JP3447743B2 - ｇｐ３５０／２２０の非スプライシング変異体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ヘルペスウイルス属の一種であるエプスタイン−バー
ウイルス（EBV）はヒトにおいて感染性単核球症を引き
起こす。この病気は集団の90％以上に感染する。健康分
析者は米国におけるこの病気の費用が年100万ドルであ
ると見積もる。このウイルスは主にウイルスを放出する
個体から唾液の交換によって蔓延する。EBVに感染した
子供はほとんど無症状であるかまたはごく弱い症状を有
するが、感染した若者と成人は、発熱、咽頭炎およびア
デノパシーにより特徴付けられる典型的な感染性単核球
症を発病する。感染した人はその後の生涯ずっと抗EBV
抗体を維持するので、次の感染に対して免疫がある。現
在のところ商業的に利用可能なEBVワクチンはない。

その感染性に加えて、EBVはリンパ球を急速に分裂す
る細胞に形質転換させることが証明されており、従っ
て、バーキットリンパ腫や口腔毛髪状白斑をはじめとす
る幾つかの異なるリンパ腫に関係があるとされている。
世界的に見て、80,000の鼻咽頭癌症例が存在すると推定
され、中国民族に流行している。

EBVの弱毒化生ワクチンの開発は行われているがまだ
問題がある。EBVに関連する潜在的な腫瘍形成性質のた
め、研究者らは生ワクチン法を使うのを嫌がっていた。
本発明は、潜在的に腫瘍形成性の生存ウイルスの使用を
必要としないサブユニットワクチンのための方法および
組成物を考案することにより、生ワクチンの開発に関連
する問題を回避する。サブユニットワクチンは、免疫応
答を惹起しそして免疫を付与するであろうウイルスから
の１または複数の抗原性タンパク質を使用する。

より重要な２つの抗原性EBVタンパク質は、ウイルス
膜のエンベロープの部分を構成しており、細胞膜タンパ
ク質CD21と相互作用することによりウイルス粒子がヒト
標的細胞に結合しそしてその中に入るのを可能にする、
糖タンパク質gp350/300とgp220/200である。Nemerow,J.
Virology 61:1416（1987）を参照のこと。それらはサブ
ユニットワクチン候補として選ばれてから久しいが、本
来の源から精製された抗原的に活性なタンパク質を得る
ことの難しさと、組換え生産された源からの収率が低い
ことが、研究者やワクチン開発者の努力を妨害してい
た。文献中には様々な分子量範囲（一方のタンパク質に
は350または300キロダルトン（kD）、他方のタンパク質
には220または200kD）を使ってそれらのタンパク質が呼
称されている。本明細書中ではgp350または300タンパク
質をgp350タンパク質と呼び、gp220または200タンパク
質をgp220タンパク質と呼ぶ。集合的に、両タンパク質
を本明細書中ではgp350/220タンパク質と呼称する。

択一的にスプライスされる単一の遺伝子がgp350/220
タンパク質をコードし、gp350 mRNA転写物とgp220 mRNA
転写物の生成をもたらす。天然に存在するgp350/220遺
伝子スプライス部位変異体は１つも知られていない。該
遺伝子は２つの発現産物、即ちgp350タンパク質とgp220
タンパク質を産生する。gp350/220 DNA配列の転写解読
枠（ORF）は2721塩基対（bp）である。全読み枠は907ア
ミノ酸のgp350をコードする。Kieffに発行された米国特
許第4,707,358号（1987）を参照のこと。転写解読枠の
スプライス形は2130塩基を含み、710アミノ酸配列のgp2
20タンパク質に翻訳される。gp350タンパク質とgp220タ
ンパク質の理論分子量はそれぞれ95kDと70kDである。発
現されたgp350タンパク質とgp220タンパク質の測定分子
量は異なるけれどもそれぞれ約350キロダクトンと220キ
ロダルトン（kD）である。推定分子量と実分子量の差の
理由は両タンパク質の多大なグリコシル化である。どの
細胞でも、gp350タンパク質とgp220タンパク質は約6:1
〜1:1の範囲のモル比で生産される。例えば、EBVが持続
的に感染したB95−８細胞では、その比は異なるように
見えるが時々6:1の範囲に近づく。Miiler,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.69:383（1972）を参照のこと。

同様に、それらの糖タンパク質の組換え生産は、今ま
では一般に生産させる予定のgp350タンパク質とgp220タ
ンパク質の混合物をもたらした。従来、gp350/220タン
パク質はラット下垂体、チャイニーズハムスター卵巣、
VERO（アフリカミドリザル腎臓）細胞、並びに酵母細胞
中で発現されている。Whang,J.Virol.61:1796（1982）,
Motz,Gene 44:353（1986）およびEmini,Virology 166:3
87（1988）を参照のこと。マウス繊維芽細胞中でgp350/
220タンパク質を生産させるのにウシ乳頭腫ウイルスの
ウイルス発現系も使われている。Madej,Vaccine 10:777
（1992）を参照のこと。gp350/220タンパク質を発現さ
せるのにワクシニアウイルスの実験株とワクチン株も使
われている。EBVのgp350/220 DNAおよびタンパク質の変
異組換え形は当業界で既知である。詳しくは、膜貫通配
列を欠いている先端が切り取られたgp350/220遺伝子の
組換え構成物が作製された。そのような構成物はgp350
とgp220の２つの混合物をまだ生産するが、膜貫通領域
の欠如が該タンパク質の分泌を可能にする。Finerty,J.
Gen.Virology 73:449（1992）およびMadej,Vaccine 10:
777（1992）を参照のこと。また、様々なgp350/220配列
を含んで成る組換え生産された様々な制限断片および融
合タンパク質が作製されE.コリ中で発現されている。19
91年７月24日に公開されたEP特許公開0 173 254を参照
のこと。

従って、gp350/220に関するEBV研究は、今まで生来の
gp350/220配列の効率的な発現を得ることか、生来のタ
ンパク質または膜貫通領域欠失タンパク質の２つの択一
的スプライス形の混合物を生じる膜貫通領域を欠く変異
配列に集中し、あるいはβ−ガラクトシダーゼ融合タン
パク質としてのエピトープ断片配列の生産に集中してい
た。

gp350/220の部分精製調製物は既知である。Finerty,
J.Gen.Virology 73:449（1992）を参照のこと（組換え
生産され、部分精製されたもの）。生来のgp350/220タ
ンパク質については、ほとんどの場合、精製作業が該タ
ンパク質の抗原性を不活性化してしまい、そのためサブ
ユニットワクチンでの使用が認められなくなる。しか
し、生来の（即ち、非組換え）源からの抗原的に活性な
gp350タンパク質の高度精製調製物が科学文献中に報告
されている。David,J.Immunol.Methods 108:231（198
8）を参照のこと。EBV誘発リンパ腫に対してコットント
ップタマリン（cottontop tamarin）を予防接種するの
にgp350/220タンパク質を発現する組換えウイルスワク
チンが使われた。Morgan,J.Med.Virology 25:189（198
8）,Mackett,EMBO J.４:3229（1985）およびMackett,VA
CCINES '86,pp293（Lerner RA,Chanock RM,Brown F編,1
986,Cold Spring Harbor Laboratory）を参照のこと。
しかしながら、該遺伝子の択一的スプライス形態のうち
のいずれか１つだけの発現を可能にし、それによって純
粋なgp350またはgp220タンパク質の生産を可能にし且つ
保証するようにウイルスgp350/220DNA配列が操作された
ことはない。また、gp350またはgp220タンパク質の一方
または他方を発現する組換えまたは変異ウイルスも作製
されていない。

一般に、スプライス部位はプレmRNA分子からmRNAへの
プロセシングを促進する。ポリオーマウイルスでは、後
期mRNAの効率的蓄積のためにスプライス部位が必要とさ
れる。ポリオーマウイルス転写物中の３′および５′ス
プライス部位の変更はmRNA蓄積を減少させるかまたは完
全に妨げる。Treisman,Nature 292:595（1981）を参照
のこと。SV40ウイルスでは、切除可能な介在配列が核外
へのmRNAの輸送と核中でのmRNAの安定化を促進し、それ
らのイントロン／エキソン接合配列が小さな核RNP粒子
の結合を促進するため、事前にスプライスされたmRNAは
プロセシング経路と正しく連携することができないだろ
うと考えられる。エキソン／イントロンスプライス部位
のところの点変異は、エキソン／イントロン開裂を低下
させ、そしてプレmRNAプロセシング、核輸送および安定
性を破壊する可能性がある。Ryu,J.Virology 63:4386
（1989）およびGross,Nature 286:634（1980）を参照の
こと。

従って、本発明までは、EBVのgp350/220配列によりコ
ードされるタンパク質の機能的発現と抗原活性に対する
スプライス部位変更の影響は最善の状態では未知であ
り、且つ予測できなかった。

追加の背景文献としては次のものが挙げられる。EBV
の生物学と病気はStraus,Annal of Int.Med.118:45（19
93）中に大体概説されている。EBVのBLLFI転写解読枠の
記載はBaer,Nature 310:207（1984）中に見つかる。エ
プスタイン−バーウイルスのgp350/220DNAおよびアミノ
酸配列の記載はBeisel,J.Virology 54:665（1985）とBi
ggin,EMBO J.３:1083（1984）による文献中並びにKieff
他に発行された米国特許第4,707,358号（1987）中に見
つかる。エプスタイン−バーウイルスＡ型とＢ型中のgp
350/220をコードするDNA配列の比較はLees,Virology 19
5:578（1993）中に開示されている。EBVのgp350/220糖
タンパク質に対して中和活性を示すモノクローナル抗体
はThorley−Lawson,Proc.Natl.Acad.Sci.77:5307（198
0）中に開示されている。最後に、供与体および受容体
スプライス部位についてのスプライス部位共通配列はMo
unt,Nucl.Acids Res.10:459（1982）中に開示されてい
る。

一観点によれば、本発明はEBVのgp350/220DNA配列の
非スプライシング変異体を提供する。本発明のDNA配列
は、均一gp350タンパク質の発現をコードする単離され
たDNA配列を含むことができる。gp350タンパク質をコー
ドするDNA配列は、供与体および受容体スプライス部位
のところの生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチ
ドにより置換されている図１の配列と同じまたは実質的
に同じヌクレオチド配列を含んで成るもの、およびその
断片として特徴づけられる。このDNA配列はコード配列
に隣接する５′および３′非コード配列を含むことがで
き、更にアミノ末端シグナル配列を含むことができる。
図１は非コード配列を表し、推定上のシグナル配列の終
わりを星印（＊）で示す。しかしながら、本発明のDNA
配列は、それらの隣接配列またはシグナル配列のうちの
幾らかまたは全部を除外することもあると解釈される。
本発明の非スプライシング変異体DNA配列は、図１のDNA
配列のgp350/220をコードする遺伝子の供与体および受
容体スプライス部位に変異を導入することにより製造さ
れる。これはgp220タンパク質の生産を排除し、その結
果gp350タンパク質だけが生産される。

従って、別の観点では、本発明は、均一gp350タンパ
ク質、および適当な原核または真核宿主細胞中で適当な
発現調節配列の支配下でのEBVのgp350/220DNA配列の非
スプライシング変異体の発現により該タンパク質を生産
する方法を含んで成る。本明細書中でgp350タンパク質
について用語を使う時、均一とは、gp220タンパク質を
全く含まないかまたは実質的に含まないことを意味す
る。哺乳類または昆虫細胞において組換え生産された均
一gp350タンパク質は確かに今まで文献中に報告された
ことがないと本発明者らは認める。

更に別の観点によれば、分泌生成物をもたらす欠失を
更に有する均一gp350タンパク質が提供される。そのよ
うな欠失は、gp350の膜貫通領域の除去か、膜貫通領域
と残りのＣ末端の除去のいずれかを含んで成る。そのよ
うな更に変更されたDNA配列およびそれによりコードさ
れるタンパク質は、本発明のまた別の観点である。

ベクターDNAと均一gp350タンパク質をコードするDNA
配列とを含んで成る組換えDNA分子も提供される。該DNA
分子は、選ばれた宿主細胞中での均一gp350の複製と発
現を指令することができる適当な調節配列と作用可能に
連結したgp350配列を提供する。組換え均一gp350タンパ
ク質を発現させる際に使われるそのようなDNA分子によ
り形質転換された宿主細胞も、本発明により提供され
る。

本発明のDNA分子および形質転換された宿主細胞は、
本発明の別の観点である組換え均一gp350タンパク質ま
たはその断片の新規生産方法において使われる。この方
法では、均一gp350タンパク質の発現を調節することが
できる適当な調節配列または発現調節配列と作用可能に
連結した均一gp350タンパク質またはその断片をコード
するDNA配列によって形質転換された細胞系を、組換えD
NAの発現を可能にする適当な条件下で培養する。次いで
発現されたタンパク質を適当な常用手段により宿主細胞
からまたは培地から収得する。この方法は宿主細胞とし
て多数の既知の細胞を使うことができるが、現在のとこ
ろ好ましいのは哺乳類細胞と昆虫細胞である。

本発明のDNA配列およびタンパク質は、EBV抗原決定基
を有する治療化合物および免疫原性化合物の製造に有用
である。そのような化合物はEBV関連疾患、例えば単核
球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌の予防処置の
ためのサブユニットワクチンに利用される。従って、別
の観点によれば、本発明は、感染性単核球症、バーキッ
トリンパ腫および鼻咽頭癌のようなヒトのEBV関連状態
や疾患を予防または治療するための治療および／または
免疫原性医薬組成物を含んで成る。そのような治療およ
び／または免疫原性医薬組成物は、医薬上許容される担
体、例えば当業界で知られるような水酸化アルミニウ
ム、塩溶液およびリン酸塩緩衝化塩溶液と共に、免疫原
的誘発有効量の本発明の１または複数の均一gp350タン
パク質を含んで成る。「免疫原的誘発」量とは、哺乳類
においてEBVに対する抗体の産生を刺激するのに十分な
量を意味する。あるいは、活性成分はリポソーム含有凝
集物の形で投与してもよい。予防用途には、そのような
医薬組成物はヒトの患者への投与のためのサブユニット
ワクチンとして処方することができる。患者の抗体形成
を刺激するのに十分な用量で患者に予防接種し；そして
６か月〜１年後に再接種することができる。

従って、本発明の更なる観点は、適当な医薬担体中の
免疫原的誘発治療有効量の均一gp350タンパク質を患者
に（特にヒト患者に）投与することにより、EBV関連疾
患および状態を治療する方法である。本発明の更に別の
観点は、適当な医薬賦形剤中の免疫原的誘発有効量の均
一gp350タンパク質を患者に投与することにより、EBVに
対する免疫応答を刺激する方法である。

図１はgp350/220のDNAおよびアミノ酸配列を表す〔Be
isel,J.Virology 54:665（1985）より〕。供与体および
受容体スプライス部位が指示される。膜貫通領域は横の
矢印で輪郭が描かれ、そして星印（＊）は推定上のシグ
ナル配列の終わりを表す。ヌクレオチドの番号は左側に
示され；アミノ酸の番号は右側に示される。

図２は、gp350の欠失および部位特異的変異体の作製
を表す。pMDTMおよびpMSTOPと表示されたプラスミド地
図は本発明の非スプライシングgp350/220変異体を例示
する。セクション（Ａ）には、およそ一定のスケールで
下のコードクローンBLLF1と共にgp350タンパク質の直鎖
状モデルが示される。タンパク質上にはＮ末端シグナル
配列（SS）と膜貫通領域（TM）が示され、遺伝子地図上
には重要な制限部位が示されている。gp350遺伝子はHin
d III/Bfa I BLSH1断片とBan I/Hind III BLSH2断片の
２部分においてクローニングした。SCYTは指摘されたBL
LF1の領域からポリメラーゼ連鎖反応を使って作製し
た。セクション（Ｂ）には、pDTM,pSTOP,pMDTMおよびpM
STOPのクローニングスキームが描写されている（プラス
ミドは一定のスケールではない）。クローニングの詳細
は実施例１と２に記載される。プラスミド地図には、関
連する制限部位、使用したクローニングベクター、およ
びgp350遺伝子断片が標示されている。pMDTMとpMSTOP中
のスプライス部位の変異は星印により示される。

図３は、SDS−PAGEにより分析した時のpMDTMクローン
からの均一gp350タンパク質の免疫沈澱の結果を表す。g
p350/220タンパク質の端が切り取られた形を分泌する陽
性対照（GH3Δ19）細胞、陰性対照（pEE14）細胞および
幾つかのpMDTMクローンを、5.5時間³⁵S−メチオニンで
代謝的に標識し；得られた組織培養上清から均一gp350
タンパク質を免疫沈澱させた。各細胞型について、標識
された組織培養上清（Ｓ）とgp350/220沈澱物（Ip）の
試料を５％ SDS−PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）上で電気泳動した。分子量マーカーの位置が左側に
示されている。

図４は、実施例3.4に記載されるような、CHO細胞中で
発現されたpMDTMクローンからのタンパク質のノーザン
ブロット分析の結果を表す。

gp350タンパク質の非スプライシング変異体をコード
するクローン化されたEBVのDNA配列を含んで成る組成物
および方法が開示される。既に指摘した通り、そのよう
な非スプライシング変異体は本明細書中では均一gp350
タンパク質と呼称される。通常、gp350/220遺伝子が哺
乳類細胞中で発現されると、該遺伝子のRNAスプライシ
ングのためにgp350とgp220という２つの遺伝子産物が生
じる。本発明は１つの遺伝子産物gp350だけが生産され
るようにする。本発明はgp350遺伝子中のRNAスプライス
部位シグナルの一部または全部を除去し、そして適当な
宿主細胞中で該遺伝子を発現させることを含む。哺乳類
細胞中でgp350/220遺伝子が発現される時に該タンパク
質の220kD形態の生産を防止するためにgp350/220遺伝子
中に変異が導入された。結果として、gp350のみをコー
ドするmRNA転写物が生産される。gp350/220遺伝子の非
スプライシング変異体を使うことによるgp220発現の除
去は、gp220に比較して増加したgp350の生産を引き起こ
すだろう。gp350はgp220上に見られる潜在的な抗原部位
を全て含むので、gp220の生産は効果的な抗EBVワクチン
の製造にとって不可欠なものではない。

従って、本発明の一観点は、アミノ酸501をコードす
る供与体スプライス部位コドンとアミノ酸698をコード
する受容体スプライス部位コドンが、生来でないヌクレ
オチドによる生来のヌクレオチドの置換によって変更さ
れていること以外、gp350と実質的に同じポリペプチド
配列をコードするDNA配列を提供する。好ましくは、ア
ミノ酸配列が同じままであるように、生来のヌクレオチ
ドが生来でないヌクレオチドにより置換される。詳しく
は、一例として、供与体スプライス部位のところの生来
のヌクレオチドAAGT（ヌクレオチド1500〜1504）と、GG
受容体スプライス部位に隣接する生来のヌクレオチドＡ
＆Ｔ（ヌクレオチド2091〜2094）が、それぞれGTCAとＴ
＆Ａにより置換された。従って、供与部位におけるこの
置換の結果として、アミノ酸500位のグルタミンと501位
のセリンは同じままであった。同様に、受容部位におけ
るこの置換の結果として、アミノ酸697位のスレオニン
と698位のグリシンは同じままであった。

同様にして、下記に更に詳述するように、当業者はそ
れらの明確に例示したもの以外の置換も容易に実施する
ことができよう。

従って、本発明は一観点によれば、均一gp350タンパ
ク質に関する。均一gp350タンパク質は、アミノ酸１か
ら907まで、アミノ酸１から862まで、またはアミノ酸１
から907までで且つアミノ酸863から881までを欠く図１
に示されるのと実質的に同じアミノ酸配列を有し、各々
Ｎ末端の18アミノ酸のシグナル配列を持つかまたは持た
ないことにより更に特徴づけられる。加えて、均一gp35
0タンパク質の類似体が提供される。それらとしては、
抗原活性を保持しており、且つ均一gp350タンパク質の
対応領域と好ましくは少なくとも80％、より好ましくは
90％、最も好ましくは95％の相同性を有する、アミノ酸
配列中に変更がある変異体が挙げられる。例としては、
図１のアミノ酸配列からの少数のアミノ酸変更、特に保
存的アミノ酸置換、を有するタンパク質およびポリペプ
チドが挙げられる。保存的置換は、それらの側鎖が類似
している（同族の）アミノ酸ファミリー内で起こるもの
である。遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に４つの
ファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン
酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニ
ン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電で極
性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイ
ン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニ
ン、トリプトファンおよびチロシンは時々芳香族アミノ
酸として一緒に分類される。例えば、ロイシンの孤立置
換または構造的に同族のアミノ酸によるアミノ酸の保存
的置換が抗原活性または機能性に対して重大な影響がな
いだろうと予想することは筋が通っている。

本発明はgp350の簡単な精製という利点を提供する。g
p350とgp220は同様な生化学的性質を有するため、gp220
はしばしばgp350の調製物中に一緒に精製される。gp350
/220遺伝子の非スプライシング変異体のみを発現する細
胞はタンパク質精製を平易にする。これはgp350の生産
費用を減少させるであろう。本発明はまた、gp350精製
のための出発材料の生化学的特徴づけを一層容易にす
る。１つの種だけが存在するため、第二の種の存在理由
を説明することなく、タンパク質含量分析とアミノ酸配
列分析を行うことができる。

本発明はその上、増加されたgp350生産という利点を
提供する。gp350遺伝子のスプライシングの防止は、細
胞をgp350とgp220の二元生産からgp350の単独生産に移
し変えるだろう。ある細胞では、gp220の濃度はgp350濃
度の30％〜100％であると推定されている。遺伝子スプ
ライシングが除去されると、gp220生産の欠如によってg
p350生産が増加されるだろう。

gp350/220遺伝子のDNA配列はBeisel,J.Virology 54:6
65（1985）およびBiggin,EMBO J.３:1083（1984）によ
り記載されており、それは図１に描写される。該遺伝子
は907アミノ酸をコードしそして約95kDの一次翻訳産物
を指定する2721塩基の転写解読枠（ORF）である。推定
値と実測値の間の差は、該タンパク質の多大なグリコシ
ル化を表している。591塩基（197アミノ酸をコードす
る）がスプライシングにより除去されるとgp220を生じ
る。gp350/220遺伝子産物の見かけ分子量は、使用する
測定方法の種類、異なる細胞系中のグリコシル化部位の
利用状態、翻訳後プロセシングの差または選択的な遺伝
子変異によって異なり得る。gp350/220遺伝子スプライ
ス部位変異体の生産物についての測定値は異なるが、
「均一gp350タンパク質」という語は、場合により追加
の欠失または変異、例えば本明細書中で開示されるＣ末
端欠失および／または膜貫通領域変更を有することがあ
る、非スプライシング変異体の遺伝子産物を包含する。
「gp220タンパク質」という語は、約220kDの分子量を有
する択一的にスプライスされたgp350/220遺伝子産物を
指す。gp350/220遺伝子中のスプライス部位は、他の遺
伝子（主に真核生物からのもの）を基にした共通の供与
体および受容体スプライス配列とgp350/220遺伝子との
比較により同定された。他の遺伝子中のスプライス部位
を調べることからMount,Nucleic Acids Res.10:459（19
82）により発見された共通配列は、下記のものである： 右肩に星印を付けた塩基は全スプライス部位の100％に
現れる塩基を表す（高度に保存された塩基）。２塩基ま
たは１塩基を有する位置は保存された位置を表す（強調
してない位置）。スラッシュ（／）は実際のスプライシ
ング部位を示す。

gp350/220遺伝子中では、gp350/220遺伝子のDNA配列
決定〔Biggin,EMBO J.３:1083（1984）〕により示され
たように、供与体スプライス部位はヌクレオチド1501の
後ろにあり、そして受容体スプライス部位はヌクレオチ
ド2092の後にある。（ここと図１中で使用した番号付け
法はBigginの番号付け法に従う）。スプライス部位はEB
VのＢ型株の対応する遺伝子領域中に存在する（供与体
スプライス部位はA₁₅₀₁の後、そして受容体スプライス
部位はG₂₀₂₉の後）。本発明は、gp350/220遺伝子から単
一種のmRNAを生産させるのにＡもしくはＢ株または別の
EBV株のスプライス部位のいずれかを使って製造した組
成物を包含する。B95−８株からのウイルスＡ型のDNA配
列を実施例で使ったが、Ｂ型株のDNA配列も同様に使う
ことができただろう。何故なら、Ａ型株とＢ型株の遺伝
子翻訳産物は98％同じであるからである。Ｂ株はアミノ
酸507〜520と570〜576を欠いている。Ａ型株はgp350抗
原部位を全て含むため、Ａ型株を使った。あるいは、本
明細書の教示に従って株特異的配列を有するEBV gp350/
220を使って、特定株に特異的な免疫原性を有し、従っ
て株特異的EBV関連疾患の予防または治療用の免疫原性
および／または治療組成物において有用である、EBV株
特異的均一gp350タンパク質を生産させることができ
る。表１は、供与体および受容体スプライス部位の野生
型ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。

gp350/220遺伝子のRNAスプライシングを防止するため
に、gp350/220遺伝子中に核酸配列を導入してRNAスプラ
イス部位の関連塩基対を置換した。スプライス部位を非
機能的にするためには、好ましくは供与部位または受容
部位を構成する２つの高度に保存された塩基群の中から
少なくとも１個の塩基を非保存的塩基で置換すべきであ
り、より好ましくは少なくとも２個の高度に保存された
塩基を非保存的塩基に変異させるべきである。別の保存
的塩基であるスプライス部位から離れた２個以上の塩基
を非保存的スプライス部位塩基により置換して、スプラ
イス部位の認識を更に弱くすることもできる。供与部位
と受容部位の両方を変更してスプライシング機構を傷つ
けることができる。好ましくは、供与体と受容体が両方
とも、４箇所の高度に保存されたスプライス部位塩基位
置のうちの１箇所に各々少なくとも１個の変更を含み、
より好ましくは４箇所の高度に保存されたスプライス部
位塩基位置のうちの２箇所に少なくとも２個の変化を含
む。一方のスプライス部位が野生型アミノ酸配列を維持
するために変異できないならば、他方のスプライス部位
に少なくとも２つの変異を導入することが好ましい。

gp350/220スプライス部位のところの変異が、その後
発現されるgp350タンパク質のアミノ酸配列中に変化を
導入してもよい。好ましくは、そのような変化は保存的
アミノ酸置換であるべきである。アミノ酸配列中の保存
的置換は、アミノ酸配列中の非保存的変化とは反対に、
抗原部位の保存を助けるだろう。保存的アミノ酸変化
は、塩基変化（または複数塩基変化）が不変の供与体／
受容体塩基中に適当な変化を引き起こす限りにおいて行
うことができる。例えば、供与体スプライス部位では、
GGU以外のどのGly特異的コドンを使ってもSer₅₀₁をGly
に置換することができる（GGUの使用はＧヌクレオチド
を保存し、スプライスシグナル中に所望のGT置換を引き
起こさないだろう）。同様に、受容体スプライス部位で
は、Gly₆₉₈からAlaへの変化は保存的置換であろうが、
全てのAlaコドンは高度に保存されるＧヌクレオチドで
始まるので、これは所望の置換を引き起こさないだろ
う。プロリンも保存的アミノ酸変化であるかもしれない
が、プロリンはタンパク質の三次構造の変更を引き起こ
し、それによって１または複数のgp350抗原部位を隠蔽
してしまうので、プロリンは野生型アミノ酸を置換する
のに使われないだろう。表１は、野生型配列中の許容さ
れる保存的アミノ酸置換を示す。表１の一番下は、保存
的アミノ酸置換を伴う変異の例である。

本発明の一観点はgp350/220の非スプライシング変異
体を含んで成るけれども、gp350/220コード配列の追加
の変更も望ましいかもしれない。可溶性均一gp350タン
パク質（「可溶性タンパク質」は溶液中で遊離形態であ
るか、または膜会合形態であるが膜統合形態でない）を
生産するために、例えば、統合型膜タンパク質としての
全長gp350の発現によって生じる細胞毒性問題を回避す
るために、gp350をコードするDNA配列の全部または部分
の削除によりgp350の膜貫通領域（経膜領域としても知
られる）が変更される。gp350/220の膜貫通領域はアミ
ノ酸861（メチオニン）から881（アラニン）までを含ん
で成る。Beisel,J.Virology 54:665（1985）を参照のこ
と。好ましくは、膜貫通領域の少なくとも８アミノ酸が
削除され、より好ましくは少なくとも12アミノ酸が削除
され、最も好ましくは18〜21アミノ酸が削除される。従
って、別の観点では、本発明は、可溶性均一gp350タン
パク質の発現をもたらすgp350/220 DNAおよび／またはg
p350均一タンパク質の膜貫通領域中に少なくとも一つの
削除を更に含んで成るgp350/220 DNAおよび／またはgp3
50均一タンパク質の非スプライシング変異体を提供す
る。

非スプライシングgp350/220変異体の膜貫通領域の全
部または一部分を削除することに加えて、本発明に従っ
て、本明細書に記載の通り、膜貫通領域の後ろのアミノ
酸881〜907を含んで成るＣ末端配列を完全にまたは部分
的に削除することもできる。よって、別の観点では、本
発明は、gp350/220の膜貫通領域をコードするDNAおよび
／または該膜貫通領域を含んで成るアミノ酸配列の全部
もしくは一部分の削除により更に変更されており、その
上gp350/220の残りのＣ末端DNAおよび／またはアミノ酸
配列の削除により更に変更されている、gp350/220 DNA
および／または均一タンパク質の非スプライシング変異
体に関する。

従って、別の観点では、本発明は、本発明の均一gp35
0タンパク質をコードする非スプライシング変異体DNA配
列に関する。そのようなDNA配列は、アミノ酸１〜907を
コードする図１のDNA配列を含んで成り、そして供与体
および受容体スプライス部位を除去するように本明細書
中に教示したヌクレオチド置換を更に含んで成る。その
ようなDNA配列は、所望により、アミノ酸861〜907を含
んで成る膜貫通領域とＣ末端の全部または一部分をコー
ドするヌクレオチドが削除されている端が切り取られた
DNA配列、およびアミノ酸861〜881を含んで成る膜貫通
領域の全部または一部分をコードするヌクレオチドが削
除されている欠失変異体を含んで成る。均一gp350タン
パク質をコードする本発明のDNA配列は、適当な緊縮条
件下で図１の単離DNA配列にハイブリダイズすることが
できるDNAを含んでもよく、または遺伝暗号の縮重がな
ければそのような条件下で図１の単離DNA配列にハイブ
リダイズすることができるだろうDNAを含んでもよい。
従って、本発明のDNA配列は、対立遺伝子変異、種変異
または計画的変更に基づいて、非コード配列、シグナル
配列またはコード配列中に変更を含むことができる。

本明細書中で開示されるそれらの非スプライシング変
異体gp350/220 DNA配列は、当業界で公知の方法を使っ
て作製することができる。本発明の変異DNA配列を、同
様に既知の方法を使って組換え的に発現させ、本発明の
均一gp350タンパク質を製造することができる。そのよ
うな組換えタンパク質を精製し、EBV関連疾患の予防処
置と防止のための医薬組成物中に配合することができ
る。

本発明のgp350/220 DNAの非スプライシング変異体
は、当業界で既知であるようにして適当な発現調節配列
を使って様々な種類の細胞中で組換え発現させることが
できる。当業界で既知であり且つ入手可能である適当な
細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae）のような酵母細胞、E.コリ（E.col
i）やバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のよ
うな細菌細胞、並びにGH3,CHO,NSO,MDCKおよびＣ−127
細胞のような哺乳類細胞が挙げられる。細胞型と共に使
われるベクターは、細胞型との適合性および使用する発
現調節系に基づいて選択される。gp350/220遺伝子の分
泌産物の発現を考慮に入れた細胞とベクターが好まし
い。典型的には、例えば、Ｃ末端および／または膜貫通
領域をコードする配列と共にまたは伴わずに、所望のタ
ンパク質（この場合EBV gp350の非スプライシング変異
体配列）の発現のためのDNA配列を含むように常用技術
を使って変更されているpBR322の誘導体を使ってE.コリ
が形質転換される。pBR322はアンピシリンとテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含み、これをマーカーとして使うこ
とができる。Bolivar,Gene ２:95（1977）を参照のこ
と。常用される発現調節配列、即ち転写開始のためのプ
ロモーターおよび場合によりオペレーターまたはエンハ
ンサーとしては、β−ラクタマーゼおよびlacプロモー
ター系〔Chang,Nature 198:1056（1977）を参照のこ
と〕、トリプトファンプロモーター系〔Goeddel,Nuclei
c Acids Res.８:4057（1980）を参照のこと〕、および
ラムダ由来PLプロモーターとＮ遺伝子リボソーム結合部
位〔Shimatake,Nature 292:128（1981）を参照のこと〕
が挙げられる。しかしながら、原核宿主細胞と適合でき
るいずれの入手可能なプロモーター系または発現調節系
も使うことができる。他の典型的な宿主細胞、プラスミ
ドおよび発現ビヒクルは、Itakura（1982）に発行され
た米国特許第4,356,270号、Riggsに発行された同第4,43
1,739号およびRutter1984）に発行された同第4,440,859
号に開示されている。

昆虫細胞発現系を使用する宿主細胞として昆虫細胞を
使ってもよい。昆虫細胞での発現の場合、発現系の構成
要素としては一般に、バキュロウイルスゲノムの断片と
発現させようとする１または複数の異種遺伝子の挿入の
ための便利な制限部位の両方を含有する伝達ベクター、
通常は細菌プラスミド；前記伝達ベクター中のバキュロ
ウイルス特異的断片と相同の配列を有する野生型バキュ
ロウイルス（これはバキュロウイルスゲノム中への異種
遺伝子の相同組換えを考慮に入れる）；並びに適当な昆
虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。

現在、AcNPV中に外来遺伝子を導入するために最もよ
く使われる伝達ベクターはpAc373である。当業者が知る
ところの多数の他のベクターもデザインされている。そ
れらとしては、例えばpVL985が挙げられる（これはポリ
ヘドリン開始コドンをATGからATTへ変更し、そして該AT
Tから32塩基対下流にBamH Iクローニング部位を導入す
る;LuckowおよびSummers,Virology（1989）17:31を参照
のこと）。

該プラスミドは普通、ポリヘドリンポリアデニル化シ
グナル〔Miller他（1988）Ann.Rev.Microbiol.,42:17
7〕並びにE.コリの選択と繁殖のための原核生物のアン
ピシリン耐性（amp）遺伝子および複製開始点も含有す
る。

バキュロウイルス伝達ベクターは通常バキュロウイル
スプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモー
ターは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼを結合する
ことができ且つコード配列（例えば構造遺伝子）からmR
NAへの下流（５′→３′）転写を開始することができる
任意のDNA配列である。プロモーターは通常コード配列
の５′末端の近位に置かれる転写開始領域を有するだろ
う。この転写開始領域は典型的にはRNAポリメラーゼ結
合部位と転写開始部位を含む。バキュロウイルス伝達ベ
クターは、存在するなら普通は構造遺伝子に対して遠位
である、エンハンサーと呼ばれる第二の領域を有するこ
ともできる。発現は調節的か構成的のいずれであっても
よい。昆虫細胞発現技術については、EP特許公開155 47
6を参照のこと。

酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae）を宿主細胞として使ってもよい。様
々な株が入手可能でありそして利用可能である。同様
に、酵母発現に適当なプラスミドベクターは既知であ
り、プロモーターや発現調節系も知られている。例え
ば、Myanohara,Proc.Natl.Acad.Sci.80:1（1983）（PHO
5プロモーター）、EP特許公開012 873（リーダー配
列）、Kurtz,Mol.Cell Biol.６:142（1986）、Ito,J.Ba
cteriol.153:163（1983）およびHinnen,Proc.Natl.Aca
d.Sci.75:1929（1979）（形質転換方法および適当なベ
クター）を参照のこと。

多細胞生物からの真核細胞ももちろん、着目のタンパ
ク質およびポリペプチドをコードする遺伝子の発現のた
めの宿主細胞として使うことができる。有用な宿主細胞
系としてはVEROおよびHeLa細胞、並びにチャイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞が挙げられる。そのような細
胞と適合する発現ベクターも入手可能であり、それらは
典型的にはプロモーターおよび発現調節配列、例えばSV
40からの初期および後期プロモーター〔Fiers,Nature 2
73:113（1978）参照〕、ポリオーマウイルス、アデノウ
イルス２、ウシ乳頭腫ウイルスまたはトリ肉腫ウイルス
からのプロモーターを含む。典型的な宿主細胞、プロモ
ーター、選択マーカーおよび技術は、Mather（1992）に
発行された米国特許第5,122,469号、Axel（1983）に発
行された同第4,399,216号、Axel（1987）に発行された
同第4,634,665号、Levinson（1987）に発行された同第
4,713,339号、Ringold（1987）に発行された同第4,656,
134号、Kellems（1989）に発行された同第4,822,736号
およびFiers（1989）に発行された同第4,874,702号を参
照のこと。

適当な宿主細胞の形質転換は、そのような細胞に適当
な標準技術、例えばCohen,Proc.Natl.Acad.Sci.69:2110
（1972）に開示されたような原核生物用のCaCl₂処理
や、Graham,Virology 52:546（1978）中に開示されたよ
うな哺乳類細胞用のCaPO₄処理を使って達成される。酵
母形質転換は、Hsiao,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3829（19
79）中に記載されたようにまたはKlebe,Gene 25:333（1
983）中に記載されたように行うことができる。

非スプライシング変異体gp350配列（Ｃ末端領域およ
び／または膜貫通領域の削除を引き起こすような本明細
書中に開示された追加の変異を有するかまたは有さな
い）を含有する適当なベクターの作製は、当業界で現在
周知である常用の連結および制限技術を使って行われ
る。部位特異的DNA開裂は標準条件下で１または複数の
適当な制限酵素で処理することにより行われ、その詳細
は典型的には制限酵素製造業者により明記されている。
標準技術を使って開裂された断片をサイズ分離するため
にポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳
動を実施することができ、そして４種のデオキシヌクレ
オチド三リン酸の存在下でE.コリのポリメラーゼＩクレ
ノウ断片での処理により該断片を平滑末端にすることが
できる。S1ヌクレアーゼでの処理はいずれの一本鎖部分
も加水分解する。例えば当業界で既知のジエチルホスホ
アミダイト法を使って、合成オリゴヌクレオチドを製造
することができる。米国特許第4,415,732号（1983）を
参照のこと。標準条件および温度の下でT4 DNAリガーゼ
を使って連結を実施し、そして連結混合物を用いてE.コ
リまたはCOS細胞を形質転換させることにより正しい連
結を確認することができる。好結果の形質転換体はアン
ピシリン、テトラサイクリンもしくは他の抗生物質耐性
により、または当業界で既知であるような別のマーカー
を使って選択される。

そのような組換えDNA技術は文献中に詳しく説明され
ている。例えば、Sambrook,MOLECULAR CLONING:A LABOR
ATORY MANUAL,2DED.（1989）;DNA CLONING,I ＆ II巻
（DN Glover編1985）;OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS（MJ
Gait編1984）;NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（BD Hames
編1984）;TRANSCRIPTION AND TRANSLATION（BD Hames編
1984）;ANIMAL CELL CULTURE（RI Freshney編1986）;B.
Perbal,A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING（198
4）;GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS（JH
Miller編1987 Cold Spring Harbor Laboratory）;Scope
s,PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,第
２版（1987 Springer−Verlag NY）；およびHANDBOOK O
F EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY I〜IV巻（DM Weired 198
6）を参照のこと。本明細書中に言及される全ての刊行
物はそれらが開示するものの内容についての参照のため
組み込まれる。

従って別の観点では、本発明はgp350/220 DNA配列の
非スプライシング変異体を含有するベクターと宿主細胞
を含んで成り、また均一gp350タンパク質の発現を可能
にする培養条件下で、発現調節配列に作用可能に連結さ
れたgp350/220 DNA配列の非スプライシング変異体を担
持しているベクターを含む前記宿主細胞を培養すること
によりgp350/220タンパク質の非スプライシング変異体
を生産する方法を更に含んで成る。

従来の糖タンパク質精製技術を使って、例えば非限定
的に、当業界で既知である限外濾過、フリーフロー電気
泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、SDS−PAGE、分別NH₄SO₄沈澱、レク
チンカラム、イオン交換カラムおよび疎水性カラムを使
って、細胞および培地成分から、発現された均一gp350
が精製される。gp350の小規模分析用調製物はSDS−PAGE
またはレクチンアフィニティーカラムを使って最も容易
に精製され、そして予防接種または免疫応答実験用のそ
のような小規模調製物は液体クロマトグラフィーを使っ
て最も容易に精製される。ワクチン組成物に使われる商
業的に有意な量のgp350の大規模生産には、限外濾過、
ゲル濾過、イオン交換および疎水的相互作用クロマトグ
ラフィーの組合せが好ましい。

本発明の精製された均一のgp350タンパク質は、感染
性単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌のよう
なEBV関連状態および疾患を予防または治療するための
治療および／または免疫原性組成物に使うことができ
る。そのような医薬組成物は、医薬上許容される担体、
例えばアジュバント／抗原提示系、例えばミョウバンと
共に、免疫原的誘発有効量の１または複数の本発明の均
一gp350タンパク質を含んで成る。他のアジュバント／
抗原提示系、例えばMF59（Chiron Corp.）,QS−21（Cam
brigde Biotech Corp.）,3−DMPL（３−デアシルモノホ
スホリルリピドＡ）（RibiImmunoChem Research,In
c.），臨床用不完全フロイントアジュバント（IFA），
フゾゲニックリポソーム，水溶性ポリマーまたはIscoms
（免疫刺激複合体）を使ってもよい。他の典型的な医薬
上許容される担体または溶液は水酸化アルミニウム、食
塩水およびリン酸塩緩衝化食塩水である。該組成物は全
身投与することができ、好ましくは許容される皮下また
は筋肉溶液の形で皮下または筋内に投与することができ
る。また表面乱切によりまたは体腔の接種により接種を
行うことができる。pH、等張性、安定性などに十分な注
意をしたそのような溶液の調製は、当業者の技術の範囲
内である。投薬法は、薬の作用を変えることが知られて
いる様々な要因、例えば健康状態、体重、性別、食事、
症状の重さ、投与の期間および他の臨床的要因を考慮し
て担当医により決定されるだろう。典型的な用量範囲は
約１μｇから約1000μｇのタンパク質を含んで成る。

本発明の処置方法を実施する場合、免疫学的誘発有効
量の均一gp350タンパク質が治療または予防処置の必要
なヒト患者に投与される。本発明の組成物の免疫学的誘
発有効量は、投与１回分あたり約１μｇ〜約1mgの範囲
内であると予想される。投与量の数字は上述した要因に
よって異なるだろう。本発明を次の実施例において更に
説明するが、本発明の範囲を限定するのではなく本発明
を例証することを意図したものである。

実施例１ pDTMおよびpSTOPを作製するためのgp350/220の膜貫通領
域および膜貫通領域からＣ末端までの削除 EBV B95−８株（Miller他,1972）からのgp350/220遺
伝子は、BLLF1と呼ばれる転写解読枠としてBamH Iライ
ブラリーにおいて入手可能である（Baer,Nature 310:20
7,1984）。所望の構成物（図2Bに略図として示される）
を作製するため、gp350/220遺伝子を２部分においてク
ローニングした：（１）2.3kb Hind III/Bfa I 3′断片
であるBLSH1および（２）337bp Ban I/Hind III 5′断
片であるBLSH2（図2A）。Ｃ末端の細胞質および／また
は膜貫通コード領域の削除を行えるようにそれらの断片
を足場（staging）ベクター中にクローニングした。Bfa
I部位はgp350膜貫通（TM）領域をコードする領域の
５′末端に存在するので、それを使ってTM領域欠失体お
よび近隣のＣ末端欠失を含むTM領域欠失体を作製した。
Bfa Iを使って、TM領域の２アミノ酸だけを保持してい
る欠失体を作製することができた。

1. pSTG1とpSTG3からのpDTMの作製 プラスミドpDTMは、完全なTMコード領域を欠くgp350/
220核酸配列から構成される。この構成物は２つの足場
ベクターpSTG1とpSTG3を使って作製した。BLLF1クロー
ン標的配列を使って、TM領域の３′末端のところにBfa
I部位を導入する450bpのPCR生成物SYCTを作製した（図
２）。使用したPCRプライマーは次の通りである： プライマー１のBfa I部位を使ってSCYTのBfa I/Xma I
断片をpSTG1中にクローニングした。プライマー１の残
部はクローンBLLF1によりコードされるアミノ酸配列に
相当する。プライマー２は、gp350/220転写解読枠の外
側の該遺伝子の３′側の領域に相当する。SCYT PCR断
片をBfa IとXma Iで切断して136塩基対の断片を得、そ
れを第二の断片であるBLSH1 Hind III/Bfa I断片と一緒
にpMT11ベクター（SpaeteおよびMocarski,1985）中にク
ローニングしてpSTG1を作製した。Bfa I部位を横切る配
列分析は、アミノ酸MetとLeuを除くTMアミノ酸コード領
域の全てが削除されたことを示した（表２を参照のこ
と）。第三のBLLF1断片であるBLSH2をpMT11中にクロー
ニングしてpSTG3を作製した。gp350/220遺伝子コード配
列の外側の16塩基対のBan I/Xba Iオリゴヌクレオチド
リンカーを使って、BLSH2 Ban I/Hind III断片をpSTG3
中にクローニングした。2.4kbのHind III/Xma I pSTG1
断片を0.3kbのXba I/Hind III pSTG3断片と一緒にpEE14
ベクター（Celltech,英国）中にクローニングし、pDTM
構成物を完成させた。

2. ベクターpSTG2とpSTG3を使ったpSTOPの作製 プラスミドpSTOPは、TM領域とTM領域に隣接したＣ末
端細胞質領域を欠くgp350/220遺伝子を含んで成る。こ
の構成物を作製するために、下記に示すようにBfa I粘
着末端の後の３フレームに終止コドン（下線を引いた部
分）を有する16塩基対のBfa I/EcoR Iオリゴヌクレオチ
ドリンカーを作った。

上側の配列の５′突出部（TA）はBfa I制限部位のた
めの粘着末端であり、そして下側の配列の５′突出部
（TTAA）はEcoR I粘着末端である。この16塩基対リンカ
ーを使って、BLSH1 Hind III/Bfa I断片をpMT11中にク
ローニングしてpSTG2を作製した。pSTG2の2.3kb Hind I
II/EcoR I断片とpSTG3の0.3kb Xba I/Hind III断片をpE
E14中にクローニングしてpSTOPを作製した。

3. 野生型、pDTMおよびpSTOP配列のTM領域のところの
比較 野生型、pSTOPおよびpDTMのgp350 DNA配列とアミノ酸
配列の３′末端のオリゴヌクレオチド配列と翻訳される
アミノ酸配列を下の表２に示す。矢印は野生型の膜貫通
領域（TM）の始まりと終わりを示す。膜貫通領域からの
２つのアミノ酸、Met₈₆₁とLeu₈₆₂だけがpDTMとpSTOP中
に保持される（図１も参照のこと）。pSTOP中ではLeu
₈₆₂の直後に終止コドンがあることに注目されたい。pDT
M中では、削除された膜貫通領域より先の位置が「ΔT
M」と記されている。（この表では、生来のアミノ酸が
示される。） 実施例２ pMDTMおよびpMSTOPを作製するためのgp350/220遺伝子の
供与体および受容体スプライス部位の除去 gp350タンパク質の均一生産を得るために、gp350/220
遺伝子スプライス部位の高度に保存された塩基と保存さ
れた塩基を変更した。全スプライス部位の100％に存在
する高度に保存されたGT対を含む、供与体スプライス部
位中の４塩基を変更した。２つの保存された供与体部位
塩基AAをGTで置き換えた。２つの高度に保存された（不
変の）供与体スプライス部位塩基をGTからCAに変更し
た。受容体スプライス部位では、アミノ酸配列を維持す
るために高度に保存された受容体スプライス部位塩基の
うちの１つだけを変更した。第二の保存された受容体ス
プライス部位塩基は表３に指摘されるように変更した。
表３はgp350/220遺伝子の供与体および受容体スプライ
ス部位の中の変更された塩基を要約する。

オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発により変更され
た塩基は変異体配列中に星印が付けられている。スプラ
イシングの実際部位は矢印により示され、コードされる
アミノ酸が記載されている。ヌクレオチド置換の結果と
してアミノ酸配列が変わらないことに注目のこと。

野生型gp350/220供与体スプライス部位と受容体スプ
ライス部位DNA配列に対するそれらのヌクレオチド置換
は、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を使って達成
された。変異ファージベクターM13TACを使ってZoller,
M.E.およびSmith,M.（1983）Methods of Enzymol.10046
8に記載のようにして変異を導入した。Asp718とXho I粘
着末端を含む19bpオリゴヌクレオチドリンカーと組み合
わせて、ポリリンカー上のAsp718制限部位とBamH I制限
部位を使ってプラスミドM13TACのポリリンカー中にgp35
0/220ヌクレオチド配列のBamH I/Xho I断片をクローニ
ングした。実施例１のプラスミドM13DTMとM13STOP（図2
B）を突然変異誘発に使った。

突然変異誘発に使用するために２つの42マーオリゴヌ
クレオチドPrDonor1とPrAcceptor1を作製した。各々、
供与体または受容体スプライス部位のいずれかの中心を
占めるgp350/220遺伝子配列に相補的であるようにデザ
インした。gp350/220遺伝子に相補的でない該オリゴヌ
クレオチドの唯一の領域は所望の変異を示す塩基であっ
た。突然変異誘発オリゴヌクレオチドは次のものから成
った： 突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列は「プライマ
ー」と標示され、一方でgp350/220遺伝子スプライス部
位を含むDNA配列は「EBV」と標示されている。突然変異
誘発の結果として変更された塩基は星印が付けられてい
る。点線はスプライスの位置を示している。

オリゴマヌクレオチドPrDonor1とPrAcceptor1をM13−
DTMとM13−STOPの一本鎖クローンにハイブリダイズさせ
た。T4 DNAポリメラーゼホロ酵素を使って二本鎖のM13
DNAを製造し、その二本鎖DNAを使ってE.コリを形質転換
せしめた。ベクターM13TACを使って、所望の変異を含ま
ないいずれのクローンも、Ｘ−galとイソチオプロピル
ガラクテートの存在下で白から青への色の変化により同
定することができた。青色プラークを取り、増殖させ、
そしてスプライス接合部にまたがるDNA配列決定を使っ
て、M13−MDTMおよびM13−MSTOPと命名された変異体ク
ローンを最終同定した。

所望の変異を含むクローンを同定した後、M13−MDTM
とM13−MSTOPからBamH I/Xho I断片を切り取り、それら
をpDTMまたはpSTOP骨格中に連結し直してそれぞれpMDTM
とpMSTOPを作製した。それらの構成物をCHO細胞中にト
ランスフェクションし、実施例３に記載のように非スプ
ライシング変異体gp350/220 DNA配列を発現させた。

実施例３ CHO細胞中でのgp350の発現 1. gp350/220遺伝子構成物のトランスフェクション 哺乳類細胞からの本発明の均一gp350タンパク質を高
レベルで生産する１つの方法は、多重コピーの異種gp35
0 DNA配列を含む細胞の作製を必要とする。異種DNA配列
は増幅可能なマーカー（この実施例では、細胞をメチオ
ニンスルホキシミンを使って増幅させることができるグ
ルタミンシンセターゼ遺伝子）に作用可能に連結され
る。

実施例２において作製したpMDTMおよびpMSTOPベクタ
ーを、Crockett,Bio/Technology ８:662（1990）の手順
に従って且つグルタミンシンセターゼ遺伝子増幅系につ
いてのCelltech Instruction Manual（1992）に記載の
通りに、後述のごとくCHO細胞中にトランスフェクショ
ンせしめた。

CHO−K1細胞（ATCC CCR61）を、10％ウシ胎児血清、1
00単位/mのペニシリン、100mg/mのストレプトマイ
シン、MEM（改良イーグル培地）非必須アミノ酸および1
mMピルビン酸ナトリウム（全てJRH Biosciencesから）
が補足されたグルタミン不含有EMEM（イーグル最少必須
培地）中に維持した。該培地に60mg/mのグルタミン
酸、60mg/mのアスパラギン、7mg/mのアデノシン、7
mg/mのグアノシン、7mg/mのシチジン、7mg/mのウ
リジンおよび2.4mg/mのチミジン（全てSigmaから）も
補足した。この培地調製物をトランスフェクションの間
終始使用するが、指摘されるようなこの処方箋からの変
化を伴う。

トランスフェクションの１日前に、10cm皿に３×10⁶
個のCHO−K1細胞を接種した。トランスフェクションの
当日、細胞を皿あたり10mの無血清培地で洗った。常
用技術を使ったCaPO₄沈澱により、プラスミドDNA（pMDT
M,pMSTOPプラスミドから）を適用した。10μｇの各プラ
スミドＤ沈澱物をCHO−K1細胞と2mの無血清培地と共
に37℃で4.5時間インキュベートした。４回のプラスミ
ドDNAトランスフェクションの各々に３つの複製物を作
った。次いでHEPES緩衝化食塩水中の15％グリセロール
を使って細胞を1.5分間刺激した。無血清培地で洗浄し
た後、細胞に血清含有培地を再び与えて24時間インキュ
ベートした。

翌日、10％透析済ウシ胎児血清（JRH Biosciences）
を含むように培地を交換し、25μＭメチオニンスルホキ
シミン（Sigma）の添加により増幅させた。増幅したク
ローンが採集に十分な位大きくなるまで（約13〜14日
後）３〜５日毎に細胞にメチオニンスルホキシミン含有
培地を再供給した。無菌の200μピペットマンチップ
を使って皿からコロニーを掻き取ることによりクローン
を採集し、メチオニンスルホキシミン不含有培地の入っ
た96ウエルプレートの１つのウエルに移した。１〜２日
後、その培地を培地＋25μＭメチオニンスルホキシミン
と交換した。４日後、培養上清を取り、後述するような
ELISAアッセイにおいてタンパク質産物についてアッセ
イした。

CHO細胞をpEE14対照ベクターだけ（EBV配列を全く含
まない）でトランスフェクションし、同様にCHO−pEE14
の24クローンを採集し、プレートに移して対照とした。
（対照クローンはメチオニンスルホキシミン中での生存
に基づいて同定された。） 2. ELISAアッセイ トランスフェクション後、241クローンのCHO−pMDTM
と158クローンのCHO−pMSTOPを採取し、増殖させた。そ
れらのクローンからの上清をgp350タンパク質生産につ
いて試験した。96ウエルプレートを、50mMホウ酸ナトリ
ウム緩衝液,pH9中に1:2000希釈されたアフィニティー精
製済ウサギ抗gp350/220抗体（抗体MDP1;Andrew Morgan
氏より）でコーティングした。プレートを37℃で３〜４
時間インキュベートし、そしてNunc Immuno Washerを使
ってPBS＋0.05％Tween 20で３回洗浄した。ブロッティ
ング乾燥後、PBS＋0.01％Thimerosal中の２％BSAと共に
37℃で0.5時間インキュベートすることによりプレート
をブロックし、次いで再び洗浄した。トランスフェクシ
ョンされた細胞と対照細胞からの上清を該ウエルに添加
し、37℃で２時間インキュベートした。次いで、PBS洗
浄環状液中に希釈された1mg/mの一次検出抗体、即ちg
p350/220に対するマウスモノクローナル抗体（抗体＃C6
5221M;Biodesign International）と共にプレートを37
℃で１時間インキュベートした。洗浄後、該プレートを
PBS＋0.05％BSA＋0.01％Thimerosal中0.7mg/mの二次
抗体、即ちマウス免疫グロブリンに対して向けられた西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギＦ（ab）_２断片（ヒ
トIg吸着精製済;Biosource International）と共に37℃
で１時間インキュベートした。プレート洗浄後、Stable
Peroxide Substrate Buffer（Pierce Chemicals）中に
溶かしたABTS（Pierce Chemicals）を使って室温で0.5
時間発色させた。１％SDSを使って反応を停止させ、Mol
ecular Devices ELISAプレートリーダーを使って405nm
と650nmの波長でプレートを読んだ。24個のpMDTMクロー
ンと18個のpMSTOPクローンが分泌型gp350について陽性
であった。最大のELISAシグナルを示すクローンをスケ
ールアップのため24ウエルプレートに移し、ウエスタン
ブロットと放射線免疫沈澱アッセイにおいて更に試験し
た。

3. ウエスタンブロットおよび放射線免疫沈澱アッセイ 最初のスクリーニングでは、ウエスタンブロットを使
ってpMDTMトランスフェクションからの組織培養上清を
活性についてアッセイした。CHO細胞上清を５％SDS−PA
GEゲル上で精製し、ニトロセルロースに一晩移行させ、
そして抗gp350抗体を使って探査した。このウエスタン
ブロット分析において７個のpMDTMクローンがgp350陽性
であるとわかった。

ウエスタンブロットで陽性であったpMDTMクローンを
更にgp220の存在について放射線免疫沈澱法により試験
した。選択された形質転換されたpMDTM細胞、pEE14対照
細胞およびGH3Δ19対照細胞（後述）を、実験の日に約3
/4周密的であるように６ウエルプレート上で一晩増殖さ
せた。各ウエルは５×10⁶細胞を含んだ。標識のため、
各ウエルから培地を取り除き、0.7mのメチオニン不含
有MEM（10％ウシ胎児血清）＋100μCiの³⁵S−メチオニ
ンで置き換えた。細胞を37℃で5.5時間インキュベート
し、次いで400rpmで５分間遠心した。50％スラリーでの
10μのセファロース−プロテインＡ（Sigma）と20μ
のモノクローナル抗gp350/220抗体（抗体＃C65221M,1
00mg/m;Biodesign International）の添加により、４
℃で一晩揺り動かしながら、上清中の均一gp350タンパ
ク質を免疫沈澱せしめた。次いで超遠心機中で2000rpm,
室温で２分間混合物をペレットにし、数倍容のリン酸塩
緩衝化食塩水で４回洗浄した。最終洗浄後、ペレットか
ら全ての液体を除去し、50μのタンパク質ゲル試料緩
衝液で置換した。沈澱した免疫複合体を含む試料を５分
間煮沸し、５％SDS−PAGE上で泳動した。免疫沈澱物
を、タンパク質試料緩衝液と1:1で混合した組織培養上
清のゲル試料と比較した。ゲルを乾燥し、次いでHyperf
ilm β−Max（Amersham）を使ってオートラジオグラフ
ィーを行った。

図３は、放射線免疫沈澱のSDS−PAGE分析のオートラ
ジオグラフ結果を示す。陽性対照として使った細胞系は
GH3Δ19（Elliot Keiffより提供;Whang他,1987）であっ
た。GH3Δ19細胞は、膜貫通領域とＣ末端細胞質領域を
欠いてる端が切り取られた形のgp350/220タンパク質を
分泌する。陰性対照として使用するために、pMDTMトラ
ンスフェクションと並行して、CHO細胞をpEE14ベクター
のみでトランスフェクションしそしてメチオニンスルホ
キシミンにより選択した。図３には、偶数のレーンに示
された免疫沈澱物（「Ip」）と互い違いに、奇数のレー
ンに上清（「Ｓ」）が示される。対照レーン２におい
て、GH3Δ19対照細胞からの沈澱物は約220kDと350kDの
ところに２本の強いタンパク質バンドを生じ、端が切り
取られたスプライス変異体gp350およびgp220タンパク質
の約1:1の比での生産を証明する。予想通り、免疫沈澱
させたそれらのバンドはレーン１の放射能標識した組織
培養上清（免疫沈澱させてない試料）に関して濃縮され
る。また、予想通り、pEE14ベクターはgp350/220構成物
のいずれも含まないので、陰性対照（レーン４）には全
くバンドが観察されない。

レーン6,8および10におけるpMDTMクローンの上清から
の免疫沈澱のSDS−PAGE分析は、約350kDのところに一本
の強いバンドを生じる。この分子量はGH3Δ19対照レー
ン２の大きい方の分子量の種と同じである。しかしなが
ら、GH3Δ19対照レーンとは異なり、レーン6,8および10
には約220kDのところに追加の強いバンドが見られな
い。ただし、レーン８には、わずかに小さい分子量で移
動するごく弱いバンドが観察される。これは、欠失した
供与体および受容体スプライス部位を生来のヌクレオチ
ドもしくはアミノ酸配列に戻す変異現象または誤翻訳か
ら生じる少量のgp220タンパク質、分解産物、または共
沈した細胞産物を表す可能世がある。約350kDのところ
の強い一本のバンドは試験した他の５つのMDTM複製物に
も観察された（データは示してない）。

レーン６とレーン10における220kDのバンドの完全な
欠失は、MDTM上清からの不完全な沈澱のためではないよ
うである。何故なら、³⁵S−標識GH3Δ19対照レーン２に
は220kDのバンドが容易に認められるからである。ま
た、野性型スプライス部位を含む実施例１のpDTM構成物
を使った追加の分析は、350kDと220kDのところに２つの
強いバンドを生じた。従って、それらの結果は、スプラ
イス部位の欠失がgp220タンパク質生産の不在下でのgp3
50タンパク質生産を引き起こすことを証明する。

CHO細胞系、または他の哺乳類もしくは非哺乳類細胞
系中で発現されたこの均一gp350タンパク質を更にスケ
ールアップすることができ、レクチンアフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相HPLC、FPLC、ゲル濾過等といっ
た技術をはじめとする当業者によく知られた方法を使っ
て、該細胞系からの順化培地より精製することができ
る。David,J.Immunol.Methods 108:231（1988）およびM
adej,Vaccine 10:777（1992）を参照のこと。

4. pMDTMタンパク質のノーザンブロット分析 この実験では、MDTM−１細胞がgp350 RNAを生産しgp2
20 RNAを生産してないことをノーザンブロットにより証
明し、スプライス部位の変異がgp220生産を防ぐという
別の段階での確証を提供する。

gp350に相補的なDNAプローブをpDTMから作製した。実
施例１を参照のこと。464bpのXho I/Pst I pDTM断片と
してgp350/220プローブ鋳型XP464を単離した。XP464はg
p350とgp220の両方を認識する。gp350特異的プローブAN
537を作製するために、pDTMをNco IとNde Iで切断し、
２つの重複する580 b.p.断片を単離し、そして１つの混
入断片を除去するためにXmn Iと、gp350/220スプライス
部位の内部の537 b.p.Alu I/Nde I断片を得るためにAlu
Iで該混合物を切断した。AN537はgp220からスプライシ
ングで除去される領域に特異的であり、従ってgp350情
報に特異的である。DNA断片XP464とAN537を使ってDNAプ
ローブを³²P−dCTPニックトランスレーション（Amersha
m）により標識した。

全細胞RNAは、ChomczyunskiおよびSacchi,Anal.Bioch
em.,162:156−59（1987）の方法に本質的に従って調製
した。CHO−pEE14（陰性対照細胞系、実施例１参照）、
CHO−MDTM−１およびCHO−DTM−７細胞（90％集密的）
の各々２本ずつのＴ−250フラスコから培地を吸引し、
細胞を溶解させ、そして変性緩衝液（10mの4Mグアニ
ジンチオシアネート,25mMクエン酸ナトリウム,pH7.0,0.
5％サルコシル,100mM 2−メルカプトエタノール）中で
削り落とした。各10mの溶解物に1mの2M酢酸ナトリ
ウム（pH4）、10mの飽和フェノール（pH4.5）および2
mのクロロホルム／イソアミルアルコールを補足し；
該溶解物を氷上で15分間インキュベートし、４℃にて10
000×ｇで20分間遠心し、そして上側の水相を取り出し
た。この水相から１容のイソプロパノールの添加によ
り、20℃で１時間RNAを沈澱させ、４℃でペレット化
し、変性緩衝液中に再懸濁し、そして再沈澱させた。RN
Aペレットを70％エタノール中で１回洗浄し、Speed−Va
c中で乾燥し、そしてDEPC処理した水に再懸濁した。

DTM−７およびMDTM−１全細胞RNAを15％ホルムアミド
と６％ホルムアルデヒド中で65℃にて15分間変性させ、
１％アガロース/6.6％ホルムアルデヒドゲル上で泳動
し、次いで毛管作用によりニトロセルロースに移行さ
せ、そして標識したXP464とAN537を使って探査した。５
分間煮沸することによってこれらのDNAプローブを変性
させ、５×SSPE中で65℃にて一晩ハイブリダイズさせ、
そしてニトロセルロースを高緊縮条件下で洗浄した。Bi
o−Rad Phosphorimagerを使ってオートラジオグラフィ
ーを行った。

CHO−MDTM細胞からの全細胞RNAのノーザンブロット
は、gp220特異的RNA生産を抑制することに対するスプラ
イス変異の有効性を示す。gp350特異的プローブであるA
N537は、gp350特異的プローブに予想される通り、MDTM
−１細胞とDMT−７細胞中の１種類のRNAだけに結合した
（図4,レーン１と２）。スプライス変異がMDTM−１中で
gp220情報の生産を抑制しているとすれば予想通り、gp3
50 RNAとgp220 RNAの両方に特異的であるXP464プローブ
はDTM−７では２つの種を認識し、MDTM−１では一本の
大きい方の分子量バンドを認識した（図4,レーン４と
３）。MDTM−１レーンはgp350特異的RNAに対して過負荷
であるにもかかわらず、明瞭なgp220 RNAは全く検出不
可能であった。MDTM−１とDTM−７レーンにおいてgp350
情報の見かけ移動度に差がある理由は明らかでない。MD
TM−１種はDTM−７に比較して過負荷であるので、それ
がゲル上での移動に影響したのかもしれない。また、gp
350情報はゲル上で大きなリボソームRNAバンドに接近し
て移動するため、それが見かけ分子量をゆがめるのかも
しれない。いずれにせよ。gp350 DNA配列に相補的な単
一種の存在は、このシグナルがgp350 mRNAを表すことを
示唆する。よって、ノーザンブロットから判断すると、
供与体および受容体スプライス部位における突然変異は
gp220情報の生産を抑制するのに有効である。この結果
は、gp350/220に特異的なモノクローナル抗体を使って
放射線免疫沈澱により並びにMDTM−１上清とDTM−７上
清のウエスタンブロットにより更に確証される。

実施例４ 免疫原性活性についての均一gp350タンパク質の試験 精製した均一gp350タンパク質を次のようにして投与
に適当な賦形剤中に配合しそしてマウスに投与する。

David,J.Immunol.Methods 108:213（1988）およびAll
ison,J.Immunol.Methods 95:157（1986）の手順に従っ
て、Pluronic L121とスクアランを（Thr¹）MDPと共にリ
ン酸塩緩衝化食塩水中の0.4％（v/v）Tween 80中で混合
することにより、２×アジュバント−賦形剤濃縮物を調
製する。

投与用組成物は、同容量のタンパク質とアジュバント
−賦形剤の添加により投与日に調製する。タンパク質含
量は用量あたり５μｇ〜50μｇの範囲内であるべきであ
る。

0,21および42日目の３回の0.1m筋肉内注射によりBA
LB/cマウスを免疫する。後眼化窩洞から免疫前の血液と
各注射の10日後に採血した血液を得る。

実施例３に記載の手順に従ってELISAにより血清抗体
価を測定する。血清中のEBV中和抗体は、Moss,J.Gen.Vi
ol.17:233（1972）およびDe Scyryver,Int,J.Cancer 1
3:353（1974）の方法に従って、試験管内でEBVによる胎
児臍帯血リンパ球の形質転換を阻害するそれらの能力に
より定量する。

あるいは、前述のアジュバント中に乳化させたタンパ
ク質の0,21,42,63および84回目の５回の筋肉内投与によ
り、ニュージーランド白ウサギに接種する。用量は接種
１回あたり約５μｇ〜50μｇの範囲内である。最後の投
与の二週間後に血清を得、抗原に対する抗体価につい
て、B95−８細胞からのウイルスgp350/220に対する交差
反応性抗体について、およびEmini,Virology 166:387
（1988）の方法に従った試験管内EBV中和活性について
試験する。

EBVのgp350/220タンパク質は既に確立されているEBV
感染の動物モデル〔Epstein,Clin.Exp.Immunol.63:485
（1986）を参照のこと〕において防御免疫を誘導するこ
とができるので、均一gp350タンパク質組成物の投与か
らも同様な良性結果が期待される。

本明細書中に指定した全ての刊行物の開示は本明細書
中に組み込まれる。本発明の範囲内での変更は当業者に
とって明白であろうから、上述の詳細な説明は理解の明
確化のために与えられるのであって、そこから無用な制
限が解釈されたり推測されたりしてはならない。

配列表 一般情報： 出願人:Spaete,RichardおよびJackman,Winthrop,T. 発明の名称:gp350/220の非スプライシング変異体 配列番号1: 配列の長さ:27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号2: 配列の長さ:19塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号3: 配列の長さ:6アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号4: 配列の長さ:27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号5: 配列の長さ:21塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号6: 配列の長さ:16塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号7: 配列の長さ:18塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号8: 配列の長さ:39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：未定 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号9: 配列の長さ:13アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号10: 配列の長さ:30塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号11: 配列の長さ:5アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号12: 配列の長さ:24塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号13: 配列の長さ:8アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号14: 配列の長さ:42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号15: 配列の長さ:42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号16: 配列の長さ:42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号17: 配列の長さ:42塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴマーDNA 配列 配列番号18: 配列の長さ:3833塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：未定 配列の種類:cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1014..3734 配列 配列番号19: 配列の長さ:907アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列

フロントページの続き (72)発明者 ジャックマン，ウィンスロップ ティ ー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94703，バークレー，デラウェア スト リート ＃１ 1828 (56)参考文献 特開 昭60−232094（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−475（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, 1984，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．５，ｐ．1083 −1090 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，1982，Ｖｏｌ．10，Ｎｏ. ２，ｐ．459−472 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，1990，Ｖ ｏｌ．10，Ｎｏ．12，ｐ．6299−6305 Ｖａｃｃｉｎｅ，1992，Ｖｏｌ．10, Ｎｏ．11，ｐ．777−782 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ, 1988，Ｖｏｌ．108，ｐ．231−236 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, 1985，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．14，ｐ．3229 −3234 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，1991，Ｖｏｌ．19，Ｎｏ. ６，ｐ．1267−1270 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/05 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】EBV gp350タンパク質をコードするか、あ
   るいは生成物の分泌をもたらす膜貫通領域の欠失、膜貫
   通領域と残りのＣ末端の欠失、及び／又はシグナル断片
   の欠失、により短縮された形のEBV gp350をコードし、
   且つgp220 mRNA転写物の生成を回避するようにスプライ
   ス部位又はその近傍に変異を有するDNA断片において、
   このスプライス部位変異又はその近傍の変異が、（ａ）
   ドナースプライス部位の野生型配列:GAA［Gul］−A|GT
   「Ser］₅₀₁におけるGAA［Glu］からGAG［Glu］への変更
   又はAGT［Ser］からTCA［Ser］への変更、及び（ｂ）ア
   クセプタースプライス部位のACA［Thr］−G|GT［Gly］
   ₆₉₈のACA［Thr］からACT［Thr］への変更又はGGT［Gl
   y］からGGA［Gly］への変更、であることを特徴とするD
   NA断片。
2. 【請求項２】請求項１に記載のDNA断片を含んで成るベ
   クター。
3. 【請求項３】請求項１に記載のDNA断片を含んで成る発
   現ベクター。
4. 【請求項４】請求項３に記載のベクターにより、あるい
   は請求項１に記載のDNA断片であって、該DNA断片の複製
   及び発現を指令することが出来る発現制御断片に作用可
   能に関連しているDNA断片により、形質転換された宿主
   細胞。
5. 【請求項５】請求項４に記載の宿主細胞を培養し、そし
   て培養物から前記gp350タンパク質を単離することを含
   んで成る、gp350タンパク質の製造方法。