JPH01501357A - ヒト呼吸器系ウイルス用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｂ、酵母；および Ｃ０真核細胞培養物 よりなる群から選択される前記第２項のプラスミド。

８、　ａ、　Ｆ蛋白質； ｂ、Ｇ蛋白質； ｃ、２２に蛋白質； ｄ、　９．５　Ｋ蛋白質； ｅ、主要キャブジッド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択されるヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコード付け するＤＮＡ配列よりなるプラスミドを含有する適当な宿主。

９、該プラスミドがヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコー ド付けするＤ　Ｎ　Ａ、配列の発現を容易とする前記第８項の適当な宿主。

１０、該宿主が ａ、細菌： ｂ、酵母；および Ｃ９真核細胞培養物 より成る群から選択される前記第８項の適当な宿主。

１１、該宿主が ａ、細菌； ｂ、酵母；および Ｃ０真核細胞培養物 よりなる群から選択される前記第９項の適当な宿主。

１２、　ａ、　Ｆ蛋白質； ｂ、Ｇ蛋白質； ｃ、　２２　Ｋ蛋白質； ｄ、９．５に蛋白質； ｅ、主要キャブジッド蛋白質、Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群 から選択される実質的に純粋な蛋白質。

１３、　ａ、　Ｆ蛋白質； ｂ、Ｇ蛋白質； Ｃ，２２Ｋ蛋白質； ｄ、　９．５　Ｋ蛋白質； ｅ、主要キャブジッド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択される１またはそれ以上の実質的に純粋な蛋白質よりなるこトラ特徴色す るヒト呼吸器系シンシチウムウイルスワクチン。

１４、ａ、Ｆ蛋白質； ｂ、Ｇ蛋白質； ｃ、　２２　Ｋ蛋白質； ｄ、　９．５　Ｋ蛋白質； ｅ、主要キャブジッド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択される１またはそれ以上の実質的に純粋な蛋白質よりなるワクチンでのワ クチン接種によってヒト呼吸器系シンシチウムウイルスからヒトを保護する方法 。

明　細　書 ヒト呼吸器系ウィルス用ワクチン 発明の分野 本発明はヒト呼吸器系シンジチウムウィルス［ＨＲＳＶＩに対するワクチンを調 製するのに有用なりＮＡの組成物および蛋白質を開示する。該蛋白質は天然構造 ウィルス蛋白質およびその免疫原性フラグメントを包含する。該ＤＮＡ組成物は これらの蛋白質についてコード付けする構造遺伝子ならびに該構造遺伝子を含有 する発現および複製プラスミドを包含する。前記ＤＮＡ組成物で形質転換した宿 主細胞も本明細書中にて開示する。最後に天然構造ウィルス蛋白質およびその免 疫原性誘導体よりなるワクチンならびに該ワクチンでの接種によるヒトの保護方 法を開示する。本発明はナショナル・インステイテユート・オブ・ヘルス（Ｎａ ｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）によるＡｔ−１２４６ ４授与下、政府の援助によりなされた。政府は本発明においである種の権利を有 する。

ＨＲＳＶは最初１９５６年に発見され、世界的に分布している。それは幼児およ び年少の子供で病気をひき起こす上および下気道病の主原因である。幼児におい ては、このひどい病気はしばしば入院を必要とする。

急性呼吸器病の入院した年少子供の約３０％は呼吸器系シンシチウムウイルス感 染を有する。もう少し年令が上の子供および成人においては、該病気は穏かであ る。呼吸器系シンシチウムウイルスでの感染は気道のすべての部分に帰すことが でき、通常、発熱、咳、鼻水、および疲労を伴い、気管支炎、細気管支炎、肺炎 。

クループ、またはウィルス感染として臨床的に診断される。より年令のいった子 供および成人においては、ウィルスは一般に上気道における応答に限定される。

ウィルスが肺に侵入すると幼児ではかなりやっかいなことになり兼ねない。肺の 損傷は永久的なものとなる可能性がある。

呼吸器系シンシチウムウイルスでの一次感染は一生において早く１通常４才以前 に起こる。子供では、このウィルスによってひき起こされた病気は、毎年少くと も１回は生じる傾向にあり、かなりはっきりとした発病であって、数カ月間続く 。流行病は、一般に、３〜５ケ月間にはっきり制限される。家族的に調べると、 低学年の子供は頻繁にウィルスを家庭に持ち込み、家族のより若い構成員に他の 家族構成員よりもひどく感染させてしまう。感染の臨床結果は最初の経験者につ いて最もひどく、免疫学的に経験したより年令が上の者においてはより穏かにな る。

呼吸器系シンシチウムウイルスの影響は不顕性感染ないしひどい肺炎および死ま で変化し得る。気道の炎症はほとんどの徴候の原因である。はとんどの場合、完 全な回復は抗体の産性により１〜３週間のうちに起こり、その抗体産生は一生維 持されるようである。米国においては、１才の幼児の約３０％および５才の子供 の９５％が呼吸器系シンシチウムウイルス抗体を循環させてきた。抗体を有する 年令がより上の幼児、子供、および成人の再感染は、はとんどの場合、風邪の形 態の穏かな上気病である。

本発明以外にはＨＲＳＶと戦う効果的なワクチンはない。

先行技術の記載 細胞培養におけるウィルスの低収率がＨＲ３Ｖ研究を妨げてきたのにもかかわら ず、該ウィルスは十分に研究されてきた。ＨＲＳＶは、１０の圧倒的にモノジス トロニックなメツセンジャーに転写される。　ＲＮＡの単一のマイナス鎖を含有 するバラミクソウィルスである。メツ上６ンジヤーは単離され、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ　で翻訳されたことがある。ウィルス粒子から単離された構造蛋白質と同様に 、産生物はゲル電気泳動、ペプチドマツビッグおよび免疫沈降によって特徴づげ されている。構造蛋白質は主たるヌクレオキャブジッド蛋白質（Ｎ；ＭＷ約４２ ０００）、ヌクレオキャブジッドリン蛋白質（Ｐ；ＭＷ約３４０００）　、大き なヌクレオキャブジッド蛋白質（Ｌ　；　ＭＷ約２０００００　）、エンベロー プマトリックス蛋白質（Ｍ　；　ＭＷ約２６０００）、マトリックス糖蛋白質（ 約２２０００　）および２のエンベロープ糖蛋白質、融合糖蛋白ｔ（Ｆ；鼎約６ ８０００〜７００００　）および第２のメチオニンが少ない糖蛋白質（Ｇ　；　 ＭＷ　約８４０００〜９００００）を包含する。加えて、ウィルス的にコード付 けされた約９５００ダルトンの蛋白質および他の小さな蛋白質が感染細胞中に存 在することが知られている。

コリンズ、ビイ・エルら（Ｃｏ１１ｉｎｓ％Ｐ、　Ｌ、、ｅｔ　ａｌ）。

ＲＳＶの第１０番目のｍＲＮＡの同定およびポリペプチドの１０のウィルス遺伝 子への割当て、ジャーナル・オブ・パイロロジ−（Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、） 　、　４９　：　５７２〜５７８（１９８４）およびそこに引用されている文献 。

ＨＲＳＶの構造蛋白質は単離されたことがあるが、そのアミノ酸配列は知られて いない。

ＨＲＳＶに対する効果的なワクチンを得ようとする多くの試みがなされてきた。

フリーデワルドら（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ ・ジ・アメリカン・メディカル・アソウシエーション、２０４巻。

１９６８年５月２０日、６９０〜６９４頁はウシ胎児腎臓組織培養における呼吸 器系シンシチウムウイルスの増殖を記載している。３４℃または２８℃において 増殖したウィルスは感染性または毒性を減じなかった。

２６℃で増殖したＨＲＳＶは、成人については感染性を減じたものの、ウィルス は感染性が制限されかつ免疫原性に乏しかったので成人における感染防止に用い ることができるとは考えられなかった。

キムら（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ、）　、ビープイアトリクス（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓ）、４８巻、１９７１年１１月、７４５〜１３才の幼児および子供に詔いて血 清抗体の高レベルの発達を刺激したが、感染を防止しなかったことを開示してい る。

マクイントラシュら（ＭｃＩｎｔｏｓｈ　ｅｔ　ａｌ、）、ビープイアトリック ・リサーチ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　８巻、１９７４．６ ８９〜６９６頁は、２種の実験的な呼吸器系シンシチウムウイルス生ワクチンに ついて考察しているが、１つは２６℃にて増殖させたウィルスから調製したもの であり、他方は３２℃で十分増殖したが３７℃またはそれ以上では全く増殖しな かった温度感受性突然変異体から調製したものであった。第１のワクチンは、ワ クチン接種と攻撃との間隔が４力月以上だと感染に対して保護しなかったので、 満足すべきものではなかった。第２のワクチンも、いくつかのワクチンにおいて 明らかにその温度感受性を喪失した点で満足すべきものではなかった。

クライブヘッド（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ　）　、ジャーナル・オブ・インフエクシ アス・デイジージス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａ ｓｅｓ　）　、　１３１巻、１９７５年６月。

７４９〜７５３頁、はいくつかの群の研究者が組織培養で増殖させたホルムアル デヒド処理したミョウバン沈降ウィルスを幼児および年少の子供において試験し た１９６６年実施のテストについて考察している。ひき続いて野生型ウィルスに 対して暴露した際、ワクチン受容者は気道病の著しい様相を示した。クライブヘ ラＦ　（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ　）はホルムアルデヒド処理ウィルスは病気のひど さを増大したと結論した。

ライトら（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、）、リサーチに一オブ・ビープイアトリ クス（Ｊａｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　）、８８巻、１９７６年 ６月、９３１〜９３６頁は、温度感受性化弱毒化呼吸器系シンシチウムワクチン の幼児における評価を記載している。すべての血清反応陰性幼児を感染させるの に十分な投与量レベルで投与した場合このワクチンは軽い上気道病をひき起こし 、投与量を減じると許容されるレベルの感染性を達成しなかった。

１のワクチン接種者において温度感受性の喪失が示されたので、該ウィルスは遺 伝的に不安定でもあった。

このワクチンに関しては自然病の増強の証明はな（、ワクチン接種者のうちには 再感染が起った。

米国特許第４１２２１６７号および第４１４５２５２号はヒト２倍体肺繊維芽細 胞を通じての系統的継代によるウィルス粒子の弱毒化法について記載しており、 米国特許第４５１７３０４号は培養で増殖させた罹患細胞の細胞膜上の免疫原性 的に活性なＨＲ３Ｖ蛋白質の産生方法を開示している。次いで、これらの細胞を 宿主に注射して免疫応答を引き出す。

前記文献は本発明で開示する方法または組成物を開示していない。前記文献は蛋 白質および核酸の双方よりなるウィルス粒子の注射により、あるいは宿主細胞の 細胞膜に結合したウィルス蛋白質のはつきりしない組成物の注射によってワクチ ンをつくり出そうとしている。前記研究は効果的なワクチンを得て＆Ｎ、ない。

レバーン・ビイ（Ｒａｅｂｕｒｎ、　Ｐ、）、ザ・フーデイニイ・ウィルス（Ｔ ｈｅ　Ｈｏｕｄｉｎｉ　Ｖｉｒｕｓ　）　、サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ） ８５．６巻：５２〜５７（１９８５年１２月）。本明細書中に開示するのは純粋 なウィルス蛋白質の組成物および商業的実用量のかかる蛋白質の産生方法である 。

該ウィルス蛋白質はワクチン、診断用抗体を産生するするクローンも用いること ができる。さらに、該蛋白質から産生じたワクチンは免疫保護を最高に生じるい ずれの割合の構造蛋白質も含有するようにつ（ることができる。安全の見地より 、本発明は年少の子供を不活化もしくは弱毒化のいずれかの無傷ＨＲＳＶウィル ス粒子、およびウィルス核酸に暴露するのを避ける。完全なウィルス粒子の注射 を避けることによって、本明細書中に開示するワクチンは、その結果効果のない 抗体の生成およびビルレントＨＲ３Ｖに暴露した場合の宿主／患者のひき続いて の罹患の増大を起こすことが示されているホルムアルデヒドの如き安定化剤で処 理する必要がない。

本発明の発明者らによる以下の文献は関連する文献を網羅するのに掲げるが、３ ５　Ｕ、Ｓ、Ｃ，１０２，（ｂ）の規定による先行技術文献ではない：（１）コ リンズ・ビイ・エルら（Ｃｏ１１ｉｎｓ　、　Ｐ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、 ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスの融合（Ｆ）糖蛋白質をコード付けする遺伝 子のヌクレオチド配列、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、ＵＳ Ａ、　８１　：　７６８３〜７６８７（１９８４年１２月）、Ｆ糖蛋白質につい ての遺伝子配列を開示；（２）コリンズ、ビイ・エルら（Ｃｏ１１ｉｎｓＰ、Ｌ 、ｅｔ　ａｌ、）、ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスのＩＡｆｃ白質遺伝子： 　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列および関連するポリジストロニック転写、パイロ ロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　１４１　：　２８３〜２９１　（１９８５）。

ＩＡｆｃ白質についての遺伝子配列を開示；（３）コリンズ・ビイ−エルら（Ｃ ｏ１１ｉｎｓ　、　Ｐ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）　％　ヒト呼吸器系シンシチウム ウイルスのエンベロープ連結２２に蛋白質：ｍＲＮＡのヌクレオチド配列および 関連するポリ転写、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、ｏｆＶｉｒｏｌ、） 、　５４　（＆ｌ　）　：６５〜７１　（１９８５年４月）、２２に蛋白質につ いての遺伝子配列を開示；（４）つｘ　ｎｔ　’７−ジイ・ダブリューら（Ｗｅ ｒｔｚ　、　Ｇ、Ｗ、　ｅｔａｌ、）　、ヒト呼吸器系シンシチウムウイルスの Ｇ（ｉ白質遺伝子のヌクレオチド配列はウィルス膜蛋白質の異常タイプを明らか にする、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ（ＰｒｏｃＪａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ、８２　：　４０？５〜４０７９（１９８５年 ６月）、Ｇ糖蛋白質についての遺伝子配列を開示；および（５）コリンズ・ビイ ・エルら（Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｐ、Ｌ、　ｅｔａｔ、）　、呼吸器系シンシチウ ムウイルスの主要ヌクレオキャブジッド蛋白質ｍ　ＲＮ　Ａについての正しい配 列、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　、　１４６　：６９〜７７　（１９ ８５）、Ｎ蛋白質についての遺伝子配列を開示。

１９８６年、ワクチニアウィルス発現系はＨＲＳＶのＧおよびＦ糖蛋白質の発現 に有用であることが証明された。パル・エル・エイら（Ｂａ１ｌ　、Ｌ、Ａ、　 ｅｔ　ａｌ、）、組換体ワクチニアウィルスベクターからのヒト呼吸器系シンシ チウムウイルスの主要糖蛋白質Ｇの発現、ビイ・エヌ・エイ・ニス（Ｐ、Ｎ、Ａ 、Ｓ、）ＵＳＡ　８３　：２４６〜２５０（１９８６）およびオルムステツド・ アール・エイ（０１ｍ５ｔｅｄ　Ｒ，Ａ、）、組換体ワクチニアウィルスによる 呼吸器系シンシチウムウイルスのＦ糖蛋白質の発現：宿主免疫に対するＦおよび Ｇ糖蛋白質の個々の寄与の比較、ビイ・エヌ・エイ・ニス（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、） 　ＵＳＡ８３ニア４６２〜７４６６（１９８６）。また、これらの２種の糖蛋白 質は哺乳動物における生きたＨＲ５ＶＲ５用ス攻撃に対する免疫保護を誘導する ことが証明された。ストット、イー・ジエイら（５ｔｏｔｔ　、Ｅ、Ｊ、　ｅｔ 　ａｌ、）。

組換体ワクチニアウィルスベクターから発現されたヒト呼吸器系シンシチウムウ イルス糖蛋白質Ｇはマウスを生きたウィルス攻撃に対して保護する、ジャーナル ・オブ・バイｏｏジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　６７： ６０７〜６１３（１９８６）；エランゴ・エヌら（Ｅｌａｎｇ。

Ｎ、　ｅｔ　ａｌ）　、耐性およびＲＳＶ　Ｇ　糖蛋白質を発現する組換体ワク チニアウィルスでコツトン（ｃｏｔｔｏｎ　）・ラットを免疫化することによっ て誘導したヒト呼吸器系シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）感染；およびオルレム ステッド・アー７ｔｚ−エイ（０１ｍ５ｔｅｄ　、Ｒ，Ａ、）　（前掲）％ビイ ・エヌ・エイ・ニス（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、）ＵＳＡ　８３　：２４６〜２５０（１ ９８６）。前記文献の方法および結果をすべてここに参照のために挙げる。

発明の要約 本発明はヒトをＨＲＳＶから保護するワクチンの開発に関する。該ワクチンはウ ィルス構造蛋白質の組成物および適当な担体よりなる。該蛋白質は組換体ＤＮＡ の発現を通じ適当な細胞宿主によって産生される。プラスミド、ｃＤＮＡ配列、 形質転換細胞宿主、およびワクチンを本明細書中にて開示する。

特に、本発明はＦ蛋白質、Ｇ蛋白質、２２に蛋白質、９．５に蛋白質；主要キャ ブジッド蛋白質Ｎおよびその免疫原性フラグメントよりなる群から選択されるヒ ト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコード付けするＤＮＡ配列 を開示する。

さらに、前記ＨＲＳＶ構造蛋白質または免疫原性フラグメントについてコード付 けするＤＮＡ配列の組成物を開示するが、該配列は、適当な宿主において独立な 複製が可能な、宿主ゲノムへの取り込みが可能な、または適当な宿主においてウ ィルス蛋白質もしくはフラグメントについてコード付けするＤＮＡ配列の発現を 誘導するのが可能なプラスミドに組み込まれるものである。適当な宿主は細菌、 酵母および真核細胞培養物を包含する。

また、本発明はＦ蛋白質、Ｇ蛋白質、２２に蛋白質、９．５Ｋｉ白質、主要キャ ブジッド蛋白質Ｎおよびその免疫原性フラグメントよりなるＨＲＳＶ構造蛋白質 の群から選択される実質的に純粋な蛋白質の組成物も開示する。

ワクチンおよび該ワクチンの使用方法を本明細書中に開示するが、ここに該ワク チンはＦ蛋白質、Ｇｉ白質、２２に蛋白質、９．５に蛋白質；主要キャブジッド 蛋白質Ｎおよびその免疫原性フラグメントよりなるＨＲ５Ｖ構造蛋白質の群から 選択されるポリペプチドよりなる。最も好ましいものはＦ蛋白質、Ｇ蛋白質およ びその免疫原性フラグメントである。

本発明は種々の公知方法で達成できる一連の分子遺伝子操作を含む。以下の記載 はＨＲ５Ｖ蛋白質を発現できる各種方法を詳細に説明するものであり、続いて好 ましい方法の具体的な実施例を挙げる。

要約すれば、該操作はＨＲ３Ｖ蛋白質のｃＤＮＡを得ること、イー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ　）におけるｃＤＮＡのクロ−ニングおよび複製ならびに適当な宿主に おける所望のｃＤＮＡの発現として記載できる。

ＨＲＳＶ株Ａ２株間２した蛋白質についての゛具体的な配列および塩基ナンバリ ング位置はチャート１２〜１６に示す。チャート１２〜１６はＨＲＳＶ構造蛋白 質Ｆ蛋白質、Ｇ蛋白質、２２に蛋白質、９．５に蛋白質、および主要キャブジッ ド蛋白質Ｎについての核酸配列を含む。

Ａ２株からの蛋白質がＨＲＳＶの他の株に対する交差保護を誘導することは予想 されるが、その最大保護は各種株からの蛋白質の混合物での免疫化を含み得る。

Ａ、−膜性 一般に、本願において必要な命名法および一般的な実験室的手順はマニアナイス ・ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、）　、モレ牛ニラ−・クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュア ル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ　）、コールド、スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハー バ−（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　）％ニューヨーク、１９８２．に 見い出すことができる。該マニュアルは以後マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） として参照する。

すべてのイー・コリ（Ｅ、　、ｃｏｌｉ）株はグルコースを含むルリア（Ｌｕｒ ｉａ　）ブロス（ＬＢ）、ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）の抗生物質培　地＃２ならび にグルコースおよび酸加水分解カゼインアミノ酸を補足したＭ９培地上で増殖さ せる。抗生物質耐性株はマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）に記載されている薬 剤濃度で維持した。形質転換はロウエカンプ・ダブリューおよびフィルチル・ア ール・エイ（Ｒｏｗｅｋａｍｐ　、　Ｗ、　ａｎｄ　Ｆｉｒｔｅｌ　、　Ｒ，Ａ 、　）　、ディベロップメンタルーバイオロジー（Ｄｅｗ、　Ｂｉｏｌ、）、７ ９：４０９〜４１８（１９８０）によって記載された方法によって行った。

すべての酵素は製造業者の指示により用いた。形質転換体はグルンステイン・エ ムおよびワリス・ジエイ（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　％Ｍ、　ａｎｄ　Ｗａｌｌｉｓ 　、　Ｊ、）、メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、　６８：３７９〜３８８に記載されている如くコロ ニー／−１イブリダイゼーシヨンによって分針した。

ハイブリダイゼーションの後、プローブを除去し。

保存し、各４００−を５回交換して合計３時間０．１％ＳＤＳ、０．２ＸＳＳＣ 中でフィルターを洗浄する。フィルターを十分に風乾し、取り付け、コダック（ Ｋｏｄａｋ）Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムおよびデュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）クロ ネツクス・ライトネニング（Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉ’ｇｈ’ｔｎｅｎｉｎｇ　）と 増感スクリーンを用いて、−７０℃にて１６時間オートラジオグラフィーに付し た。

プラスミドの配列決定には、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）に記載した方法 により精製したプラスミドＤＮＡを調製する。末端をラベルしたＤＮＡフラグメ ントを調製し、コリンズ・ビイ・エルおよびウエルッ・シイ・ダブリュー（Ｃｏ ｌｌｉｎｓ　、　Ｐ　、Ｌ、　ａｎｄ　Ｗｅｒｔｚ　、　Ｇ、Ｗ、　）、ジャー ナル・オブ・パイロロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）５４　：　６５〜７１（１９８ ５）によって記載された変法と共にマキサムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａ ｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）の化学的配列決定法によって分析した。

ヌクレオチドのサイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで 表わす。これらはアガロースゲル電気泳動から見積ったものである。

Ｂ、ＨＲＳＶ　ｃＤＮＡ ＨＲＳＶ　ｉ白質の発現を行う第１の工程は、ｃＤＮＡクローンからの蛋白質に ついてコード付けするＤＮＡ配列を得ることである。次いで、この配列をクロー ンして遺伝子の転写を定方向化できかつ転写の効果的な翻訳を可能とする発現プ ラスミドに入れる。

ＨＲＳＶ蛋白質をコード付けするｃＤＮＡを得るためのラリブチリ−法は、一般 に、マニアナイス・ティ、フリッシュ・イー・エフおよびサムプルツク・ジエイ （Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｔ、　、　Ｆｒ１ｔｓｈ　％Ｅ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ　、）（１９８２）％モレキュラー・クローニング、ア・ラボ ラトリ−・マニュアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ＡＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、）　、　：ｌ−ルドーｘプリング・バーバー・ラ ボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　） ％ニューヨークおよび特にコリンズ・ビイ・エルおよびウエルツ・シイ・ダブり ニー（Ｃｏｆｆ１ｎｓ、Ｐ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｗｅｒｔｚ、　Ｇ、Ｗ、　）　％ｃ ＤＮＡクローニングおよびＨＲＳＶのゲノムによってコード付けされた９つのポ リアゾニレ−ジョン化ＲＮＡの転写マツピング、プロシーデイングズ・オブ・ナ ショナル・アカデミ−（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　、）ＵＳＡ　８０ 　：３２０８〜３２１２（１９８３）中に記載されている。ｄＧＴＰのホモポリ マー・トラクト（ｔｒａｃｔ）が切断部位の３Ｉ末端に酵素的に加えられたＰｓ ｔＩ切断ｐＢＲ３２２中に、ｃＤＮＡを挿入することによってクローンを調製す る。マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）によって記載された方法によりｄＣＴ Ｐのホモポリマー・トラクト（ｔｒａｃｔ）をｃＤＮＡ分子の３′末端に酵素的 に加える。理想的には、ｄＣＴＰまたはｄＧＴＰの１０〜３０残基を加えてクロ ーニング効率を最大にする。ｃ　ＤＮＡおよびプラスミドを一緒にアニールし、 イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質転換する。ラベルしたウィルスｃＤＮＡの プローブまたはチャート１２〜１６に示した配列の一部に相補的なオリゴヌクレ オチドによって完全長ＨＲＳＶ　ｃＤＮＡを含有するクローンを検出し、続いて 制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定を行う。

ニードハム・パン・デバンター・ディ・アールラ（Ｎｅｅｄｈａｍ　Ｖａｎ　Ｄ ｅｖａｎｔｅｒ　、　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）　、ヌクレイツク・アシツズ・リ サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１２　：６１５９〜６１ ６８（１９８４）中に記載されている如く自動合成器を用い、ボカージ・ニス・ エルおよびカルサーズーｘム・エイチ（Ｂｅａｕｃａｇｅ　Ｓ、Ｌ、　ａｎｄ　 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｍ、Ｈ，）、テトラヘドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒ ｓ）、２２ｍ：　１８５９〜１８６２（１９８１）によって最初に記載された固 相ホスホルアミダイトトリエステル法によりオリゴヌクレオチドを化学的に合成 する。

ピアソン・ジエイ・ディおよびレグニエ・エフ・イー（Ｐｅａｒｓｏｎ　、Ｊ、 Ｄ、　ａｎｄ　Ｒｅｇｎｉｅｒ　、　Ｆ、Ｅ、）、ジャーナル・オブ・りＯ？ト ゲラフイー（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ　）、　２５５　：１３７〜１４９（１９８３） に記載されている如く天然アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰ ＬＣのいずれかによってオリゴヌクレオチドの精製を行う。

合成オリゴヌクレオチドの配列はマキサム・エイ・エムおよヒキルバート・ダブ リュー、グロスマン・エルおよびモルダブ・ディ（Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、　ａｎ ｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｗ、　、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ、　Ｄ、　）編、 アカデミツク、プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、ニューヨーク、メ ソジス。イア　−工７ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ）、６５：４９９〜５６０（１９８０）の化学的分解法を用いて証明できる 。

Ｃ，イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）における発現原核系においてクローン化遺 伝子、例えばＨＲＳＶ蛋白質ｃＤＮＡの高レベル発現を得るには、最低限、　ｍ ＲＮＡ転写を定方向化する強力なプロモーター、翻訳開始用リポソーム結合部位 、および転写ターミネータ−を含有する発現ベクターを組立てることが必須であ る。この目的に適当な調節領域の例はヤノフスキイ・シイ。

ケーリー・アール・エルおよびホーン・ブイ（Ｙａｎｏｆｓｋｙ。

Ｃ、）、　Ｋｅｌｌｅｙ、　Ｒ，Ｌ、　ａｎｄ　Ｈｏｒｎ　、　Ｖ、　）、ジャ ーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１５８： １０１８〜１０２４（１９８４）によって記載されている如きイー・コリ（Ｅ、 　ｃｏｌｉ）　トリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領 域およびヘルスコビッッ、アイ・およびハーゲン・ディ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ 　、　Ｉ。

ａｎｄ　Ｈａｇｅｎ、　Ｄ、　）、アヌ・レブ・ジエネト（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、）１４：３９９〜４４５（１９８０）によって記載されている如き ファージ・ラムダ（ＰＬ）の左方プロモーターである。

システィン残基が存在するため、および適当なポスト翻訳修飾を欠くために、イ ーコ！ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）において産生されたＨＲＳＶ様蛋白質は正しく折 りたたまれていないだろう。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からの精製の間、発 現された蛋白質はまず変性し、次いで天然状態に戻さなくてはならない。これは 、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）産生蛋白質をグアニジンＨＣ７？に溶解し、β− メルカプトエタノールですべてのシスティン残基を還元することによって達成で きる。次いで、ゆっくりとした透析またはゲルｐ過のいずれかによって蛋白質を 天然状態に戻す。米国特許第４５１１５０３号。

ＨＲ５Ｖ様蛋白質の検出はラジオイムノアッセイまたはウェスタンブロッティン グ法あるいは免疫沈降の如き当該分野で公知の方法によって達成される。イー・ コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）からの精製は米国特許第４５１１５０３号に記載されてい る方法により達成できる。

Ｄ、酵母におけるＨＲＳＶ様蛋白質の発現酵母における異種蛋白質の発現はよく 知られ、記載されている。メソツズ・イン・イースト・ジエネテイックス（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　、ジャーマン・エフら （Ｓｈｅｒｍａｎ　、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ−１コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　ＳＰｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 　）　、（１９８２）はＨＲ５Ｖ様蛋白質を酵母中で産生ずるのに用いる各種方 法を記載するかなり認められた研究である。

遺伝子を酵母において高レベルで発現するには、原核生物における如く遺伝子を 強力なプロモーター系に連結すること、また、酵母遺伝子からの有効な転写停止 ／ポリアゾニレ−ジョン配列を供給することが必須である。有用なプロモーター の例はＧＡＬＩ、１０　（ジョンストン・エムおよび、ディビス・アール・ダブ リュー　（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　Ｍ、　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ　、　Ｒ，Ｗ、）モレ キュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、）、４：１４４０〜４８．１９８４）、ＡＤＨ２（ラッセル・ディ ら（Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　Ｄ、、ｅｔ、ａｌ、）　、ジャーナ７Ｌｌ−オブ・バイ オロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、）　２５８　：２ ６７４〜２６８２．１９８３）、ＰＨ０５（ニアロービーアン・モレキュラー・ バイオロジー・オーガナイゼーション・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）６：６７５ 〜６８０．１９８２）、およびＭＦαｌを包含する。Ｌｕｅ−２、ＵＲＡ−３， Ｔｒｐ−１゜およびＨｉｓ−３の如き選択マーカーを有するマルチコピー・プラ スミドも望ましいものである。ＭＦα１プロモーターが好ましい。α接合型の宿 主において、　ＭＦα１プロモーターは構成的であるが、二倍体またはα接合型 を有する細胞においては作動停止の状態である。しかしながら、ＳＩＲ座の１つ においてｔｓ　突然変異を有する宿主においては温度を上げ下げすることによっ てそれを調節することができる。α型細抱についての３５℃におけるかかる突然 変異の効果はα接合型についてコード付けする通常はサイレントな遺伝子を作動 状態とすることである。一方、サイレン、トなα接合型遺伝子はＭＦα１プロモ ータ、−を作動停止する。増殖の温度を２７℃まで低下させると全過程を逆行さ せる。すなわち、α接合型を作動停止し、ＭＦα１を作動状態とスル（ヘルスコ ビッッ・アイおよびオーシマ・Ｙ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　、　Ｉ　、　＆　Ｏ ｓｈｉｍａ、　Ｙ　）（１９８２）　、ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ ・ザ・イースト・サツカロミセス（Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　（ストラセン 帝ジエイ・エヌ・ジョーンズ・イー・ダブリューおよびブローチ・ジエイ・アー ）Ｌｔ　（５ｔｒａｔｈｅｒｎ　ＩＩＪ、Ｎ、、Ｊｏｎｅｓ％Ｅ、Ｗ、　ｋ　Ｂ ｒｏａｃｈ　。

Ｊ、Ｒ，）編、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、）　、：２−　ルド・スプリング・ハーバ −（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　）　、＝　−Ｌ　−ヨーク、１８ １〜２０９頁）。

ポリアゾニレ−ジョン配列はＡＤＨＩ、ＭＦα１．またはＴＰＩのような高度に 発現された遺伝子いずれかの３′末端配列より供給される（アルバー・ティおよ びカワサキ・シイ（Ａｌｂｅｒ　％Ｔ、　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ　、Ｇ、　 ）、ジャーナル嘩オブ罐モル・アンド参アプル・ジエネト（Ｊ。

ｏｆ　Ｍｏ１．　＆　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　）　１　：４１９〜４３４， １９８２）。

ＹＥｐ６　、　ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４のような多数の酵母発現゛プラスミドを ベクターとして用いることができる。ＨＲ８ｖ様蛋白質ｃＤＮＡの如き注目する 遺伝子を前記プロモーターのいずれかに融合し、次いで各種酵母宿主における発 現用プラスミドに結ぶことができる。前記プラスミドは文献に詳細に記載されて いる（ポートスティンら（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジーン（ Ｇｅｎｅ）、８：１７〜２４．１９７９；ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ、　ｅｔ　 ａｌ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、８：１２１〜１３３．１９７９）。

酵母細胞を形質転換するには２つの方法を用いる。

１の場合、ザイモリアーゼ、リチカーゼまたはグルスラーゼを用いてまず酵母細 胞をプロトプラストに変換し、続いてＤＮＡおよびポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）を加える。次いで１選択した条件下、３％寒天培地中でＰＥＧ処理プロト プラストを再生する。この方法の詳細はジエイ・ディ・ベグズ（Ｊ、Ｄ、　Ｂｅ ｇｇｓ　）。

ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）（０ンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））、　２５７　：１ ０４〜１０９（１９７８）；およびヒンネン・エイら（Ｈｉｎｎｅｎ。

Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、　）％プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７５：１９２９〜１９３３（１９７８）による報文中に記載 されている。第２の方法は細胞壁の除去を含まない。その代わり、細胞を塩化も しくは酢酸リチウムおよびＰＥＧ　で処理し、選択プレート上に置く（イト−・ エイチら（ｔｔｏ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・バクテリオロ ジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔ、）　、１５３：１６３〜１６８．１９８３）。

ＨＲＳＶ様蛋白質は細胞を溶解し、溶解物に標準的な蛋白質単離法を適用するこ とによって酵母から単離できる。蛋白質はウェスタンプロット法またはラジオイ ムノアッセイによって検出できる。

Ｅ、細胞培養物における発現 ＨＲ３Ｖ　ｃＤＮＡ　は宿主細胞培養物を形質転換するのに用いる各種発現ベク ターに結ぶことができる。ベクターはすべて、形質転換すべき宿主細胞に受容可 能なＨＲＳＶ様蛋白質の転写および翻訳を開示する遺伝子配列を含有する。

加えて、ベクターは、好ましくは、ジヒドロ葉酸還元酵素またはメタロチオネイ ンの如き形質転換宿主細胞の選択用の表現型特性を提供するマーカーを含有する 。加えて、複製ベクターはレプリコンを含有することができる。

ＨＲ３Ｖ＊蛋白質の産生に有用な細胞培養物の例は。

昆虫もしくは哺乳動物源の細胞である。哺乳動物細胞浮遊液も用いることができ るが、哺乳動物細胞系はしばしば細胞の単層形態である。哺乳動物細胞系の例は ベロおよびヘラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（（ＣＨＯ）細胞系、ＷＩ３ ８、ＢＨＫ、ＣＯ３−７またはＭＤＣＫ細胞系を包含する。

前記の如く、ベクター、例えば宿主細胞を形質転換するのに用いるプラスミドは 好ましくはＨＲ３Ｖ様蛋白質遺伝子配列の転写および翻訳を開始する遺伝子配列 を含有する。これらの配列を発現制御配列という。宿主細胞が補乳動物もしくは 昆虫源のものである場合。

有用な発現制御配列は５Ｖ−４０プロモーター（サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　 ）　、　２２２，５２４〜５２７．１９８３）、ＣＭＶ　１．Ｅ、７’ロモータ ー（プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・・オブ・サイエンシ ズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　８１　：６５９〜６６ ３．１９８４）。

メタロチオネインプロモーター（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９６．３９〜 ４２．１９８２）またはバクロウィルス多角体プロモーター（昆虫細胞）（パイ ロロジー（Ｖｉｒｏｌ）、１３１，５６１〜５６５．１９８３）から得られる。

制限酵素を用いて発現制御配列を含有するプラスミドまたは複製もしくは統合Ｄ ＮＡ物質を切断し、要すればまたは所望によりサイズを調節し、当該分野でよく 知られた方法によってＨＲＳ　Ｖ様蛋白質についてコード付けするｃＤＮＡと結 ぶ。

酵母に関する如く高等動物宿主細胞を用いる場合、公知哨乳動物遺伝子からのポ リアゾニレ−ジョンもしくは転写ターミネータ−配列をベクターに取込む必要が ある。ターミネータ−配列の例はウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアゾニレ− ジョン配列である。

ＨＲＳＶ糖蛋白質Ｆは細胞からまわりの培地中に分泌するように設計できる。そ のアンカー領域に先立ち糖蛋白質の早い停止をひき起こすごとによってこ汰は達 成される。ニス・ラスキイら（Ｌ、　Ｌａ５ｋｙ　、　ｅｔ　ａｌ、）　。

バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）、２：５２７〜５３２（ １９８４）。該アンカーは糖蛋白質のカルボキシ末端の疎水性領域であり、それ は糖蛋白質を細胞膜中に保持する。早い停止は、ユニバーサル翻訳ターミネータ −オリゴヌクレオチドを遺伝子のＤＮＡ中の適当な部位に挿入することＫよって 達成される。これらのオリゴヌクレオチドは商業的に入手可能である。Ｆ遺伝子 については、挿入に好ましい部位は遺伝子の５′末端から約１．５ｋｂのＮ５ｉ Ｉ制限酵素部位である。

さらに、宿主細胞において複製を制御する遺伝子配列をウシ・パピローマウィル ス型ベクターにおいて見い出される如きベクター中に取込むことができる。サベ リアーカンポ・エム（５ａｖｅｒｉａ　−Ｃａｍｐｏ　Ｍ、　）、「ウシ・パピ ローマウィルスＤＮＡ：真核クローニングベクター」、ディ・エヌ・エイ・クロ ーニング（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ　）第■巻ア・プラクティカル・アプローチ（ ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　）　、ディ争エム番グローバー（ Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ　）編、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ　）　、アーリントン（ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　）、バージニア州、２１３〜２ ３８頁（１９８５）。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてＨＲＳ　Ｖｌｌｌ蛋白質を 発現するのに有用な好ましい発現ベクターはシャトルベクターｐ　５ＶＣＯＷ７ であり、それは各々イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）およびＣＨＯ細胞においてアン ピシリン耐性およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をマーカーとして利用してＣＨ Ｏおよびイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｔ）細胞の双方において複製する。また、プラ スミドｐｓＶｃＯＷ７　はＣＨＯ細胞における発現に必要なウシ成長ホルモンか らのポリアゾニレ−ジョン配列を供給する。プラスミド、ｐｓＶｃＯＷ７　を切 断し、ウィルスプロモーターおよびＨＲ５Ｖ様蛋Ｖ様蛋白質Ａを挿入する。

昆虫細胞においてＨＲ３ｖｓｉ白質を発現するための組換体バクロウィルスを形 成するのに有用な好ましい発現ベクターはｐＡｃ３７３である。スミスら（Ｓｍ ｉｔｈｅｔ　ａｌ、　）、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（ Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）　３　：２１５６〜２１６５　（１９８３ ）。該プラスミドはアンピシリン耐性を利用してイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　 ）　細胞において複製し、　ＨＲＳＶ遺伝子の発現用にバクロウィルス多角体遺 伝子からの真核プロモーターおよびポリアゾニレ−ジョンシグナルを提供する。

プラスミドｐＡｃ３７３　を切断し３％該プロモーターの隣にＨＲＳＶ　ｃＤＮ Ａを挿入する。リン酸カルシウム沈降によってこの新しいプラスミドをバクロウ ィルス（アリトグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｑｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏ ｒｎｉｃａ　）　核多角体病ウィルス）Ｄ　Ｎ　Ａ２？共トランスフェクトして 昆虫細胞に入れる。同種組換えによってＨＲＳＶ　ｃＤＮＡを含有するｐＡｃ３ ７３多角体遺伝子が存在するウィルス多角体遺伝子を置き換えた組換体バクロウ ィルスを、プローブとして３２Ｐ−ラベルＨＲＳＶ　ｃＤＮＡを用いてドツト・ プロット・ハイブリダイゼーション（サマーズ・エムおよびジイ・スミス（Ｓｕ ｍｎｅｒｓ　、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ、　Ｓｍ１ｔｈ　）、ア・マニュアル・オブ ・メソッズ・フォー・バクロウィルス・ベクター・アンド・インセクト・セル・ カルチャー・プロモータ−ズ（Ａ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏ ｒ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　１ｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌ 　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　）　、テキサスエイ・アンド・エム （Ａ＆Ｍ）大学、カレッジ・ステーショア　（ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ 　）、テキサス、２９〜３０頁（１９８６）によッテ検出する。ＨＲＳＶ　ｃＤ ＮＡの多角体遺伝子への挿入はこの封入体形成蛋白質の合成を阻止するので１組 換体バクロウィルスで感染した昆虫細胞はその封入体陰性形態によって分化する こともできる。ＨＲ３Ｖ蛋白質の感染昆虫細胞からの単離はＣＨＯ細胞について 記載した如く達成される。

ＨＲＳＶ様蛋白質を発現するためのウシ・パピローマウィルス（ＢＰＶ）との結 合に用いる好ましい発現ベクターはｐＴＦＷ９、米国出願番号９３５４９０号で あり、ここに参照のために挙げる。該プラスミドはアンピシリン耐性を用いイー ・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）において複製し、ＨＲ８Ｖ遺伝子の発現用のマウス ・メタロチオネインプロモーターおよびＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル を供給する。プラスミドｐＴＦＷ９を切断し％ＨＲ３ＶｃＤＮＡを該プロモータ ーの隣に挿入する。次いでこの新しいプラスミドを切断してＢＰＶの挿入を行う 。リン酸カルシウム沈降によって組換体プラスミドをトランスフェクトして動物 細胞に入れ、形質転換細胞のフォーカスを選択する。これらの形質転換細胞にお いて発現されたＨＲＳＶｉ白質をＣＨＯ細胞について記載した如く単離する。

宿主細胞はトランスフェクションについて受容可能であるかまたは種々の方法に よって受容可能とされる。

ＤＮＡを動物細胞に導入するいくつかのよく知られた方法がある。これらはリン 酸カルシウム沈降、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストを用いる受容細胞の融 合、ＤＮＡを含有するリポソームを用いる受容細胞の処理、および細胞中へのＤ ＮＡの直接マイクロインジェクションを包含する。

当該分野でよく知られた方法、バイオケミカル・メソツズ・イン・セル・カルチ ャー・アンド・パイロロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄＶｉｒｏｌｏｇｙ　）　、クチラー・アー ル・ジエイ（Ｋｕｃｈｌｅｒ　％Ｒ，Ｊ、）　、ドウデン（Ｄｏｗｄｅｎ　）　 、ハツチンソン・アンド−ロス・インコーホレイテッド（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ 　ａｎｄＲｏｓｓ　、Ｉｎｃ、）　、　（１９７７）によッテ、トランスフェク トした細胞を培養し、よく知られた機械的または酵素的方法による宿主細胞系の 破壊によって生成した細胞浮遊液から発現されたＨＲ８Ｖ様蛋白質を単離する。

細胞から分泌されるように設計されたＨＲ５ｖｓ蛋白質は細胞を破壊することな く培地から単離する。

洗剤でＣＨＯ細胞を溶解することによってＨＲ５Ｖ蛋白質の単離を達成する。Ｈ ＲＳＶ＊蛋白質については、まず細胞質画分を糖蛋白質に特異的に結合するヒラ マメレクチンカラムに適用するのが有効である。次いで、溶離した糖蛋白質を抗 −ＨＲ５Ｖ抗体を含有するアフィニティーカラムに適用する。ＨＲＳＶの非糖蛋 白質は直接にアフイニテイカラムに適用することができる。

Ｆ、定義 「細胞培養物」なる語句は、もとの植物または動物の体外で細胞が生存できるよ うにする、多細胞植物もしくは動物のいずれかから由来する増殖細胞の含有物を いう。

「下流」なる語は発現の方向にさらに進行する配列に同じであり１例えばコーデ ィング領域は開始コードンよりも下流にある。

「微生物」なる語は細菌、放線菌および酵母の如き単一細胞の原核生物および真 核生物を共に包含する。

「オペロン」なる語は構造遺伝子、調節遺伝子および調節遺伝子産生物によって 認識されるＤＮＡ中の制御要素を包含する遺伝子の発現および調節の完全な単位 をいう。

「プラスミド」なる語は自律自己複製染色体外環状ＤＮＡをいい、発現型および 非発現型を共に包含する。

組換体微生物または細胞培養物が発現プラスミドを宿すと記載する場合、「発現 プラスミド」なる語句は染色体外環状ＤＮＡおよび宿主染色体に取込まれたＤＮ Ａを共に包含する。プラスミドが宿主細胞によって維持される場合、該プラスミ ドは自律構造としてまたは宿主ゲノムに取込まれた一部としてのいずれかとして 、有糸分裂の間、細胞によって安定に複製される。

「プロモーター」なる語は転写を開始するための。

ＲＮＡポリメラーゼに結合するのに関与するＤＮＡの領域である。

「免疫原性フラグメント」なる語句はビルレントＨＲＳＶに暴露された患者にお いて効果的な免疫学的保護を生ずるのに十分な抗原的能力を有するＨＲＳＶの構 造蛋白質の誘導体を包含する。ｒＨＲＳＶ様蛋白質」なる語句はこれらのフラグ メントを含むことを意味する。

例えば、ＨＲＳＶｉ白質はアミノ酸残基よりなり、それらのすべてが水性環境に 暴露され、強力な免疫原性応答を引き出すことができるのではない。注意深く選 択すると、これらの領域に対する修飾または欠失は抗原性に影響を与えないであ ろう。もはや天然ＨＲＳＶ蛋白質ではないが、欠失が含まれると該蛋白質は今や 免疫原性フラグメントであり、第一次配列に対して欠失または修飾が含まれると 該蛋白質はＨＲＳＶ様蛋白質である。

ｒＤＮＡ配列」なる語句はヌクレオチド塩基、アデノシン、チミジン、シトシン およびグアノシンよりなる単一鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子をいう。

「実質的に純粋な（ＨＲＳＶ）蛋白質」なる語句はウィルス合成の蛋白質を含有 しないウィルス蛋白質の組成物をいう。該実質的に純粋な蛋白質は低濃度の宿主 細胞構成要素で汚染され得るが、該蛋白質は複製ＨＲＳＶによって産生される構 造および非構造汚染ウィルス蛋白質を欠く。

「適当な宿主」なる語句は組換体プラスミドを受容可能であり、該プラスミドが 複製を行い、そのゲノムに組込まれ、または発現されることを可能とする細胞培 養物または微生物をいう。

「上流」なる語は発現から反対方向に進行する配列に同じであり、例えば、細菌 プロモーターは転写単位より上流にあり、開始コードンはコーディング領域より 上流にある。

チャート１〜６でプラスミドおよびフラグメントを表わすのに用いる約束はプラ スミドおよびそれらのフラグメントの通常の環状表示に同意義である。環状図と は異なり、チャート上の単一線は開始または転写が左から右に（５′から３′に ）起こる環状および直線状二本鎖ＤＮＡを共に表わす。星印（＊）はプラスミド の環状形を完成するヌクレオチドの架橋を表わす。フラグメントは二本鎖ＤＮＡ の直線状断片であるから、それらは星印を有さない。エンドヌクレアーゼ制限部 位は直線の上方に示す。遺伝子マーカーは直線の下方に示す。プラスミドまたは フラグメントを表わす図表の下方に現われる棒線はＤＮＡ上の２地点間の塩基対 の数を表わすのに用いる。マーカー間の相対的な隔りは実際の距離を示すもので はなく、単に示されたＤＮＡ配列上のそれらの相対的位置を示すためのものであ る。

実施例 実施例Ｉ　ＨＲＳＶ糖蛋白質ＦおよびＧのクローニング Ａ、ウィルスおよび細胞 ５％加熱不活化胎児ウシ血清を補足したイーグル最小泌須培地中、（アメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄｉ　）　、メリー ランド州から入手可能な）ＲＳウィルスのＡ２株をＨＥｐ−２細胞の単層培養に おいて増殖させる。ＨＥｐ−２細胞の単層培養物についての細胞病理効果によっ てウィルス感染性を測定する。

Ｂ、放射能ラベルＲＳウィルス細胞内ＲＮＡの調製細胞当たりＩ　ＰＦＵの感染 の多連にて、ＨＥｐ−２細胞の単層培養物をＲＳウィルスで感染する。３７℃に おける吸着の２時間後、５％加熱不活化胎児ウシ血清を補足した新鮮なイーグル 最小泌須培地を加える。感染後（ｐ、ｉ、）　１４時間にて、１ｄ当たりアクチ ノマイシンＤ５／ｌで細胞を処理する。次いで、ｐ、ｉ、　１６〜２０時間に、 薬剤の存在において、２０μＣｉ／−にて細胞を〔３Ｈ〕ウリジンに暴露する。

Ｃ１精製したＨＲＳＶ　ｍＲＮＡ　の調製感染後２０時間において、細胞をＨＢ Ｓ溶液（１０ｍＭ　Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−、１ｍ ＭＭｙｃ１２）　中に懸濁し、ドウンス（Ｄｏｕｎｃｅ　）ホモジネート化によ って破壊する。２０００Ｘｙにおける遠心によって核を除去する。上澄みをＣｓ Ｃ１に関して約４．５Ｍとし％Ｎ−ラウリルサルコシンにおいて１．５％とし、 ＨＢＳ、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、および２％Ｎ−ラウリルサルコシンを含有する５ 、　７　Ｍ　ＣｓＣ！溶液２−上に重ねる。２５００Ｏｒｐｍおよび２２℃にお けるベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　ＳＷ　４０　ａ−ター中での遠心の１２ 〜２４時間後、清澄なＲＮＡベレットを滅菌水中に再懸濁し、　０．２　Ｍ　Ｎ ａＣ１−０，２％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　”）とし、エタノールで 沈殿させる。エタノールでの第２の沈殿の後、０．０２％ＳＤＳおよび０．５　 ＭＮａＣｌを含有する０、ＯＩＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５、中のオリゴデオキシ チミジレート〔オリゴ（ｄＴ）Ｊ−セルロースに結合させ％ＮａＣ１を除（前記 物で溶離することによってｍ　ＲＮ　Ａを単離する。ウサギ肝臓ｔＲＮＡキャリ アーおよびＮ　ａ　Ｃ／　ｔ’＝′’０．２　Ｍ添加後、溶離したｍＲＮＡをエ タノールで沈殿させる。

Ｄ、ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡの合成はｃＤＮＡ長を最大にするよう設計された条件による。ランド・ エイチら（Ｌａｎｄ　、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、）、ヌクレイツク・アシッズ・リサ ーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）９：２２５１〜２２６６（１９８１）。

トリスＨＣ／（５０ｍＭ、　ｐＨ８，３）　；　Ｍ？Ｃ１２（１０ｍＭ　）　； ジチオスレイトール（３０ｍＭ）；　ＫＣ／（１２０ｍＭ）；　ピロリン酸ナト リウム（４ｍＭ）；　ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＧＴＰ（各１ｍＭ）；　［ ３Ｈ］ｄＣＴＰ　（アイ・シイ・ニス・ラジオケミカルズ（ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　、　０．８ｍＣ１，０，４Ｃｉ　／ミリモル；　Ｉ　 Ｃｉ　＝　３．７　Ｘ　１０１０ベクレル）；および（ｄＴ）１２−１６　（８ ０μＰ／ｍｆｆ）　；ならびにｍＲＮＡ　（５０μｙ／ｌｎりを含有する５００ μｌ反応混合物中、オリゴ（ｄＴ）　４０μノをプライマーとしておよび鳥の骨 髄芽細胞症ウィルス逆転写酵素（ライフ・サイエンス（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ 　）　、セント・ペータースブルグ（ｓｔ、　−Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ　）、フ ロリダ州）４０単位を用いることによって、　Ｒ３ウィルス感染細胞からのポリ （Ａ）　ＲＮＡ２５マイクログラムを転写してｃＤＮＡに入れる。混合物を４３ ℃にて１時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノー ル沈殿によって反応を停止する。

核酸を水中に再懸濁し％０．３　ＭＮａＯＨの存在において３７℃で２時間イン キュベートする（終容量、３００μｌ）。２．５Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，６） ２５μｌ　および２ＭＨＣ／３０μｌの添加によって混合物を中和し、直ちに１ 　ｍＭ　ト！Ｊス塩酸（ｐＨ７，６）のカラム緩衝液を用いてセファデックスＧ −２００ｔＣ通す。ボイド容量の先端に含有されるｃＤＮＡを収集する。末端転 移酵素（ビイ−ｘ　／Ｌ／−バイオケミカルズ（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ）　）３２５単位を含有する反応混合物５５０μｌ中にホモポリマーｄＣ ＭＰテイルを加える。１５℃にて反応混合物をインキュベートする。２．５およ び５分後に一部を取り出し、１０ｍＭＥＤＴＡに調整し、フェノール−クロロホ ルムでの抽出、続いての３回のエタノール沈殿によってｃＤＮＡを精清する。

アクチノマイシンＤを省略し、オリゴデオキシチミジレートを１−当たりオリゴ デオキシグアニレート１２−１８　’ビイーエル・バイオケミカルズ（Ｐ−ＬＢ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　）　３０μ２　で置き換え、および反応物が〔α −３２Ｐ］ｄＣＴＰ　Ｏ，７５ｍＣ１（比活性、３０００Ｃｉ／ミリモル；アメ ルスハム・コーポレイション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、　）　）を含有す る以外はｍ　ＲＮ　Ａの逆転写について前記した条件下で第２のｃＤＮＡ！ｍｌ の合成を反応混合物６００μｌ中で行う。４３℃での１時間のインキュベーショ ンの後、反応混合物ヲセファロース６Ｂに直接通し、ボイド容量中のｃＤＮＡを 回収する。第２鎖合成の最大限の完成を達成するには、１０ｍＭ）！ｊスス−酸 （ｐＨ７，６）、８ｍＭ酢酸マグネシウム、７０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ　ジチオ エリスリトール、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラー ゼｌ（クレノーフラグメント）（ビイ−エル・バイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））　１２単位を含有する反応混合物４００μｊ中にｃＤ ＮＡを入れる。１５℃での２時間のインキュベーションの後、ＥＤＴＡ〜１０ｍ Ｍ添加によって反応を停止する。フェノール−クロロホルムでの抽出によって産 生物を精製し、セファロース６Ｂを通す。インキュベーションを３０℃にて２． ５および３分間行う以外は前記条件下でホモポリマーｄＣＭＰテイルを反応混合 物６００μｌ中に添加する。ＥＤＴＡの添加によって、およびフェノール−クロ ロホルムでの抽出によって反応を停止し、産生物をエタノール沈殿によって収集 する。

Ｅ、ｃＤＮＡのベクターＤＮＡへのティリングおよびアニーリング （ｐＢＲ３２２をＰｓｔｌで完全に消化しｄＧＴＰ残基のホモポリマー・トラク ト（ｔｒａｃｔ　）を添加することによって調製した）ベクターＤＮＡは二ニー ・イングランド・ヌクレアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）か ら商業的に入手可能である。該ベクターは前記方法により作製することもできる 。また、ベクターＤＮＡと共にｃ　ＤＮＡをアニールする方法はマ二アテイス（ Ｍａｎｉａｔｉｓ　）Ｋよって記載されている。要約すると、１０ｍＭト！Ｊス ｐＨ７，４；　０．４Ｍ　ＮａＣ１；　１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する反応物５０ μ！中でテイル化ｃＤＮＡを１：１のモル比でベクターと混合する。最終ＤＮＡ １度は２０〜６０μ？ｌｔｄ間で変化する。　１）６５°／１０分；４２°／６ ０分；３７°／２時間、および続く室温での２時間よりなるインキュベーション の定義した方法、または２）水浴を止めおよび一晩で室温までゆっくりと平衡化 することを可能とする６５°／１０分でのインキュベーションのいずれかによっ てアニーリングを達成する。

すでに記載した形質転換方法を用いｃＤＮＡ含有ベクターをイー・コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）　に導入する。前記したハイブリダイゼーション法を用いて該細菌をイ ンシテユスクリーニングする。

以下のいずれかの方法によって放射活性的にラベルした〔３２Ｐ〕ハイブリダイ ゼーシヨンプローブを調製する。未感染細胞ｍ　ＲＮ　Ａであらかじめハイブリ ダイゼーションを行った感染細胞ｍＲＮＡを逆転写して細胞ＲＮＡを除去するこ とによって、または精製したヌクレオキャブジッドから単離したウィルスＲＮＡ の逆転写によってプローブを調製することができる。コリンズ、ビイ・エルおよ びウエルツ・シイ（Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｐ、Ｌ、　ａｎｄＷｅｒｔｚ　、　Ｇ、 　）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ％８０：３２０８〜３２１２（１９８３）。

特異的ｃＤＮＡの同定は、コリンズ・ビイ・エルら（Ｃｏｌｌｉｎｓ　Ｐ、Ｌ、 　ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、 ４９Ｔ２）：　５７２〜５７８（１９８４）に記載されている如く、ハイブリッ ド選択、細胞−自由翻訳および免疫沈降によって達成される。

コロニーハイブリダイゼーションの好ましい方法は、プローブとして以下に記載 する１５一体を組立てるのに本明細書中で開示する配列を利用する。ハイブリダ イゼーションプローブとして用いるには、７０ｍＭ）リス塩基（ｐＨ７，６）　 、　１００ｍＭＫＣＪ　；　１０ｍＭＭｙＣ／２．５ｍＭジチオスレイトール、 ５０　μｃｉｒ３２Ｐ　ｄＡＴＰ（ビイ・エル・バイオケミカルズ（Ｐ、Ｌ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　）％ＩＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにュー ・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　） 　）を含有する反応容量５０μｌ中で１５一体１μ２をホスホリル化する。イン キュベーションは３７℃にて６０分間行う。このようにして、１５一体をラベル してμｍ当たりＩ　Ｘ　１１０８ｃｐの比活性とすることができる。

Ｆ、プラスミドｐＧＰＦ（チャート１）およびＧＰＧ クローンのＰｓｔｌ　制限分析を用いて、ＦおよびＧ糖蛋白質の５′領域に対し て相補的なプローブに対して相補的配列を示すクローンを第２のスクリーニング にて選択して消化産生物が第１〜４図に示す配列から得ることができるＰｓｔｌ 制限マツプと合致するかどうかを決定する。

最後の証明として、ＤＮＡのミニ調製物をクローンから単離し、デオキシ鎖停止 法によって配列決定する。

一般法の節に記載した如く、プラスミドＤＮＡのミニ調節物を調製する。以下に 記載する合成１５一体を鋳型よりも２０：１モル過剰でプライマーとして用い、 一般法の節に記載した如く、ジデオキシ配列決定を行う。

Ｇ、ＨＲ３Ｖ様蛋白質に対して相補的なオリゴヌクレオチドの合成 ニードハム・パン・デバンター・ディ・アールら（Ｎｅｅｄｈａｍ　Ｖａｎ　Ｄ ｅｖａｎｔｅｒ　、　Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）、ヌクレイツク・アシツズ・リサ ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１２：　６１５９〜６１６８ （１９８４）　に記載されている如く自動合成器を用い、最初ボカージ・ニス・ エルおよびカルサーズ・エム・エイチ（Ｂｅａｕｃａｇｅ　Ｓ、Ｌ、　ａｎｄＣ ａｒｕｔｈｅｒｓ　、　Ｍ、Ｈ，）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ）２２ＣＩＩ　：　１８５９〜１８６２　（１９８１） によって記載された固相ホスホルアミダイト・トリエステル法によりオリゴヌク レオチドを化学的に合成する。ベアソン・ジエイ・ディおよびレグニエ・エフ・ イー（Ｐｅａｒｓｏｎ　ｌＩＪ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｒｅｇｎｉｅｒ、　Ｆ、Ｅ、） 、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、）、　２５５： １３７〜１４９（１９８３）、に記載されている如く、天然アクリルアミドゲル 電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによってオリゴヌクレオチドの 精製を行った。

マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブリュー　（Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ 、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　、　Ｗ、）、グロスマン・エルおよびモルダブ・ ディ（Ｇｒｏｓｓｍａｎ　、Ｌ、　ａｎｄ　Ｍｏ１ｄａｖｅ。

Ｄ、）！、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）。

ニューヨーク、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５：４９９〜５６０（１９８０）の化学的分解法を用 いて合成オリゴヌクレオチドの配列を証明することができる。別法として、マキ サムおよびギルバー）　（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）の方法、前 掲。

またはワレス・アーＡ／−ビイら（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、、ｅｔａｌ、） 、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１６：２１〜２６（１９８１）の二本鎖鋳型を配列決定 するための鎖停止法を用いて、オリゴヌクレオチドフラグメントの二本鎖ＤＮＡ 配列への組立後に配列を確認することができる。

ｍ　ＲＮ　Ａの３′末端からのオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡの第１鎖を 作製するための逆転写反応を特異的に開始することができる。５′末端からのオ リゴヌクレオチドを用いてその遺伝子に特異的な全長ｃ　ＤＮＡについてプロー ブすることができる。別法配列を用いることもできるが、以下の１５一体オリゴ ヌクレオチドは前記目的に対して有用である。

ｇｐ ５′末端　ＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧ３′末端　ＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡ ＧＴＡＧｇｐ ５′末端　ＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＡＡＴＣ３′末端　ＧＣＡＴＴＴＡＧＴＡＡ ＣＴＡＡＡ ５′末端　ＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＴＣＣ３′末端　ＣＧＡＧＴＣＡＡＣＡＣ ＡＴＡＧｕｃ ５′末端　ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡ３′末端　ＧＡＴＧＴＡＧＡＧＣＴ ＴＴＧＡ２２に ５′末端　ＡＴＧＴＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＴ３′末端　ＡＡＴＧＡＴＡＣＴＡＣ ＣＴＧＡλエキソヌクレアーゼ工程で用いるオリゴヌクレオチド ｇｐ ＣＡＡＡＴＡＡＣＡＡＴＧＧＡＧ ｇｐ ＣＡＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡ 実施例２　ＣＨＯ細胞におけるＨＲ３Ｖの糖蛋白質Ｆ　（ｇｐＦ）およびＧ（ｇ ｐＧ）の発現特に断りのない限り、同一の方法および酵素を両筒蛋白質について 用いる。

Ｆ糖蛋白質の最大発現を得るためには、ｃＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２に挿 入するのに用いるＧ−ＣヌクレオチドをｃＤＮＡの（もとのｍＲＮＡに対する） ５′末端から除去しなければならない。ｇｐＦ　ｃ　ＤＮＡをＣＨＯ細胞につい て好ましい発現ベクター、ｐｓＶｃＯＷ７　（以下に記載）、に都合よく挿入す るには、蛋白質コーディング配列から上流にＢ　ａ　ｍＨ１部位を供給しなけれ ばならない。これを達成するには、ＦもしくはＧ糖蛋白質のｃＤＮＡをｐＵｃ１ ２（ビイ・エル・ファルマシア・ラブズ（ＰＬ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌａｂｓ 　）ｂ　ピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）、ニューシャーシー州）に 挿入する。

Ａ、ｐＧＰＦ２の組立て−チャート２ 糖蛋白質のｃＤＮＡをＰｓｔＩ部位により両側切断するが（チャート１）、内部 ＰｓｔＩ部位も存在する。従って、プラスミドｐＧＰＦをＰｓｔＩで部分的に消 化し、フラグメント２　（１，９ｋｂ　；　ｇｐＧｃＤＮＡは０．９ｋｂ）　を ゲルから単離する。ＰＳｔＩ　で消化したプラスミドｐｔＴｃ１２（ベセスダ・ リサーチ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５Ｌａｂｓ、）、ロックビル （Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ　）％メリーランド州）にフラグメント２を結ぶ。ｐ Ｕｃ１２においてＸｂａＩ部位に隣接するｇｐＦ遺伝子の５′末端を有するプラ スミドを選択し、ｐＧＰＦ２　（４，６ｋｂ）と名付ける。約２００ｂｐのフラ グメントを生じるＡｃｃＩでの切断によってこの配位を証明する（　ｇｐＧにつ いては、約４００ｂｐのフラグメントを生じるＨ４　ｎｃ■での消化によって配 位を証明する）。

Ｂ、ｐＧＰＦ３の組立てチャート３ ｃＤＮＡの５′末端からＧ−Ｃヌクレオチドを除去するには、）（ｂａｉでｐＧ ＰＦ２を開き、細菌アルカリ性ホスファターゼで末端を処理してフラグメント４ を得る。次いで、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位間の小片を切断除去する５ａｌＩ でフラグメント４を消化し、クレノー酵素で処理して平滑末端とする。クレノー 酵素での処理後、５Ｉホスフエートを要しかつ３−突出部分を得るラムダエキソ ヌクレアーゼでフラグメント２を消化する。ｇｐＦから上流の末端上の５′ホス フエートの除去のため。

エキソヌクレアーゼはｇｐＦ配列に向って下流に消化するであろう。エキソヌク レアーゼに十分な時間を与えてＧ／Ｃテイル領域を超えて先導配列に至るヌクレ オチドを除去する。先導配列の最初の１５塩基を含有する合成配列をフラグメン ト４に対してハイブリダイゼーションを行い、失った塩基をクレノー酵素で満た し、末端をＴ４リガーゼで結んでｐＧＰＦ３　（４，６ｋｂ）を得、これをトラ ンスフェクトしてイー・コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）に入れ、その配列を確認する 。

ｃＤＮＡの３Ｉ末端からＧ−Ｃヌクレオチドを除去するには、Ｈｉｎｄ　ｍでｐ ＧＰＦ３を開環し％Ｇ−Ｃヌクレオチドを通じて消化するのに十分な時間エキソ ヌクレアーゼＢａ１３１で処理する。クレノー・酵素で末端を平滑とし、Ｂａｍ ＨＩ　での消化によってベクターＤＮＡからｃ　ＤＮＡを遊離する。ｃＤＮＡフ ラグメントをゲルから単離し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃ　ＩＩ　（ＨｉｎｃＩ Ｉは平滑末端に適合する）で消化したプラスミドｐＵｃ１２　に結んでｐＧＰＦ ４を得る。該プラスミドを形質転換してイー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）に入れ、Ｂａ１３１で十分に消化した適当なりローンを配列決定によ って同定する。別法として、　Ｇ−Ｃヌクレオチドから上流にユニーク部位を有 する制限酵素で消化することによってＧ−Ｃヌクレオチド配列去することができ る。ｇｐＦについてはかかる酵素はＨａｅ■であり、ｇｐＧについてはＦｏｋＩ である。これらの末端を平滑とし、ｇＧＰＦ４を生成するのに前記した如くＤＮ Ａ　を処理する。これらの酵素はそれらの遺伝子の正規の翻訳停止シグナルから 上流を切断するので、ユニバーサル翻訳停止オリゴヌクレオチドにュー・イング ランド・バイオロジー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））は適当な 制限酵素部位に結ばれるであろう。

Ｃ，ｐｓＶｃＯＷ７の組立−チャード４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ　）から入手可能な、またはスブラマニら（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　、　ｅｔ 　ａｌ、）。

「マウス・ジヒドロ葉酸還元酵素相補性デオキシリボ核酸のシミアンウィルス４ ０における発現」、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　２　：　８５４ 〜８６４　（１９８１，９月）の方法により調製した）出発プラスミドｐＳＶ２ ｄｈｆｒをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化してアンピシリン耐性遺伝子、Ｓ Ｖ４０開始点、およびｄｈｆｒ遺伝子を含有するフラグメン）　（５）　（５， ０ｋｂ）　を得る。

ｐＳＶ２ｄｈｆｒ　を切断するのに用いたのと同一の制限エンドヌクレアーゼで 消化したプラスミドｐλＧＨ２Ｒ２からｐｓＶｃＯＷ７の第２の部分を得てゲノ ムウシ成長ホルモン遺伝子、すなわちＢＧＨｇＤＮＡの３′末端を含有するフラ グメント５（２，１ｋｂ）を得る。プラスミドｐλＧＨ２Ｒ２はイリノイ州、ペ オリア（Ｐｅｏｒｉａ）のノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ （Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ　）に寄託したイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩ宿主（ＮＲＲ Ｌ　Ｂ−１５１５４）から公に入手可能である。フラグメント（５および６）を 結んテｐ　５ＶＣＯＷ７　（７，１ｋ　ｂ　）を得る。

Ｄ、ｐＧＰＦ−ＩＥ−ＰＡ　の組立−チヤード５〜６ｐＧＰＦ−ＩＥ−ＰＡの組 立は２つの工程で達成される。

まずｐＧＰＦ３からのＧｐＦ　ｃＤＮＡをｐｓＶｃＯＷ７に挿入してｐＧＰＦ− ＰＡを得、次いでサイトメガロウィルスの即時型プロモーターを挿入してＨＲ５ Ｖ！ｆ２白質の転写を開始してｐＧＰＦ−ＩＥ−ＰＡを得る。

工程１゜プラスミドｐｓＶｃＯＷ７をＥｃｏＲＩおよびＰｕｖＩで切断し、ＢＧ Ｈ遺伝子の最も３′のエクソン中のＰｖｕ１１部位から３′末端より下流のＥｃ ｏＲＩ　部位まで延びるウシ成長ホルモンのポリアゾニレ−ジョン配列を含有す るフラグメン）　７　（６００ｂｐ）を単離する。

ＢＧＭポリアゾニレ−ジョン配列の完全な記載については以下の文献を参照：　 （１１Ｂ　Ｇ　ＨゲノムＤＮＡの同定および特徴づけが開示されている１９８４ 年６月２７日公開のヨーロッパ特許出願０１１２０１２号；（２）ウォイチック ・アール・ビイら（Ｗｏｙｃｈｉｋ、Ｒ，Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、）、「正確なポリ アゾニレ−ジョンのためのウシ成長ホルモン遺伝子の３′フランキング領域の要 件」、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ８１：３９４４ 〜３９４８（１９８４年７月）；およびディ・アール・ヒグズら（Ｄ、Ｒ，Ｈｉ ｇｇｓ　、　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０６：３９８〜４ ００Ｃ１９８３年１１月２４日）ならびにヌクレオチド配列ＡＡＴＡＡＡはＢＧ Ｈ遺伝子の３′末端から上流の（５’末端に向う）位置１１〜３ｏヌクレオチド においてポリアゾニレ−ジョンシグナルを特徴づけることを開示するそこに引用 されている文献。

ｐｓＶｃＯＷ７の第２の試料をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断してフラグメ ント８を得る。別法として、フラグメント８は、ベセスダ・リサーチ・ラボラト リーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　） から入手可能な親プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒからのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフ ラグメントから得ることができる。フラグメント８はｐＢＲ３２２からの複製開 始点およびイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）においてプラスミドの選択を可能とする イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）において発現されるアンピシリン耐性遺伝子を含 有する。また、該フラグメントは哺乳動物細胞における発現を可能とするマウス ・ジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡを構造中に含有する。スブラマニら（Ｓｕｂｒ ａｍａｎｉ　、　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・アンド−セリュラー・バイオ ロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）１　：８５４〜８６４（１９８１ ）。

プラスミドｐＧＰＦ３をＨｉｎｄｌＩＩで切断し、クレノー酵素で処理し、Ｂａ ｍＨＩで再切断してフラグメント９（１，９ｋｂ）を得、これをゲル単離する。

フラグメント９はＧｐＦ　ｃＤＮＡからの先導および構造コーディング配列を含 有する。９ａｍＨＩ部位はｍＲＮＡの５′未翻訳配列についてコード付けするｃ ＤＮＡから丁度上流にあり、ＨｉｎｄＩ［１部位はｇｐＦｃＤＮＡの３′末端近 くのＰｓｔ　Ｉ部位を数塩基対超えてｐＵｃ１２ベクター中にある。

フラグメント７．８および９を結んでイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）およびＣＨＯ 細胞間を往き来することができる複製ベクターであるｐＧＰＦ−ＰＡ　（７，３ ｋ　ｂ　）を得る。プラスミドｐＧＰＦ−ＰＡを形質転換してイー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）に入れる。

工程２゜工程２ではヒト・サイトメガロウィルスからの即時型遺伝子プロモータ ー（ＣＭＶ　１．Ｅ、プロモーター）を挿入することによって、　ｐＧＰＦ−Ｐ Ａを発現プラスミドｐＧＰＦ−ＩＥ−ＰＡに変換する。該ＣＭＶ１．Ｅ、プロモ ーターはＣＭＶゲノムのＰｓｔｉ消化から得られる。

主要即時型遺伝子（ＣＭＶ　１．Ｅ、）を含有するヒト・サイトメガロウィルス （ＣＭＶ）ゲノムの領域の制限エンドヌクレアーゼ切断マツプはステインスキイ ら（Ｓｔｉｎｓｋｉ　、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナ）１．ｔ−オブ・バイｏｏ ジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）４６　：１〜１４．１９８３　；　ステンベルグら（Ｓｔｅｎｂ ｅｒｇ　、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイｏｏジー　（Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ、）４９　：１９０〜１９９％１９８４　；およびトムセンら（Ｔｈｏｍｓ ｅｎ、ｅｔ　ａｔ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ 、　８１　：６５９〜６６３゜１９８４　に詳細に記載されている。

ステインスキイおよびトムセン（５ｔｉｎｓｋｉ　ａｎｄＴｈｏｍｓｅｎ　）の 文献は主要な即時型遺伝子についてのプ０−Ｔ−−ターを含有する２、０キロベ ースのＰｓｔ）　フラグメントを記載している。こ（７？２．０　ｋｂ　Ｐｓｔ Ｉフラグメントを単離し、Ｓａｕ　３Ａ　Ｉで消化すると、産生物のなかに７６ ０　塩基対フラグメントが得られる。この７６０塩基対フラグメントは、そのサ イズならびに該フラグメント中のＳａｃ　Ｉ切断部位およびＢａｌ　Ｉ切断部位 の存在により、他の産生物から区別できる。その便利な同定のため、本明細書中 に記載する如く、この５ａｕ３ＡＩフラグメントの利用はＣＭＶ　１．Ｅ、プロ モーターの使用の好ましい方法である。

プラスミドｐＧＰＦ−ＰＡをＢａｍＨＩで切断し、ＣＭＶ即時型プロモーターを 含有する５ａｕ３ＡＩフラグメントを受容可能なりａｍＨＩ　部位に結ぶ。プロ モーターからの転写がＨＲＳＶ様蛋白質についてのｍＲＮＡを合成するようにＣ ＭＶプロモーターフラグメントを配位中に含有するプラスミドは、　５ａｃＩを 用いる該プラスミドの切断によって同定される。得られたプラスミドをｐＧＰＦ −ＩＥ−ＰＡ　と名付け、それはｃＤＮＡの５’末端にＣＭＶｌ　、Ｅ、プロモ ーター、およびその３′末端上にＢＧＨポリアゾニレ−ジョンシグナルを有する 。同一の方法を用いてＧｐＧについての同等な発現ベクターを得る。

ＣＨＯ細胞中へのトランスフェクションまで該プラスミドをイー・コリ（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）中で維持する。

Ｅ、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび培養グラハムら（Ｇｒａｈａｍ、 　ｅｔ　ａｌ、）（イントロダクション・オブ・マクロモレキュールズ・イント ウ・バイアプル・ママリアン・セルズ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆＭａｃ ｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１ｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ １ｌｓ）、アラン・アール・リス・インコーホレイテッド（ＡｌａｎＲ，Ｌｉ５ ｓ　Ｉｎｃ、）、ニューヨーク、１９８０．３〜２５頁）によって詳細に記載さ れているＤＮＡの細胞中へのトランスフェクションのためのリン酸カルシウム法 を用い。

ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ）細胞中へプラスミドｐＧＰＴ−ＩＥ−ＰＡをトランスフェクトする。用いる細 胞系はコロンビア大学のエル・チェイシン（Ｌ、　Ｃｈａｓｉｎ　）からもとも と入手可能で、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズ（Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　７７　：　４ ２１６〜４２２０．　（１９８０）に詳細に記載されている突然変異体ＤＸＢ− １である。前記トランスフェクション方法は、トランスフ鳳クトされたプラスミ ドを取込む細胞はもはやｄｈｆｒ　を欠（ものではなく、ダルベツコの修正イー グル借地＋プロリン中で増殖するという事実に基づく。

ＨＲ５Ｖ様蛋白質を発現するＣＨＯ細胞をｐＨ７，４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢ Ｓ）中で洗浄し、次いで１．０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００および １．０％デオキシコール酸ナトリウムを含有するＰＢＳ中で溶解する。核をペレ ット化した後、上澄みをコンカナバリンＡカラムに付す。充分に洗浄した後、前 記緩衝液中のα−Ｄ−メチルグルコシドの直線グラジェント（０〜０．５　Ｍ　 ）で糖蛋白質を溶離する。溶離した糖蛋白質を０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ 　）　Ｘ−１００を含有するＰＢＳに対して透析し、アフィニティーカラムに付 す。アフィニティカラムは、公知技術によってセファロース４Ｂビーズ（ファル マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）、ピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　） 　、　ニュージャー外用）に結合させたＨＲ５Ｖの多クローンもしくは単クロー ン抗体のいずれかよりなる。該カラムを透析緩衝液中で洗浄し、０．１Ｍグリシ ン（ｐＨ２，５）および０．１％トリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ　）　Ｘ　−１００ を含有するＰＢＳで溶離する。食塩水に対して糖蛋白質を透析し、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲル上の電気泳動によって純度をチェックする。

実施例３　ウシ・パピローマウィルス（ＢＰＶ）を用いるＨＲ３Ｖ　ＧＰＦ　（ ７）発、現Ａ、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）における複製に適した翻訳不可 能な発現カセットを含有するクローニングベクターの組立 ｐＴＦＷ８およびｐＴＦＷ９の組立は、ＢＰＵ　を用いるＨＲ３Ｖ蛋白質を発現 する都合よい出発材料を供給する。

寄託したプラスミドの転写ターミネータ−はＨＲ５Ｖｉ白質の発現を阻止するが 、それは単一工程の切出しおよび結びで除去されなければならない。

ａ　、　ＰＴＦＷ８の組立−チヤード７プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（ ３４２−１２）はモレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。

ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、３巻（ｍｌ　１　）　：　２１１０〜２１１ ５（１９８３）中に記載されており、米国、メリーランド州、ベセスダ（Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ　）、ナショナル・キャンサー・インステイテユー）　（Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のピータ−・ホウレイ（Ｐｅｔｅ ｒ　Ｈｏｗｌｅｙ）から得られる。

プラスミドｐｄＢＰＶＭＭＴ　ｎｅｏ　（３４２−１２）は３つの部分：ユニー クＢａｍＨＩ部位において開いた完全なりＰＶ−１ゲノム（１００％）；ｐＭＬ ２（毒性除去ｐＢＲ３２２の誘導体）；ならびにマウス・メタロチオネインＩ遺 伝子プロモーター、Ｔｎ５のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子、 およびシミアンウィルス４０初期領域転写プロセッシングシグナルよりなる転写 カセットよりなる。まずプラスミドｐｄＢＰＶ　−ＭＭＴｎｅｏ　（３４２−１ ２）をＢａｍＨＩで消化してＢＰＶＥ列を除き、それを単離し、後の挿入のため に保存した。Ｔ４リガーゼを用いて残存するフラグメントを再び結んでｐＭＭｐ ｒｏ、　ｎｐｔＩＩ　（６，７ｋｂ　）を得る。残存するプラスミド中にユニー ク制限部位を生成することにより、ＢＰＶゲノムの除去は後の遺伝子操作を容易 とする。組換えが完了した後、　ＢＰＶゲノムを置き換える。

プラスミドｐＭＭ　ｐｒｏ　、　ｎｐｔ　ｎをＢｇｌＩ［で消化し、ユニーク制 限部位を含有する合成りＮＡフラグメント１１を挿入し、Ｔ４リガーゼを用いて 結んでｐＴＦＷ８　（６，７ｋｂ）ヲ得る。マウス・メタロチオネインＩ遺伝子 プロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子間へのユニーク制限部位の挿入以外 は、プラスミドｐＴＦＷ８はｐＭＭｐｒｏ、ｎｐｔＩＩに同じである。

＞　、ｐＴＷＦ９の組立−チャード８ プラスミドｐＴＷＦ９は、メタロチオネインＩ遺伝子プロモーターおよびネオマ イシン耐性遺伝子間に挿入されたファージラムダからの転写ターミネータ−ＴＩ を含有する。該転写ターミネータ−は米国、メリーランド州、ベセスダ（Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ）のナショナル・キャンサーφインステイテユー）　（Ｎａｔｉｏｎ ａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　）のドナルド・コート（Ｄｏｎａｌｄ 　Ｃｏｕｒｔ　）から得られる。グアルネロスら（Ｇｕａｒｈｅｒｏｓ　ｅｔ　 ａｌ、）、ビイ・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）、７９：２３８〜２４２（１９ ８２）に記載されている如＜　ｔｉがｓｉｂ　３　突然変異を有する以外は、該 転写ターミネータ−はジーン（Ｇｅｎｅ　）、２８：３４３〜３５０（１９８４ ）に記載されているｐＵＳ６と同じであるｐＫＧ１８００ｓｉｂ　３　中に供給 される。

ファージラムダの通常の感染過程の間、　ｔＩ　ターミネータ−はｐｌからのバ クテリオファージλｉｎｔ　遺伝子発現の抑制において、およびＰ□から由来す るｉｎｔ　遺伝子転写の停止において機能する。Ａｌｕ　ＩおよびＰｖｕＩを用 い、該ターミネータ−をフラグメント１２　（１，２ｋｂ）としてｐＫＧ１８０ ０ｓｉｂ３　から切り出し、ゲル単離し。

該フラグメントのいずれか末端上にＸｈｏ　Ｉリンカ−を置く。該リンカ−は米 国、マサチューセッツ州、ベバーリイ（Ｂｅｖｅｒｌｙ　）、二ニー・イングラ ンド・パイオラプズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）から入手可 能である。

次いで、ＸｈｏＩ相補性末端によって結合されたターミネータ−フラグメントを 、あらかじめＸｈｏ　Ｉで消化したｐＴＷＦＢ中に挿入する。次いで、Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼを用いてフラグメントを結んでｐＴＷＦ９（７，９ｋｂ）を得る。プ ラスミドｐＴＷＦ９はブダペスト条約に従って寄託した。プラスミドｐＴＦＷ９ をイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主中に維持し、１９８６年１１月１７８に米国 、イリノイ州、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ　）、ノーザン・リージョナル・リサー チ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎ ｔｅｒ　）　に寄託し、受１も番号ＮＲＲＬＢ−１８１４１が与えられた。

Ｂ、ｐＴＦＷ／ＧＰＦの組立−チャード９本実施例では、糖蛋白質の培地中への 分泌が所望される。従って、ｐＧＰＦ４中のｇｐＦ　遺伝子のＮ５ｉＩ制限酵素 部位にユニバーサル翻訳停止オリゴヌクレオチドを結んで前記した如きその「ア ンカー領域」を欠く、切断した糖蛋白質を生じる。修飾したプラスミドをｐＧＰ Ｆ５と名付ける。ｐＴＦＷ／ＧＰＦを組立てるには。

ｐＧＰＦ５をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［［で消化する。クレノー酵素でその 末端を平滑とし、合成りｇｌｌｌｌＪンカー（ニュー・イングランド・バイオラ ブズ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）　）を該クローンの末端に結 ぶ。ＤＮＡをＢｇｌ■で消化し、フラグメント１３（１，９ｋｂ）と呼ぶ。次い で、ｇｐＦ遺伝子を含有するフラグメント１３をゲルから単離する。精製したフ ラグメントをＢｇｌＩ［で消化したｐＴＦＷ９に結んでｐＴＦＷ／ＧＰＦ（９， ８ｋｂ）を得る。

Ｃ，ｐＴＦＷ／ＧＰＦの真核発現ベクターへの変換−チャード１０ 実施例３Ａの工程ａ（チャート７％工程ａ）においてＢａｍＨＩで切断した１０ ０％完全ＢＰＶ−１ゲノムを再挿入することによって、プラスミドｐＴＦＷ／Ｇ ＰＦを真核発現ベクターに変換する。プラスミドｐ　Ｔ　Ｆ　Ｗ／ＧＰＦをＢａ ｍＨＩで切断し、ＢＰＶ−１無傷ゲノム、７．９ｋｂ　フラグメント（チャート ７）を挿入してｐＴＦＷ／ＧＰＦ／ＢＰＶ　（１７，７ｋｂ）を得、真核細胞に よる糖蛋白質Ｆの産生が所望されるまでイー・コ！Ｊ　（Ｅ、Ｃｏ１１）中で複 製する。

Ｄ、マウス・Ｃ１２７細胞におけるｇｐＦの発現マウス・Ｃｌ２７　細胞中への トランスフェクションに先立ち、ｐＴＦＷ／ＧＰＦ／ＢＰＶ＊をＸｈｏ　Ｉで消 化してＴＩターミネータ−を切り出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再び結ぶ（チャー ト１０）。得られたプラスミドｐＴＦＷ／ＧＰＦ／ＢＰＶ（１６，５ｋｂ）　は 、今や、培地中に分泌されるｇｐＦの高レベルの発現を定方向化するであろう。

該Ｃ１２７細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）から入手可能で あり、１０％胎児ウシ血清を含有するダルベツコの修正最小必須培地中で増殖さ せる。Ｃ１２７細胞の培地中のｇｐＦｉ白質の濃度は、抗−ＲＳＶ抗体および１ ２５Ｉ−ラベル蛋白質Ａを用いるウェスタンプロット実験によって測定する。

発現する細胞のまわりの培地を収集することによって、（切断された）　ＨＲＳ Ｖ　ｇｐＦを精製する。発現のレベルがこの培地中で許容されるならば、この時 点では血清のない培地が好ましい。低速遠心によって培地を清澄化し、濾過によ って濃縮する。次いで、ＣＨＯ細胞中で産生された糖蛋白質について記載した如 く、カラムクロマトグラフィーによってＨＲＳＶｇｐＦを精製する。

実施例４　バクロウィルス・ウィルスを用いるＨＲＳＶ　ＧＰＦ（７）発現 以下の実施例は昆虫細胞培養物における糖蛋白質Ｆの発現に関する。すべての手 順は、サマーズ・エム・ディおよびスミス・シイ・イー（Ｓｕｍｍｅｒｓ　、Ｍ 、Ｄ、　ａｎｄＳｍｉｔｈ　％Ｇ、Ｅ、）、１９８６年にテキサス州、カレッジ −ステーション（ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ）、テキサス・アグリカルチ ュラル・イクステンション・サービス（ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　 Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ　）、テキサス−アグリカルチュラル・イ クスペリメント・ステーション（Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　）　、農業単科大学によって出版されたバ クロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養方法のマニュアル（Ａ　Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　）　中に詳細に記載されている 。出発プラルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　）核多角 体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）についての多角体プロモーターから直ぐ下流にユニ ークＢａｍＨＩ部位を有する一般的なノ（クロウィルス発現ベクターである。該 多角　蛋白質はウィルス感染およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ複製には必須でないマトリ ックス蛋白質である。該プラスミドは、テキサス７７８４３、カレッジ−スｆ− ショア　（ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ　）　、テキサスＡ＆Ｍ大学、昆虫 学部門のマックス・サマーズ（Ｍａｘ　Ｓｕｍｍｅｒｓ　）教授から入手可能で あり、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、３（１３：　２１５６〜２１６５　（ １９８３）に詳細知記載されている。

Ａ、ｐＡｃＧＰＦの組立−チャード１１プラスミドｐＧＰＦ５をＨｉｎｄｎｌ　 で消化し、クレノー酵素で末端を平滑とする。合成りａｍＨＩ　！Ｊンカーにニ ュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　 ）　）を該ＤＮＡ　の末端に結ぶ。該ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ｇｐＦ遺伝 子を含有するフラグメント１４をゲルから単離する。ＢａｍＨＩ　で消化したｐ Ａｃ３７３に精製したフラグメントを結ぶ。

Ｂ、ニス・フルギペルダ（Ｓ　、　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）のトランスフェク ションおヨヒ培養 ニス・フルギペルダ（Ｓ、　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）における共トランスフェ クションによって、ｐＡｃＧＰＦのｇｐＦｃＤＮＡ挿入を天然ＡｃＮＰＶ　ＤＮ Ａと再び組合せる。ニス・フルギペルダ（Ｓ、　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）　（ ＳＦ９　；　ＡＴＣＣＣＲＬ　１７１１）を、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）ラクトア ルブミン加水分解物およびイースト分解物で補足したブレイス（Ｇｒａｃｅ　） 培地（ジブコ・ラブ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、）　、リボニア（Ｌｉｖｏｎｉａ　 ）、ミシガン４８１５０）、１０％胎児ウシ血清、中で培養する。各々１μ／− および２μ／ｄにおいて細胞をＡｃＮＰＶ　ＤＮＡおよびｐＡｃＧＰＦで共トラ ンスフェクトする。培地を収集し、低速遠心によって細胞物質を除去することに よってウィルス粒子が得られる。次いで、ウィルス含有培地を用いてニス・フル ギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）　を感染する。天然ウィルスＤＮＡ および糖蛋白質Ｆについてコード付けするｃＤＮＡで組換えたＤＮＡを共に包含 するこれらのウィルス粒子を用いる続いてのニス・フルギペルタ（ｓ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）　の感染の結果、多角体蛋白質の代りにＨＲ５Ｖ蛋白 質を発現するいくらかの細胞が得られる。

ニス・フルギペルダ（Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）細胞を含有する９６−ウ ェル組織培養プレートにおける一連の制限希釈ブレーティングによって、ｉｌ換 体ウィルスの精製が達成される。ニックトランスレーションによって３２Ｐ　− ｄ　ＣＴＰでラベルしたｐＧＰＦ４　をプローブとして用いるドツト・プロット ・ハイブリダイゼーションにより１組換体ウィルスを含有するウェルを検出する 。

一旦十分に精製すると、そのユニーク封入体−陰性プラーク形態によって組換体 ウィルスが検出される。組換体バクロウィルス感染細胞中で合成された）ＩＲ３ Ｖ蛋白質は、抗−Ｒ５Ｖ抗体および１２５Ｉ−ラベル蛋白質Ａ（アメルスハム・ コーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、））を用いるウェスタン・プ ロット実験によって検出される。

Ｃ１２５細胞についてのＢＰＶ発現系において記載した方法によって、ＨＲ３Ｖ ｉ白質を培地から精製する。

実施例Ｓ　ＨＲＳＶ用ワクチンの調製 よく知られた方法によって免疫原をワクチン投与形態に調製することができる。

該ワクチンは筋肉内、皮下、または鼻腔内投与できる。筋肉内注射の如き非経口 投与用には、免疫原を適当な担体と組合わすことができ、例えば、水酸化アルミ ニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸 ベリリウム、シリカ、カオリン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エ マルジョン、ムラミルジペプチド、細菌エンドトキシン、脂質Ｘ、コリネバクテ リウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ　）　（プ ロピオノハクテリウム−７クネ−Ｘ　（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａ ｃｎｅｓ　））　％ボルデテラ・ベルタスシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔ ｕｓｓｉｓ　）　、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、 リゾレシチン、ビタミンＡ１サポニン、リポソーム、レバミゾール、　ＤＥＡＥ −デキストラン、ブロック共重合体または他の合成アジュバントの如き各種アジ ュバントまたは免疫調節剤と共に、あるいはそれなしで、水、食塩水または緩衝 ビヒクル中にてそれを投与することができる。かかるアジュバントは種々の源１ 例えばメルク（Ｍｅｒｃｋ　）アジュバント６５（メルク・アンド・カンパニー ・インコーホレイテッド（Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　、　Ｉｎｃ、 　）、ラーウエイ（可熊 Ｒａｈｗａｙ　）　、ニューシャーシー州）から商業的に入手でへ ある。

共に有効量で存在する限り、免疫原およびアジュバントの割合は広範囲に変化さ せることができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約０．５％ （ＡＪ’２０３　ベース）の量で存在させることができる。

投与量ベース当たりについては、免疫原の濃度は患者体１１Ｋｇ当たり約０．０ １５Ｉｇ〜約１．５■の範囲とすることができる。好ましい投与量範囲は約１． ５μｇ／々〜約０．０４３Ｆ／？患者体重である。ヒトにおける適当な投与容量 は約０．１〜ｌｄ、好ましくは約０．１１ｎ！である。

従って、筋肉内注射用投与量は、例えば、０．５％水酸化アルミニウムと混合し た免疫原を含有する０、　１　ｄよ　′りなる。

該ワクチンを妊婦または子供を持つ年令の婦人に投与して母親のＨＲ５Ｖ抗体を 刺激することができる。要すれば、該女性に再びワクチン接種することができる 。

幼児は２〜３月令にワクチン接種でき、要すれば、好ましくは６〜９月令に再度 ワクチン接種することかできる。ワクチン接種してない母親から生まれた赤ん坊 は２〜３月令にワクチン接種することができる。また。

該ワクチンは、より年令が上のまたは衰弱した患者の如き他の罹患集団において も有用であり得る。

また、該ワクチンは、他の病気用の他のワクチンと組合せて多価ワクチンとする こともできる。抗生物質の如き他の医薬品と組合わすこともできる。

チャート１．　９ＧＰＦの組立 （ａ）プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔ　Ｉで切断し、グアノシンをテイルして フラグメント１を得、これをゲル単離（ｂｌＨＲｓＶのｍＲＮＡからのｃ　ＤＮ Ａを、３′末端にっき１０１０−１５ｄＣ残基でティル　する。

（ｃ）フラグメント１およびＨＲ３Ｖ　ｍＲＮＡからのｃ　ＤＮＡを結び、適当 なプローブを用いるハイブリダイゼーションによってｐ　ＧＰＦ同定を行う。

ＧＰＦ チャート１（続き） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシンテイル Ｆ＝糖糖蛋白質 子ャー）　２　ｐＧＰＦ２の組立 （ａｌプラスミドｐＧＰＦをＰｓｔ　Ｉで切断し、フラグメン）２（１，９ｋｂ ）をゲル単離する。

フラグメント２ （ｂｌプラスミドｐＵｃ１２　（２，７ｋｂ　）をＰｓｔ　Ｉで切断してフラグ メント３を得、これをゲル単離する。

フラグメント３ （ｃ）フラグメント４および５を結んでｐＧＰＦ２　（４，６ｋｂ）を得、形質 転換してイー・コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　に入チャート２（続き） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｔ＝”アノシン／シトシンディル Ｆ＝糖蛋白質Ｆ チャート３　ｐＧＰＦ３およびｐＧＰＦ４の組立（ａｌプラスミドｐＧＰＦ２を Ｘｂａ　Ｉで切断し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理し、５ａｌＩで再切 断し、クレノー酵素で処理してフラグメント４を得る。

フラグメント４ （ｂｌラムダエキソヌクレアーゼを用いてフラグメント４を５ａｌＩ部位から下 流を消化し、残存する３′テイルをＧｐ　Ｆ　ｃ　Ｄ　ＮＡの以下の配列を有す る先導配列の５′部分に相補的な合成オリゴスクレオチドにハイブリダイズする 。

５′末端　ＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＡＡＴＣｒｃ）クレノー酵素を用いて合成オ リゴヌクレオチドから下流のｃＤＮＡ　３’の一本鎖部分を満たし、Ｔ４りが一 ゼを用いて末端を結んでｐＧＰＦ３　（４，６ｋｂ　）を得る。

チャート３（続き） （ｄ）プラスミドｐＧＰＦ　３をＨｉｎｄｌ［で切断し、Ｂａ１３１で処理して ｇｐＦ　ＣＤＮＡの３′末端におけるＧ−Ｃヌクレオチドテイルを消化する。ｇ ｐ　Ｆ　ｃ　ＤＮＡをＢａｍ　ＨＩで切断しく　１．７　ｋｂ　）、ゲルから単 離し、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｃ　Ｉ［消化のＰＵＣ１２に再び結んでｐＧＰＦ４　 （４，４ｋｂ　）を得る。

ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｔ＝グアノシン／シトシンテイル Ｆ＝糖糖蛋白質 子−？−）４　ｐｓＶｃＯＷ７（７）組立（ａｔプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒを ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断してフラグメント５（５，０ｋｂ）を得る。

フラグメント５ （ｂｌｌプラスミドル、ＧＨ２Ｒ２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断してフ ラグメント６（２，１ｋｂ）を得る。

フラグメント６ （ｃ）フラグメント５および６を結んでｐＳｖｃＯＷ？　（７、１ｋｂ　）を得 る。

ｐｓＶｃＯＷ７ Ａ＝ウシ成長ホルモンポリＡテイル Ｂ＝ゲノムウシ成長ホルモン チャート４（続き） ■＝イントロン ｄｈｆｒ　＝ジヒドロ葉酸還元酵素 ＳＶ４０　＝　ＳＶ４０プロモーターおよび複製開始点Ａｍｐ　Ｒ＝アンピシリ ン耐性 チャート５　９ＧＰＦ−ＰＡの組立 （ａ）　ｐｓＶｃＯＷ７をＥｃｏ　ＲＩおよびＰｖｕ　Ｉ［で切断してウシ成長 ホルモンのポリアゾニレ−ジョン配列を含有するフラグメン）７（６００ｂｐ） を得、これをゲル単離する。

フラグメント７ （ｂ）　ｐｓｖｃｏｗ７をＥｃｏ　ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断してフラグメン ト８（５，８ｋｂ）を得る。

フラグメント８ （ｃ）プラスミドｐＧＰＦ　４をＨｉｎｄｌｌ［で切断し、クレノー酵素で処理 し、ＢａｍＨＩ　で切断してメーセージ（ｍｅｓｓａｇｅ　）から下流に３’Ｂ ａｍＨＩ突出部分およびメツセージ（ｍｅｓｓａｇｅ　）から下流に平滑末端を 有するＧＰＦを含有するフラグメント９（ｘ、９ｋｂ）を得る。

チャート６　ｐＧＰＦ−ＩＥ−ＰＡの組立チャート５（続き］ フラグメント９ （ｄ）フラグメント５．６および７を結んでｐＧＰＦ−ＰＡを得、これをイー・ コ！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　中で維持する。

ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ｐＢＲ３２２＝　ｐＢＲ３２２についての複製開始点ＳＶ４０　＝５Ｖ４０につ いての複製開始点ｄｈｆｒ　＝ジヒドロ葉酸還元酵素 Ｆ＝糖蛋白質Ｆ ＣＭＶ　＝サイトメガロウィルスプロモーターａ＝ポリアデニレーションテイル Ｔ＝グアノシン／シトシンテイル 手セード７　ｎ　Ｔ　ｆ　ｕｒ　Ｑ出鋼台（ａ）プラスミドｐＧＰＦ−ＰＡをＢ ａｍＨＩで切断してフラグメントｘＯ（７，３ｋｂ）を得る。

フラグメント１０ （ｂ）ＣＭＶゲノムからのＰｓｔＩフラグメントのＳａｕ　３　Ａ　Ｉ消化から ＣＭＶ即時型プロモーターを得る。Ｓａｕ　３Ａは結びにつき１３ａｍＨＩ　に 適合する。

（Ｃ）フラグメント１０およびＣＭｖプロモーターを結んでｐＧＰＦ−ＩＥ−Ｐ Ａ　（８，Ｏｋｂ　）　を得る。

ｐＧＰＦ　−Ｉ　Ｅ　−ＰＡ ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ｐＢＲ３２２＝　ｐＢＲ３２２についての複製開始点５Ｖ４０＝　ＳＶ４０につ いての複製開始点ｄｈｆｒ　＝ジヒドロ葉酸還元酵素 Ｆ＝糖蛋白質Ｆ ＣＭＶ　＝サイトメガロウィルスプロモーターａ＝ポリアデニレーションテイル （ａ）プラスミドｐｄＢＰＶ　−ＭＭＴｎｅｏ　（３４２−１２）　（１４，６ ｋｂ）をＢａｍＨＩで切断し、ウシ・パピローウィルスゲノムを切除しく７．９ ｋｂ）、ゲル単離し、保存した。残存するフラグメントをゲル単離し、Ｔ４リガ ーゼを用いて再び結び、これをｐＭＭｐｒｏ、ｎｐｔ　Ｉ［（６，７ｋｂ　）と 名付けた。

ｐｄＢＰＶ　−Ｍλ（Ｔｎｅｏ　（３４２−１２）ｐＭＭｐｒｏ、ｎｐｔ　ＩＦ （ｂ）プラスミドｐＭＭｐｒｏ　、ｎｐｔ　ＩＩをＢｇｌＩＩで切断し、合成フ ラグメント１１を挿入し、該プラスミドを再び結んでｐＴＦＷ８　（６，７ｋｂ 　）を得た。

チャート７（続き） 合成フラグメント１１ ＧＣＧＣＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧ Ｂ＝ウシ・パピローマウィルス配列 ＳＶ４０　＝シミアンウィルス４０配列初期領域、スモールを抗原スプライシン グシグナルおよび３′転写プロセツシングシグナル ｎｅｏ　＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子（ＮＰＴＩ［） λｉＭＴ”マウス・メタロチオネイン遺伝子プロモーターｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３ ２２複製開始点 β−Ｌａｃ　＝β−ラクタマーゼ遺伝子チャート８　ｐＴＦＷ９の組立 （ａ）プラスミドｐＴＦＷ８　（チャート１）をＸｈｏ　Ｉで切断し、Ｔ４リガ ーゼを用いてｐＫＧ　１８００　ｓｉｂ　３からのｔ１ターミネータ−を含有す るフラグメント１２を挿入してプラスミドｐＴＦＷ９　（７，９ｋｂ　＞を得る 。

フラグメント１２ ＳＶ４０　＝シミアンウィルス４０’配列初期領域、スモールを抗原スプライシ ングシグナルおよび３′転写プロセツシングシグナル ｎｅｏ　＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子（ＮＰＴＩＩ） ＭＭＴ　＝マウス・メタロチオネイン遺伝子プロモーターｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３ ２２複製開始点 β−Ｌａｃ　＝β−ラクタマーゼ遺伝子チャート８（続き） Ｔ＝λｔ１ターミネータ− チャート９　ｐＴＦＷ／ＧＰＦ （ａ３ｐＧＰＦ４　（チャート３）をＮｓｉ　Ｉで切断し、翻訳ターミネータ− をｇｐＦのＣＤＮＡに結んでｐＧＰＦ５　（４，６ｋｂ）を得る。

ＧＰＦ　５ ｆｂｌプラスミドｐＧＰＦ　５をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌＩ　で切断し、 ｇｐＦをコード付けするｃ　ＤＮＡよりなるフラグメント１３（１，９ｋｂ）を 単離する。クレノー酵素でフラグメント１３の末端を平滑とし、合成りｇｌＩＩ りンカーを該クローンの末端に結び、ｃ　ＤＮＡをＢｇｌｍで処理してフラグメ ント１３を得る。

フラグメント１３ （Ｃ）プラスミドｐＴＦＷ９をＢｇｌ　Ｉ［で切断し、フラグメント１３を挿入 し、再び結んでｐＴＦＷ／ＧＰＦ　（９，８ｋｂ）を得る。

チャート９（続き） ＳＶ４０＝シミアンウィルス４０配列初期領域、スモールを抗原スプライシング シグナルおよび３′転写プロセツシングシグナル ｎｅｏ　＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子（ＮＰＴｎ　） ＲｌＭＴ　＝マウス・メタロチオネイン遺伝子プロモーターｏｒｉ＝ｐＢＲ３２ ２複製開始点 β−Ｌａｃ　＝β−ラクタマーゼ遺伝子Ｆ＝糖蛋白質Ｆ ｔ＝翻訳ターミネータ− ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 チャート１０　ｐＴＦＷ／ＧＰＦ／ＢＰＶの組立（ａｌプラスミドｐＴＦＷ／Ｇ ＰＦ　（チャート９）をＢａｍＨＩで切断し、（チャート７エ程ａからの）無傷 ＢＰＶゲノムを挿入し、ｐＴＦＷ／ＧＰＦに結んでｐＴＦＷ／ＧＰＦ／ＢＰＶ’ 　（１７，９ｋｂ　）を得る。

ｐＴＦＷ／ＧＰＦ／ＢＰＶ　＊ （ｂｌ　ｐＴＦＷＦＧＰＦ　／ＢＰＶ　”　ヲＸｈｏ　テ切断Ｌ、大キナフラク メントヲ再び結／ｕ　テｐＴＦＷ／ＧＰＦ　／ＢＰＶ　（９，３ｋｂ　）を得る 。

ｐＴＦＷ／ＧＰＷ／ＢＰＶ ５Ｖ４０＝シミアンウィルス４０配列初期領域、スモールを抗原スプライシング シグナルおよび３′転写プロセツシングシグナル チャート１０（続き） ｎｅｏ　＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子（ＮＰＴＩＩ　） ＭＭＴ　＝マウス・メタロチオネイン遺伝子プロモーターｏｒｉ　＝　ｐＢＲ３ ２２複製開始点 β−Ｌａｃ　＝β−ラクタマーゼ遺伝子Ｆ＝ｇｐＦ蛋白質 ｔ＝翻訳ターミネータ− Ｔ＝λｔ！ターミネータ− チャート１１　ｐＡｃＧＰＦの組立 （ａ）プラスミドｐＧＰＦ５　（チャート９）をＢｉｎｄ■で切断し、クレノー 酵素で末端を平滑とする。合成りａｍＨＩリンカ−を結び、該プラスミドをＢａ ｍＨＩで消化してｇｐＦ　ｃＤＮＡを有するフラグメント１４（１，９ｋｂ）を 得る。フラグメント１４をゲル単離する。

フラグメント１４ （ｂ）　ｐＡｃ　３７３　（７，１ｋｂ　）をＢａｍＨＩで処理してｐＡｃ３７ ３　（７，１ｋｂ　）を直線化する。

（ｃｌ該直線状ｐＡｃ３７３およびフラグメント１４をアニチャート１１（続き ） Ｎ　＝　ＴＰＡ　ｃＤＮＡの未翻訳３′部分ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 Ｐｏ１ｙ＝多角体蛋白質遺伝子 Ｆ＝糖蛋白質Ｆ ｔ＝翻訳ターミネータ− チャー ＧＣＴ　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＴＣＣＡＣＡ　ＡＡＣＡＡＧ　ＧｃＴ　ＧＴＡＡｌａ 　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌ、ｙｓ　Ａｌａ　ＭａｌＴＴＡ 　ＡＣＣＡ（、ＣＡＡＡ　Ｃ；ＴＧ　ＴＴＡ　ＧＡＣＣＴＣＡＡＡＬｅｕ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ｌ、）ｒｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａ５ｐＬｅｕ　Ｌ：Ｙ３ＡＴＴ　Ｇ ＴＧ　ＡＡＣＡＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡ工１ｅ　Ｖａｌ　Ａｓ ｎ　ＬｙｓＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　 ＡＡＣＡＡＣＡＧＡ　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＧＡＧＧｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ 　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌ、ｅｕ　ＧｌｕＧＧＴ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ 　ＣＣτＧτＡ　ＡＧＣＡＣＴ　ＴＡＣＧｌｙ　Ｍａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒ ｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＴＴＡ　ＡＴＣＡＡＴ　ＣＡＴＡＴＧ　Ｃ ＣＴ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＡＡ’ｒＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｐ ｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＣ７ｒＴ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　Ｃ ＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＴＡＣＶａｌ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＧＴＣＴＴＡ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　 ＣＡＡ　ＴＴＡ　ＣＣＡＶａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｎ　Ｌｅｕ　ＰｒｃＴＧＧ　ＡＡＡ　ＣＴＡ　ＣＡＣＡＣＡ　ＴＣＣＣＣＴ　 ＣＴＡ　ＴＧＩＴｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ　Ｃ／５ＡＴＣＴＧＴ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＧＡＣＡＧＡ　 ＧＧＡｌｌｅ　Ｃｙｃ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇ ｌ）丁ＣＴ　ＴＴＣＴＴＣＣＣＡ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＴＧ’］ Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ− ）１２（続き） 【 〜 へ こ ｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ、　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａ ｓｎ　２７７ＣＴＣＴ　ＡＴＣＡＴＧ　ＴＣＣＡＴＡ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＧ 　ＧＡＡ　８９８ｒ　Ｓｅｒ　工１ｅ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　２９５Ａ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＡＴＡ　Ｇ ＡＴ　ＡＣＡ　ＣＣＣＴＧＴ　９５２ｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉ ｌｅ　Ａ３ｐＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　３１３Ｔ　ＡＣＡ　ＡＣＣＡＡＣＡＣＡ 　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＴＣＣＡＡＣ１００６３Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　３３１チ六！−１・ ＣＡＣＡＣＡ　ＡＴＣＡＡＣＡＧＴ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＣＣＡ入ｓｐ　 Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌ、ｅｕ　Ｐｒｏ　５ｅｒ ＡＴＡτＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＴｌ ｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＴＦ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　工１ ｅＡＧＣＴＣＣＧＴＴ　ＡＴＣＡＣＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＧＧＡ　ＧＣＣＡＴＴ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍａｌ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌ、ｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ 　ｌ１ｅＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＧＴ　Ｇ ＧＡ　ＡＴＣＣｙｓτｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ Ｇｌｙ　工１ｅＧＡＴ　ＴＡＴ　ＧＴＡ−ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＣＯＧ　Ａ ＴＧ　ＧＡＣＡＣＴＡｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　Ｍｅｔ　Ａ３り　ＴｈｒτＡＴ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　 ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＡσＣＴＣＴｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＡＡＴ　ＴＴＣＴＡＴ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＴ Ａ　ＧＴＡ　ＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡｓｎ　Ｐｈｅτｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅ ｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　５ｅｒＣＡＡ　ＧＴＣＡＡＣＧＡＧ　ＡＡＧ　Ａ ＴＴ　ＡＡＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＡＧｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 工１ｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＴＴ入　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　Ｇ ＴＡ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＴＣＣＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ａｓ ｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　５ｅｒＡＴＡ　ＡＴＴ　ＡＴＡ 　Ｇ’ｒＧ　ＡＴＴ　ＡＴＡ　ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡｌｌｅ　Ｉｌｅ 　工１ｅ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ１２（、 ト°シき　） Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　３８５Ａ ＴＣＡＣＴ　ＴＣＡ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ａ（χ　１２２２Ｍｅ ｔ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　１１０３石Ｇ 　ＴＣＡ　ＴＧＣＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＡ　ＡＣＴ　ＡＡＡ　１２７６Ｖａｌ　Ｓ ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　！！２１ＡＴＡ　Ａ ＡＧ　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＡＣＧＧＧ　ＴＧＣ１３３０１１ｅ　Ｌｙｓ 　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　１１３９ＧＴＧ　ＴＣＴ 　ＧＴＡ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＣＡ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　１３８１１Ｖａｌ　Ｓｅｒ 　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅ′ｕ　Ｔｙｒ　１１５７ＴＡＴ　ＧＴ Ａ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＡＴＡ　ＡＴＡ　１’１３８Ｔ）ｒｒ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　！１７５ＣＡＴ　 ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＡＴＡ　ＴＣＴ　１１！９２Ａｓｐ 　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａ３ｐＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　！＋９３ＧＣＡ　 ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＣＯＴ　ＡＡＡ　ＴＣＣＧＡＴ　ＧＡＡ　１５１１６Ａｌａ　 Ｐｈｅ　工１ｅ　Ａｒｇ　Ｌ）ｒｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　５１１ＡＣＣＡ ＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＣＡＴＣｙ　ＡＴＡ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　１６００ＴｈｒＴｈ ｒＡ３ｎ　工１ｅ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　’ｒｈｒ　’ｒｈｒ　５２９ＴＣＡ　ＴＴ Ａ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＣＴＣ１６５！ＪＳｅｒ　Ｌｅ ｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　５４７チャート１２（ 、矛 ＧＧＴ　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＴｒ　ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＴ ＡＡ　ＡＴＡ　ＡＡ。

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Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．Ｆ蛋白質； ｂ．Ｇ蛋白質； ｃ．２２Ｋ蛋白質； ｄ．９．５Ｋ蛋白質； ｅ．主要キヤプシツド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択されるヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコード付け するＤＮＡ配列よりなることを特徴とするプラスミド。
2. ２．該プラスミドが適当な宿主によってヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造 蛋白質についてコード付けするＤＮＡ配列の発現を容易とする前記第１項のプラ スミド。
3. ３．ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造遺伝子の発現がサイトメガロウイル スプロモーターの制御下にある前記第２項のプラスミド。
4. ４．適当な真核宿主におけるプラスミドの複製がウシ・パピローマウイルスＤＮ Ａ配列の制御下にある前記第２項のプラスミド。
5. ５．ａ．Ｆ蛋白質； ｂ．Ｇ蛋白質； ｃ．２２Ｋ蛋白質； ｄ．９．５Ｋ蛋白質； ｅ．主要キヤプシッド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択されるヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコード付け するＤＮＡ配列を発現することができるバクロウイルス科の組換体ウイルス。
6. ６．該ウイルスがアウトグラフア・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａ ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスである前記第５項のウイルス。
7. ７．該適当な宿主が ａ．細菌； ｂ．酵母；および ｃ．真核細胞培養物 よりなる群から選択される前記第２項のプラスミド。
8. ８．ａ．Ｆ蛋白質； ｂ．Ｇ蛋白質； ｃ．２２Ｋ蛋白質； ｄ．９．５Ｋ蛋白質； ｅ．主要キヤプシツド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択されるヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコード付け するＤＮＡ配列よりなるプラスミドを含有する適当な宿主。
9. ９．該プラスミドがヒト呼吸器系シンシチウムウイルス構造蛋白質についてコー ド付けするＤＮＡ配列の発現を容易とする前記第８項の適当な宿主。
10. １０．該宿主が ａ．細菌； ｂ．酵母；および ｃ．真核細胞培養物 より成る群から選択される前記第８項の適当な宿主。
11. １１．該宿主が ａ．細菌； ｂ．酵母；および ｃ．真核細胞培養物 よりなる群から選択される前記第９項の適当な宿主。
12. １２．ａ．Ｆ蛋白質； ｂ．Ｇ蛋白質； ｃ．２２Ｋ蛋白質； ｄ．９．５Ｋ蛋白質； ｅ．主要キヤプシッド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択される実質的に純粋な蛋白質。
13. １３．ａ．Ｆ蛋白質； ｂ．Ｇ蛋白質； ｃ．２２Ｋ蛋白質； ｄ．９．５Ｋ蛋白質； ｅ．主要キヤプシツド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択される１またはそれ以上の実質的に純粋な蛋白質よりなることを特徴とす るヒト呼吸器系シンシチウムウイルスワクチン。
14. １４．ａ．Ｆ蛋白質； ｂ．Ｇ蛋白質； ｃ．２２Ｋ蛋白質； ｄ．９．５Ｋ蛋白質； ｅ．主要キヤプシッド蛋白質Ｎ；およびその免疫原性フラグメントよりなる群か ら選択される１またはそれ以上の実質的に純粋な蛋白質よりなるワクチンでのワ クチン接種によつてヒト呼吸器系シンシチウムウイルスからヒトを保護する方法 。