JPH05508538A - 馬ヘルペスウィルス―４ ｔｋ￣ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１、　細胞培養物にＥＨＶ−４ＤＮＡと請求の範囲第７項に記載の組換ＤＮＡ 分子とを同時トランスフェクトすることを特徴とする請求の範囲第１〜７項のい ずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体の製造方法。

１２、特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体で感 染した細胞培養物。

１３、　請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体から誘 導されるワクチン。

１４、　請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体と、そ の医薬上許容しうるキャリヤとからなるワクチン。

１５、ＥＨＶ−４含有物質を請求の範囲第１２項に記載の細胞培養物から回収し て、これを免疫活性を有する製剤まで処理することを特徴とするＥＨＶ−４ワク チンの製造方法。

明細書 馬ヘルペスウィルス−４７に一ワクチン本発明は、馬（Ｅｑｕｉｎｅ）ヘルペス ウィルス−４突然変異体（ＥＨＶ−４）　、ＥＨＶ−４ＤＮＡからなる組換ＤＮ Ａ分子、前記組換ＤＮＡ分子を含有する宿主細胞、前記ＥＨＶ−４突然変異体の 製造方法、ＥＨＶ−４突然変異体で感染した細胞培養物、ＥＨＶ−４突然変異体 から得られるワクチン、並びにこの覆のワクチンの製造方法に関するものである 。

馬ヘルペスウィルス−４（ＥＨＶ−４）は、関連の馬ヘルペスウィルス−１と同 様に、馬産業にて重大な経済的損失の原因となるα−ヘルペスウィルスである。

ＥＨＶ−４は主として呼吸器病に関連するが、ＥＨＶ−４誘発の流産がしばしば 報告される。

ＥＨＶ−４のゲノムは、２個の共有結合断片（ＬＳ１０９ｋｂｐ　；　Ｓ、３５ ｋｂｐ）（後者はインバーテツドリピートにより整列する）よりなる二本鎖線状 ＤＮＡ分子として特性化されている。

ワクチン接種によるＥＨＶ−４感染の抑制が長い間追及された目標である。現在 のワクチンは、化学的に失活させたウィルスワクチンおよび改質された生ウイル スワクチンからなっている。しかしながら、失活ワクチンは一般に低レベルの免 疫性しか誘発せずに追加の免疫処理を必要とし、不利なことにアジュバントを必 要としかつ生産が高価につく。さらに成る程度の感染性ウィルス粒子が失活処理 の後にも生存し、動物に投与した後に病気をもたらす。一般に弱化した生ウイル スワクチンが好適である。何故なら、これらはより長持続性の免疫反応（しばし ば体液性および細胞性の両者）を発揮すると共に生産が容易であるからである。

現在まで組織培養における毒性株の一連の通過により弱化された生ＥＨＶ−４ウ ィルスに基づく弱化生ＥＨＶ−４ワクチンしか入手できない。しかしながら、こ の処理のため無制御の突然変異がウィルスゲノムに導入され、毒性および免疫特 性にて異質であるウィルス粒子の集団をもたらす。さらに、この種の従来の弱化 生ウイルスワクチンは毒性に復帰して接種動物の発病をもたらすと共に他の動物 に対する病原体の伝染を可能にする。さらに、現存する弱化生ＥＨＶ−４ワクチ ンを用いて、ＥＨＶ−４感染につき積極的な血清学試験が得られる。たとえば現 存するＥＨＶ−４ワクチンでは、（血清学的）試験［たとえばエリザ（Ｅｌｉｓ ａ）］により特特定物が毒性ウィルスの（潜在）キャリヤであるか或いはワクチ ン接種されているかどうかを決定することができない。

本発明の目的はＥＨＶ−４感染に対するワクチンの製造に使用しうるＥＨＶ−４ 突然変異体を提供することであり、この突然変異ウィルスは毒性への復帰を排除 すると共に強力な免疫反応を宿主動物にて示すよう制御して弱化される。

本発明によれば、この種の突然変異ＥＨＶ−４はチミジンキナーゼをコードする 遺伝子における欠失および／または挿入の結果として官能性チミジンキナーゼ（ ＴＫ−）を産生じないことを特徴とする。

遺伝子物質を制御操作する技術の開発は、古典的な弱化ウィルスワクチンの欠点 を回避する弱化ウィルスワクチンを得ることを可能にした。しかしながら、現在 までＥＨＶ−４の毒性に関与する領域の正確なＥＨＶ−４ゲノム上の位置に関す る情報は入手できず、遺伝子工学処理された弱化ＥＨＶ−４の産生を不可能にす る。

チミジンキナーゼをコードする遺伝子はＥＨＶ−４ゲノムのＢｍａＨＩ　Ｃ断片 の内部に地図化され、さらにその約２ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＯＩ断片に位 置し、約０．４８のマツプ位置を有する（第１図）。ＴＫ遺伝子の核酸配列が決 定されてＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示され、それから遺伝子の遺伝子操作に使用 すべき制限酵素切断部位を誘導することができる。

ＴＫ遺伝子は１０５６個のヌクレオチドで構成されて、３８．８００Ｄの推定分 子量を有する３５２アミノ酸酵素をコードする。ＴＫの発現効率は発現制御配列 の存在により調整される。たとえばプロモータ配列がＤＮＡ雛型に対するＲＮＡ ポリメラーゼの結合に関与すると共に、ｍＲＮＡの部位および開始を制御する。

この種の配列はしばしば転写開始部位の前の１ｏｏｂｐ領域に見られる。

特に下流の転写制御信号は転写停止コドンおよびポリアデニル化信号である。塩 基対２１〜２５に位置するＴＡＴＡ枠はＥＨＶ−４ＴＫ遺伝子の推定プロモータ ＴＡＴＡ枠である。有力なＲＮＡポリメラーゼ開始部位はＴＡＴＡ粋の２２ｂｐ 下流に位置する。ポリＡ信号は停止コドンの４２ｂｐ下流に位置する（ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ：１）。

ＥＨＶ−４ＴＫ遺伝子のＤＮＡ配列につき個々のＥＨＶ−４ウィルス間には天然 変種が存在しうろことも了解されよう。これら変種はＴＫ遺伝子における１個も しくはそれ以上のヌクレオチドの変化をもたらしつるが、まだ官能性ＴＫをコー ドする。さらに遺伝子工学技術を用いて、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示した配列 に関するＤＮＡ配列をもたらすような上記変種を与える可能性が存在する。この 種の関連核酸配列における欠失および／または挿入からなるＥＨＶ−４突然変異 体も本発明の範囲内に包含されることは明らかである。

本発明のＥＨＶ−４欠失突然変異体はＤＮＡ断片が欠失したＴＫ遺伝子からなり 、ウィルスの複製に際したとえば変化したＴＫ蛋白の三次構造の変化の結果とし て或いは読粋のシフトの結果として官能性ＴＫコードは産生じない。

さらに、ＥＨＶ−４突然変異体のゲノムにおける欠失は完全ＴＫ遺伝子を構成す ることもできる。

本発明によるＥＨＶ−４突然変異体はさらに核酸配列をＴＫコード領域に挿入し て得ることもでき、かくして官能性ＴＫ酵素の発現を防止する。この種の核酸配 列は特にたとえば約１０〜６０ｂｐのオリゴヌクレオチドとすることができ、好 ましくはさらに１個もしくはそれ以上の翻訳停止コドンを有し、或いはポリペプ チドをコードする遺伝子とすることができる。前記核酸配列は、たとえば合成、 ウィルス性、原核性もしくは真核性の任意の原料から誘導することができる〇 本発明の他の具体例において、ＥＨＶ−４欠失突然変異体は、欠失したＥＨＶ− ４ＤＮＡの代りに上記核酸配列を有することもできる。

本発明の他の目的は、ＥＨＶ−４感染だけでなく他の馬感染病に対するワクチン の製造についても使用しうる突然変異ＥＨＶ−４を提供することにある。安全な 弱化生ＥＨＶ−４突然変異体に基づくこの種のベクターワクチンは、免疫化した 宿主の感染細胞に病原体の抗原を発現することにより他の病原体に対し免疫化す る可能性を与え、さらにＥＨＶ−４に対し異種のポリペプチドをコードする異種 構造核酸配列をＥＨＶ−４ゲノムの挿入領域に挿入して得ることができる。

しかしながら有用なＥＨＶ−４ベクターの必須条件は、異種核酸配列がゲノムＥ ＨＶ−４配列の許容位置もしくは領域（すなわちたとえば感染もしくは複製に必 要とするようなＥＨＶ−４の必須機能を破壊することなく異種配列の組込みに使 用しつる位置もしくは領域）に組込まれることである。この種の領域を挿入領域 と呼ぶ。本発明ノ以前ニハ、ＥＨＶ−４ゲノムにおける挿入領域につき記載され ていなかった。

本発明によればウィルスベクターとして使用しうるＥＨＶ−４突然変異体が提供 され、この突然変異体はＴＫをコードする遺伝子にてポリペプチドをコードする 異種核酸配列の挿入の結果として官能性ＴＫを産生じないことを特徴とする。

欠失ＴＫ　ＤＮＡの代りに異種核酸配列を挿入した上記のＥＨＶ−４挿入突然変 異体も本発明の範囲内に包含される。

ｒＥＨＶ−４挿入突然変異体」と言う用語は、特に異種核酸配列のウィルスゲノ ム（すなわちＥＨＶ−４に自然に存在する遺伝子とは異なる遺伝子の蛋白もしく はその部分をコードする遺伝子）に組込んで遺伝子改質された感染性ウィルスか らなっている。

前記ＥＨＶ−４挿入突然変異体で細胞を感染させると、これは異種ポリペプチド として異種遺伝子を発現する。

「ポリペプチド」と言う用語は、生物学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味 し、生産物の特定長さを意味せず、必要に応じたとえばグリコジル化、アミド化 、カルボキシル化もしくはホスホリル化によりインビボもしくはインビトロで改 質することができる。特にペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白がポリペプチド の定義内に包含される。

本発明のＥＨＶ−４ゲノムに組込むべき異種核酸配列は、たとえばウィルス性、 原核性、真核性もしくは合成の圧意の原料から誘導することができる。前記核酸 配列は病原体（好ましくは馬病原体）から誘導することができ、ＥＨＶ−４ゲノ ム中に挿入した後に病気に対する免疫性を誘発させるべく施すことができる。好 ましくはＥＨＶ−１、馬インフルエンザウィルス、ロータウィルス、感染性貧血 症ウィルス、動脈炎ウィルス、脳炎ウィルス、馬のボルナ病ウィルス、馬のペル ーウィルス、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）もしくはストレプトコッカス・エクイ（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓψｅｑｕｔ）から誘導される核酸配列がＥＨＶ−４ゲ ノムの挿入領域に組込むべく考えられる。

さらに医薬もしくは診断用途のポリペプチド（特にたとえばリンホキン、インタ ーフェロンもしくはサイトキンのような免疫調整剤）をコードする核酸配列を前 記挿入領域に組込むことができる。

ＥＨＶ−４突然変異体に異種核酸配列を発現させるための必須要件は、異種の核 酸配列に作用結合された適するプロモータである。当業者には明らかなように、 プロモータの選択は遺伝子転写をＥＨＶ−４突然変異体により感染した細胞に遺 伝子転写を指向させる、たとえば５Ｖ−４０プロモータ［サイエンス、第２２２ 巻、第５２４〜５２７頁（１９８３）１またはたとえばメタロチオネインプロモ ータ［ネイチャー、第２９６巻、第３９〜４２頁（１９８２）］または熱ショッ クプロモータ［ベルミー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイ エンス、ＵＳＡ、第８２巻、第４９４９〜５３頁（１９８５）］またはヒトサイ トメガロウィルスＩＥプロモータまたはＥＨＶ−４に存在するプロモータ（たと えばＴＫプロモータ）のような任意の真核性、原核性もしくはウィルス性プロモ ータに拡大される。

ＤＮＡ配列をクローン化ベクター中に挿入するための周知方法およびインビボに おける相同組換を用いて欠失および／または挿入をＥＨＶ−４ゲノムに導入する ことができる［Ｔ、マニアチス等（１９８２）、ｒモレキュラ・クローニング」 、コールド・スプリング・ノＸ−ノく−・ラボラトリ−；ヨーロッパ特許出願第 ７４，８０８号；Ｂ、ロイラマンおよびＦ、Ｊ、ジエンキシス（１９８５）、サ イエンス、第２２９巻、第１２０８頁：Ｒ，ヒグチ等（１９８８）、ヌクレイツ ク・アシッド・リサーチ、第１６巻、第７３５１頁］。要するに、これはＥＨＶ −４ＤＮＡで組換えるべく組換ＤＮＡ分子を構成することにより達成することが できる。この種の組換ＤＮＡ分子は任意適するプラスミド、コスミド、ウィルス もしくは）アージ（プラスミドが最も好適である）から誘導することができ、恐 らくそこに挿入された核酸配列を有し、所望ならばプロモータに作用結合された ＥＨＶ−４ＤＮＡを含有する。適するクローン化ベクターの例はプラスミドベク ター、たとえばｐＢＲ３２２、各種のｐＵＣおよびブルースクリプトプラスミド 、バクテリオファージ、たとえばλ　ｇｔ−ＷＥＳ−λ　Ｂ１シャロン２８およ びＭｌ　３ｍｐファージまたはウィルス性ベクター、たとえばＳＶ４０、牛乳頭 腫ウィルス、ポリオーマおよびアデノウィルスである。本発明に使用すべきベク ターについてはさらに従来技術、たとえばＲ，Ｌ、　ロドリゲスおよびり、Ｔ、 デンハルト編、［ベクター：分子状クローン化ベクターの検討およびその使用」 、バターワース（１９８８）に要約されている。

第一に、挿入領域からなるＥＨＶ−４ＤＮＡ断片（すなわちＴＫ遺伝子）をｒｅ ｃＤＮＡ技術によってクローン化ベクターに挿入する。前記ＤＮＡ断片はＴＫ遺 伝子の１部または実質的に完全ＴＫ遺伝子で構成することができ、所望ならばそ の配列に整列する。第二に、ＥＨＶ−４ＴＫ欠失突然変異体を得る場合には、Ｔ Ｋ遺伝子の少なくとも１部を第１工程から得られた組換ＤＮＡ分子より欠失させ る。これは、たとえば第１工程からの組換ＤＮＡ分子を適するエキソヌクレアー ゼＩＩＩ切断または制限酵素処理によって達成することができる。ＥＨＶ−４挿 入突然変異体を得る場合には、核酸配列を第１工程の組換ＤＮＡ分子に存在する ＴＫ遺伝子に挿入し、或いは前記組換ＤＮＡ分子から欠失したＴＫ　ＤＮＡの代 りに導入する。欠失ＴＫ　ＤＮＡまたは挿入核酸配列に整列するＥＨＶ−４ＤＮ Ａ配列は、ウィルス性ＥＨＶ−４ゲノムとの相同組換を生ぜしめつるような適す る長さとすべきである。

所望ならば、２個もしくはそれ以上の異なる挿入（異種）核酸配列、たとえば同 一もしくは異なる病原体から誘導された配列を含有する構成物も作成することが でき、前記配列はここに規定したＥＨＶ−４の挿入領域配列と整列する。この種 の組換ＤＮＡ分子を用いて、２種もしくはそれ以上の異なる抗原性ポリペプチド を発現することにより多価ワクチンを生成するようなＥＨＶ−４突然ＴＫ−表現 型）または馬細胞（たとえば馬皮膚細胞）］を適するＥＨＶ−４配列と整列した （異種）核酸配列の欠失および／または挿入を有する組換ＤＮＡ分子の存在下に ＥＨＶ−４ＤＮＡでトランスフェクトすることができ、これにより組換ＤＮＡ分 子とＥＨＶ−４ゲノムとにおける対応領域間で組換が生ずる。さらに組換は、Ｅ ＨＶ−４ゲノムＤＮＡを含有する宿主細胞を適する整列挿入領域配列（ベクター ＤＮＡ配列を持たない）と整列した（異種）核酸配列を有するＤＮＡデトランス フエクトして生ぜしめることもできる。次いで、組換ウィルス子孫が細胞培養物 で生産され、これをたとえば遺伝子型または表現型によりたとえばハイブリッド 化により選択し、（異種）核酸配列と共に同時組込みされた遺伝子によりコード される酵素活性を検出すると共に官能性ＴＫを生産しないＥＨＶ−４突然変異体 をスクリーニングすることができ［Ｂ、ロイラマンおよびＦ、Ｊ、ジエンキシス （１９８５）　（同上）コ、またはＥ　ＨＶ　−４突然変Ｊｉ体により免疫学的 に発現された抗原性異種ポリペプチドを検出することができる。選択されたＥＨ Ｖ〜４突然変異体を細胞培養物で大規模に培養することができ、次いでＥＨＶ− ４突然変異体を含有する物質または前記ＥＨＶ−４で発現された異種のポリペプ チドをそこから回収することができる。或いは突然変異体ＥＨＶ−４は、挿入お よび／または欠失がＥＨＶ−４ＴＫ　ＤＮＡを有するコスミドに組込まれた場合 、全ＥＨＶ−４ゲノムを有する数種のコスミドの同時トランスフエクションによ り発生させることもできる。

本発明によれば、官能性ＴＫを生産せずかつ所望ならば特定病原体の１覆もしく はそれ以上の異なる異種ポリペプチドを発現する弱化生ＥＨＶ−４突然変異体を 用いて、ＥＨＶ−４およびこれら病原体に感受性の馬をワクチン処理することが できる。この種の生ワクチンにてワクチン接種した後、好ましくは接種された宿 主にＥＨＶ−４突然変異体を複製させてインビボでＥＨＶ−４ポリペプチドを発 現させ、かつ所望ならば異種のポリペプチドを発現させる。次いで免疫反応がＥ ＨＶ−４および異種ポリペプチドに対し発生する。この種のＥＨＶ−４突然変異 体でワクチン処理した動物は、所定の期間にわたりその後のＥＨＶ−４および上 記病原体の感染に対し免疫性となる。

必要に応じ１種もしくはそれ以上の異なる異種ポリペプチドを含有しかつ発現す る本発明によるＥＨＶ−４突然変異体は一価もしくは多価のワクチンとして作用 することができる。

さらに本発明によるＥＨＶ−４突然変異体を用いて、失活ワクチンを作成するこ ともできる。

動物に投与するには、本発明によるＥＨＶ−４突然変異体を特にエアロゾル、ス プレー、飲料水などにより経口的、皮肉、皮下または筋肉内投与することができ る。

たとえばスキムミルクもしくはグリセリンのような成分を用いてウィルスを安定 化させることができる。鼻腔内投与により馬にワクチン接種するのが好適である 。馬１頭当り１０〜１０　ＴＣＩＤ５ｏのＥＨＶ−４突然変異体の投与量が一般 に推奨される。

さらに本発明の目的は、サブユニットワクチン、すなわち本発明のＥＨＶ−４突 然変異体により発現した異種ポリペプチドからなる医薬用および診断用製剤を製 造することにある。これは、前記ＥＨＶ−４突然変異体で感染した細胞を、異種 ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養して達成することができる。次いで 、異種ポリペプチドを慣用技術により目的用途に応じ成る程度精製することがで き、さらに免疫化治療もしくは診断活性を有する製剤まで処理することもできる 。

特定病原体に対する上記の活性免疫化は、健康動物における保護処理として施さ れる。既に特定病原体で感染した動物を、本発明によるＥＨＶ−４突然変異体で 発生した抗体を含む抗血清で処理しうることは言うまでもない。本発明によるＥ ＨＶ−４突然変異体に指向する抗血清は、動物を有効量の前記ＥＨＶ−４突然変 異体で免疫化して適する免疫反応を生ぜしめることにより作成することができる 。その後、動物を出血させて抗血清を作成することができる。

実施例　Ｉ ＥＨＶ−４挿入領域の分離および特性化１、ＥＨＶ−４ウイルスの培養 ０．２％の重炭酸ナトリウムと１％の非必須アミノ酸と１％のグルタミンと１０ ０単位／ｍｌのペニシリンと１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンと１０％の 胎児牛血清とを補充したアールス最小必須培地（フロー）で成長させた馬皮膚細 胞（ＮＢＬ−６）の僅かサブ融合性の単層を含むローラ瓶にＥＨＶ−４菌株１９ ４２のウィルスを０．００３のｍ、ｏ、ｉ、にて感染させ、３７℃にて６０分間 にわたり吸着させた。これらを激しいＣ６ｐ、ｅ、が出現するまで３１℃にて培 養し、細胞の大部分を肌表面から剥離させた（２〜６日間）。感染した細胞培地 を５．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、にて５分間にわたり遠心分離して細胞をペレット化さ せると共に、上澄液を１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、にて２時間にわたりツルバール ＧＳＡ６Ｘ２００ｍｌロータで遠心分離した。ベレットを５　ｍ　ｌのＰＢＳに 再懸濁させ、音波処理し、次いで１１．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、にてツルバール５Ｓ ３４０−夕で５分間遠心分離して細胞残骸を除去した。次いでウィルスを１８． ００Ｏｒ、１）、ｍ−でのツルバール５Ｓ３４０−タにおける１時間の遠心分離 によりペレット化させた。ウィルス粒子とプラーク形成単位との比は約１゜００ ０〜５．０００であった。

２、ＥＨＶ−４ＤＮＡ（７）作成 ペレット化したウィルスを１０ｍ１のＮＴＥ　（ＮａＣ１／トリス／Ｅ　Ｄ　Ｔ 　Ａ）に再懸濁させ、簡単に音波処理した。汚染性の細胞ＤＮＡを１０μｇ／ｍ ｌのＤＮアーゼの添加および３７℃における１時間の培養により分解させた。Ｓ ＤＳを２％の最終濃度まで添加し、調製物をＮＴＥ平衡化フェノールにより透明 な中間相が得られるまで約３回抽出した。クロロホルム抽出に続き上記したよう にＤＮＡのエタノール沈澱を行なった。ＤＮＡをペレット化させ、７０％エタノ ールで洗浄し、１０ｍ１の１００ｍＭのＮａＣ１および１０μｇ／ｍｌのＲＮア ーゼに再懸濁させ、次いで１晩わたり室温にて放置した。

１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのプロテナーゼにで３１℃にて２時間処理することによ り、さらに精製を行なった。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１容量／ 容量）で１回抽出し、さらにクロロホルムで１回抽出し、エタノール沈澱させ、 充分に排液し、次いで０．　ｌＸ５ＳＣに再懸濁さＥＨＶ−４ＢａｍＨＩ　ＤＮ Ａ断片をベクターｐＵＣ９、すなわちｐＢＲ３２２からのアンピシリン耐性遺伝 子とＭ１３ｍｌ）９からのポリリンカー領域とを含むプラスミド［Ｊ、ビエイラ およびＪ、メッシング（１９８２）、ジーン、第１９巻、第２５９頁コに結合さ せた。

５μｇのＥＨＶ−４ＤＮＡと５μｇ（７）ｐＵＣ９ＤＮＡとを別々にＢ　ａｍＨ Ｉで切断した。反応物の１部をゲル電気泳動にかけて完全な切断を証明し、次い でＤＮＡを等容積のフェノール：クロロホルム（１：　１）で２回抽出し、次い でエタノール沈澱させた。実質的にタナ力およびワイスブルムの方法［ジャーナ ル・バクテリオロジー、第１２１巻、箪３５４頁（１９７５）］によって結合を 行なった。約０．１ＭｇのＢａｒｎＨＩ切断ｐＵＣ９と１ＭｇのＢａｍＨＩ切断 ＥＨＶ−４ＤＮＡとを５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、８ｍＭの ＭｇＣｌ　、１０ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＡＴＰにて４０μｌの最 終容積で混合した。次いで２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（０，５μＩ）を添加し た。反応物を４℃にて１６時間にわたり培養した。

カルシウムでシタツク処理した大腸菌ＤＨ！細胞［Ｄ。

ハナハン（１９８３）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１６６巻、 第５５７頁］を、実質的にコーヘン等［プロシーディング・ナショナル・アカデ ミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第６９巻、第２１１０頁（１９７２）］により記載 された組換プラスミドで形質転換させた。ＢａｍＨＩ　Ｃ断片を含む組換プラス ミドｐＵＣ９の制限切断（ｊｌｉ１図）に続く特定ＥＨＶ−４制限断片の回収お よび配列分析のためのブルースクリプト間１３＋プラスミドベクター（ストラタ ジーン）のマルチクローニング部位におけるサブクローン化［Ｔ、マニアチス等 、同上コによって追加クローンを得た。

２０μｇの各作成物をプラノ１ムおよびファン・デル・Ｅｂの技術［パイロロジ ー、第５２巻、第４５６頁（１９７３）；セルフェクト・トランスフェクション ・キット、製造業者の指針］の改変により単層ＢＨＫ　ＴＫ−細胞にトランスフ ェクトした。ＴＫ　コロニーをＨＡＴ補充培地（ヒボキサンチン１０−４Ｍ、ア ミノプテリン４ｘｌＯ’Ｍ、チミジン１．　６　Ｘ　１０−５Ｍ）で選択した。

かくしてＴＫ形質転換活性が２ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ断片（ＲＸ２）に 位置し、作成物ｐＢｓＲＸ２にクローン化し、マツプ位置は約０．４８であった （第１ｂ図）。

断片ＲＸ２の両ストランドのヌクレオチド配列を、一本鎖プラスミドＤＮＡを雛 型として用いると共にブルースクリプト誘導の特注オリゴヌクレオチドをサンガ ージデオキシ配列決定法にプライマーとして使用することにより決定した［サン ガー等、プロシーディング・ナショナル拳アカデミーーサイエンス、第７４巻、 第５４６３頁（１９７７）］　（箪ｌｃ図）。正確な位置決定、すなわちＴＫ遺 伝子の核酸配列および対応アミノ酸配列をＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示す。

ＥＨＶ−４７に遺伝子にまたがるＤＮＡの制限地図化および配列分析は、独特の ＳａｍｌおよびＢｓ　ｔＸＩ部位が断片ＲＳａ内に存在しく第１．２図）かつ独 特のＳｍａｌおよびＢｓｔＥＩＩ部位がＲＸ２内に存在することを示し、これら 全てはＴＫコード領域内に位置する。

ＴＫ遺伝子内の０．７３ｋｂｐ欠失は、Ｒ３３をｐＵＣ８にクローン化しく多重 クローン化部位におけるＳｍａｌおよび５ａｉ１部位）かつ作成物をＳｍａ　Ｉ およびＢｓ　ｔＸＩで切断して達成された。欠失に整列するベクター断片プラス ＥＨＶ−４ＤＮＡを分離し、オーバーハングをＴ４ボールを用いて充填されたＢ ｓ　ｔＸＩにより発生させた。次いで線状プラスミドを自己結合させて、Ｓｍａ ｌ−ＢｓｔＸｒ部位から欠失したプラスミド含有のＲ３３断片を生ぜしめた（第 ２ｂ図）。ＴＫ遺伝子内（７）０．５２ｋｂ＋）欠失ハ、ＥＨＶ−４ＲＸ２をブ ／Ｌ、　−スクリプトベクターにクローン化しく多重クローン化部位におけるＳ ｍａ　ＩおよびＸｈｏ　１部位）かつＴＫ遺伝子内のＳｍａ　ｌ−Ｂｓ　ｔＥＩ 　Ｉ部位からこれら酵素での制限切断により欠失させて達成された。より大きい ベクター断片を０．５２ｋｂｐ（７）ＥＨＶ−４断片カラ分離シ、オーバーハン グを充填すると共にプラスミドを再結合させた。得られたプラスミドはＥＨＶ− ４ＴＫ遺伝子の５′および３′コード化領域を有するが、ｓｍａｌ　ＢｓｔＥＩ Ｉ部位から欠失する（第２Ｃ図）。

遺伝子内に明確な欠失部を有するＥＨＶ−４ＤＮＡを含有する。これら欠失部の 位置は、欠失手段で用いうるＴＫ遺伝子内の制限エンドヌクレアーゼ部位の利用 性により支配される。両欠失部はＴＫ遺伝子のＮ−末端コード化領域にまたがる 。この領域が隣接ＵＬ２４型遺伝子のプロモータを有すると仮定すれば、ＥＨＶ −４ゲノムがって、ＴＫ遺伝子のＣ−末端コード化領域内に欠失部を有するＤＮ Ａを作成し、最終的にＴＫ発現においてのみ影響を受けるＥＨＶ組換体を産生じ た。組換ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、これらＤＮＡを作成よび３ ．４）を合成し、これらを独立的に用いて欠失部位の左側および右側に位置する ＤＮＡ断片を作成した（工程１）。次いで外部プライマー（プライマー１．４） を用いて第１回のＰＣＲ反応の生産物（相補的にアニールしうる末端領域を有す るプライマー２．３）を増幅してＴＫ−作成物を生産させた（工程２．３）。こ の種の手段は、制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマー内への組込みにより末 端および欠失部位に挿入しつると言う追加利点を有する。これら部位を用いて、 適するプラスミドベクターへのＴＫ−ＤＮＡ　ＰＣＲ生産物のクローン化を容易 化させ（工程４）かつ欠失部位内のクローン化を行なうことができる。

プライマー 以下のプライマーにおける３′末端配列をＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４のＴＫ遺 伝子に関する公開された配列情報から誘導した（下線を施した配列）。５′配列 は「ＧｃＪクランプ（内部プライマー制限酵素による切断の効率を高めるため） および３個の制限酵素部位を組込む。プライマー２および３の場合は、プライマ ーの５′領域が相補的であって工程２における変性された第１回の増幅生成物の アニーリングを容易化させる。

Ｃ１ａよりｇｌエエＮｏｔＸ ＲＩＵ（プライマー３） ＢａｍよりｇｌエエＮｏｔ工 を追加量のプライマーを用いて反復し、ＰＣＲ生産物の量を増大させることがで きる。

（ａ）ＴＫ遺伝子は０．４３〜０．５３の間に位置するｐ　ＥｃｏＲＶ／Ｘｈｏ ｌ断片ＲＸ　２　！、：位置した。

（ｃ）ＲＸ２のサブクローン化および重なり断片の配列決定は正確な位置決定と ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列とを与えた。

第２図 （ａ）ＴＫ遺伝子を含有する断片Ｒ３３の制限酵素パターン。

（ｂ）Ｒ３３から欠失したＴＫ遺伝子（Ｓｍａ　Ｉ−Ｂ　５ｔＸＩ）における０ 　７３ｋｂｐ欠失〇（ｃ）ＲＸ２から欠失したＴＫ遺伝子（Ｓｍａ　Ｉ−Ｂ　５ ｔＥＩＩ）における０、５２ｋｂｐ欠失。

第３図 この図面は、実施例４の工程１〜３にしたがうポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 技術を用いたＴＫ遺伝子の領域の欠失手段を示している。

第４図 この図面は、実施例４から得られたＴＫ−ＤＮＡ　ＰＣＲ生産物を適するプラス ミドベクターにクローン化するための手段を示している（工程４）。

配列リスト ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ 配列型　：蛋白対応ヌクレオチド 配列長さ　：１２６０塩基；３５２アミノ酸鎖型　ニ一本鎖 トポロジー　・線状 分子型　ニゲツムＤＮＡ 初期原料 生物　、馬ヘルペスウィルスー４ 直接的実験 原料　ニゲツムＢａｍＨＩ保存物 特徴： ２１〜２５ｂｐの推定ＴＡＴＡ信号からｂｐ４７の推定ポリメラーゼ開始部位 １０９〜１１４ｂｐのポリＡ信号から 性質　：チミジンキナーゼ遺伝子 ＳＢ４　５ＡＬＩ　ＳＡＭＨ！　＋ ７６９　フ８６　１ヨ０８　１８２４ ＮＡ ＴＫ−欠失 ＮＡ Ｘｂａｌ　εＣ０ＲＶ　５ｓｔｌ 要約書 における欠失および／または挿入によって達成することができる。さらに本発明 は、ＥＨＶ−４ゲノムに挿入された外来遺伝子を有するＥＨＶ−４突然変異体か らなるベクターワクチンにも関するものである。

補正音の翻訳文提出書 （特許法１８４条の８） 平成５年　１月　６日

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．チミジンキナーゼをコードする遺伝子における欠失および／または挿入の結 果として官能性チミジンキナーゼを産生しないことを特徴とするＥＨＶ−４突然 変異体。
2. ２．欠失もしくは挿入の領域の末端がチミジンキナーゼ遺伝子のエンドヌクレア ーゼ制限部位に対応しない請求の範囲第１項に記載のＥＨＶ−４突然変異体。
3. ３．欠失もしくは挿入がチミジンキナーゼ遺伝子のＣ−末端コード領域に存在す る請求の範囲第２項に記載のＥＨＶ−４突然変異体。
4. ４．ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種核酸配列が挿入されること を特徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体。
5. ５．異種核酸配列が、前記ＥＨＶ−４突然変異体で感染した細胞における前記核 酸配列の発現を調整するプロモータの制御下にあることを特徴とする請求の範囲 第４項に記載のＥＨＶ−４突然変異体。
6. ６．異種核酸配列が馬病原体の抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲第 ４項または第５項に記載のＥＨＶ−４突然変異体。
7. ７．抗原がＥＨＶ−１または馬インフルエンザ抗原であることを特徴とする請求 の範囲第６項に記載のＥＨＶ−４突然変異体。
8. ８．ベクター分子とＥＨＶ−４チミジンキナーゼ遺伝子領域の１部とからなる組 換ＤＮＡ分子。
9. ９．チミジンキナーゼ遺伝子に欠失および／または挿入を有することを特徴とす る請求の範囲第８項に記載の組換ＤＮＡ分子。
10. １０．請求の範囲第９項に記載の組換ＤＮＡ分子を含有する宿主細胞。
11. １１．細胞培養物にＥＨＶ−４ＤＮＡと請求の範囲第７項に記載の組換ＤＮＡ分 子とを同時トランスフェクトすることを特徴とする請求の範囲第１〜７項のいず れかに記載のＥＨＶ−４突然変異体の製造方法。
12. １２．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体で感染し た細胞培養物。
13. １３．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体から誘導 されるワクチン。
14. １４．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＥＨＶ−４突然変異体と、その 医薬上許容しうるキャリヤとからなるワクチン。
15. １５．ＥＨＶ−４含有物質を請求の範囲第１２項に記載の細胞培養物から回収し て、これを免疫活性を有する製剤まで処理することを特徴とするＥＨＶ−４ワク チンの製造方法。