅ@１１１ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＣＣＣ　ＧＧＴ　ＧＡＣ　ＣＣＡ　ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＴＣＣ　ＧＴＣ　ＡＡＣ　ＴＣＡ@４４５ＡＴａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ@１２７ＣＴＡ　ＣＴＣＴＣＣＧＴＴ　ＡＴＣＣＣＡ　ＣＣＴ　ＣＧＣＣＴＧ　ＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴτＡ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＧｏ　１ｇ二ユニ＝＊　ＬｅＵＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｔｎｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉｙ６Q：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２配列型　：蛋白対応ヌクレオチド配列長さ　：１５６０塩基対；４８５アミノ酸鎖型　ニー末鎖トポロジー　：線状分子型　ニゲツムＤＮＡ初期原料生物：馬ヘルペスウィルス−４直接的実験原料ニゲツムＢ　ａｍＨＩ保存物性質　・ＥＨＶ−４ｇＣ遺伝子ＡＡＧＡＧｎＡＴＴ　ＡＴＴＧＴＴＣＴＴＴ　ＧＴ［；Ｇ；１ＡＡＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴ　ＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ@５７Ｍｅｔ　ＧＴｙ　２ＣＡＧＴＴＣＡＡＡＣＣ！Ｅ６０要約書本発明は、ＥＨＶ−４感染に対し馬にワクチン接種すべく使用しうるＥＨＶ−４の糖蛋白ワクチンｇＨおよびｇＣに関するものである。さらに本発明は、ＥＨＶ −４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドをコードする核酸配列にも関するものである。前記配列は、サブユニットまたはベクターワクチンの製造に使用することができる。

国際調査報告Ｆ＋ｙｍｐＪＴ／ｌＳ＾／２１０Ｌｓｖｐｐ−１℃す薯ａ＋１ｍｅ１１２１１− Ｐ９４１２１１αν９１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．　ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドまたはその抗原性断片をコードする核酸配列。
２．　前記配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミン酸配列を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の核酸配列。
３．　前記配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるデキオキシ核酸配列または前記デキオキ核酸配列の誘導体に対応することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の核酸配列。
４．　発現制御系に作用結合した請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の核酸配列からなる組換核酸分子。
５．　請求の範囲第４項に記載の組換核酸分子を含有するベクターウィルス。
６．　請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の核酸配列または請求の範囲第４項に記載の組換核酸分子または請求の範囲第５項に記載のベクターウィルスを含有する宿主細胞。
７．　ＥＨＶ−４ｇＨもしくはｇＣポリペプチドまたはその抗原性断片。
８．　ＳＥＱＩＤＮＯ：１もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の少なくとも１部からなる請求の範囲第７項に記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
９．　請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の核酸配列によりコードされるＥＨＶ−４ポリペプチド。
１０．　請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のポリペプチドに対し免疫反応性である抗体もしくは抗血清。
１１．　ＥＨＶ−４感染に対し馬を保護するワクチンにおいて、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の核酸配列、請求の範囲第４項に記載の組換核酸分子、請求の範囲第５項に記載のベクターウィルス、請求の範囲第６項に記載の宿主細胞または請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のポリペプチドからなることを特徴とするワクチン。
１２．　請求の範囲第６項に記載の宿主細胞を培養し、次いでＥＨＶ−４含有物質を回収すると共に免疫活性を有する医薬製剤まで処理することを特徴とするＥＨＶ−４ワクチンの製造方法。
１３．　請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のポリペプチドを免疫活性を有する医薬製剤まで処理することを特徴とするＥＨＶ−４ワクチンの製造方法。
１４．　有効量の請求の範囲第１１項に記載のワクチンを動物に投与することを特徴とするＥＨＶ−４感染に対する馬の保護方法。