JPH06253852A - Ｃｃｖワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）感染を攻撃す
るためのワクチン及びそのようなワクチンの調製のため
の組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。 【構成】 イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）のＥ₂ タンパ
ク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を
含んで成るポリヌクレオチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）感染を攻撃す
るためのワクチン及び そのようなワクチンの調製のための組換えポリヌクレオ
チド及びポリペプチドに 関する。

【０００２】 ＣＣＶは、いわゆるコロナウィルス科のグループに属す
る。そのコロナウィル スは、ウィルス粒子の形態にそれらの名称を負う。この
粒子は、ＲＮＡ分子及び Ｎ，Ｅ₁ 及びＥ₂ として示される３種のタンパク質から
製造される。ＲＮＡ分子 及びＮタンパク質（ヌクレオキャプシドタンパク質）は
一緒に、ウィルス粒子の コアーを構成する。このコアーは、Ｅ₁ 及びＥ₂ タンパ
ク質から構成される膜に より囲まれる。Ｅ₂ タンパク質は、ウィルス粒子にかさ
（コロナ）の出現を付子 する、明白な形跡を有する突起（いわゆるスパイク又は
ペプロマー）の形で現わ れる。

【０００３】 ＣＣＶによるイヌの感染は、数ある中で、腸炎をもたら
すことができる。すべ ての年齢のイヌがＣＣＶ感染に対して敏感であるとして
も、若い子犬は、年とっ た犬よりも一層敏感である。臨床的な徴候は、感染後１
〜５日以内に現われる。 その徴候は、食欲の低下から発熱、下痢、嘔吐及び昏睡
に変化する。ひじょうに 水のような下痢が１０日以上の間続き、脱水の相当の危
機を包含する。特に若い 子犬は脱水の相当の危機を受け、そして致死率はひじょ
うに高い。二次感染（細 菌又はパルボウィルスによる）は、その症候群を相当に
高める。

【０００４】 多くの研究が、ＣＣＶに対する適切なワクチンを開発す
るためになされて来た 。これは、保護が腸における局部的な免疫性によっての
み得られる理解を導びく 。従って、予防接種は、腸における局部的な免疫応答の
誘発を目ざす必要がある 。非経口的に適用されたＣＣＶワクチンの価値は問題が
ある。

【０００５】 ＣＣＶ感染に対する不活性化されたワクチンは最近、副
作用、たとえば脳炎を 引き起こすことが知られているので、使用されていな
い。従って、ＣＣＶ感染に 対する安全且つ効果的なワクチンの必要性が存在する。

【０００６】 本発明によれば、ワクチンは、Ｅ₂ タンパク質又はその
一部をコードするポリ ヌクレオチド、又はＥ₂ タンパク質の少なくとも一部に
対応する合成ポリペプチ ドに基づいて供給され得る。

【０００７】 本発明は、ＣＣＶのＥ₂ タンパク質をコードし、そして
配列番号１で表わされ るヌクレオチド配列の発見に基づかれている。このヌク
レオチド配列から、Ｅ₂ タンパク質のアミノ酸配列が誘導され、これはまた、配
列番号１で表わされる。

【０００８】 従って、本発明は、Ｅ₂ タンパク質及び配列番号１のア
ミノ酸配列の少なくと も一部を有するポリペプチドＥ₂ タンパク質フラグメン
ト（Ｅ₂ ポリペプチド） に関する。 より特定には、対象のＥ₂ ポリペプチドは、犬への投与
に基づいてＣＣＶに対 する免疫応答を誘発することができる。

【０００９】 従って、本発明は、配列番号１のＤＮＡ及びそのフラグ
メントのみならずまた 、前記ＤＮＡ及びそのフラグメントにハイブリダイズ
し、そしてＣＣＶのＥ₂ タ ンパク質の免疫原性特性を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドに も関する。

【００１０】 本発明はまた、ＣＣＶのＥ₂ タンパク質の免疫原性特性
を有するポリペプチド をコードするポリヌクレオチドにも関し、ここで配列番
号１のＤＮＡ又はそのフ ラグメント、又は前記ハイブリダイズするポリヌクレオ
チドのコドンの少なくと も一部が同じアミノ酸のための他のコドンにより置換さ
れる。

【００１１】 小さな抗原はしばしば、免疫原として有用でない。従っ
て、Ｅ₂ ポリペプチド は、ホモポリマー（結合される複数の同一のＥ₂ ポリペ
プチド）又はヘテロポリ マー（１又は複数の異なったＥ₂ ポリペプチドに結合さ
れ、又はＣＣＶ又は他の 病原体の特徴を有する１又は複数の異なったポリペプチ
ドに結合される１又は複 数のＥ₂ ポリペプチド）として調製され得、又は免疫原
性を増強するために１又 は複数の他の化合物に結合され得る。

【００１２】 本発明の特定の態様によれば、上記いづれかの変性にお
いて、Ｅ₂ ポリペプチ ドは、合成的に、たとえば相同的合成又は固相ポリペプ
チド合成により調製され 得る。

【００１３】 適切なＥ₂ ポリペプチドの特定のアミノ酸配列は、配列
番号１のアミノ酸配列 及び場合によっては、Ｅ₂ タンパク質の空間的形態に由
来することができる。適 切なＥ₂ ポリペプチドは、たとえばＨｏｐｐ ａｎｄ
Ｗｏｏｄｓにより記載さ れる技法も適用することによって、Ｅ₂ タンパク質の最
っとも親水性部分から選 択され得る。そのようなポリペプチドを選択するための
もう１つの適切な方法は 、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎにより記載される。

【００１４】 多くの方法が、タンパク質上の免疫原的に重要なエピト
ープの位置を予測する ために開発されて来た。種々の予測の結果は、抗原部位
の良好な予測を付与する 。

【００１５】 図１は、ＣＣＶ−Ｅ₂ −タンパク質で抗原的に重要な領
域を最終的に予測する ために使用されて来た種々のアルゴリズムを示す。

【００１６】親水性プロット は、Kyte and Doolittle〔J. Mol. Bio
l., 157;105〜132 (198 2)〕に従って行なわれた。表面確率 はＥｍｉｎｉなどの公式を用いて決定され、こ
こで単一の確立はＪａ ｎｉｎなど〔J. Mol. Biol., 125;357〜386 (1978)〕に
取られた。

【００１７】鎖柔軟性 は、Ｋａｒｐｌｕｓなど〔Naturwissenschafte
n,72:212〜213(1985) 〕の方法を用いて評価された。抗原性インデックス （すなわち領域が抗原性である確
立）は、Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ〔CABIOS, 2(1);181〜186 (1988)〕に
より記載されるように して計算された。

【００１８】転換 、α−ヘリックス及びβ−シートは、Ｃｈｏｕ ａ
ｎｄ Ｆａｓｍａｎの 方法〔Chou P.Y. and Fasman G.D.(1987)Advances in E
nzynology 47, 45〜148 〕及び（わずかに改良された）Ｒｏｂｓｏｎ−Ｇａｒｎ
ｉｅｒの方法〔Garnier など.(1987):J. Mol. Biol., 120;97 〕を用いて予測さ
れる。適切なエピトープ の位置に対する追加の情報は、Ｇｅｙｓｏｎ ａｎｄ
Ｍｅｌｏｅｎ〔Geyson, H.M., Meloen, R.H. and Barteling, S.J. (1984):Pro
c. Natl. Acad. Sci., 81 (13); 3998〜4002〕により開発されたＰＥＰＳＣＡＮ−
方法を用いて得られる。

【００１９】 この方法は、酵素結合イムノソルベントアッセイにおい
て反応するのに十分な 長さの合成ペプチドを使用する。これらのペプチドは、
与えられたＤＮＡ−配列 に従って合成される、それらは、第１ペプチドがアミノ
酸ｎｒ．１−９を包含し 、第２ペプチドがアミノ酸ｎｒ．２−１０等を包含する
事実により特徴づけられ る。

【００２０】 個々のペプチドは、抗血清又はモノクローナル抗体との
その反応性について試 験される。次に反応性ペプチドは、免疫原性エピトープ
を表わすべきである。

【００２１】 本発明の他の特定の態様によれば、Ｅ₂ −タンパク質特
異的ポリペプチドは、 組換えポリヌクレオチドの一部を形成するポリヌクレオ
チド配列番号１の少なく とも一部を有するポリヌクレオチドの発現により生成さ
れる。組換えポリヌクレ オチドは好ましくは、そこに挿入されるＣＣＶ−特異的
ポリヌクレオチドフラグ メントを有するベクターに基づかれ得る。適切なベクタ
ーはプラスミド、バクテ リオファージ、コスミド、ウィルス、ミニクロモソーム
又は安定組込みベクター であり；特に後者は植物又は動物細胞のために好まし
い。一般的に、これらのベ クターは、アトノーマス複製の性質を有し、但し、宿主
細胞の遺伝子材料にそれ らを挿入し、そして宿主の遺伝子材料と共に複製する安
定組込みベクターを除く 。適切な宿主細胞は、原核又は真核、たとえば細菌、酵
母、ヌイコプラズマ、藻 類、植物細胞又は動物細胞であり得；植物細胞又は動物
細胞はインビトロで培養 され得、又は損なわれていない植物又は動物の一部を形
成できる。組換えポリヌ クレオチドは、挿入体として、Ｅ₂ タンパク質又はその
フラグメントをコードす る完全なポリヌクレオチドを含むことができる。挿入体
は、単一のコード配列、 又はその同じ配列の複数コピー、又は少なくとも１つの
Ｅ₂ タンパク質コード配 列及び少なくとも１つの第２配列、たとえばＥ₂ タンパ
ク質コード配列の異なっ た部分又は他の病原体の特徴的なタンパク質又は小さな
Ｅ₂ −ポリペプチドのた めのキャリヤーとして機能する不活性タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド を含むハイブリッドポリヌクレオチドを含んで成る。

【００２２】 上記態様の特定の場合は、いわゆるベクターワクチンと
して直接的に有用なウ ィルスベクターを有する組換えポリヌクレオチドに関す
る。この目的のために適 用できるウィルスは、免疫化される動物、すなわち犬に
おいて複製する能力を有 すべきである。さらに、これらのウィルスは、ワクチン
接種された動物において また発現される予定である外来性遺伝子（たとえばＣＣ
Ｖ−Ｅ₂ タンパク質又は ポリペプチドをコードする）の挿入のために適切なゲノ
ム領域を有すべきである 。この目的のための適切なウィルスは、腸内ウィルス、
たとえば一定のアデノウ ィルスである。

【００２３】 上記のように、本発明のタンパク質及びポリペプチド、
並びに組換えポリヌク レオチドは、ワクチンの調製において有用である。従っ
て、これらのワクチンは また、本発明の一部を形成する。

【００２４】 本発明の特定の用途は、細菌ベクターワクチンに関す
る。ここで、犬において コロニ化することができる細菌が、Ｅ₂ タンパク質又は
Ｅ₂ ポリペプチドの発現 を可能にするために、ＣＣＶに対する免疫原性応答を導
びくであろうような態様 で形質転換される。この目的のための適切な細菌は、た
とえばサルモネラ細菌で ある。

【００２５】 本発明のワクチンはまた、補助のワクチン成分、たとえ
ばキャリヤー緩衝液、 安定剤、可溶化剤、アジュバンド及び保存在も含むこと
ができる。好都合には、 これらのワクチンは、適用の前、適切な液体（水、緩衝
液）の添加により再構成 される凍結乾燥生成物である。 ワクチンは、経口的に、鼻腔内に又は筋肉内に適用され
得る。

【００２６】 ワクチンはさらに、犬のための他の免疫原、たとえばイ
ヌパルボウィルス、イ ヌアデノウィルス、ボーデテラ ブロンキセプチカ（Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂ ｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ ）、カムピロバクター ジ
ジュニ（Ｃａｍｐｉｌｏ ｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カムピロバクター コ
リ（Ｃａｍｐｉｌｏｂａ ｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、イエルシニア エンテロコリチ
カ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｃａ ）、レプトスピラ インテ
ロガン（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）及びボレリア ブル
グドルフェリ（Ｂｏｒｒ ｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の特徴を有する免
疫原性材料も含むことが できる。 本発明は、次の例により例示される。

【００２７】

【実施例】例１ ＣＣＶ Ｅ₂ 遺伝子の単離及び配列決定 細胞及びウィルス フェリン カタス （Ｆｅｌｉｎｅ ｃａｔｕｓ）の完全
な胎児（ｆｃｗｆ）細 胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１
００ＩＵ）及びストレプ トマイシン（１００μｇ／ml）により補足されたダルベ
ンコ変性イーグル培地（ ＤＭＥＭ）中に増殖した。使用されるイヌコロナウィル
ス（ＣＣＶ）株（株Ｋ３ ７８）は、Ｄｕｐｈａｒから得られたフィールド単離物
であった。

【００２８】ウィルス感染された細胞の調製 ＣＣＶ−Ｋ３７８ウィルスを、プラーク精製し、そして
３７℃でｆｃｗｆ細胞 上で増殖せしめた。約５×１０⁷ 個の細胞を含む集密的
ローラーボトル（８５０ cm² ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、５０μｇ／mlのＤＥＡＥ−
デキストランを含むリン 酸緩衝溶液（ＰＢＳ−ＤＥＡＥ）２０mlの接種物中、
０．１のＴＣＩＤ₅₀の感染 の多重度を有する高い力価のＣＣＶ原液により感染せし
めた。ウィルス吸着を１ 時間続け、接種物を除き、そして細胞をＰＢＳにより１
度洗浄した。続いて、２ ５mlのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを添加した。感染後１５
時間で（細胞変性効果の 開始）、培養流体を除き、そして細胞をＰＢＳにより洗
浄した。

【００２９】ＲＮＡの単離 ウィルス感染された細胞からのＲＮＡの単離のために、
その細胞を、Ｍａｎｉ ａｔｉｓなど〔Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Samb
rouk, J. (1982):Molecu lar Cloning, A Laboratory Mannal, Cold Spring Harb
or Laboratory, New Yor k 〕により記載されているようにしてグアニジニウムチ
オシアネート（ＧＳＣＮ ）により溶解した。ＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど．
（１９８２）により実質 的に記載されているようにして、５．７ＭのＣｓＣｌの
クッションを通しての遠 心分離により単離した。ＲＮＡをさらに、フェノール抽
出、及びエタノール沈殿 により精製した。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓなど．（１９８２） により記載されているようにしてオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースカラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）上で単離した。

【００３０】ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡ合成のために、ＲＮＡを、ウシ胸腺ＤＮＡペン
タマー及びオリゴ（ｄ Ｔ）プライマー（両者ともＰｈａｒｍａｃｉａから得ら
れた）により感作した。 第１及び第２鎖合成を、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆ
ｆｍａｎ〔Gubler, U. a nd Hoffman, B.J.(1983):A simple and very efficient
method for generating cDNA libraries. Gene 25,263〜269 〕により記載され
ているようにして行なっ た。ｃＤＮＡを、ｄＣ残基により末端化し、ｄＧ−末端
化されたＰｓｔＩ消化さ れたｐＵＣ９プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアニ
ールし、Ｈａｎａｈａｎ 〔Hanahan, D. (1983):Studies on transformation of
Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557〜580 〕により記載
されているようにしてＥ ．コリ 株ＰＣ２４９５の形質転換のために使用した。細
胞を、５０μｇ／mlのア ンピシリンを含むペトリ皿上にプレートした。約５００
０個の独立した形質転換 体を得、これを、異種プローブとしてＦＩＰＶ〔de Gro
ot, R.J., Maduro, J., Lenstra, J.A., Horzinek, M.C., Van de Zeijst, B.A.
M. and Spoan, W.J.M. ( 1987):cDNA cloning and sequence ceralysis of the g
ene encoding the peplo mer protein of feline infectious peritonitis viru
s, J. Gen. Virol. 68, 2639〜2646〕の³²Ｐ−ラベルされたＳ遺伝子との現場コ
ロニーハイブリダイゼー ションによるＣＣＶ−Ｅ₂ 配列を含む組換え体の存在に
ついてスクリーンした。

【００３１】ＣＣＶ−Ｅ₂ ｃＤＮＡクローンの単離 ＦＩＰＶ−Ｓ遺伝子とＣＣＶ−ｃＤＮＡライブラリーと
のハイブリダイゼーシ ョンを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど．（１９８２）により記
載されているようにして 実施した。ＤＮＡプローブを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど．
（１９８２）に従ってニ ックトランスレーションにより調製した。０．４〜３．
０kb（平均の長さ１．５ kb）の範囲の挿入体を含む、約２５個の陽性組換え体プ
ラスミドを得た。小規模 及び大規模なプラスミドＤＮＡ単離を、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓなど．（１９８２）に 従って行なった。ＣＣＶ−ｃＤＮＡクローンの制限地図
及び物理的地図を、制限 酵素分析により及びＦＩＰＶ−Ｓ遺伝子の異なったフラ
グメントとのハイブリダ イゼーションにより構成した。

【００３２】ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子の配列決定 ＣＣＶ−Ｅ₂ ｃＤＮＡの制限フラグメントを、アガロ
ースゲル電気泳動によ り分離し、そしてＤＮＡをガラス−ミルク（ＧｅｎｅＣ
ｌｅａｎ ＴＭ）により アガロースから精製した。続いて、ＤＮＡフラグメント
を、バクテリオファージ Ｍ１３ ｍｐ１８／ｍｐ１９ベクター〔Yanisch-Perro
n, C., Vieira, J. and M essing, J.(1985):Improved M13 phage cloning vector
s and host strains:nuc leotide sequences of the M13 mp18 and pUC19 Vector
s. Gene 33, 103〜119 〕中に再クローン化した。配列決定を、Ｓａｎｇｅｒな
ど．〔Sanger, F., Nick len, S. and Coulson, A.R.(1977):DNA sequencing wit
h chain terminating in hibitors. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74, 5463〜54
67〕のジデオキシ−ヌク レオチド鎖−終結方法に従って行なった。

【００３３】 ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子をコードするＤＮＡ配列を、〔Stad
en, R.(1982):Automat ion of the computer handling of gel reading data p
roduced by the shotgun method of DNA sequencing. Nucleic Acid Res, 10, 4
731〜4751〕のコンピュ ータープログラム及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎにより 開発されたプログラムを用いて、ＤＥＣコンピューター
により分析した。その結 果は、配列番号１として示される。

【００３４】例２ ワクシニア−Ｔ₇ システムにおけるＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子
の発現 材料及び方法 ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子の発現のために、Ｆｕｒｓｔなど．
〔Furst, T.R., Niles , E.G., Studier, F.N. and Moss, B.(1986) PNAS USA
83, 8122〜8126〕により 記載されるようなＴ₇ ポリマラーゼ／プロモーターシス
テムを使用した。

【００３５】 基本的に、これは、次の２つの成分系である： １）中間にクローン化された選択の遺伝子と共にバクテ
リオファージＴ₇ プロモ ーター及びターミネーターを含むプラスミド、 ２）Ｐ７．５ワクシニアプロモーターの制御下でバクテ
リオファージＴ₇ ポリメ ラーゼ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルス組換え
体。 組換えプラスミドによる適切な細胞のトランスフェクシ
ョン、続く、組換えワ クシニアウィルスによる感染は、外来性遺伝子の発現を
導びく。 発現−ベクターｐＴＵＧ３を下記のようにして構成し、
そして図２に図的に示 す。

【００３６】 図２に使用される略語の列挙： Φ１０：Ｔ７プロモーター ＴΦ：Ｔ７ターミネーター ＬＺ′：ｐＵＣ１８のＬａｃＺフラグメント ＬａｃＰ：Ｌａｃプロモーター ＴＫ：チミジンキナーゼ配列 Ｐ７．５：ウクシニアウィルスＰ７．５プロモーター ＢＨ：ＢａｍＨ１ Ｓ：Ｓａｃ１ Ｃ：Ｃｌａ１ Ｓ：Ｓａｌ１ Ｅ：ＥｃｏＲ１ Ｓｍ：Ｓｍａ１ Ｈ：ＨｉｎｄIII Ｓｐ：Ｓｐｈ１ Ｋ：Ｋｎｐ１ Ｘｂ：Ｘｂａ１ Ｎ：Ｎａｒ１ Ｘ：Ｘｈｏ１ Ｐ：Ｐｓｔ１

【００３７】 ｐＡＲ２５２９（Ｆｕｒｓｔなど，１９８６）からのＴ
７プロモーター／ター ミネーターカセットを、ｐＵＣ１８のＢａｍＨ１部位中
にＢｇｌIIフラグメント としてクローン化した。ｌａｃＺプロモーターに対して
反対の方向にＴ７プロモ ーターを有するクローンを、ｐＴＵＣとして命名した。
ＢａｍＨ１によるｐＴＵ Ｃの切断の後、ＢａｍＨ１部位の突出する５′−末端
を、ヤエナリ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼにより分解し（この方法におい
ては、Ｔ７プロモーター に向かって８個の追加のヌクレオチドが除かれた）、そ
してＸｈｏＩ部位（ＣＣ ＴＣＧＡＧＧ）を含むリンカーをそれらの間にクローン
化し、ｐＴＵＸをもたら した。ｐＵＣ１８においては、ＸｈｏＩ部位を、タレノ
ウポリメラーゼによりフ ィルインされたＥｃｏＲ１部位中にＸｈｏＩリンカーを
クローン化することによ って創造し、その得られるプラスミドをｐＵＣＸと命名
した。このプラスミドの ＨｉｎｄIII とＸｈｏＩ部位との間に、ｐＧＳ２０（Ｍ
ａｃｋｅｔｔなど，１９ ８４）の１．７kbのＨｉｎｄIII ／ＸｈｏＩフラグメン
トをクローン化した、こ のフラグメントは、ワクチニアＴＫ配列及びワクチニア
Ｐ７．５プロモーターを 含んだ。その得られる構造体をｐＵＧＳ１と命名した。
ＸｈｏＩ部位の両側の約 ３０個のヌクレオチドを、エキソヌクレアーゼIII によ
り欠失した。これは、Ｘ ｈｏＩ 部位及び２つのＥｃｏＲ１部位の１つを欠くｐＵ
ＧＳ２をもたらした。ｐ ＵＧＳ３において、Ｐ７．５プロモーター部位のすぐ上
流のＣｌａＩ部位を、ク レノウによりフィルインされたＣｌａＩ部位中にＸｈｏ
Ｉリンカーをクローニン グすることによってＸｈｏＩ部位に転換した。ｐＴＵＧ
１の構成のために、ｐＵ ＧＳ３のＰ７．５プロモーターＸｈｏＩ／ＥｃｏＲ１フ
ラグメントを、ｐＴＵＸ のＳａｌＩ／ＥｃｏＲ１ Ｔ７プロモーター／ターミネ
ーターカセットにより置 換した。続いて、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲ１フラグメントを
除去し、そして突出する 末端をクレソウポリメラーゼによりフィルインし、ｐＴ
ＵＧ２を得た。

【００３８】 最後に、ｐＴＵＧ２のＸｈｏＩ部位中にｐＴＵＣＸのＸ
ｈｏＩ／ＳａｌＩポリ リンカーフラグメントをクローニングすることによっ
て、ｐＴＵＧ３を構成した 。ｐＴＵＧ３１は、１７０個のヌクレオチドの長さのｐ
ＵＣ１８のＮａｒＩ／Ｈ ｉｎｄIII ｌａｃＺフラグメントを欠くｐＴＵＧ３の
誘導体である。突出する 末端を、連結の前、クレノウ酵素によりフィルインし
た。

【００３９】 最終構造物は、複数のクローニング部位により分離さ
れ、そしてワクシニアウ ィルスチミジンキナーゼ配列により囲まれるＴ７プロモ
ーター及びターミネータ ー配列を含む。Ｔ７プロモーターは、転写体においてヘ
アピン構造を形成するこ とができる配列の前に存在する。

【００４０】 ｐＴＵＧ３から出発して、ｐＴＵＧ３ＣＣＶＳは、下記
のようにして構成され た（図３も参照のこと）： ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を含むｃＤＮＡ Ｐｓｔ１カセット
の５′−及び３′−非 コード配列を、図３に示されるようにして構造体ｐＢＳ
ＣＣＶＳ１（Centraalbu reau voor Schimmelcultures at Baarn, the Netherlan
dsで寄託された）から除 去した。

【００４１】 図３における略語の列挙： ＣＣＶＥ２：Ｐｓｔ１カセットとして、３′−及び５′
−非コード配列を両端に 有するＣＣＶ−スパイク遺伝子のコード領域を含むｃＤ
ＮＡフラグ メント ＡＴＧ：ＣＣＶＥ２−遺伝子の翻訳開始コドン ＳＴＯＰ：同じ遺伝子の停止コドン ＰＣＲ：ポリメラーゼ鎖反応

【００４２】 構造体ｐＢＳＣＣＶＳ１は、Ｐｓｔ１カセットとしてＣ
ＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子及び フランキング配列を含むｃＤＮＡを含む。位置−２１〜
−６及び＋４２０〜＋４ ００でのプライマーの付加、続くポリメラーゼ鎖反応
は、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃ II部位において続いてクローン化されるブラント末端化
されたフラグメントを生 成した。ＢａｍＨＩ及びＮｃｏ１による消化は、５′−
未翻訳ヌクレオチドをほ とんど含まないフラグメントを付与した。

【００４３】 元のｐＢＳＣＣＶＳ１構造体におけるＢａｍＨＩ／Ｎｃ
ｏ１フラグメントを、 続いて切断し、そして上記の短くされたＢａｍＨＩ／Ｎ
ｃｏ１フラグメントによ り置換し、ｐＢＳＣＣＶＳ２を生成した。

【００４４】 最後に、ｐＢＳＣＣＶＳ２及びｐＴＵＧ３を、Ｓａｃ１
及びＫｐｎ１により消 化した。ｐＴＵＧ３のＳａｃ１／Ｋｐｎ１部位における
ｐＢＳＣＣＶＳ２のＳａ ｃ１ ／Ｋｐｎ１フラグメントのクローニングは、ｐＴＵ
Ｇ２ＣＣＶＳを付与した 。 従って、ｐＴＵＧ３ＣＣＶＳは、Ｔ７プロモーターの制
御下でのＣＣＶスパイ ク−遺伝子のコード領域及び続いて２つの隣接するＴ７
ターミネーターを含む。

【００４５】過渡発現条件 Ｈｅｌａ細胞を、２５mlのフラスコ中で８０％の集密度
まで増殖し、そして細 胞当たり３０個のウィルス粒子の感染の多重性で組換え
ワクシニア−Ｔ７ウィル スにより感染せしめた。そのウィルスを、３７℃で３０
分間吸収せしめた。リン 酸カルシウム沈殿物を製造し、そして１５μｇのＤＮＡ
を含む溶液１mlを、ウィ ルス懸濁液の除去の後、細胞に添加した。室温で３０分
間のインキュベーション の後、１０％のＦＣＳを含む新鮮な培地を細胞に添加
し、そして細胞を３７℃で 維持した。トランスフェクションの後、種々の時間で、
細胞を収穫した。

【００４６】 図７は、Ｔ７プロモーターの制御下でのＣＣＶ−Ｅ₂ タ
ンパク質の発現を示す 。³⁵ Ｓ−ラベルされた放射性−免疫沈殿物を、１０％ポリ
−アクリルアミドゲル 上に使用した。 レーン １：¹⁴Ｃ−マーカー ２：ワクシニア−ウィルス感染細胞 ３：ワクシニア−感染＋ｐＴＵＧ３ ４：ＣＣＶ−感染細胞 ５：ワクシニア−感染＋ｐＴＵＧ３ＣＣＶＳ ６：ＦＩＰＶ−感染細胞 ７：ワクシニア感染＋ｐＴＵＧ３ＦＩＰＶ−Ｓ 注：ＦＩＰＶ及びＦＩＰＶ−構造体を、マーカーとして
使用した。

【００４７】例３ アデノウィルスＡｄ５中へのＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子のクロ
ーニング 及び救済 材料 細胞、ウィルス及びプラスミド Ａｄ５−形質転換されたヒト胚の腎細胞（２９３個の細
胞）をウィルスの救済 のために使用し、そしてそれを、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ
（ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）〔Graham, F.L., Smiley, J., Ru
ssel, W.C. and Nairn, R.(1977):Characteristics of a human cell line tran
s formed by DNA from h uman adenovirus 5 DNA. J. Gen. Virol36, 59〜72〕か
ら得た。ウィルスの滴定 及び増殖のために、またＨｅＬａ細胞を使用した。細胞
の単層培養をＭＥＭ Ｆ −１１培地に維持した。培地は、５％ウシ胎児血清によ
り補充された。すべての 細胞培養を、３７℃、１００％の湿度及び５％のＣＯ₂
の雰囲気下でインキュベ ーター中において行なった。Ａｄ５野生型ウィルス及び
Ａｄ５組換えウィルスを 、Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ（ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）と協同で 得、そして救済した。

【００４８】 組換えＤＮＡ作業のために使用されるすべての酵素は、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍから購入し、 そしてｖｅｎｄｏｒにより推薦される反応条件下で使用
した。プラスミドＤＮＡ を、アルカリ溶解方法〔Birnbiem, H. C. and Doly, J.
(1979) : A rapid alka line extraction procedure for screening recombinan
t plasmid DNA. Nucleic acid Res.７, 1513〜1523〕を用いて調製し、そしてそ
のＤＮＡをさらに、Ｃｓ Ｃｌ−エチジウムブロミド密度グラジエント上で精製し
た。ＤＮＡフラグメント を溶出し、そしてＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎｅ法を用いてア
ガロースから精製した。

【００４９】方法 Ａｄ５におけるＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子のクローニング １．ｐＳＶ−プラスミドの構成 プラスミドｐＳＶ２Ｘ１３は、ｐＳＶ２Ｘ１１に由来し
（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａ ｍ，公開されていない）；この後者のブラスミドはｐＳ
Ｖ２Ｘ１３に由来し（Ｌ ．Ｐｒｅｖｅｃ，公開されていない）。プラスミドｐＳ
Ｖ２Ｘ３はｐＳＶ２ｎｅ ｏに由来した〔Southern, P. J. and Berg, P. (1982)
: Transformation of ma mmalian cells to antibiotic resistance with a bact
erial gene under contr ol of the SV40 early region promoter. J. Mol Appl.
Genet. １, 327〜334 〕。ｐＳＶ２Ｘ３はＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４９の
プロモーター）配列、及 び適切な遺伝子を挿入するために使用されるポリリンカ
ー配列により分離される ポリ（Ａ）付加配列（（Ａ）_n ）を有する。そのカセッ
トは、ＸｂａＩ部位によ り囲まれる。ｐＳＶ２Ｘ１１を構成するために、ポリリ
ンカーとｐＳＶ２Ｘ３の ＳＶ４０プロモーターとの間で欠失を行ない、そしてユ
ニークＸｈｏＩ部位がこ の位置で創造された。続いて、アンピシリン耐性遺伝子
（ＡｍＰｒ）をその元の 位置から除去し、ＸｈｏＩリンカーを付加し、そしてそ
の遺伝子を、ｐＳＶ２Ｘ ３のユニークＸｈｏＩ部位中にサブクローン化した。得
られたｐＳＶ２Ｘ１１プ ラスミドは、２種のＸｈｏＩ部位を両端に有するアンピ
シリン耐性遺伝子を有す る。ポリリンカーにユニークＥｃｏＲＩ部位を有するよ
うに、両ＥｃｏＲＩ部位 の１つの不活性化により、ｐＳＶ２Ｘ１３をｐＳＶ２Ｘ
１１から誘導した。

【００５０】 ２．アデノウィルス トランスファー ベクターの構成 プラスミドｐＡＢ１４は、トランスファーベクターｐＦ
Ｇ１４４Ｋ３に由来し た〔Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ，公開されていない〕。ｐＦ
Ｇ１４４Ｋ３は、複製の 起点及びカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ^r ）を含むプラ
スミドに融合されるＡｄ ５ＤＮＡの右側４０％から成る。ｐＦＧ１４４Ｋ３のＡ
ｄ５部位は、不可欠なＥ １領域における欠失（１．３−１０．６交差単位）及び
非不可欠なＥ３領におけ る欠失（７８．５−８４．７交差単位）を有する。ｐＡ
Ｂ１４においては、Ｅ３ 領域における欠失を、Ａｄ５における大きな遺伝子をク
ローン化するために高め た（７８．３−８５．０交差単位）。また、ｐＡＢ１４
においては、ｐＦＧ１４ ４Ｋ３のＡｄ５部位におけるＸｈｏＩ及びＳａｌＩ部位
を不活性化した。ｐＡＢ １４のユニークＸｂａＩ部位におけるポリリンカーの挿
入により、プラスミドｐ ＡＢ１６をｐＡＢ１４から誘導した〔Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈ
ａｍ，公開されていない 〕。ｐＡＢ１６においては、遺伝子を、ＳＶ４０プロモ
ーター及びＳＶ４０ポリ （Ａ）付加配列を両端に有さないＡｄ５の欠失されたＥ
３領域中に直接的にクロ ーン化することができる。対象の遺伝子が適切なトラン
スファーベクターにクロ ーンされる場合、相補的なＡｄ配列を含む第２プラスミ
ドｐＦＧ１７３と共にこ の構造体は、２９３個の細胞中に同時トランスフェクト
された（Ｇｒａｈａｍな ど．，１９７７）。ｐＦＧ１７３は、ウィルス複製のた
めに必要なＡｄ５左側端 からの配列を補充し、そしてＡｄゲノムの７５．９及び
８５．０交差単位の間の 領域を含む致死性欠失を担持する。個々のプラスミド
（アデノトランスファーベ クター及びｐＦＧ１７３）は単独で感染性でない。

【００５１】 ３．アデノウィルストランスファー ベクターにおける
ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子のク ローニング ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を、ｐＢＬｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ
−のポリリンカーのＰ ｓｔ１ 及びＥｃｏＲ１部位中にクローン化した。このプ
ラスミドは、ｐＵＣ１９ に由来した（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど．，１
９８５）。続いて、ＣＣ Ｖ−Ｅ₂ 遺伝子の５′末端での５′非−コード領域及び
ｄＧ／ｄＣ−末端を除去 した。ＣＣＶ−Ｓ遺伝子を続いて、アデノウィルストラ
ンスファーベクターｐＪ Ｗ１３中にクローン化した（図４）。このトランスファ
ーベクターを、ｐＡＢ１ ４のＸｂａＩ部位中にｐＳＶ２Ｘ１３のＸｈａＩカセッ
ト（ＳＶ４０プロモータ ー、ポリリンカー、アンピシリン耐性遺伝子及びＳＶ４
０ポリアデニル化シグナ ル配列を含む）をクローニングすることによって構成し
た。ｐＪＷ１３は、アン ピシリン及びカナマイシン耐性遺伝子の両者を含む。ｐ
ＪＷ１３におけるＳＶ４ ０プロモーターの配向は、Ｅ３プロモーターに対して平
行である。ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を、ｐＪＷ１３のＢａｍＨ１及びＸｈｏ１（Ｘｈ
ｏ）部位中にクローン化 し、アンピシリン遺伝子の欠失をもたらした。この構造
体はｐＪＷ１６と呼ばれ （図５）、そしてＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を、ＳＶ４０−プ
ロモーター／ポリ（Ａ） シグナル配列を用いて表わした。ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を
また、欠失されたＥ３領 域のＢａｍＨ１及びＳａｌ１部位を用いてｐＡＢ１６中
に直接的にクローン化し た（すなわち、ＳＶ４０プロモーター／ＳＶ４０ポリア
デニル化シグナル配列の 不在下で）。ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を、その配向がアデノ
ウィルスＥ３プロモータ ーの転写の方向に平行するような態様でクローン化し
た。この構造体をｐＪＷ１ ７と命名した（図６）。

【００５２】組換えＭ５ウィルスの救済及び精製 ６０mmの皿における２９３個の細胞の半集密性単層を、
リン酸カルシウム沈殿 技法によりプラスミドｐＦＧ１７３＋ｐＪＷ１６／ｐＪ
Ｗ１７プラスミドにより 同時トランスフェクトした〔Graham, F. L. and Van de
r Eb, A. J. (1973) : A new technique for assay of infectivity of adenovir
us 5 DNA. Virology 52 , 456〜467 〕。この場合、ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を含む
組換えＡｄ５ウィルスが 救済された。そのＡｄ５ウィルスは、Ａｄ５ＣＣＶ−Ｓ
１（ｐＪＷ１６誘導体） 及びＡｄ５ＣＣＶ−Ｓ２（ｐＪＷ１７誘導体）と呼ばれ
る。８〜１０日後、個々 のプラークを単離し、そしてそれを用いて、６０mmの皿
の中の２９３個の細胞を 感染せしめた。ウィルスＤＮＡを、ＨｉｎｄIII 又はＸ
ｂａＩによる消化及び１ ％アガロースゲル中での電気泳動により分析した。組換
えＡｄウィルスを２度プ ラーク精製し、そして制限酵素消化により再分析した。
ウィルスを、ウィルス貯 蔵物の大規模調製物を得るためにＨｅＬａ細胞中で増殖
せしめた。

【００５３】組換えＡｄ５ウィルスの救済及び精製 ６０mm皿における２９３個の細胞の半集密性単層を、リ
ン酸カルシウム沈殿技 法（Ｇｒａｈａｍなど．，１９７３）を用いて、プラス
ミドｐＦＧ１７３＋ｐＪ Ｗ１６／ｐＪＷ１７プラスミド（図４，５及び６を参照
のこと）により同時トラ ンスフェクトした。この場合、ＣＣＶ−Ｅ₂ 遺伝子を含
む組換えＡｄ５ウィルス が救済された。そのＡｄ５ウィルスを、Ａｄ５ＣＣＶ−
Ｓ１（ｐＪＷ１６誘導体 ）及びＡｄ５ＣＣＶ−Ｓ２（ｐＪＷ１７誘導体）と呼
ぶ。８〜１０日後、個々の プラークを単離し、そしてそれを用いて、６０mm皿中の
２９３個の細胞を感染せ しめた。ウィルスＤＮＡを、ＨｉｎｄIII 又はＸｂａＩ
による消化及び１％アガ ロースゲルにおける電気泳動により分析した。組換えＡ
ｄウィルスを二度プラー ク精製し、そして制限酵素消化により再分析した。ウィ
ルスをＨｅＬａ細胞中で 増殖し、ウィルス貯蔵物の大規模調製物を得た。

【００５４】 配列の列挙 配列番号１についての情報 配列の特徴： （Ａ）長さ：４４８６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ〜ゲノムＤＮＡ 起源： （Ａ）生物名：イム コロナ ウィルス （Ｂ）株名：Ｋ３７８ 直接の起源 細胞系の名称：ＣＢＳ ４８５．９０ 配列の特徴： （Ａ）位置：１６９〜４４５５の塩基対 （Ｂ）他の情報：読取り枠 性質：スパイクタンパク質（＝Ｅ２タンパク質） 配列の説明： TGTTAATTTA AAAGAAAAAG AATTGAATGA AATGGTTGTT GGATTACTAA 50 GGAAAGGTAA GTTGCTCATT AGAAACAATG CAAAACTACT AAACTTTGGT 100 AATCACTTGG TTAATGTGCC ATG ATT GTG CTA ATA TTG TGC CTC CTC 147 Met Ile Val Leu Ile Leu Cys Leu Leu 1 5 TTG TTT TCG TAC AAT AGT GTG ATT TGT ACA TCA AAC AAT GAC TGT 192 Leu Phe Ser Tyr Asn Ser Val Ile Cys Thr Ser Asn Asn Asp Cys 10 15 20 GTA CAA GGT AAT GTG ACA CAA TTG CCT GGC AAT GAA AAC ATT ATT 237 Val Gln Gly Asn Val Thr Gln Leu Pro Gly Asn Glu Asn Ile Ile 25 30 35 AAA GAT TTT CTA TTT CAC ACC TTC AAA GAA GAA CCA AGT GTA GTT 282 Lys Asp Phe Leu Phe His Thr Phe Lys Glu Glu Pro Ser Val Val 40 45 50 GTT GGT GGT TAT TAC CCT ACA GAG GTG TGG TAT AAC TGC TCC AGA 327 Val Gly Gly Tyr Tyr Pro Thr Glu Val Trp Tyr Asn Cys Ser Arg 55 60 65 AGC GCA ACA ACC ACC GCT TAC AAG GAT TTT AGT AAT ATA CAT GCA 372 Ser Ala Thr Thr Thr Ala Tyr Lys Asp Phe Ser Asn Ile His Ala 70 75 80 TTC TAT TTT GAT ATG GAA GCC ATG GAG AAT AGT ACT GGC AAT GCA 417 Phe Tyr Phe Asp Met Glu Ala Met Glu Asn Ser Thr Gly Asn Ala 85 90 95 CGA GGT AAA CCT TTA CTA GTA CAT GTT CAT GGT GAT CCT GTT AGT 462 Arg Gly Lys Pro Leu Leu Val His Val His Gly Asp Pro Val Ser 100 105 110 ATC ATC ATA TAT ATA TCG GCT TAT AGA GAT GAT GTG CAA CCA AGG 507 Ile Ile Ile Tyr Ile Ser Ala Tyr Arg Asp Asp Val Gln Pro Arg 115 120 125 CCT CTT TTA AAA CAT GGT TTG TTG TGT ATA ACT AAA AAT AAA ATC 552 Pro Leu Leu Lys His Gly Leu Leu Cys Ile Thr Lys Asn Lys Ile 130 135 140 ATT GAC TAT AAC ACG TTT ACC AGC GCA CAG TGG AGT GCC ATA TGT 597 Ile Asp Tyr Asn Thr Phe Thr Ser Ala Gln Trp Ser Ala Ile Cys 145 150 155 TTG GGT GAT GAC AGA AAA ATA CCA TTC TCT GTC ATA CCC ACA GAT 642 Leu Gly Asp Asp Arg Lys Ile Pro Phe Ser Val Ile Pro Thr Asp 160 165 170 AAT GGT ACA AAA ATA TTT GGT CTT GAG TGG AAT GAT GAC TAT GTT 687 Asn Gly Thr Lys Ile Phe Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asp Tyr Val 175 180 185 ACA GCC TAT ATT AGT GAT CGT TCT CAC CAT TTG AAC ATC AAT AAT 732 Thr Ala Tyr Ile Ser Asp Arg Ser His His Leu Asn Ile Asn Asn 190 195 200 AAT TGG TTT AAC AAT GTG ACA ATC CTA TAC TCT CGA TCA AGC TCT 777 Asn Trp Phe Asn Asn Val Thr Ile Leu Tyr Ser Arg Ser Ser Ser 205 210 215 GCT ACG TGG CAG AAG AGT GCT GCA TAT GTT TAT CAA GGT GTT TCA 822 Ala Thr Trp Gln Lys Ser Ala Ala Tyr Val Tyr Gln Gly Val Ser 220 225 230 AAT TTT ACT TAT TAC AAG TTA AAT AAC ACC AAT GGC TTG AAA AGC 867 Asn Phe Thr Tyr Tyr Lys Leu Asn Asn Thr Asn Gly Leu Lys Ser 235 240 245 TAT GAA TTG TGT GAA GAT TAT GAA TAC TGC ACT GGC TAT GCT ACC 912 Tyr Glu Leu Cys Glu Asp Tyr Glu Tyr Cys Thr Gly Tyr Ala Thr 250 255 260 AAC GTA TTT GCC CCG ACA GTG GGC GGT TAT ATA CCT CAT GGC TTC 957 Asn Val Phe Ala Pro Thr Val Gly Gly Tyr Ile Pro His Gly Phe 265 270 275 AGT TTT AAC AAT TGG TTT ATG CGG ACA AAC AGT TCC ACG TTT GTT 1002 Ser Phe Asn Asn Trp Phe Met Arg Thr Asn Ser Ser Thr Phe Val 280 285 290 AGT GGC AGA TTT GTA ACA AAT CAA CCA TTA TTG GTT AAT TGT TTG 1047 Ser Gly Arg Phe Val Thr Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu 295 300 305 TGG CCA GTG CCC AGT TTT GGT GTC GCA GCA CAA CAA TTT TGT TTT 1092 Trp Pro Val Pro Ser Phe Gly Val Ala Ala Gln Gln Phe Cys Phe 310 315 320 GAA GGT GCG CAG TTT AGC CAA TGT AAT GGT GTG TCT TTA AAC AAT 1137 Glu Gly Ala Gln Phe Ser Gln Cys Asn Gly Val Ser Leu Asn Asn 325 330 335 ACA GTG GAT GTC ATT AGA TTC AAC CTT AAT TTT ACC GCA TTA GTA 1182 Thr Val Asp Val Ile Arg Phe Asn Leu Asn Phe Thr Ala Leu Val 340 345 350 CAA TCT GGC ATG GGT GCT ACA GTA TTT TCA CTG AAT ACA ACA GGT 1227 Gln Ser Gly Met Gly Ala Thr Val Phe Ser Leu Asn Thr Thr Gly 355 360 365 GGT GTC ATT CTT GAG ATT TCT TGT TAT AAT GAT ACA GTG AGT GAG 1272 Gly Val Ile Leu Glu Ile Ser Cys Tyr Asp Asp Thr Val Ser Glu 370 375 380 TCA AGT TTC TAC AGT TAT GGT GAA ATT TCA TTC GGC GTA ACT GAT 1317 Ser Ser Phe Tyr Ser Tyr Gly Glu Ile Ser Phe Gly Val Thr Asp 385 390 395 GGA CCG CGT TAC TGT TTC GCA CTC TAT AAT GGC ACG GCT CTT AAG 1362 Gly Pro Arg Tyr Cys Phe Ala Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Lys 400 405 410 TAT TTA GGA ACA TTA CCA CCT AGT GTC AAG GAA ATT GCT ATT AGT 1407 Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Pro Ser Val Lys Glu Ile Ala Ile Ser 415 420 425 AAG TGG GGC CAT TTT TAT ATT AAT GGT TAC AAT TTC TTT AGC ACT 1452 Lys Trp Gly His Phe Tyr Ile Asn Gly Tyr Asn Phe Phe Ser Thr 430 435 440 TTT CCT ATT GAT TGT ATA TCT TTT AAT TTA ACC ACT GGT GAT AGT 1497 Phe Pro Ile Asp Cys Ile Ser Phe Asn Leu Thr Thr Gly Asp Ser 445 450 455 GGA GCA TTT TGG ACA ATT GCT TAC ACA TCG TAC ACT GAC GCA TTA 1542 Gly Ala Phe Trp Thr Ile Ala Tyr Thr Ser Tyr Thr Asp Ala Leu 460 465 470 GTA CAA GTT GAA AAC ACA GCT ATT AAA AAG GTG ACG TAT TGT AAC 1587 Val Gln Val Glu Asn Thr Ala Ile Lys Lys Val Thr Tyr Cys Asn 475 480 485 AGT CAC ATT AAT AAC ATT AAA TGT TCT CAA CTT ACT GCT AAT TTG 1632 Ser His Ile Asn Asn Ile Lys Cys Ser Gln Leu Thr Ala Asn Leu 490 495 500 CAA AAT GGA TTT TAT CCT GTT GCT TCA AGT GAA GTT GGT CTT GTC 1677 Gln Asn Gly Phe Tyr Pro Val Ala Ser Ser Glu Val Gly Leu Val 505 510 515 AAT AAG AGT GTT GTG TTA CTA CCT AGT TTC TAT TCA CAT ACC AGT 1722 Asn Lys Ser Val Val Leu Leu Pro Ser Phe Tyr Ser His Thr Ser 520 525 530 GTT AAT ATA ACT ATT GAT CTT GGT ATG AAG CGT AGT GGT TAT GGT 1767 Val Asn Ile Thr Ile Asp Leu Gly Met Lys Arg Ser Gly Tyr Gly 535 540 545 CAA CCC ATA GCC TCA ACA TTA AGT AAC ATC ACA CTA CCA ATG CAG 1812 Gln Pro Ile Ala Ser Thr Leu Ser Asn Ile Thr Leu Pro Met Gln 550 555 560 GAT AAT AAC ACC GAT GTG TAC TGC ATT CGT TCT AAC CGA TTT TCA 1857 Asp Asn Asn Thr Asp Val Tyr Cys Ile Arg Ser Asn Arg Phe Ser 565 570 575 GTT TAC TTT CAT TCC ACT TGT AAA AGT TCT TTA TGG GAC GAT GTG 1902 Val Tyr Phe His Ser Thr Cys Lys Ser Ser Leu Trp Asp Asp Val 580 585 590 TTT AAT TCC GAC TGC ACA GAT GTT TTA TAT GCT ACA GCT GTT ATA 1947 Phe Asn Ser Asp Cys Thr Asp Val Leu Tyr Ala Thr Ala Val Ile 595 600 605 AAA ACT GGC ACT TGT CCT TTC TCG TTT GAT AAA TTG AAC AAT TAC 1992 Lys Thr Gly Thr Cys Pro Phe Ser Phe Asp Lys Leu Asn Asn Tyr 610 615 620 TTA ACT TTT AAC AAG TTC TGT TTG TCA TTG AAT CCT GTT GGT GCC 2037 Leu Thr Phe Asn Lys Phe Cys Leu Ser Leu Asn Pro Val Gly Ala 625 630 635 AAC TGC AAG TTT GAT GTT GCC GCT CGT ACA AGA ACC AAT GAG CAG 2082 Asn Cys Lys Phe Asp Val Ala Ala Arg Thr Arg Thr Asn Glu Gln 640 645 650 GTT GTT AGA AGT TTA TAT GTA ATA TAT GAA GAA GGA GAC AAC ATA 2127 Val Val Arg Ser Leu Tyr Val Ile Tyr Glu Glu Gly Asp Asn Ile 655 660 665 GTG GGT GTG CCG TCT GAC AAT AGT GGT CTT CAC GAC TTG TCA GTG 2172 Val Gly Val Pro Ser Asp Asn Ser Gly Leu His Asp Leu Ser Val 670 675 680 CTA CAC TTA GAC TCC TGT ACA GAT TAT AAT ATA TAT GGT ATA ACT 2217 Leu His Leu Asp Ser Cys Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr Gly Ile Thr 685 690 695 GGT GTT GGT ATT ATT AGA CAA ACT AAC AGT ACG CTA CTT AGT GGC 2262 Gly Val Gly Ile Ile Arg Gln Thr Asn Ser Thr Leu Leu Ser Gly 700 705 710 TTA TAT TAC ACA TCA CTA TCA GGT GAC TTG TTA GGG TTT AAA AAT 2307 Leu Tyr Tyr Thr Ser Leu Ser Gly Asp Leu Leu Gly Phe Lys Asn 715 720 725 GTT AGT GAT GGT GTC ATC TAT TCT GTC ACG CCA TGT GAT GTA AGC 2352 Val Ser Asp Gly Val Ile Tyr Ser Val Thr Pro Cys Asp Val Ser 730 735 740 GCA CAT GCT GCT GTT ATT GAT GGC GCC ATA GTT GGA GCT ATG ACT 2397 Ala His Ala Ala Val Ile Asp Gly Ala Ile Val Gly Ala Met Thr 745 750 755 TCC ATT AAT AGT GAA CTG TTA GGT CTA ACA CAT TGG ACA ACA ACA 2442 Ser Ile Asn Ser Glu Leu Leu Gly Leu Thr His Trp Thr Thr Thr 760 765 770 CCT AAT TTT TAT TAT TAT TCT ATA TAT AAT TAT ACC AAT GAA AGG 2487 Pro Asn Phe Tyr Tyr Tyr Ser Ile Tyr Asn Tyr Thr Asn Glu Arg 775 780 785 ACT CGT GGC ACA GCA ATT GAT AGT AAC GAT GTT GAT TGT GAA CCT 2532 Thr Arg Gly Thr Ala Ile Asp Ser Asn Asp Val Asp Cys Glu Pro 790 795 800 ATC ATA ACC TAT TCT AAT ATA GGT GTT TGT AAA AAT GGA GCT TTG 2577 Ile Ile Thr Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Asn Gly Ala Leu 805 810 815 GTT TTT ATT AAC GTC ACA CAT TCT GAT GGA GAC GTT CAA CCA ATT 2622 Val Phe Ile Asn Val Thr His Ser Asp Gly Asp Val Gln Pro Ile 820 825 830 AGC ACC GGT AAT GTC ACG ATA CCT ACA AAT TTT ACC ATA TCT GTG 2667 Ser Thr Gly Asn Val Thr Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val 835 840 845 CAA GTT GAA TAC ATT CAG GTT TAC ACT ACA CCG GTG TCA ATA GAT 2712 Gln Val Glu Tyr Ile Gln Val Tyr Thr Thr Pro Val Ser Ile Asp 850 855 860 TGT TCA AGG TAC GTT TGC AAT GGT AAC CCT AGA TGC AAT AAA TTG 2757 Cys Ser Arg Tyr Val Cys Asn Gly Asn Pro Arg Cys Asn Lys Leu 865 870 875 TTA ACG CAA TAC GTT TCT GCA TGT CAA ACT ATT GAG CAA GCA CTT 2802 Leu Thr Gln Tyr Val Ser Ala Cys Gln Thr Ile Glu Ala Leu Ala 880 885 890 GCA ATG GGT GCC AGA CTT GAA AAC ATG GAG ATT GAT TCC ATG TTG 2847 Met Gly Gly Ala Arg Leu Gln Asn Met Glu Ile Asp Ser Met Leu 895 900 905 TTT GTT TCG GAA AAT GCC CTT AAA TTG GCA TCT GTT GAA GCA TTC 2892 Phe Val Ser Glu Asn Ala Leu Lys Leu Ala Ser Val Glu Ala Phe 910 915 920 AAT AGT ACG GAA ACT TTA GAT CCT ATT TAC AAA GAA TGG CCT AAC 2937 Asn Ser Thr Glu Thr Leu Asp Pro Ile Tyr Lys Glu Trp Pro Asn 925 930 935 ATT GGT GGT TCT TGG CTA GGA GGT TTA AAA GAC ATA TTG CCA TCT 2982 Ile Gly Gly Ser Trp Leu Gly Gly Leu Lys Asp Ile Leu Pro Ser 940 945 950 CAC AAC AGC AAA CGT AAG TAC CGG TCG GCT ATA GAA GAT TTG CTT 3027 His Asn Ser Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu 955 960 965 TTT GAT AAG GTT GTA ACA TCT GGC TTA GGT ACA GTT GAT GAA GAT 3072 Phe Asp Lys Val Val Thr Ser Gly Leu Gly Thr Val Asp Glu Asp 970 975 980 TAT AAA CGT TGT ACA GGT GGT TAT GAC ATA GCT GAC TTA GTG TGT 3117 Tyr Lys Arg Cys Thr Gly Gly Tyr Asp Ile Ala Asp Leu Val Cys 985 990 995 GCA CAA TAT TAC AAT GGC ATC ATG GTG CTA CCT GGT GTA GCT AAT 3162 Ala Gln Tyr Tyr Asn Gly Ile Met Val Leu Pro Gly Val Ala Asn 1000 1005 1010 GAT GAC AAG ATG GCT ATG TAC ACT GCA TCT CTT GCA GGT GGT ATA 3207 Asp Asp Lys Met Ala Met Tyr Thr Ala Ser Leu Ala Gly Gly Ile 1015 1020 1025 ACA TTA GGT TCA CTT GGT GGT GGC GCA GTG TCT ATA CCT TTT GCA 3252 Thr Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Val Ser Ile Pro Phe Ala 1030 1035 1040 ATA GCA GTT CAA GCC AGA CTT AAT TAT GTT GCT CTA CAA ACT GAT 3297 Ile Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Val Ala Leu Gln Thr Asp 1045 1050 1055 GTA TTG AAC AAG AAC CAG CAG ATC CTG GCT AAT GCT TTC AAT CAA 3342 Val Leu Asn Leu Asn Gln Gln Ile Leu Ala Asn Ala Phe Asn Gln 1060 1065 1070 GCT ATT GGT AAC ATT ACA CAG GCA TTT GGT AAG GTT AAT GAT GCT 3387 Ala Ile Gly Asn Ile Thr Gln Ala Phe Gly Lys Val Asn Asp Ala 1075 1080 1085 ATA CAT CAA ACG TCA CAA GGT CTT GCT ACT GTT GCT AAA GTA TTG 3432 Ile His Gln Thr Ser Gln Gly Leu Ala Thr Val Ala Lys Val Leu 1090 1095 1100 GCA AAA GTG CAA GAT GTT GTT AAC ACA CAA GGG CAA GCT TTA AGC 3477 Ala Lys Val Gln Asp Val Val Asn Thr Gln Gly Gln Ala Leu Ser 1105 1110 1115 CAC CTA ACA TTA CAA TTG CAA AAT AAT TTC CAA GCC ATT AGT AGT 3522 His Leu Thr Leu Gln Leu Gln Asn Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser 1120 1125 1130 TCC ATT AGT GAC ATT TAT AAC AGG CTT GAT GAA TTG AGT GCT GAT 3567 Ser Ile Ser Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Asp Glu Leu Ser Ala Asp 1135 1140 1145 GCA CAA GTT GAC AGG CTG ATT ACA GGA AGA CTT ACA GCA CTT AAT 3612 Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Thr Ala Leu Asn 1150 1155 1160 GCA TTT GTG TCT CAG ACT TTA ACC AGA CAA GCA GAG GTT AGG GCT 3657 Ala Phe Val Ser Gln Thr Leu Thr Arg Gln Ala Glu Val Arg Ala 1165 1170 1175 AGC AGA CAG CTT GCT AAA GAC AAG GTA AAT GAA TGC GTC AGG TCT 3702 Ser Arg Gln Leu Ala Lys Asp Lys Val Asn Glu Cys Val Arg Ser 1180 1185 1190 CAA TCT CAG AGA TTT GGA TTC TGT GGT AAT GGT ACA CAT TTA TTT 3747 Gln Ser Gln Arg Phe Gly Phe Cys Gly Asn Gly Thr His Leu Phe 1195 1200 1205 TCA CTT GCA AAT GCA GCA CCA AAT GGC ATG ATC TTC TTT CAC ACA 3792 Ser Leu Ala Asn Ala Ala Pro Asn Gly Met Ile Phe Phe His Thr 1210 1215 1220 GTG CTA TTA CCA ACA GCT TAT GAA ACC GTG ACA GCC TGG TCA GGT 3837 Val Leu Leu Pro Thr Ala Tyr Glu Thr Val Thr Ala Trp Ser Gly 1225 1230 1235 ATT TGT GCA TCA GAT GGC GAT CGT ACT TTT GGA CTT GTT GTT AAG 3882 Ile Cys Ala Ser Asp Gly Asp Arg Thr Phe Gly Leu Val Val Lys 1240 1245 1250 GAT GTC CAG TTG ACG CTG TTT CGC AAT CTA GAT GAC AAA TTC TAT 3927 Asp Val Gln Leu Thr Leu Phe Arg Asn Leu Asp Asp Lys Phe Tyr 1255 1260 1265 TTG ACT CCC AGA ACT ATG TAT CAG CCT ATA GTT GCA ACT AGT TCT 3972 Leu Thr Pro Arg Thr Met Tyr Gln Pro Ile Val Ala Thr Ser Ser 1270 1275 1280 GAT TTT GTT CAA ATT GAA GGA TGT GAT GTG TTG TTT GTT AAT GCA 4017 Asp Phe Val Gln Ile Glu Gly Cys Asp Val Leu Phe Val Asn Ala 1285 1290 1295 ACT GTA ATT GAC TTG CCT AGT ATT ATA CCT GAC TAT ATT GAT ATT 4062 Thr Val Ile Asp Leu Pro Ser Ile Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Ile 1300 1305 1310 AAT CAA ACT GTT CAG GAC ATA TTA GAA AAT TTC AGA CCA AAT TGG 4107 Asn Gln Thr Val Gln Asp Ile Leu Glu Asn Phe Arg Pro Asn Trp 1315 1320 1325 ACT GTA CCT GAG TTG CCA CTT GAC ATT TTC AAT GCA ACC TAC TTA 4152 Thr Val Pro Glu Leu Pro Leu Asp Ile Phe Asn Ala Thr Tyr Leu 1330 1335 1340 AAC CTG ACT GGT GAA ATT AAT GAC TTA GAA TTT AGG TCA GAA AAG 4197 Asn Leu Thr Gly Glu Ile Asn Asp Leu Glu Phe Arg Ser Glu Lys 1345 1350 1355 TTA CAT AAC ACC ACA GTA GAA CTT GCT ATT CTC ATT GAT AAT ATT 4242 Leu His Asn Thr Thr Val Glu Leu Ala Ile Leu Ile Asp Asn Ile 1360 1365 1370 AAT AAC ACA TTA GTC AAT CTT GAA TGG CTC AAT AGA ATT GAA ACT 4287 Asn Asn Thr Leu Val Asn Leu Glu Trp Leu Asn Arg Ile Glu Thr 1375 1380 1385 TAT GTA AAA TGG CCT TGG TAT GTG TGG CTA CTA ATT GGA TTA GTA 4332 Tyr Val Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Leu Ile Gly Leu Val 1390 1395 1400 GTA ATA TTC TGC ATA CCC ATA TTG CTA TTT TGT TGT TGT AGT ACT 4377 Val Ile Phe Cys Ile Pro Ile Leu Leu Phe Cys Cys Cys Ser Thr 1405 1410 1415 GGT TGT TGT GGA TGT ATT GGG TGT TTA GGA AGC TGT TGT CAT TCC 4422 Gly Cys Cys Gly Cys Ile Gly Cys Leu Gly Ser Cys Cys His Ser 1420 1425 1430 ATA TGT AGT AGA AGG CAA TTT GAA AGT TAT GAA CCA ATT GAA AAA 4467 Ile Cys Ser Arg Arg Gln Phe Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Glu Lys 1435 1440 1445 GTT CAT GTT CAC TGA ATTC 4486 Val His Val His ^*** 1450 1453

【図面の簡単な説明】

【図１】これは、ＣＣＶ−Ｅ₂ タンパク質での抗原的に
重要な領域を示すために使用された種々のアルゴリズム
である。

【図２】これは、発現ベクターｐＴＵＧ３の構成法を示
す。

【図３】これは、ｐＴＵＧ３から出発して、ｐＴＵＧ３
ＣＣＶＳの構成法を示す。

【図４】これは、ＣＣＶ−Ｓ遺伝子がアデノウィルスト
ランスファーベクターｐＪＷ１３中にクローン化されて
いることを示す図である。

【図５】これは、ｐＪＷ１６の構造体を示す図である。

【図６】これは、ｐＪＷ１７の構造体を示す図である。

【図７】これは、Ｔ７プロモーターの制御下でのＣＣＶ
−Ｅ₂ タンパク質の発現を示す、図面に代わる電気泳動
の写真である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年８月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ペトルス ロッティエル オランダ国，ウエースプ，セー．イェー. ファン ホーテンラーン 36

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イヌコロナウィルス（ＣＣＶ）のＥ₂ タ
   ンパク質の少なくと も一部をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリ
   ヌクレオチド。
2. 【請求項２】 下記のもの： ａ）．配列番号１に示されるヌクレオチド配列の少なく
   とも一部を有するＤＮ Ａ； ｂ）．いづれかの外来性ＤＮＡにハイブリダイズし、そ
   してＣＣＶのＥ₂ タン パク質の免疫原性特性を有するポリペプチドをコードす
   るポリヌクレオチド；又 は ｃ）．ａ）に定義されるようなＤＮＡ又はｂ）に定義さ
   れるようなポリヌクレ オチドに遺伝子コードの結果として変性し、そしてＣＣ
   ＶのＥ₂ タンパク質の免 疫原性特性を有するポリペプチドをコードするポリヌク
   レオチドから選択される ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ＣＣＶのＥ₂ タンパク質の少なくとも一
   部の発現をコードす る組換えポリヌクレオチドであって、その中に挿入され
   る適切なベクター及び請 求項１又は２記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴
   とする組換えポリヌクレ オチド。
4. 【請求項４】 ＣＣＶのＥ₂ タンパク質のアミノ酸配列
   の少なくとも一部を 有するポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号１に示されるアミノ酸配列の少
   なくとも一部を有す るポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項３記載の組換えポリヌクレオチド
   又は請求項４又は５ 記載のポリペプチドの有効量を含むＣＣＶ感染を攻撃す
   るためのワクチン。
7. 【請求項７】 ＣＣＶ感染の攻撃における請求項４又は
   ５記載のポリペプチ ドの使用。