FI118224B - gp350/220:n ei-silmukoivia muunnoksia - Google Patents

Description

1 118224 gp350/220:n ei-silmukoivia muunnoksia - Tcke-splitsande varianter av gp350/220

Epstein-Barrin virus (EBV), herpesvirusten ryhmään kuuluva virus, aiheuttaa tarttu-5 vaa mononukleoosia ihmisissä. Tauti tarttuu yli 90 %:iin väestöstä. Terveydenhoidon analyytikot arvioivat taudin kustannusten olevan Yhdysvalloissa 100 mil joonaa dollaria vuodessa. Virus leviää ensisijaisesti syljen mukana virusta kantavilta henkilöiltä. EBV-tartunnan saaneet pikkulapset ovat yleensä oireettomia tai heillä esiintyy hyvin vähäisiä oireita, kun sen sijaan tartunnan saaneilla nuorilla aikuisilla ja aikui-10 silla kehittyy tyypillinen tarttuva mononukleoosi, jolle on tunnusomaista kuume, nielutulehdus ja adenopatia. Infektoituneilla ihmisillä säilyy anti-EBV-vasta-aineita koko loppuelämän ajan ja he ovat siten vastustuskykyisiä myöhemmille infektioille. Tällä hetkellä ei ole olemassa mitään kaupallisesti saatavaa EBV-rokotetta.

15 Sen lisäksi, että EBV on tarttuva, sen on osoitettu muuttavan lymfosyyttejä nopeasti jakautuviksi soluiksi ja sen vuoksi sen on katsottu olevan mukana useiden eri lym-foomien, Burkittin lymfooma ja suun nukkainen leukoplakia mukaanluettuina, synnyssä. EBV on löydetty myös nenä-nielun kasvaimista peräisin olevista kudosnäytteistä. Maailmassa arvioidaan esiintyvän 80 000 nenä-nielun syöpätapausta ja ylei-20 sempi se on kiinalaisessa väestöstä.

Elävän heikennetyn rokotteen kehittäm inen EBV:tä vastaan on ollut ja on edelleen . .·. ongelmallista. EBV:hen liittyvän mahdollisen onkogeenisyyden vuoksi tutkijat ovat • · · olleet haluttomia käyttämään elävän rokotteen ratkaisumallia. Tämän keksinnön • · · ^ 25 avulla päästään elävän rokotteen kehittämiseen liittyvistä ongelmista luomalla mene- • < telmiä ja kooostumuksia alayksikkörokotetta varten, joka ei vaadi mahdollisesti on-kogeenisen elävän viruksen käyttöä. Alayksikkörokotteessa käytetään yhtä tai use-ampaa viruksesta peräisin olevaa antigeemproteiinia, jotka synnyttävät immuunivas- • « · *·’ teen ja aikaansaavat immuniteetin.

30 *

Kaksi tärkeämpää antigeenistä EBV-proteiinia ovat glykoproteiini(t) gp350/300 ja • · · : gp220/200, jotka muodostavat osan viruksen kalvovaipasta ja tekevät mahdolliseksi viruspartikkeleiden sitoutumisen ihmisen kohdesoluihin ja pääsemisen niiden sisään * · vaikuttamalla yhdessä solukalvon proteiinin, CD21:n, kanssa. Katso Nemerow, J.

35 Virology 61: 1416 (1987). Ne on jo kauan sitten valittu alayksikkörokotekandidaa- • · • " teiksi, mutta vaikeudet antigeenisesti aktiivisen, natiivilähteistä puhdistetun proteii- nin saamisessa ja rekombinaatiotekniikalla tuotettujen lähteiden huonot saannot ovat 2 118224 vaikeuttaneet tutkijoiden ja rokotteen kehittäjien ponnisteluja. Kirjallisuudessa näihin proteiineihin viitataan käyttämällä erilaisia molekyylipainoalueita [350 tai 300 kilodaltonia (kD) toisesta proteiinista ja 220 tai 200 kD toisesta proteiinista] gp350-tai -300-proteiiniin viitataan tässä nimellä gp350-proteiini ja gp220 tai -200-proteii-5 niin viitataan tässä nimellä gp220-proteiini. Kollektiivisesti näihin kahteen proteiiniin viitataan nimellä gp350/220-proteiini(t).

Eräs vaihtoehtoisesti silmukoinut yksittäinen geeni koodaa gp350/220-proteiineja, jolloin tuloksena syntyy gp350 ja gp220 mRNA-transskriptejä; luonnossa esiintyviä 10 variaatioita gp350/220-geenin silmukointikohdissa ei tunneta. Geeni tuottaa kaksi ekspressiotuotetta, gp350- ja gp220-proteiinit. Avoin lukukehys gp350/220:n DNA-sekvenssille on 2721 emäsparia (bp). Koko lukukehys koodaa gp350:n 907 aminohappoa. Katso Kieffin US-patentti n:o 4 707 358, (1987). Lukukehyksen silmukoin-tiversio kattaa 2130 emästä ja translatoituu gp220-proteiiniksi, 710 aminohapon sek-15 venssiksi. gp350-proteiinin ja gp220-proteiinin teoreettiset molekyylipainot ovat 95 kD ja 70 kD, vastaavassa järjestyksessä. Ilmennetyn gp350-proteiinin ja gp220-proteiinin mitatut molekyylipainot vaihtelevat, mutta ovat likimain 350 kilodaltonia ja 220 kilodaltonia (kD), vastaavassa järjestyksessä. Ennakoitujen ja todellisten mo-lekyylipainojen eron selittää proteiinien laaja glykosyloituminen. Sekä gp350- että 20 gp220-proteiinia muodostuu missä tahansa solussa moolisuhteessa noin 6:1-1:1. Esimerkiksi B95-8-soluissa,jotka ovat pysyvästi infektoituneet EBV:llä, suhde näyttää vaihtelevan, mutta joskus se lähestyy aluetta 6:1. Katso Miller, Proc. Natl. Acad. Sei. 69: 383 (1972).

• » * · * *·,ν 25 Samaten kun näitä glykoproteiineja on tuotettu rekombinaatiotekniikalla, tuloksena *:**: on tätä ennen tavallisesti ollut tuotettavien gp350-ja gp220-proteiinien seos. Tähän ·:* mennessä gp350/220-proteiineja on ilmennetty rotan kuivatun aivolisäkkeen soiuis- * *· · . sa, kiinalaisen hamsterin munasarjasoluissa VERO (Afrikan viherapinan munu- • * · ais)soluissa sekä hiivasoluissa. Katso Whang, J, Virol. 61: 1796 (1982), Motz, Gene 30 44: 353 (1986) ja Emini, Virology 166: 387 (1988). Erästä naudan papilloomaviruk- # sen virusekspressiosysteemiä on myös käytetty gp350/220-proteiinien valmistami- • * 4 “*. seen hiiren fibroblastisoluissa. Katso Madej, Vaccine 10:777 (1992). Vaccinia- ’*. * viruksen labotorio-ja rokotekantoja on myös käytetty gp350/220-proteiinien ilmen- L*·: tämiseen. Alalla tunnetaan muunnettuja rekombinanttiversioitaEBV:n gp350/220- ·:··*: 35 DNA:sta ja -proteiinista. Erityisesti on valmistettu rekombinaatiotekniikalla ··* gp350/220-geenin katkaistuja rakenteita, joista puuttuu transmembraanisekvenssi.

• φ · * . Sellaiset rakenteet tuottavat edelleen mainittujen gp350:n ja gp220:n seosta, mutta • ·

transmembraanialueen poistaminen sallii proteiinien sekreetion. Katso Finerty, T

3 118224

Gen. Virol. 73: 449 (1992) ja Madej, Vaccine 10:777 (1992). Myös erilaisia rekom-binaatiotekniikalla tuotettuja restriktiopalasia ja fuusioproteiineja, jotka käsittävät erilaisia gp350/220-sekvenssejä, on valmistettuja ilmennetty E. colissa. Katso EP-patenttijulkaisu 0 173 254, joka on julkaistu 24. joulukuuta 1991.

5

Niinpä gp350/220:een liittyvä EBV-tutkimus onkin tähän asti keskittynyt joko natii-vin gp350/220-sekvenssin tai muunnetun sekvenssin, josta puuttuu transmembraa-nialue, tehokkaaseen ilmentämiseen, jolloin tuloksena on natiivin proteiinin ja proteiinin, josta puuttuu transmembraani ai ue, kahden vaihtoehtoisen silmukointiversion 10 seos, tai epitooppifragmenttisekvenssien tuottamiseen β-galaktosidaasifuusio-proteiineissa.

Osittain puhdistettuja gp350/220-valmisteita tunnetaan. Katso Finerty, J. Gen. Virology 73: 449 (1992) (rekombinaatiotekniikalla tuotettu, osittain puhdistettu). Mitä 15 tulee natiiviin gp350/220-proteiiniin, useimmissa tapauksissa puhdistusmenetelmien tuloksena proteiinin antigeenisyys inaktivoitui, jolloin sitä ei voitu käyttää alayksik-körokotteessa. Alan tieteellisessä kirjallisuudessa on kuitenkin raportoitu erittäin puhdistettuja antigeenisesti aktiivisen gp350-protciinin valmisteita natiiveista (s.o. ei-rekombinantti-) lähteistä. Katso David, J. bnmunol. Methods 108: 231 (1988).

20 Lisäksi gp350/220-proteiinia ilmentävää rekombinanttirokotevirusta on käytetty val-kotöyhtötamariinien rokottamiseen EBV llä indusoitua lymfoomaa vastaan. Katso Morgan, J. Med. Virology 25: 189 (1988), Mackett, EMBO J. 4: 3229 (1985) ja Mackett, VACCINES '86. ss. 293 (Lcmer RA, Chanock RM, Brown F toim., 1986, Cold Spring Harbor Laboratory). Tätä ennen ei ole kuitenkaan rakennettu viruksen * \v 25 gp350/220-DNA-sekvenssiä siten, että se kykenisi ilmentämään yksinomaan jom-* paakumpaa geenin vaihtoehtoisista silmukointiversioista, mikä mahdollistaisi ja ta-kaisi puhtaan gp350-tai gp220-proteiinin valmistuksen. Ei ole myöskään valmistettu : : rekombinantti- tai mutanttivirusta, joka ilmentää jompaakumpaa gp350- ja gp220- proteiineista.

30 . .·, Yleensä silmukointikohdat helpottavat esi-mRNA-molekyylien prosessia mRNA:ksi.

Polyoomaviruksissa silmukointikohdat ovat välttämättömiä myöhempien * · · mRNA:iden tehokasta kasaantumista varten. 3'-ja 5'-silmukointikohtien vaihtelu * t polyoomavirustransskripteissä vähensi tai esti kokonaan mRNA-kasaantumisen. Kat-35 so Treisman, Nature 292: 595 (1981). SV40-viruksessa leikattavat välisekvenssit helpottavat mRNA:n kulkeutumista ulos tumasta ja mRNA:n stabiloitumista tumassa, ja koska nämä introni/eksoniliitossekvenssit helpottavat pienten tumallisten RNP- • · partikkelien sitoutumista, ajatellaan, että esisilmukoidut mRNA:t eivät ehkä onnistu 4 118224 assosioitumaan oikein prosessireitteihin. On osoitettu, että pistemutaatiot ekso-ni/intronisilmukointikohdissa vähentävät eksoni/intronipilkkoutumista ja voivat keskeyttää esi-mRNA-prosessin, tuman kuljetuksen ja stabiiliuden. Katso Ryu, J. Virology 63: 4386 (1989) ja Gross, Nature 286: 634 (1980).

5

Niinpä ennen tätä keksintöä silmukointikohtien modifioinnin vaikutus EBV:n gp350/220-sekvenssin koodaamien proteiinien toiminnalliseen ekspressioon ja antigeeniseen aktiivisuuteen on ollut parhaimmillaankin tuntematonta ja ennalta-arvaa-matonta.

10

Taustakirjallisuuteen kuuluvat vielä seuraavat. Yleiskatsauksen EBV-biologiasta ja -taudista on esittänyt Straus, Annal of Int, Med. 118: 45 (1993). Kuvaus EBV-BLLFI:n avoimesta lukukehyksestä löytyy Baerin artikkelista lehdessä Nature 310: 207(1984). Kuvauksia Epstein-Barrin viruksen gp350/220-DNA-ja aminohappo-15 sekvensseistä löytyy Beiselin artikkelista julkaisussa J. Virology 54: 665 (19851 ia Bigginin artikkelista julkaisussa EMBO J, 3: 1083 (1984) ja US-patentista n:o 4 707 358, joka on myönnetty Kieffille työtovereineen (1987). Lees julkaisussa Virology 195; 578 (1993) vertailee DN A-sekvenssien, jotka koodaavat gp350/220:tä Epstein-Barrin virustyypeissä A ja B. Thorley-Lawson julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 20 5307 (1980) kuvaa monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on neutraloivaa aktiivisuutta EBV:n gp350/220-glykoproteiinia vastaan. Lopuksi vielä donori-ja akseptorisilmu-kointikohtien konsensussekvenssejä kuvaa Mount julkaisussa Nucleic Acids Res. 10: 459(1982).

• * ··* • * · itL: 25 Eräs tämän keksinnön aspekteista koskee EBV gp350/220:n DNA-sekvenssin ei- ·:*·; silmukoivia muunnoksia. Keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit voivat sisältää eriste- ·:· tyn DNA-sekvenssin, joka koodaa homogeenisen gp350-proteiinin ilmentymistä.

* » · * . gp350-proteiinia koodaavalle DNA-sekvenssille on tunnusomaista, että se käsittää * # * , saman tai olennaisesti saman nukleotidisekvenssin kuin kuviossa 1, jossa natiivinu-30 kleotidit donori- ja akseptorisilmukointikohdissa ovat korvautuneet ei-natiiveilla t.4 nukleotideillä ja niiden palasilla. Tämä DNA-sekvenssi voi sisältää 5'-ja 3'ei-

I · I

koodaavia sekvenssejä koodaavan sekvenssin vieressä ja se voi lisäksi sisältää ami-*\ * noterminaalisen signaali sekvenssi n. Kuviossa 1 on esitetty ei-koodaavat sekvenssit ja !/·· siinä on osoitettu putatiivisen signaalisekvenssin päättymiskohta asteriskilla. On ·:··*: 35 kuitenkin selvää, että tämän keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit voivat sisältää ;*4 eräitä näistä viereisistä tai signaalisekvensseistä tai kaikki ne. Keksinnön mukaiset I * t ei-silmukoivat DNA-sekvenssimuunnokset tuotetaan viemällä mutaatioita kuvion 1 • · · 9 *

II

DNA-sekvenssiin gp350/220:ta koodaavan geenin donori-ja akseptorisilmukointi- 5 118224 kohtiin. Tällä tavoin eliminoidaan gp220-proteiinin tuotanto, jolloin muodostuu vain gp350-proteiinia.

Niinpä keksintö erään toisen aspektinsa mukaan koskee homogeenisiä gp350-proteii-5 neja ja menetelmiä näiden proteiinien valmistamiseksi ilmentämällä EBV

gp350/220:n DNA-sekvenssin ei-silmukoivaa muunnosta sopivassa prokaryoottises-sa tai eukaryoottisessa isäntäsolussa sopivan ilmentämistä säätelevän sekvenssin ohjaamana. Termi homogeeninen tarkoittaa tässä gp350-proteiinien yhteydessä käytettynä gp220-protei inistä vapaata tai olennaisesti vapaata. Huomautamme, että homo-10 geenistä gp350-proteiinia, joka on tuotettu rekombinaatiotekniikalla nisäkäs-tai hyönteissoluissa, ei meidän tietomme mukaan ole koskaan tätä ennen raportoitu alan tieteellisessä kirjallisuudessa.

Vielä erään aspektinsa mukaan keksintö koskee homogeenisiä gp350-proteiineja, 15 joissa on lisäksi deleetioita, joiden tuloksena on erittynyt tuote. Tällaiset deleetiot käsittävät joko gp350:n transmembraanialueen poiston tai gp350.n transmembraani-alueen ja jäljellä olevan C-terminuksen poiston. Sellaiset lisämuunnetut DNA-sekvenssit ja niiden koodaamat proteiinit muodostavat näin keksinnön vielä erään aspektin.

20

Keksintö koskee myös rekombinantti-DNA-molekyyliä, joka käsittää vektori-DNA:n ja DNA-sekvenssin, joka koodaa homogeenistä gp350-proteiinia. DNA-molekyyli antaa gp350-sekvenssin operatiivisesti liittyneenä sopivaan säätelysekvensshn, joka kykenee ohjaamaan homogeenisen gp350:n replikoitumista ja ilmentymistä valitussa i.V 25 isäntäsolussa. lsäntäsolut, jotka on transformoitu sellaisilla DNA-molekyyleillä käy- ·:··: tettäväksi homogeenisen rekombinantti-gp350:n ilmentämiseen, ovat myös tämän ·:· keksinnön kohteena.

·♦·· ♦ ♦ · « · · « > ·

Keksinnön mukaisia DNA-molekyylejä ja transformoituja isäntäsoluja käytetään 30 keksinnön eräässä toisessa aspektissa, uudessa menetelmässä rekombinaatioteknii- # kalla tuotetun homogeenisen gp350-proteiinin tai sen fragmenttien tuottamiseksi.

• « · Tässä menetelmässä solulinjaa, joka on transformoitu DNA-sekvenssillä, joka koo- *. daa homogeenistä gp350-proteiinia tai jotakin sen fragmenttia (tai edellä kuvatun • · V*i kaltaista rekombinantti-DNA-molekyyliä) operatiivisesti kytkettynä johonkin sopi- ·:·: 35 vaan säätely-tai ilmentämisen säätelysekvensshn, joka kykenee ohjaamaan proteiinin y\ ilmentymistä, viljellään sopivissa olosuhteissa, jotka tekevät mahdolliseksi rekombi- * * * * nantti-DNA.n ilmentämisen. Ilmennetty proteiini korjataan sitten isäntäsolusta tai · viljelyalustasta sopivilla konventionaalisilla tavoilla. Menetelmässä voidaan käyttää 6 118224 muutamia tunnettuja soluja isäntäsoluina; tällä hetkellä edullisimpia ovat nisäkäs-tai hyönteissolut.

Esillä olevan keksinnön mukaisia DNA-sekvenssejä ja proteiineja voidaan käyttää 5 tuotettaessa terapeuttisia ja immunogeenisiä yhdisteitä, joissa on EB V-antigeen i-determinantteja. Sellaisia yhdisteitä voidaan käyttää alayksikkörokotteissa, jotka ovat tarkoitetut EBV:hen liittyvien sairauksien, kuten mononukleoosin, Burkittin lym-fooman ja nenä-nielun karsinooman, hoitoon ja ehkäisyyn. Niinpä vielä erään aspektinsa mukaan esillä oleva keksintö koskee sellaisia terapeuttisia ja/tai immunogeeni-10 siä lääkekoostumuksia EBV.hen liittyvien tilojen ja sairauksien, kuten tarttuvan mononukleoosin, Burkettin lymfooman ja nenä-nielun karsinooman, ehkäisemiseen ja hoitamiseen ihmisissä. Sellaiset terapeuttiset ja/tai immunogeeniset lääkekoostumuk-set käsittävät immunogeenisesti indusoivan tehokkaan määrän yhtä tai useampaa tämän keksinnön mukaista homogeenistä gp350-proteiinia sekoitettuna johonkin 15 farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, kuten aluminiumhydroksidiin, keittosuolaliuokseen ja fosfaattipuskuroituun keittosuolaliuokseen alan tuntemuksen mukaisesti, "Immunogeenisesti indusoivalla" tarkoitamme määrää, joka riittää stimuloi-maan nisäkkäässä vasta-ainetuotannon EBV:lle. Vaihtoehtoisesti aktiivista aineosaa voidaan antaa liposomin sisältävän aggregaatin muodossa. Profylaktista käyttöä var-20 ten sellaiset lääkekoostumukset voidaan valmistaa ihmispotilaille annettaviksi alayk-sikkörokotteiksi. Potilaat voidaan rokottaa annoksella, joka riittää stimuloimaan vasta-ainemuodostuksen potilaassa, ja rokottaa sitten uudestaan kuuden kuukauden . tai yhden vuoden kuluttua.

• · » · * • f * • · *.*.* 25 Keksinnön vielä eräs aspekti onkin menetelmä EBV:hen liittyvien tautien ja tilojen hoitamiseksi antamalla potilaalle, erityisesti ihmispotilaalle, immunogeenisesti in- ..*·* dusoiva terapeuttisesti tehokas määrä jotakin homogeenistä gp350-proteiinia jossa- kin sopivassa farmaseuttisessa kantajassa. Vielä eräs keksinnön aspekti on menetel- :**:*: mä immuunivasteen stimuloimiseksi EBV:tä vastaan antamalla potilaalle lmmuno- 30 geenisesti indusoiva tehokas määrä jotakin homogeenistä gp350-proteiinia jossakin j ,·; sopivassa farmaseuttisessa vehikkelissä.

• * * · • ® · • · « ’· ^ Kuvio 1 kuvaa gp350/220:n DNA-ja aminohapposekvenssiä [Beisel, J. Virology 54: *· *: 665 (1985)]. Donori-ja akseptorisilmukointikohdat on merkitty. Transmembraani- l ” ‘ 35 alue on merkitty vaakasuorilla nuolilla ja asteriski (*) osoittaa putatiivisen signaali- ·*·., sekvenssin päätekohdan. Nukleotidinumerointi on merkitty vasemmalle puolelle; • ...

aminohapponumerointi oikealle.

: 7 118224

Kuvio 2 kuvaa gp350-deleetion ja paikkaspesifisten mutanttien rakentamista. pMDTM- ja pMSTOP-merkityt plasmidikartat ovat esimerkkejä keksinnön mukaisista ei-silmukoivista gp350/220-muunnoksista. Osassa (A) on esitetty gp350-proteiinin lineaarinen malli likimain samassa mittakaavassa alapuolella esitetyn koodaavan 5 kloonin, BLLF1 :n, kanssa. Proteiinissa on osoitettu N-terminaalinen signaalisek-venssi (SS) ja transmembraanialueet (TM) ja geenikaaviossa on osoitettu tärkeät restriktiokohdat. gp350-geeni kloonattiin kahdessa segmentissä, Hindlll/Bfal BLSH1 -fragmentissa ja Banl/Hindlll BLSH2 -fragmentissa. SCYT luotiin käyttämällä polymeraasiketjureaktiota osoitetulta BLLF1 -alueelta. Osassa (B) on esitetty kloonaus-10 kaavio pDTM.lle, pSTOP.lle. pMDTM: Ile ja pMSTOP.lle (plasmidit eivät ole samassa mittakaavassa). Kloonauksen yksityiskohdat kuvataan esimerkeissä 1 ja 2. Plasmidikarttoihin on merkitty relevantit restriktiokohdat, käytetyt kloonausvektorit ja gp350-geenifragmentit. Silmukointikohtamutaatiot pMDTM:ssä ja pMSTOP:ssä on merkitty asteriskein.

15

Kuvio 3 esittää homogeenisen gp350-proteiinin immunosaostuksen tuloksia pMDTM-klooneista SDS-PAGE:lla analysoituna. Positiivisia verrokki(GH3Al 9) soluja, jotka erittivät typistettyä muotoa gp350/220-proteiineista, negatiivisia ver-rokki(pEE14)soluja ja useita pMDTM-klooneja merkittiin metabolisesti "S-metio-20 niinillä 5,5 tuntia; homogeeninen gp350-proteiini immunosaostettiin saaduista ku-dosviljelyn supematanteista. Kustakin solutyypistä käsiteltiin näytteitä merkityistä kudosviljelysupcmatanteista (S) ja gp350/220-saostumista (lp) elektroforeesilla 5%-SDS-PAGE:lla (polyakryyliamidigeelielektroforeesi). Molekyylipainomarkkerciden *·!·1 sijainti on merkitty vasemmalle puolelle.

*'.0 25 ψ

Kuvio 4 esittää tuloksia Northern blot -analyysistä, joka suoritettiin pMDTM-klooneista saadulle CHO-soluissa ilmennetylle proteiinille esimerkissä 3.4 kuvatulla * :1: tavalla.

i·· ·1 } · ·

* · I

* 30 Tässä kuvataan seoksia ja menetelmiä, jotka käsittävät kloonattuja EBV-DN A-. sekvenssejä, jotka koodaavat gp350-proteiinin ei-silmukoivia muunnoksia. Kuten .··1·, havaitaan, sellaisiin ei-silmukoiviin muunnoksiin viitataan tässä nimellä homogeeni- • 1 m set gp350-proteiinit. Tavallisesti kun gp350/220-geeni ilmennetään nisäkässoluissa, V 1: syntyy kaksi geemtuotetta, gp350 ja gp220, johtuen geenin RNA-silmukoinnista.

35 Keksinnön avulla on mahdollista tuottaa vain yhtä geenituotetta, gp350:tä. Keksin-:·. nössä poistetaan osa gp350-geenissä olevista RNA-silmukointikohtasignaaleista tai ne kaikki ja geeni ilmennetään jossakin sopivassa isäntäsolussa. gp350/220-geeniin tehtiin mutaatioita, joilla estettiin proteiinin 220 kD -version muodostuminen, kun 1 8 118224 gp350/220-geeni ilmennetään nisäkässoluissa. Tuloksena syntyy mRNA-transskrip-tejä, jotka koodaavat vain gp350:tä. Kun gp220-expressio eliminoidaan käyttämällä gp350/220-geenin ei-silmukoivaa muunnosta, on tuloksena suurempi gp350:n tuotanto gp220:een verrattuna. gp220:n muodostuminen ei ole olennaista tehokkaan 5 anti-EBV-rokotteen tuottamiseksi, koska gp350 sisältää kaikki potentiaaliset gp220:ssä todetut antigeenikohdat.

Sen vuoksi tämän keksinnön eräänä kohteena onkin DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidisekvenssiä, joka on olennaisesti sama kuin gp350, lukuunottamatta sitä, 10 että aminohappoa 501 koodaava donorisilmukointikohtakodoni ja aminohappoa 698 koodaava akseptorisilmukointikohtakodoni on muunnettu korvaamalla natiivit nukleotidit ei-natiiveilla nukleotideillä. Natiivinukleotidit korvataan edullisesti sellaisilla ei-natiivinukleotideillä, että aminohapposekvenssi pysyy muuttumattomana. Erityi-sesimerkkinä natiivinukleotidit AAGT donorisilmukointikohdassa (nukleotidit 1500 15 - 1504) ja natiivinukleotidit Aja T GG-akseptorisilmukointikohdan vieressä (nukleotidit 2091 ja 2094) korvattiin nukleotideillä GTCA ja T ja A, vastaavassa järjestyksessä. Niinpä siis glutamiini aminohappoasemassa 500 ja seriini asemassa 501 pysyivat samoina tämän substituution tuloksena donorikohdassa. Samaten freoniini aminohappoasemassa 697 ja glysiini asemassa 698 pysyivät samoina modifi-20 kaation tuloksena akseptorikohdassa.

Tämän mukaan alaan perehtynyt pystyisi helposti tekemään muita substituutioita kuin mitkä tässä on esimerkkeinä selitetty, kuten tuonnempana täydellisemmin kuva- , taan.

.V. 25 « 1 ·

Niinpä erään aspektinsa mukaan keksintö koskee homogeenisiä gp350-proteiineja. Homogeenisille gp350-protei ineille on tunnusomaista vielä se, että niillä on olennai- « sesti sama aminohapposekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty aminohaposta 1 aminohap- X t 1 poon 907, aminohaposta 1 - aminohappoon 862 tai aminohaposta 1 aminohappoon Ϊ i · ** 30 907, lukuunottamatta aminohappoja 863 - 881, ja kussakin niissä joko on tai ei ole N-terminaalinen 18 aminohapon signaalisekvenssi. Lisäksi keksintö koskee homo-• ♦ 1 .. 1 f1 geenisten gp3 50-protennien analogeja ja sisältää mutantteja, joiden aminohapposek- V : vensseissä on variaatioita, jotka säilyttävät antigeenisen akti i visuuden ja joiden ho- 4 **·,· mologisuus homogeenisten gp350-proteiinien vastaavan alueen kanssa on edullisesti Λ · 35 vähintään 80 %, vielä edullisemmin 90 % ja kaikkein edullisimmin 95 %. Esimerkkejä niistä ovat proteiinit ja polypeptidit, joissa on vähäisiä aminohappovariaatioita ψ ψ : kuvion 1 aminohapposekvenssiin verrattuna; erityisesti konservatiivisia aminohap- 1 pokorvauksia. Konservatiiviset korvaukset ovat sellaisia, joita tapahtuu aminohappo- 9 118224 ryhmissä, jotka muistuttavat läheisesti toisiaan sivuketjujensa osalta. Geneettisesti koodatut aminohapot jakautuvat yleensä neljään ryhmään: (1) happamat = aspartaat-ti, glutamaatti; (2) emäksiset = lysiini, arginiini, histidiini; (3) poolittomat = alaniini, väliini, leusiini, isoleusiini, proliini, fenyylialaniini, metioniini, tryptofaani; ja (4) 5 varauksettomat pooliset = glysiini, asparagiini, glutamiini, kysteiini, seriini, treoniini, tyrosiini. Fenyylialaniini, tryptolaani ja tyrosiini luokitellaan joskus yhdessä aromaattisiksi aminohapoiksi. On esimerkiksi järkevää ajatella, että leusiinin eristetty korvaus tai jonkin aminohapon samankaltainen konservatiivinen korvaus jollakin rakenteellisesti sitä muistuttavalla aminohapolla ei juurikaan vaikuta antigeeniseen 10 aktiivisuuteen tai toiminnallisuuteen.

Keksinnön tarjoama etu on gp350:n yksinkertaisempi puhdistaminen. Koska gp350:llä ja gp220:llä on samankaltaisia biokemiallisia ominaisuuksia, gp220 puhdistuu usein mukana gp350-valmisteissa. Solut Jotka ilmentävät vain gp350/220-15 geenin ei-silmukoivaa varianttia, yksinkertaistavat proteiinin puhdistusta. Tämä : alentaa gp350:n tuotantokustannuksia. Keksintö helpottaa myös gp350:n puhdistuksen lähtömateriaalin biokemiallista karakterisointia. Koska vain yksi laji on läsnä, proteiinin sisältöanalyysi ja aminohapposekvenssianalyysi voidaan suorittaa tarvitsematta ottaa huomioon jonkin toisen lajin läsnäoloa.

20

Lisäksi keksinnön tarjoama etu on gp350:n suurempi tuotanto. gp350-geenin silmu-koimisen estäminen muuttaa solun gp350:n ja gp220:n yhteistuotannosta tuottamaan yksinomaan gp350:tä. Joissakin soluissa gp220:n pitoisuuden on arvioitu olevan 30 - v 100 % gp350:n pitoisuudesta. Kun geenin silmukointi on eliminoitu, gp350:n tuotan-Lv 25 to kasvaa, koska gp220:n tuotantoa ei tapahdu.

«»M · « t ·:· gp350/220-geenin DNA-sekvenssin on kuvannut Beisel J. Virology 54: 665 Π 985) j ·*: ja Biggin, EMBO J, 3: 1083 (1984) ja se on kuvattu kuviossa 1. Geeni on 2721 • ♦ * emäksen avoin lukukehys, joka koodaa 907 aminohappoa ja spesifioi noin 95 kD:n 30 primaarisen translaatiotuotteen. Ennakoitujen ja todellisten arvojen ero edustaa pro-' teiinin laajamittaista glykosylaatiota. 591 emästä (jotka koodaavat 197 aminohappoa) »*i < silmukoivat pois tuottamaan gp220:tä. gp350/220-geenituotteiden näennäinen mole- *. kyylipaino voi vaihdella käytetystä mittaussysteemityypistä, glykosylaatiokohdan *9 !,*·· käytöstä eri solutyypeissä, translaation jälkeisten käsittelyjen eroista tai selekliivises- *·."'· 35 tä geenimutaatiosta riippuen. Mitatut arvot vaihtelevat eri gp350/220 geenin silmu- ··* kointikohdattomien varienttien tuotteissa, mutta termi "homogeeninen gp350- • it ' t proteiini tai -proteiinit" kattaa ei-silmukoivan muunnoksen geenituotteet, joissa ha- • · luttaessa voi olla lisädeleetioita tai -mutaatioita, kuten C-terminaalisia deleetioita 10 1 1 8224 ja/tai transmembraanimuutoksia, ja ne sisältyvät myös keksinnön alaan. Termi "gp220-proteiini" käsittää vaihtoehtoisesti silmukoidun gp350/220-geenituotteen, jonka molekyylipaino on likimain 220 kD. Silmukointikohdat gp350/220-geenissä identifioitiin vertaamalla gp350/220-geeniä donori- ja akseptorisilmukointikonsen-5 sussekvensseihin, jotka perustuvat muihin geeneihin, pääasiassa eukaryoottisista organismeista peräisin oleviin. Konsensusssekvenssit, jotka Mount, Nucleic_Acids_Res. K): 459 (1982) kehitti tutkimalla silmukointikohtia muissa geeneissä, ovat:

A A

10 Donori: - AG/G*T* - AGT

C G

T C

Akseptori: - N}] - A *G*/G CT 15

Edellä olevat asteriskeilla merkityt emäkset ovat emäksiä, jotka esiintyvät 100 prosentissa kaikista silmukointikohdista (erittäin säilyneitä). Asemat, joissa on kaksi emästä tai yksi emäs, ovat säilyneitä asemia (ei korostetut asemat). Vinoviiva osoittaa tosiasiallisen silmukointikohdan.

20 gp350/220-geenissä donorisilmukointikohta esiintyy nukleotidin 1501 jälkeen ja ak-septorisilmukointikohta esiintyy nukleotidin 2092 jälkeen, kuten osoittaa gp350/220-geenin DNA-sekvensointi (Biggin, EMBOX_3: 1083 (1984). (Tässä käytetty ja kuvion 1 numerointi noudattavat Bigginin numerointia). Silmukointikohta esiintyy • · · 25 vastaavassa geenialueessa EBV tyyppi B-kannassa (donorisilmukointikohta Ai5oi:n • * * v\ jälkeen ja akseptorisilmukointikohta G2o92:n jälkeen). Keksintö kattaa koostumukset, • · · * · jotka on tehty käyttämällä joko A- tai B-kannan tai jonkin muun EBV-kannan silmu-kointikohtaa yhden mRNA-lajin tuottamiseen gp350/220-geenistä. Esimerkeissä käytettiin kannasta B95-8 peräisin olevan viruksen tyyppi A -muodon DNA-sekvens- • · * 30 siä, vaikka yhtä hyvin olisi voitu käyttää tyyppi B -kannan DNA-sekvenssiä, koska tyyppiä A ja tyyppiä B olevan kannan translatoitunet geenituotteet ovat 98-prosentti-

: f: sesti samanlaisia. B-kannasta puuttuvat aminohapot 507 - 520 ja 570 - 576. Tyypin A

f·’: kantaa käytettiin siksi, että se sisältää kaikki mahdolliset gp350 antigeenikohdat.

* , Vaihtoehtoisesti voitaisiin käyttää EBV gp350/220:tä, jolla on kantaspesifisiä sek- ** *; 35 venssejä tässä esitetyn mukaisesti sellaisten EBV-kantaspesifisten homogeenisten gp350-proteiinien tuottamiseen, joilla on immunogeenisiä ominaisuuksia, jotka ovat spesifisiä jollekin erityiselle kannalle, ja jotka sen vuoksi ovat käyttökelpoisia immu-·:·· nogeenisissä ja/tai terapeuttisissa koostumuksissa, jotka ovat tarkoitetut kantaspesifi- Π 118224 seen EBV;hen liittyvien sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon. Taulukossa 1 on esitetty donori- ja akseptorisilmukointikohtien villityypin nukleotidi- ja aminohapposekvenssit.

5 gp350/220-geenin RNA:n silmukoinnin estämiseksi gp350/220-geenin nukleiinihap-posekvenssiin tehtiin mutaatioita RNA:n silmukointikohdan relevanttien emäsparien vaihtamiseksi toisiin. Jotta silmukointikohta saataisiin ei toimivaksi, edullisesti vähintään toinen emäs kahdesta erittäin säilyneestä emäksestä, jotka kehystävät dono-rikohtaa tai akseptorikohtaa, olisi korvattava ci-säilyneillä emäksillä, vielä edulli-10 semmin ainakin kaksi erittäin säilynyttä emästä olisi muutettava ei-säilyneiksi emäksiksi. Muitakin säilyneitä emäksiä, jotka sijaitsevat kauempana kuin kahden emäksen päässä silmukointikohdasta, voidaan samoin korvata ei-säilyneillä silmukointikohta-emäksillä silmukointikohdan tunnistamisen heikentämiseksi edelleen. Sekä donori-että akseptorikohta voidaan vaihtaa silmukointimekanismin heikentämiseksi. Edulli-15 sesti sekä donori että akseptori sisältävät edullisesti kumpikin vähintään yhden muutoksen, yhdessä neljästä erittäin säilyneestä silmukointikohtaemäsasemasta ja vielä edullisemmin vähintään kaksi muutosta kahdessa neljästä erittäin säilyneestä silmukointikohtaemäsasemasta. Mikäli yksi silmukointikohta ei ole mutatoitävissä, koska halutaan säilyttää villityypin aminohapposekvenssi, on suositeltavaa tehdä vä-20 hintään kaksi mutaatiota toiseen silmukointikohtaan.

Mutaatio gp350/220:n silmukointikohdissa saattaa tuoda mukanaan muutoksia myöhemmin ilmennetyn gp350-proteiinin aminohapposekvenssiin. Sellaisten muutosten . tulisi edullisesti olla säilyttäviä arninohapposubstituutioita. Säilyttävät substituutiot *,·'*/ 25 aminohapposekvenssissä päinvastoin kuin ei-säilyttävät muutokset aminohapposek- * * · *·*·* venssissä auttavat säilyttämään anti geenikohtia. Säilyttäviä aminohappomuutoksia * * voidaan tehdä niin kauan kuin emäksenvaihdon (tai emästenvaihtojen) tuloksena on sopiva muutos invarianteissa donori/akseptoriemäksissä. Esimerkiksi Gly.llä voitai- * :.j.: siin korvata Ser50i donorisilmukointikohdassa käyttämällä mitä tahansa muuta Gly- • tl ‘•m‘ i 30 spesifistä kodonia kuin GGU.ta (GGU:n käyttäminen säilyttäisi G-nukleotidin eikä tuloksena olisi haluttu GT-korvaus silmukointisignaalissa). Samaten akseptorisilmu- i kointikohdassa Gly698 -» Ala olisi säilyttävä vaihdos, mutta koska Ala-kodonit aika- • · · vat erittäin säilyneellä G-nukleotidillä, tuloksena ei olisi haluttu korvaus. Vaikka , proliini saattaisi sekin olla säilyttävä aminohappovaihdos, proliinia ei käytettäisi kor- '* 35 vaamaanviHityypinaminohappoa,koskatuloksenasaattaisiollaproleiiniintertiääri- sen rakenteen muutos, jolloin yksi tai useampia gp350-antigeenikohtia peittyisi. Taulukossa 1 esitetään hyväksyttäviä säilyttäviä aminohappokorvauksia villityypin ·:··· sekvensseissä. Taulukon alaosassa on esimerkki mutaatiostajossa on suoritettu sai- 12 1 1 8224 lyttäviä aminohappovaihdoksia Taulukko 1

Donori Akseptori

Villityypin sekvenssit silmukointi silmukointi

GAA A |GT ACA G|GT

Glu Ser50i Thr Gly698 4^4- Säilyttäviä aminohappo- -l 4^ vaihdoksia

Asn Ala Ala Ser

Asp Gly Gly Thr

Gin Thr Ser

Esim.: GAC ACA TCG TCT

Asp Thr50i Ser Ser698 '5

Vaikka esillä olevan keksinnön eräs aspekti koskee gp350/220:n ei-silmukoivaa muunnosta, lisämutaatiot gp350/220:n koodaavaan sekvenssiin saattavat myös olla suotavia. Liukoisten homogeenisten gp350-proteiinien tuottamiseksi ("liukoiset pro- . 10 teiinit" ovat joko vapaina liuoksessa tai solukalvoon liittyneinä, mutta eivät solukal- * · voon integroituneina). esimerkiksi solun toksisuusongelmien, joita saattaa esiintyä -*·* täyspitkän gp350-proteiinin ekspressiossa integraalisena kalvoproteiinina, välttämi- seksi gp350:n kalvovälialue (tunnetaan myös nimellä transmembraanialue) muunne- taan poistamalla koko sen koodaava DNA-sekvenssi tai osa siitä. gp350/220:n ’•'il 15 transmembraanialue käsittää aminohapot 861 (metioniini) -181 (alaniini). Katso :T: Beisel, J. Virology 54: 665 (1985). Edullisesti poistetaan vähintään 8 transmem- braanialueen aminohappoa, vielä edullisemmin poistetaan vähintään 12 aminohap- . .·. poa ja kaikkein edullisimmin poistetaan 18-21 aminohappoa. Niinpä keksintö erään • · · aspektinsa mukaan koskee gp350/220-DNA:n ei-silmukoivia muunnoksia ja/tai ho-20 mogeenisiä gp350-proteiinejä, jotka käsittävät vähintään yhden deleetion gp350/220- • · · *· *· DNA:n ja/tai homogeenisen gp350-proteiinin transmembraanialueessa, jolloin tulok- sena on liukoisen homogeenisen gp350-proteiinin ilmentyminen.

·* ·#:'· • #·

Sen lisäksi, että koko ei-silmukoivan gp350/220-variantin transmembraanialue tai ,3 1 1 8224 osa siitä poistetaan, keksinnön mukaan myös transmembraanialueen jälkeinen C-terminaalinen sekvenssi, joka käsittää aminohapot 881 - 907, voidaan poistaa kokonaan tai osittain tässä kuvatulla tavalla keksinnön mukaan. Siten erään toisen aspektinsa mukaan keksintö koskee gp350/220-DNA:n ei-silmukoivia muunnoksia ja/tai 5 homogeenistä proteiiniajoka on muunnettu poistamalla koko koodaava DNA-sekvenssi ja/tai aminohapposekvenssi, joka käsittää gp350/220:n transmembraanialueen, tai osa siitä ja vielä muunnettu edelleen poistamalla gp350/220:n jäljellä olevat C-terminaaliset DNA-ja/tai aminohapposekvenssit.

10 Tämän mukaisesti keksintö erään toisen aspektinsa mukaan koskee ei-silmukoivan muunnoksen DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat keksinnön mukaista homogeenistä gp350-proteiinia. Sellaiset DNA-sekvenssit käsittävät kuvion 1 mukaisen DNA-sekvenssin, joka koodaa aminohappoja 1 - 907, ja käsittää vielä tässä kuvatut nu-kleotidisubstituutiot donori-ja akseptorisilmukointikohlien poistamiseksi. Sellaiset 15 DNA-sekvenssit voivat valinnaisesti käsittää typistettyjä DNA-sekvenssejä Joissa nukleotidit, jotka koodaavat koko transmembraanialuetta tai osaa siitä, ja C-terminus, joka käsittää aminohapot 861 - 907, on poistettuja deleetiomuunnoksia, joissa nukleotidit, jotka koodaavat koko aminohapot 861 - 881 käsittävää transmembraani-aluetta tai osaa siitä, on poistettu. Esillä olevan keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit, 20 jotka koodaavat homogeenisiä gp350-proteiineja, voivat myös käsittää DNA:ta, joka kykenee hybridisoitumaan sopivissa niukoissa olosuhteissa tai joka kykenisi hybridi-soitumaan sellaisissa olosuhteissa ainoastaan geneettisen koodin degeneraatioasteen vuoksi kuvion 1 eristettyyn DNA-sekvenssiin. Tämän keksinnön mukaiset DNA- , sekvenssit voivat siis sisältää ei-koodaavissa sekvensseissä, signaalisekvensseissä tai • · ' ··;* 25 koodaavissa sekvensseissä muutoksia, jotka perustuvat alleelisiin variaatioihin, laji- • · · * · * ' variaatioihin tai harkittuihin muutoksiin.

• * Nämä tässä kuvatut ei-silmukoivat gp350/220:n muunnetut DNA-sekvenssit voidaan * valmistaa käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä. Tämän keksinnön mukaiset 30 muunnetut DNA-sekvenssit voidaan ilmentää rekombinaatiotekniikalla, samoin käyttämällä tunnettuja menetelmiä, tämän keksinnön mukaisten homogeenisten . gp350-proteiinien tuottamiseksi. Sellaisia rekombinanttiproteiineja voidaan puhdis- • * · taa ja niitä voidaan sisällyttää lääkeseoksiin Jotka ovat tarkoitetut EBV:n liittyvien / sairauksien profylaktiseen hoitoon ja ehkäisyyn.

35 Tämän keksinnön mukaisia ei-silmukoivia gp350/220-DNA-muunnoksia voidaan **.. ilmentää rekombinaatiomenetelmillä erityyppisissä soluissa käyttämällä sopivia il- mentämistä ohjaavia systeemejä, kuten alalla tiedetään. Sopivia alalla tunnettuja ja 118224 14 saatavissa olevia soluja, rajoittumatta kuitenkaan tässä mainittuihin, ovat hiivasolut, kuten Saccharomvces cerevisiae, bakteerisolut, kuten E. coli ja Bacillus subtilis, ja nisäkässolut, kuten GH3-, CHO-, NSO-, M DC K- ja C-l 27-solut. Näiden solutyyppien kanssa käytettävät vektorit valitaan sen mukaan, miten ne sopivat yhteen solutyy-5 pin kanssa, ja käytettävän ilmentämisen ohjaussysteemin mukaan. Edullisimpia ovat solut ja vektorit, jotka tekevät mahdolliseksi gp350/220-geenin erittyneiden tuotteiden ilmentämisen. Tyypillisesti esimerkiksi E. coli transformoidaan käyttämällä pBR322:n johdoksia, jotka on muunnettu konventionaal isiä menetelmiä käyttäen niin, että ne sisältävät DNA-sekvenssejä halutun proteiinin, tässä tapauksessa EBV-10 gp350:n ei-silmukoivien muunnossekvenssten ilmentämistä varten, jossa joko on tai ei ole sekvenssejä, jotka koodaavat C-terminusta ja/tai transmembraanialuetta. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresistanssigeenejä, joita voidaan käyttää markkereina. Katso Bolivar, Gene 2: 95 (1977). Tavallisesti käytettyjä ilmentämisen ohjaussysteemejä, s.o. transskription aloittamisen promoottoreja ja valinnaisesti ope-15 raattoria tai voimistajaa, ovat beeta-laktamaasi- ja lac-promoottori-systeemit [katso Chang, Nature 198: 1056 (1977)], tryptofaanipromoottorisysteemi [katso Goeddel, Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)] ja lambda-johdettu PL promoottori- ja N-geeni-ribosomisitoutumiskohta [katso Shimatake, Nature 292 128 (1981)]. Mitä tahansa saatavissa olevaa promoottorisysteemiä tai ilmentämisen säätelysysteemiä, joka on 20 yhteensopiva prokaryoottisten isäntäsolujen kanssa, voidaan kuitenkin käyttää. Muita esimerkkejä isäntäsoluista, plasmideista ja ilmentämisvektoreista on kuvattu US-patentissa n:o 4 356 270, joka on myönnetty Ttakuralle (1982), 4 431 739, joka on myönnetty Riggsille (1984) ja 4 440 859Joka on myönnetty Rutterille (1984).

*25 Hyönteissoluja voidaan myös käyttää isäntäsoluina käyttämällä hyönteissoluekspres-• · siota. Kun kysymyksessä on ilmentäminen hyönteissoluissa, ilmentämissysteemin "1: komponentteihin kuuluu yleensä siirtovektori, tavallisesti jokin bakteeriplasmidi, #>·:· joka sisältää bakulovirusgenomin palasen ja sopivan restriktiokohdan ilmennettävän ! heterologisen geenin tai geenien insertiota varten; villityypin bakulovirusjoka sisäl- * · · 30 tää sekvenssin Joka on homologinen siirtäjävektorisssa olevan bakulovirusspesitisen palasen kanssa (tämä antaa mahdollisuuden heterologisen geenin homologiseen yh-, distymiseen bakuloviruksen genomiin) Ja sopivia hyönteisisäntäsoluja ja kasvatus- « I · liuosta.

♦ 1 · • ♦ » · 35 Nykyisin tavallisimmin käytetty siirtäjävektori vieraiden geenien viemiseksi "·"! AcNPV.hen on pAc373. Monia muitakin vektoreitajotka alan ammattilainen tuntee, :·. on kehitelty. Niitä ovat esimerkiksi pVL985 (joka muuttaa polyhedriinialoituskodo- ...,· nin ATG —» ATT ja joka vie BamHl-kloonauskohdan 32 emäsparin päähän alavir- • # ^ 15 1 1 8224 taan ATT:stä; katso Luckow ja Summers, Virology (1989) 17: 31.

Plasmidi sisältää tavallisesti myös polyhedriinipolyadenylaatiosignaalin [Miller et ai. (19881 Ann, Rev. Microbiol., 42: 177] ia prokaryoottisen amplsilliiniresistanssi-5 (amp)geenin ja replikaation alkamiskohdan valintaa ja propagaatiota varten E. colis-sa.

Bakulovirussiirtäjävektorit sisältävät tavallisesti baculoviruspromoottorin. Bakulovi-ruspromoottori on mikä tahansa DN A-sekvenssi, joka kykenee sitomaan bakulovirus-10 RNA-polymeraasia ja aloittamaan koodaavan sekvenssin (esimerkiksi rakennegee-nin) alavirtaan tapahtuvan (5' -> 3') transskription mRNA:han. Promoottorissa tulee olla transskription aloitusalue, joka sijaitsee tavallisesti lähellä koodaavan sekvenssin 5'-päätä. Tämä transskription aloitusalue sisältää tyypillisesti RNA-polymeraasin si-tomiskohdan ja transskription aloituskohdan. Bakulovirussiirtäjävektorissa voi olla 15 myös toinen voimistajaksi kutsuttu alue, joka on tavallisesti distaalinen rakenne-geeniin nähden. Ekspressio voi olla joko säädelty tai konstitutiivinen. Hyönteisso-luekspressiotekniikan osalta katso EP-patenttijulkaisu 155 476.

Hiivaa, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiaeta, voidaan myös käyttää isäntäsoluna. 20 Saatavilla on ja voidaan käyttää erilaisia kantoja. Samaten plasmidivektoreita, jotka soveltuvat hiivaekspressioon, tunnetaan, samoin promoottori-ja ilmentämisen sääte-lysysteemejä. Katso esimerkiksi Myanohara, Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 1 (1983) (PH05-promoottori), EP-patenttijulkaisu 012 873 (johtosekvenssit), Kurtz, Mol.

,·. Cell. Biol. 6: 142 (1986T Ito, J. Bacteriol. 153: 163 (19831 ia Hinnen. Proc. Natl.

4"· # 25 Acad. Sei. 75: 1929 (1979) (transformaaliomenetelmiä ja sopivia vektoreita).

• · · • 1 · , Monisoluisista organismeista peräisin olevia eukaryoottisoluja voidaan tietysti myös ·«« •••j käyttää isäntäsoluina kysymyksessä olevia proteiineja ja polypeptidejä koodaavien | 1 · ··1' geenien ilmentämiseen. Käyttökelpoisia solulinjoja ovat VERO-ja HeLa-solut ja : 30 kiinalaisen hamsterin munasarjasolut (CHO). Sellaisten solujen kanssa yhteensopivia ekspressiovektoreita on myös saatavilla ja ne sisältävät tyypillisesti promoottoreita ja :.|.ϊ ilmentämisen säätelysekvenssejä, kuten esimerkiksi SV40:stä peräisin olevia varhai- :T: siä ja myöhäisiä promoottoreita [katso Fiers, Nature 273: (1978)] ja polyoomaviruk- .·) : sesta, adenovirus 2:sta, naudan papilloomaviruksesta ja linnun sarkoomaviruksesta • ti 118224 16 (1987), 4 656 134, myönnetty Ringoldille (1987), 4 822 736, myönnetty Kellemsil-le (1989) ja 4 874 702, myönnetty Fiersille (1989).

Sopivien isäntäsolujen transformointi suoritetaan käyttäen sellaisille soluille sopivia 5 standardimenetelmiä, kuten CaCl2-käsittelyä prokaryooteille, kuten Cohen kuvaa julkaisussa Proc, Natl. Acad. Sei. 69: 2110 (1972), ja CaP04-saostusta nisäkässoluil-le. kuten Graham selittää julkaisussa Virology 52: 546 (1978V Hiivan transformointi voidaan suorittaa kuten Hsiao kuvaa julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei, 76: 3829 (1979) tai kuten Klebe kuvaa julkaisussa Gene 25: 333 (1983).

10

Sopivien vektorien, jotka sisältävät ei-silmukoivan gp350-varianttisekvenssin (joko tässä kuvatuin lisämuunnoksin, jotka johtavat C-terminuksen ja/tai transmembraani-alueen deleetioon, tai ilman niitä) suoritetaan käyttämällä konventionaalisia ligaatio-ja restriktiomenetelmiä, jotka tällä alalla nyt hyvin tunnetaan. Paikkaspesifmen 15 DNA:n pilkkominen suoritetaan käsittelemällä sopivalla restriktioentsyymillä (-entsyymeillä) standardiolosuhteissa, joiden yksityiskohdat restriktioentsyymin valmistaja tyypillisesti määrittelee. Pilkottujen palasten erottelemiseksi koon mukaan voidaan suorittaa polyakryyliamidigeeli- tai agaroosigeelielektroforeesi standardimenetelmiä käyttäen ja palaset voidaan tehdä tylppäpäisiksi käsittelemällä ne E. coli -polymeraa-20 sin Klenowin fragmentilla neljän deoksinukleotiditrifosfaatin läsnäollessa. Käsittely S1 -nukleaasilla hydrolysoi mahdolliset 1 -säikeiset osat. Synteettisiä oligonukleotide-jä voidaan valmistaa käyttämällä esimerkiksi alalla tunnettua dietyylifosfoamidiitti-menetelmää. Katso US~patentti n:o 4 415 732 (1983). Ligaatiot voidaan suorittaa . käyttämällä T4 DNA ligaasia standardiolosuhteissa ja lämpötiloissa ja oikein tapah- • t 25 tuneet ligaatiot voidaan vahvistaa transformoimalla E. coli - tai COS-soluja ligatoin- • » i *·’·1 tiseoksella. Onnistuneet transformantit valikoidaan ampisilliini-, tetrasykliini- tai muilla antibioottiresistansseilla tai käyttämällä muita alalla tunnettuja markkereita.

« 1 · •»a·''.

Sellaisia yhdistelmä-DNA-menetelmiä selitetään täydellisesti kirjallisuudessa. Katso »T: 30 esimerkiksi Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL

2D EDITION (1989); DNA CLONING, Voi. I ja II (DN Glover toim., 1985): OLI-i GONUCLEOTIDE SYNTHESIS (MJ Gait toim. 1984); NUCLEIC ACID HYBRT- DIZATION (BDHamcs toim. 1984); TRANSSCTPTION AND TRANSLATION ,· , (BD Hames toim. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (RI Freshney toim. 1986); 35 B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (JH Miller toim. 1987 Cold Spring Harbor Laboratory); Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES ....: AND PRACTICE, 2. painos (1987 Springer-Vcrlag NY) ja HANDBOOK OF EX- 17 ; 1 1 8224 PERTMENTAL IMMUNOLOGY osat I-IV (DM Weired 1986). Kaikki sellaiset tässä mainitut julkaisut sisällytetään tähän viitteinä niiden sisällön osalta.

Sen mukaisesti keksintö erään toisen aspektinsa mukaan koskee vektoreita, jotka 5 sisältävät gp350/220 DN A-sekvenssien ei-silmukoivia muunnoksia Ja isäntäsoluja ja se koskee vielä menetelmiä gp350/220-proteiinin DNA-sekvenssin ei-silmukoivien muunnosten, jotka ovat toiminnallisesti kytketyt ilmentämisen säätelysekvenssiin, valmistamiseksi viljelyolosuhteissa, jotka mahdollistavat homogeenisen gp350-proteiinin ilmentymisen.

10

Ilmennetty homogeeninen gp350 puhdistetaan solusta ja viljelyliuoksen aineosista käyttämällä tavanomaisia glykoproteiinin puhdistamismenetelmiä, kuten ultrasuoda-tusta, vapaavirtauselektroforeesia, geelisuodatuskromatografiaa, affiniteettikromato-grafiaa, SDS-PAGE:a, differentiaalista NII4S04-saostusta, lektiinikolonneja, ionin-15 vaihtokolonneja ja hydrofobisuuskolonneja alalla tunnetulla tavalla, rajoittumatta kuitenkaan näihin menetelmiin. Pienen mittakaavan analyyttisiä gp350-valmisteita puhdistetaan helpoimmin käyttämällä SDS-PAGE:a tai lektiiniaffiniteettikolonneja ja rokotuskokeisiin tai immuunivastekokeisiin tarkoitettuja pienen mittakaavan valmisteita puhdistetaan helpoimmin käyttämällä nestekromatografiaa. Tuotettaessa suures-20 sa mittakaavassa kaupallisesti merkittäviä määriä gp350:tä käytettäväksi rokotekoos-tumuksissa edullisin on ultrasuodatuksen, geelisuodatuksen, ioninvaihto-ja hydrofobisen vuorovaikutuksen kromatografian yhdistelmä.

4 Esillä olevan keksinnön mukaisia puhdistettuja homogeenisiä gp350-proteiineja voi- • · 25 daan käyttää terapeuttisissa ja/tai immunogeenisissä koostumuksissa EBV:hen liit-tyvien tilojen ja sairauksien, kuten tarttuvan mononukleoosin, Burkittin lymfooman ja nenä-nielunkarsinooman ehkäisemiseen ja hoitoon. Sellaiset lääkeseokset käsittä- t vät immunogeenisesti indusoivan tehokkaan määrän yhtä tai useampaa esillä olevan i,*/ keksinnön mukaista homogeenistä gp350-proteiinia sekoitettuna johonkin farmari*: 30 seuttisesti hyväksyttävään kantajaan, esimerkiksi johonkin adjuvantti/antigeeni- presentaatiosysteemiin, kuten alunaan. Muitakin adjuvantti/antigeenipresentaatio-t systeemejä, esimerkiksi MF59ä (Chiron Corp ), QS-21 (Cambridge Biotech Corp.) ,‘r. 3-DMPE (3-deasyyUmonofosforyylilipidi A) (RibilmmunoChem Research, Inc ), ** t kliinisen puhtausasteen omaavaa epätäydellistä Freundin adjuvanttia (IFA), fuso- rt» *·‘i 35 geenisiä liposomeja, vesiliukoisia polymeerejä tai Iscomseja (Immune stimulating *i,,: complexes) voidaan käyttää. Muita esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttävistä j·.., kantajista tai liuoksista ovat aluminiumhydroksidi, keittosuolaliuos ja fosfaattipusku- roitu keittosuolaliuos. Koostumus voidaan antaa systeemisesti, edullisesti ihon alle 18 1 1 8224 tai lihakseen, hyväksyttävänä ihon alle tai lihakseen annettavana liuoksena. Myös rokottaminen voidaan suorittaa pintanaarmutusmenetelmällä tai johonkin kehon onteloon. Alan ammattilainen osaa valmistaa sellaisia liuoksia ottaen asianmukaisesti huomioon niiden pH:n, isotonisuuden, stabiiliuden ja vastaavat ominaisuudet. An-5 nostuksen määrittää hoitava lääkäri ottaen huomioon eri tekijät lääkkeiden vaikutuksen muuntamiseksi, kuten esimerkiksi fyysisen kunnon, kehonpainon, sukupuolen, ruokavalion, tilan vakavuuden, antoajan ja muita kliinisiä tekijöitä. Esimerkkejä an-nosalueista ovat noin 1 pg - noin 1 000 pg proteiinia.

10 Tämän keksinnön mukaista hoitomenetelmää toteutettaessa ihmispotilaalle, joka tarvitsee terapeuttista tai profylaktista hoitoa, annetaan immuunivasteen indusoiva tehokas määrä homogeenistä gp350-proteiinia. Immuunivasteen indusoivan tehokkaan määrän tämän keksinnön mukaista koostumusta ajatellaan olevan noin 1 mikrogrammasta noin 1 milligrammaan per annos. Annettavien annosten lukumää-15 rä voi vaihdella edellä mainituista tekijöistä riippuen. Keksintöä kuvataan vielä seu-raavissa esimerkeissä Jotka ovat tarkoitetut havainnollistamaan keksintöä sen suoja-alaa rajoittamatta.

Esimerkki 1 20 gp350/220:n transmembraanialueen ia transmembraanialueen - C-termin uk sen poistaminen pDTMm ia pSTOP:n luomiseksi EBV B95-8 -kannasta peräisin oleva gp350/220-geeni (Miller et ai., 1972) on saatavissa BamHI-kirjastosta avoimena lukukehyksenä nimellä BLLF1 (Baer, Nature 310: 207,1984). Haluttujen rakenteiden (esitetty kaavamaisesti kuviossa 2B) luomi- ♦ · · Π 25 seksi gp350/220-geeni kloonattiin kahdessa osassa: 1) BLSH1,2,3 kiloemäksen *'*] Hindlil/Btäl 3’ fragmentti ja 2) BLSH2, 337 emäsparin BanI/H.indIII 5' fragmentti (kuvio 2A). Nämä fragmentit kloonattiin vaihevektoreihin siten, että C-terminaali- • * 9 •·ί nen sytoplasma- ja/tai transmembraanialuetta koodaavan alueen deleetio voitiin 4.:.! suorittaa. Koska Bfal-kohta esiintyy gp350:n transmembraanidomainia (TM) koo- V! 30 daavan alueen 5-päässä, sitä käytettiin TM-domainin deleetioiden ja TM-domainin deleetioiden sekä viereisten C-terminuksen deleetioiden aikaansaamiseen. Käytettä-tix essä Bfaktä oli mahdollista aikaansaada deleetioita säilyttäen ainoastaan kaksi TM- i‘·'· alueen aminohappoa (taulukko 2).

« · • * « *‘ *1 35 1. pDTM:n rakentaminen pSTGltstä ja pSTC3:sta

Plasmidi pDTM muodostuu gp350/220.n nukleiinihapposekvenssistä, josta puuttuu koko TM:a koodaava alue. Tämä rakenne tehtiin käyttämällä kahta vaihevektoria ·:··· pSTGl ja pSTG3. 450 emäsparin PCR-tuote, SYCT, joka toi Bfal-kohdan TM- 19 1 1 8224 alueen 3'-päähän, valmistettiin käyttämällä BLLFl kloonin kohdesekvenssiä (kuvio 2). Käytetyt PCR-alukkeet olivat seuraavat:

BfaT

Alukel: GG ATC CIA GAC TGC GCC TTT AGG CGT A

5 BLLFl: ... GAC TGC GCC TTT AGG CGT A..

A.A.: ... Asp Cys Ala Phe Arg Arg ...

T_TM-alueen päättymiskohta

Aluke 2: GGA TCC TCT GTT CCT TCT GCT CC A GTG 10 BLLFl: ....... TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG

Alukkeen 1 Bfal-kohtaa käytettiin SCYT:n BfaJ/Xrnal-fragmentin kloonaamiseen pSTGl :teen. Alukkeen 1 loppuosa vastaa kloonin BLLFl :n koodaamaa aminohappo-sekvenssiä. Aluke 2 vastaa aluetta Joka on gp350/220:n avoimen lukukehyksen ui-15 kopuolella geenin 3'-puolella. SCYT PCR -fragmentti katkaistiin BfaLllä ja XmaLllä 136 emäsparin fragmentin aikaansaamiseksi, joka kloonattiin pMTl 1-vektoriin (Spaete ja Mocarski, 1985) yhdessä toisen fragmentin, BLSH1 Hindlll/BfaL-frag-mentin, kanssa pSTGl :n luomiseksi. Sekvensointi Bfäl-kohdasta osoitti, että koko TM-aminohappoja koodaava alue oli deletoitunut lukuunottamatta aminohappoja 20 Met ja Leu (katso taulukko 2). Kolmas BLLFl -fragmentti, BLSH2, kloonattiin pMTl 1 :teen pSTG3:n luomiseksi. BLSH2 Banl/Hindlll-fragmentin kloonaamiseen pSTG3:een käytettiin 16 emäsparin Banl/Xbal oligonukleotidikytkysekvenssiäJoka oli gp350/220-geenin koodaavan sekvenssin ulkopuolella. 2,4 Hindilll/Xmal pSTGl -fragmentti kloonattiin pEE 14-vektori in (Celltech, Englanti) yhdessä 0,3 25 Xbal/Hindlll pSTG3-fragmentin kanssa pDTM-rakenteen täydentämiseksi.

• · · * · · • « • * * *· ·. 2. pSTOP:n rakentaminen käyttämällä vektoreita pSTG2 ja pSTG3 • « · · ·

Plasmidi pSTOP käsittää gp350/220-geenin Josta puuttuu TM-alue ja TM-alueen · · vieressä oleva C-terminaalinen sytoplasma-aluc. Tämän rakenteen luomiseksi tehtiin 30 16 emäsparin Bfal/EcoRI-oligonukleotidikytkyfragmentti Jossa oli lopetuskodoneja * · · * (alleviivatut) kolmessa lukukehyksessä Bfal-tarttuvan pään jälkeen, kuten alla on esitetty:

: TAT AGA CT A GTC TAG G

A TCT GAT CAG ATC CTT AA

35 Ylemmän sekvenssin 5'-pään yli menevä osa (TA) on tarttuva pää Blal-restriktio-** kohtaa varten ja alemman sekvenssin 5'-pään ylimenevä osa on EcoRI tarttuva pää.

Tätä 16 emäsparin kytkyfragmenttia käytettiin BLSH1 Hindlll/Bfal -fragmentin j'·. kloonaamiseen pMTl l:een pSTG2:n luomiseksi. pSTOPrn luomiseksi pEE14:ään »·»*· • · 20 118224 kloonattiin 2,3 kiloemäksen pSTG2 HindTIT/EcoRT-fragmentti ja 0,3 kiloemäksen pSTG3 Xbal/Hindlll -fragmentti.

3. Villityypin, pDTM- ja pSTOP-sekvenssien vertailu TM-alueclla 5 gp350 DNA.n ja aminohapposekvenssien villityypin, pSTOP:n ja pDTM:n 3'-päiden oligonukleotidisekvenssi ja translatoitunut aminohapposekvenssi on esitetty alla olevassa taulukossa 2. Nuolet osoittavat villityypin transmembraanialueen (TM) alku- ja loppukohdan. Ainoastaan kaksi aminohappoa transmembraanialueelta on säilynyt pDTM:ssä ja pSTOP:ssä, Met86i ja Leu862 (katso myös kuvio 1). Huomaa lopetusko-10 doni heti Leug62'n jälkeen pSTOP:ssä. pDTM:ssä poistetun transmembraanialueen aikaisempi sijainti on merkitty "ATM:llä". (Taulukossa on esitetty natiiviaminoha-pot).

Taulukko 2 15 gp350 villityypin sekvenssin 3*-pää

.....AAC CTC TCC ATG CI A GTA CTG.....GTC ATG GCG GAC TGC GCC

...Asn Leu Ser Met Leu862Val Leu.....Vai Met Ala Asp882 Cys Ala T t TM alku TM loppu 20 pSTOP:p 3’-oää ...AAC CTC TCC ATG CTA TAG ACT AGT TCT AGG...

...Asn Leu Ser Met Leu^ STOP

pDTM:n 3*-pää ...0 25 ...AAC CTC TCC ATG CTA GAC TGA GCC...

:V: ...Asn Leu Ser Met Leu862 Asp882Cys Ala...

·:··: λ

·:· ATM

·«*· » : .* 30 Esimerkki 2 * · * gp350/220-geenin donori- ia akseptorisilmukointikohtien poistaminen # pMDTM:n ia pMSTOP:n valmistamiseksi

Homogeenisen gp350-proteiinin tuottamiseksi vaihdettiin gp350/220-geenin silmu- • · · \ ‘ kointikohdan erittäin säilyneet ja säilyneet emäkset. Donorisilmukointikohdassa ί/.j 35 vaihdettiin neljä emästä, niiden joukossa erittäin säilynyt GT-pari, joka esiintyy ·:*·: 100 %:ssa kaikista silmukointikohdista. Kaksi säilynyttä donorisilmukointikohdan emästä AA korvattiin GT:llä. Kaksi erittäin säilynyttä (invariantti) donorisilmukoin- [ tikohdan emästä vaihdettiin GT —> CA. Akseptorisilmukointikohdassa muutettiin • » 21 1 1 8224 vain yksi erittäin säilyneistä akseptorisilmukointikohdan emäksistä aminohapposekvenssin säilyttämiseksi. Eräs toinen säilynyt akseptorisilmukointikohdan emäs vaihdettiin kuten taulukossa 3 on osoitettu. Taulukossa 3 on yhteenveto emäksistä, jotka muutettiin gp350/220-geenin donori-ja akseptorisilmukointikohdissa.

5

Taulukko 3: EBV gp350/220-geenin silmukointikohtien muutokset

Donorisilmukointikohta: 10 donori donori

Villityyppi: GAA A^GT mutantti: GAG* T*C*A*

Glu Seri01 Glu Ser50i

Akseptorisilmukointikohta: 15 akseptori akseptori

Villityyppi: ACA G^GT mutantti: ACT* GGA* 1 hr Gly698 Thr Gly698 20 Oligonukleotidiperustaisella mutageneesilla muutetut emäkset on merkitty mutantti-sekvensseissä asteriskilla. Varsinainen silmukointikohta on merkitty nuolella ja koodatut aminohapot on esitetty taulukossa. Huomaa, että aminohapposekvenssi ei muutu nuklcotidisubstituutioiden tuloksena.

. 25 Nämä nukleotidisubstituutiot villityypin gp350/220:n donorisilmukointikohdan ja • · · akseptorisilmukointikohdan DNA-sekvensseihin suoritettiin käyttämällä oligonu-kleotidivälitteistä mutageneesia. Mutaatioiden aikaansaamiseen käytettiin muunnet- * · #;> tua faagivcktoria, M13TAC, kuten Zoller, M E. ja Smith, M. ovat kuvanneet (1983) julkaisussa Methods of Enzymol. 100: 468. gp350/220-nukleotidisekvenssin ;;; 30 BamHI/XhoI-fragmentteja kloonattiin plasmidin M13TAC polylinkkeriin käyttämäl- • · · ' *’ * lä Asp718 ja BamHI -restriktiokohtia polylinkerissä yhdistettynä 19 emäsparin oli- gonukleotidilinkkeriin, joka sisälsi Asp718 ja XhoI tarttuvia päitä. Mutageneesiin käytettiin esimerkin 1 (kuvio 2B) plasmidcja Ml 3DTM ja Ml 3STOP.

* * * * · · * * * | 35 Mutageneesissa käytettäviksi valmistettiin kaksi 42-meeristä oligonukleotidiä, PrDo- • * norl jaPrAcceptor 1. Kumpikin rakennettiin komplementaarisiksi gp350/220-geenisekvenssille keskittäen joko donori- tai akseptorisilmukointikohtaan. Ainoa • * • ’* nukleotidien alue, joka ei ollut komplementaarinen gp350/220-geenille, muodostui 22 11 8224 haluttuja mutaatioita edustavista emäksistä. Mutageneesin oligotidit olivat seuraavat: PrDonorl:

Aluke: GOT CAT GTC GGG GGC CTT TG j A CTC TGT GCC OTT GTC CCA TGG 5 ** I 1 1

EBV: GGT CAT GTC GGG GGC CTT AC ! T TTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG

PrAcceptorl

Aluke: CTG TGT TAT ATT TTC ACC TC IC AGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG 10 1 1

EBV: CGT TGT TAT ATT TTC ACC AC J C TGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG

Mutagenecsioligonukleotidien sekvenssi on merkitty "Alukkeeksi", kun taas gp350/220-geenin silmukointikohtiin ulottuva DNA-sekvenssi on merkitty 15 "EBV:ksi". Emäkset, jotka muuttuivat mutageneesin tuloksena, on merkitty asteriskilla. Katkoviiva osoittaa silmukointikohdan.

Oligonukleotidit PrDonorl ja PrAcceptorl hybridisoitiin M13-DTM:n ja M13-STOP:n yksisäikeisiin klooneihin. T4DNA polymeraasi-holoentsyymiä käytettiin 20 kaksisäikeisin M l 3 DN A:n tuottamiseen ja E. coli transformoitiin kaksisäikeisellä DNA:lla. Vektoria M13TAC käyttämällä voitiin identifioida mikä tahansa klooni, joka sisälsi halutun mutaation, värin vaihtumisen avulla valkoisesta siniseksi X-geelin ja isotiopropyyligalaktaatin läsnäollessa. Siniset plakit poimittiin ja niitä kasvatettiin ja DNA-sekvensointia silmukointiliitosten kohdalta käytettiin mutantti-25 kloonien, jotka merkittiin Ml 3-MDTM:ksi ja M13-MSTOP:ksi, identifioimiseksi lopuksi.

• · * · · • · · ♦ ♦ •:”i Halutut mutaatiot sisältävien kloonien identifioimisen jälkeen Ml 3-MDTM:stä ja ' ·:· Ml 3-MSTOP:stä leikattiin BamHl/Xhol-fragmenttejaja ne ligatoitiin takaisin i ;1; 30 pDTM- tai pSTOP-rankoihin vastaavasti rakenteiden pMDTM ja pMSTOP luomi- • · · seksi. Nämä rakenteet transfektoitiin CHO-soluihin ei-silmukoivien gp350/220- varianttien DNA-sekvenssien ilmentämiseksi esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

• · · • 1 1

Esimerkki 3 * 1 1 *. 35 gp350:n ilmentäminen CHO-soluissa • · 1. gp350/220-geenirakenteiden transfektointi :1·: Eräs menetelmä suurien määrien keksinnön mukaista homogeenistä gp350-proteiinia tuottamiseksi nisäkässoluista rakennetaan soluja, jotka sisältävät hyvin paljon hetero- * ·· j · ,, 1 1 8224

: I

logisen gp350-DNA-sekvenssin kopioita. Heterologinen DNA-sekvenssi on toiminnallisesti kytketty monistuvaan markkcriin, tässä esimerkissä glutamiinisyntetaasi-geeniinjota varten soluja voidaan monistaa metioniinisulfoksiminiä käyttäen.

5 Esimerkissä 2 valmistetut pMDTM-ja pMSTOP-vektorit transfektoitiin CHO-soluihin, kuten edellä selitettiin, Crockettin menettelytavan, Biotechnology 8: 662 (1990)mukaisestijakutenkuvataanCelltechinglutamiinisyntetaasigeenimonistus-systeemin ohjekirjassa (1990).

10 CHO-K1 -soluja (ATCC CCR61) pidettiin glutamiinittomassa EMEM-elatusaineessa (Eagle's Minimal Essential Medium), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä, 100 mg/ml streptomysiiniä, MEM:n (Modified Eagle's Medium) ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1 mM natriumpuryvaattia (kaikki saatiin JHR Biosciencesilta). Elastusaineeseen lisättiin myös 60 mg/ml glutamiinihap-15 poa, 60 mg/ml asparagiinia, 7 mg/ml adenosiinia, 7 mg/ml guanosiinia, 7 mg/ml sy-tidiiniä, 7 mg/ml uridiinia ja 2,4 mg/ml tymidiiniä (kaikki Sigmalta). Tämä elatusai-nevalmistetta käytettiin koko transfektion ajan, mainituin poikkeamin tästä reseptistä.

Päivää ennen transfektiota 10 cm:n maljoihin ympättiin 3 x 106 CHO-K1 -soluja.

20 Transfektiopäivänä solut pestiin 10 mklla seerumitonta elatusainetta per malja.

Plasmidi-DNA:ta(pMDTM-japMSTOP-plasmideista) käytettiin CaP04-saostuk- sella tavanomaisia menetelmiä käyttäen. 10 pg kutakin plasmidi-DNA-presipitaattia inkuboitiin CHO-KT -solujen ja 2 ml:n kanssa seerumitonta elatusainetta 37 °C:ssa 4,5 tuntia. Kustakin neljästä plasmidi-DNA-transfektiosta tehtiin kolme replikaattia.

.·. 25 Sitten soluja shokeerattiin 1,5 minuuttia 15% glyserolilla HEPES-puskuroidussa ♦ · · keittosuolaliuoksessa. Seerumittomalla elatusaineella huuhtelun jälkeen soluja ruo- I · · * *. kittiin taas seerumia sisältävällä elatusaineella ja niitä inkuboitiin 24 tuntia.

• ··« •••j Seuraavana päivänä elatusaine vaihdettiin sellaiseksi, että se sisälsi 10% dialysoitua 30 vasikan sikiön seerumia (JRH Biosciences) ja monistettiin lisäämällä 25 μΜ metio- · · : niinisulfoksiminiä (Sigma). Soluja ruokittiin taas metioniinisulfoksiminiä sisältävällä elatusaineella joka 3-5 päivä, kunnes monistuneet kloonit olivat tarpeeksi suuria : poimittaviksi, noin 13 - 14 päivän kuluttua. Kloonit poimittiin raaputtamalla pesäk- keitä maljasta steriilillä 200 μ1:η pipetin kärjellä ja siirrostettiin 96-kuoppaisen astian . 35 yhteen kuoppaan elatusaineessa, jossa ei ollut metioniinisulfoksiminiä. 1 - 2 päivän • · · * *. kuluttua elatusaine korvattiin elatusaineella + 25 gM:lla metioniinisulfoksimiinia.

4 päivän kuluttua viljelyn supematantit koljattiin talteen ja tutkittiin proteiinituottei- j *·· den osalta ELlSA-analyysillä alla selitetyllä tavalla.

« ***** • · I .

118224 24 CHO-soluja transfektoitiin pelkästään pEE14-säätelyvektorilla (joka ei sisällä EBV-sekvenssejä) ja 24 CHO-pEE14.n kloonia poimittiin myös ja siirrettiin levyille verrokeiksi. (Vertailukloonit identifioitiin sen perusteella, säilyivätkö ne elossa metio-5 niinisulfoksiminissä).

2. ELISA-analyysi

Transfektion jälkeen poimittiin ja kasvatettiin 241 CHO-pMDTM:n ja 158 CHO-pMSTOP:n kloonia. Näistä klooneista saadut supernatantit tutkittiin gp350-10 proteiinin tuotannon suhteen. 96-kuoppaisia levyjä päällystettiin affiniteettipuhdiste-tulla kaniinin anti-gp350/220-vasta-aineella (vasta-aine MDPI; lahjoitus Andrew Morganilta) laimennettuna 1:2000 50 mM natriumboraattipuskuriin, pH 9. Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 3-4 tuntia ja pestiin sitten 3 kertaa PBS + 0,05 % Tween 20.llä käyttäen Nunc ImmunoWasher-laitetta. Kuivablottauksen jälkeen levyt blo-15 keerattiin inkuboimalla 2% BSA:lla PBS + 0,01 % Thimerosalissa 37 °C:ssa 0,5 tuntia ja pestiin uudestaan . Transfektoiduista soluista ja vertailusoluista saadut supernatantit lisättiin kuoppiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37 °C:ssa. Sitten levyjä ^ inkuboitiin ensimmäisellä detektiovasta-aineella, hiiren monoklonaalisella vasta-aineella gp350/220:ta vastaan (vasta-aine #C6522 IM; Biodesign International) 20 1 mg:n/ml pitoisuutena PBS-pesupuskurissa, 37 °C:ssa, 1 tunti. Pesun jälkeen levyjä inkuboitiin toisella vasta-aineella, piparjuuriperoksidaasilla konjugoiduilla vuohen F(ab^-fragmenteillaJotka oli nostatettu hiiren immunoglobuliineja vastaan (Human Ig adsorbed; Biosource International), käyttäen 0,7 pg/ml PBS + 0,05% BSA:ssa ja 0,01 % Thimerosalissa 37 °C:ssa 1 tunti. Levyt pestiin ja kehitettiin käyttäen ABTS:ä * \*\: 25 (Pierce Chemicals) liuotettuna Stable Peroxide Substrate Buffer -puskuriin (Pierce

Chemicals) 0,5 tuntia huoneenlämpötilassa. Reaktio pysäytettiin 1 %:isella SDS:lläja ·:**: levyt luettiin 405 ja 650 nm aallonpituuksilla käyttäen Molecular Devices Vmax ·** ELISA-levylukijaa. Kokeissa paljastui 24 pMDTM-ja 18 pMSTOP-kloonia positii- • · · · , visiksi gp350:n sekreetion suhteen. Kloonit, joissa ELISA-signaali oli voimakkain, ·«» 30 siirrettiin 24-kuoppaisille levyille mittakaavan suurentamista ja edelleen tutkimista varten Western blot -menetelmällä ja radio immunosaostuskokeella.

• · * · · 3. Western blot- ja radioimmunosaostuskoe * · * \* Ensiseulonnassa tutkittiin pMDTM-transfektioista saatuja kudosviljelysupematantte- ja aktiivisuuden kannalta Western blot -menetelmällä. CHO-solujen supernatantit *:··: puhdistettiin 5% SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin nitroselluloosalle yön yli ja tutkit- tiin käyttämällä koettimena anti-gp350-vasta-aineita. Seitsemän pMDTM-kloonia

• M

[ m . todettiin positiivisiksi gp350:n suhteen Western blot -analyysissä.

25 11 8224 pMDTM-klooneja, jotka olivat positiivisia Western blot -kokeessa, tutkittiin edelleen radioimmunosaostuksella gp220:n läsnäolon suhteen. Valittuja transformoituja pMDTM-soluja, pEEl4-vertailusoluja ja GH3A19-vertailusoluja (kuvataan tuon-5 nempana) kasvatettiin yön yli 6-kuoppaisilla levyillä siten, että ne olivat koepäivänä . suunnilleen kolmeneljäsosaltaan yhtyneinä. Kukin kuoppa sisälsi noin 5 x 106 solua. Merkintää varten väliaine poistettiin jokaisesta kuopasta ja korvattiin 0,7 mklla me-tioniinitöntä MEM.ä (10% vasikan sikiön seerumi) +100 pCi" S-metioniiniä. Soluja inkuboitiin 5,5 tuntia 37 °C:ssa ja sitten niitä mikrosentrifugoitiin 4000 kierrok-10 sella minuutissa 5 minuuttia. Homogeeninen gp350-proteiini supernatantissa immu-nosaostettiin lisäämällä 10μ1 Sepharose-Protein A.ta (Sigma) 50% lietteessä ja 20 μΐ monoklonaalista anti-gp350/220:ta (vasta-aine #C65221 M, 100 mg/ml; Biodesign International) ja tärisyttämällä yön yli 4 °C:ssa. Sitten seos pelletoitiin 2000 kierroksella minuutilla, 2 minuuttia huoneenlämpötilassa mikrosentrifugissa ja pestiin neljä 15 kertaa useilla tilavuuksilla fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta. Loppupesun jälkeen kaikki neste poistettiin pelletistä ja korvattiin 50 pklla proteiinigeelinäytepus-kuria. Näytteitä, jotka sisälsivät saostunutta immunokompleksia, keitettiin 5 minuuttia ja ajettiin 5% SDS-PAGE:lla. Immunosaosteita verrattiin kudosviljelysupema-tanttien geelinäytteisiin sekoitettuna 1:1 proteiininäytepuskuriin. Geeli kuivattiin ja 20 autoradiografoitiin Hypertilm β-Maxilla (Amersham).

Kuviossa 3 esitetään radioimmunosaostuksen SDS-PAGE-analyysin autoradiografia- tulokset. Positiivisena verrokkina käytetty solulinja oli GH3A19 (lahjoitus Elliot

Keiffiltä; Whang et ai., 19S7). GH3A19-solut erittävät gp350/220-proteiinin tylpis- . 25 tettyä muotoa, josta puuttuu transmembraani ja C-terminaaliset sytoplasma-alueet.

• · ♦ .'Λ Negatiivisena verrokkina käyttöä varten CHO-soluja transfektoitiin pelkästään * * pEE14-vektorilla ja valikoitiin metioniinisulfoksiminillä rinnan pMDTM-transfek- tion kanssa. Kuviossa 3 supematantit ("S") näkyvät parittomilla numeroilla numeroi- t duilla kaistoilla, vuorotellen immunopresipitaattien ("lp") kanssa, jotka näkyvät pa- .*!.* 30 Tiilisillä numeroilla varustetuilla kaistoilla. Vertailukaistalla 2 saostaminen GH3A19- : : : vertailusoluista tuotti tulokseksi kaksi voimakasta proteiininauhaa suunnilleen 220 ja 350 kD:n kohdalla, osoittaen typistettyjen gp 350-ja gp220-proteiinien silmukointi- • · f **!*’ muunnosten tuotannon noin 1:1 suhteessa. Kuten odotettiin, nämä immunosaostu- ‘ neet nauhat ovat konsentroituneita verrattuna radiomerkittyyn kudosviljelysupema- 35 tanttiin (ei-immunosaostunut näyte) kaistalla 1. Samoin odotetusti negatiivisessa ver- • * rokissa (kaista 4) ei ole nauhoja, koska pEE14-vektori ei sisällä gp350/220-raken-teitä.

• • · · · * • · 26 1 1 8 2 2 4

Immunosaostuksen SDS-PAGE-analyysi pMDTM-kloonien supematanteista kaistoilla 6, 8 ja 10 tuottaa tulokseksi yhden voimakkaan nauhan suunnilleen 350 kD:n kohdalla, saman kuin suuremman molekyylipainon omaavat lajit GH3Äl9-vertailukais-talla 2. Päinvastoin kuin GH3A19-vertailukaistalla kaistoilta 6,8 ja 10 puuttuu kui-5 tenkin toinen voimakas nauha suunnilleen kD 220 kohdalla, vaikkakin kaistalla 8 paljastuu hyvin heikko nauha migratoitumassa hieman pienemmän molekyylipainon kohdalla. Tämä saattaisi edustaa jotakin hajoamistuotetta, kerasaostunutta solutuotet-ta tai pientä määrää gp220-protei inia tuloksena mistranslaatiosta tai jostakin mutaa-tiotapahtumasta, joka palauttaa poistettuja donori-ja akseptorisilmukointikohtia na-10 tiivinukleotidi-tai-aminohapposekvensseihin. Viidessä muussa tutkitussa MDTM-replikaatissa todettiin voimakkaita yksittäisiä nauhoja suunnilleen 350 kD.n kohdalla (tuloksia ei ole esitetty).

On epätodennäköistä, että nauhan täydellinen puuttuminen 220 kD:n kohdalla kais-15 toissa 6 ja 10 johtuu tehottomasta saostumisesta MDTM-supematanteista, koska 35S-merkityllä GH3A19-vertai 1 ukaistalla (2) on helposti nähtävissä nauha 220 kD:n kohdalla. Myös lisäkokeet, joissa käytettiin esimerkin 1 mukaisia pDTM-rakenteita, jotka sisältävät villityypin silmukointikohtia, tuottavat tulokseksi kaksi voimakasta nauhaa 350 ja 220 kD:n kohdalla. Sen vuoksi nämä tulokset osoittavat, että silmukointi-20 kohtien deleetio tuottaa tulokseksi gp350-proteiinin tuotannon ilman gp220-proteiinin tuotantoa.

Tämän homogeenisen gp350-proteiinin, joka on ilmennetty CHO-solulinjoissa tai muissa nisäkäs-tai ei-nisäkässolulinjoissa, mittakaavaa voidaan edelleen suurentaa ja • · *·*·' 25 homogeeninen gp350-proteiinia voidaan eristää ja puhdistaa jo kerran käytetystä, \v solulinjoista peräisin olevasta viljelynesteestä käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä, mukaanlukien sellaiset kuten lektiiniafiiniteettikromatografia, käänteisfaasi-HPLC, ,,*·* FPLC, geelisuodatus ia vastaavat. Katso David, J, Immunol. Methods 108: 231 (1988) ia Madei. Vaccine 10: 777 Π992).

ι’Γ: 30 4. pMDTM-protciinin Northern blot -analyysi . ,·. Tässä kokeessa osoitamme Northern blot -menetelmällä, että MDTM-1 solut valmis- * · · ,···. tavat gp350 RNA:ta, mutta eivät gp220 RNA:ta vahvistaen toisella tasolla, että sil- * · * mukointikohtamutaatiot estävät gp220:n tuotantoa.

• · *. *: 35 gp350:lle komplementaarisia DNA-koettimia valmistettiin pDTM:stä, kts. esimerkki 1. gp350/220-koetintemplaatti, XP464, eristettiin 464 cmäsparin Xhol/Pstl pDTM- a fragmenttina. XP464 tunnistaa sekä gp350:n että gp220:n. gp350-spesifisen koetti- • * 27 1 1 8224 men AN537 valmistamiseksi pDTM leikattiin NcoPlla ja Ndekllä, kaksi päällekkäin menevää 580 emäsparin fragmenttia eristettiin ja tämä seos leikattiin Xmnlllä yhden kontaminoivan palasen eliminoimiseksi ja Alukllä 537 emäsparin AluT/Ndel-frag-mentinjoka oli gp350/220-silmukointikohtien sisällä, saamiseksi. AN537 on spesi-5 finen gp220:stä pois silmukoituneelle alueelle ja siten spesifinen gp350-lähetille. DNA-koettimeia merkittiin 32P-dCTP nick-translaatiolla (Amersham) käyttäen DNA-fragmentteja XP464 ja AN537.

Kokosolu-RNA:ta valmistettiin olennaisesti Chomczyunskin ja Sacchin, Anal 10 Biochem. 162: 156-159 (1987) menetelmän mukaisesti. Elatusliuosta kahdesta T-250-pullosta, joissa kummassakin oli CHO-pEE14-soluja (negatiivinen vcrtailusolu-linja, kts. esimerkki 1), CHO-MDTM-1-soluja ja CHO-DTM-7-soluja, jotka 90-prosenttisesti yhtyivät, imettiin ja solut liuotettiin ja raaputettiin irti denaturoivassa puskurissa (10 ml 4M guanidiinitiosyanaattia, 24 mM natriumsitraattia, pH 7, 0,5% 15 sarkosyyliä, 100 mM 2-merkaptoetanolia). Kuhunkin 10 min lysaattiin lisättiin 1 ml 2M natriumasetaattia, pH 4, 10 ml kyllästettyä fenolia, pH 4,5, ja 2 ml klorofor-mi/isoamyylialkoholia; lysaattia inkuboitiin jään päällä 15 minuuttia, lingottiin keskipakovoimalla 10 000 x g 20 minuuttia 4 °C:ssa ja ylempi vesipitoinen faasi poistettiin. RN A saostettiin vesipitoisesta faasista lisäämällä yksi tilavuus isopropanolia 20 20 °C:ssa 1 tunti, pelletoitiin 4 °C:ssa, suspendoitiin uudelleen denaturoivaan pus kuriin ja saostettiin uudelleen. RNA-pelletti pestiin 1 x 70% etanolissa, kuivattiin Speed-Vac -lait-teella ja lietettiin uudelleen DEPCllä käsiteltyyn veteen.

DTM-7- ja MDTM-1 -kokosolu-RNA:ta denaturoitiin 65 °C:ssa 15 minuuttia 15% 25 formamidissaja 6% formaldehydissä, ajettiin 1% agaroosi/6,6% formaldehydigee- • · ‘4·1 leiliä ja siirrettiin nitroselluloosalle kapillaarimenetelmällä ja tutkittiin käyttäen koet- timena merkittyä XP464:ä ja AN537:ä. DNA-koettimet denaturoitiin keittämällä 5 minuuttia, hybridisoitiin 5 x SSPE:ssä 65%C yön yli ja nitroselluloosa pestiin erit- m .,1·1 täin tarkkaan. Autoradiografia suoritettiin käyttämällä Bio-Rad-fbstbrikuvantamis- i 30 laitetta.

il» ·1 • · · • 1 1 CHO-MDTM-soluista saadun kokosolu-RNA:n Northern blot -tulokset osoittavat . .1. silmukointimutaatioiden tehokkuuden gp220-spesifisen RNA:n tuotannon estämises- sä. gp350-spesifinen koetin, AN537, sitoutui ainoastaan yhteen RNA-lajiin MDTM-35 1 -soluissa ja DTM-7-soluissa (kuvio 4, kaistat 1 ja 2) kuten gp350-spesifiseltä koet- timelta odotettiin. XP464-koetin, joka on spesifinen sekä gp350-RNA:lle että gp220-'i,,: RNA:lle, tunnisti kaksi lajia DTM-7-soluissa ja yhden suuremman molekyylipainon nauhan MDTM-1 -soluissa (kuvio 4, kaistat 4 ja 3), kuten odotettiinkin, mikäli sil- « «M·1 • · 118224 28 mukointimutaatiot estävät gp220-lähetin tuotannon MDTM-1 -soluissa. Vaikka MDTM-1 -kaistat ovat ylikuormitettuja gp350-spesifisellä RNA:lla, mitään selvästi erotetlavaagp220-RNA:taeiolenähtävissä.Syytäeroongp350-lähetinviestinnäen-näisliikkuvuudessa MDTM-1-kaistoissa versus DTM-7-kaistoissa ei tunneta.

5 MDTM-1-laji on ylikuormitettu DTM-7-kaistoihin verrattuna, mikä saattaa vaikuttaa migraatioon geelissä. gp350-viesti juoksee myös lähellä leveää robosomi-RNA-nauhaa geelillä, mikä saattaa väärentää nimellistä molekyylipainoa. Kummassakin tapauksessa yhden gp350-DNA-sekvenssille spesifisen lajin läsnäolo antaa olettaa, että tämä signaali edustaa gp350 mRNA:ta. Mutaatiot donori- ja akseptorisilmukoin-10 tikohdissa estävät siis tehokkaasti gp220-viestin tuotannon Northern blot -tulosten perusteella arvioituna. Tämän tuloksen vahvistaa vielä radioimmunosaostus, jossa käytetään monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä gp350/220:lle, samoin kuin MDTM-1 :n ja DTM-7:n supernatanttien Western blot -tulokset.

15 Esimerkki 4

Homogeenisten gp350-proteiinien tutkiminen immunogeenisen aktiivisuuden kannalta

Puhdistetut homogeeniset gp350-proteiinit sijoitetaan sopiviin vehikkeleihin hiirille antoa varten ja niitä annetaan hiirille seuraavasti.

20

Valmistetaan 2 x adjuvanttivehikkelikonsentraatti sekoittamalla Pluronic L121 :tä ja skvalaania 0,4% (v/v) Tween 80: ssä fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa (Thr1) MDP.hen menettelytavan mukaisesti, iota David kuvaa julkaisussa J. Immunol. Methods 108: 231 (1988) ia Allison julkaisussa J. Immunol. Methods 95: 157 . :‘i 25 (1986).

··· • · • * · * · · * *

Antoa varten tarkoitettu koostumus valmistetaan lisäämällä yhtä suuret tilavuusmää-rät proteiinia ja adjuvanttivehikkeliä antopäivänä. Proteiinipitoisuuden tulisi olla 5 mikrogrammasta 50 mikrogrammaan per annos.

::: 30 • · · * BALB/c-hiiriä immunisoidaan kolmella 0,1 ml:n lihaksensisäisellä injektiolla päivinä . 0,21 ja 42. Ennen immunisointia otettava verinäyte ja peräkkäiset verinäytteet, jotka • « · *««* otetaan 10 päivää kunkin injektion jälkeen, saadaan retro-orbitaalisesta sinuksesta.

♦ · · • * · * :**,· 35 Seerumin vasta-ainetasot määritetään ELISA:lla menetellen esimerkissä 3 kuvatulla « · tavalla. EBV:tä neutraloivien vasta-aineiden määrä seeruminäytteissä määritetään niiden kyvyllä estää EBV:n vaikutuksesta tapahtuvaa napanuoraveren lymfosyyttien * * ; " muuttumista in vitro menetelmillä, joita ovat kuvanneet Moss, J. Gen. Virol. 17: 233 29 118224 (1972) ia De Schrwer. Int, J. Cancer 13: 353 (1974).

Vaihtoehtoisesti Uuden-Seelannin valkoisia kaniineja rokotetaan lihakseen viidellä annoksella proteiinia, joka on emulgoitu edellä mainittuun adjuvanttiin, päivinä 0, 5 21,42, 63 ja 84. Annoksen tulisi olla noin 5 pg - 50 pg per rokotus. Seeruminäytteet otetaan kaksi viikkoa viimeisen annoksen jälkeen ja niiden vasta-ainetiitterit antigeeniä vastaan, ristireaktiivinen vasta-aine virus-gp350/220:lle, joka on peräisin B95-8-soluista,ja in vitro EBV.tä neutraloiva aktiivisuus tutkitaan noudattaen menetelmiä, joita Emini on kuvannut julkaisussa Virology_l66:387 (1988).

10

Koska EBV-gp350/220-proteiinin kyky indusoida suojaava immuniteetti EBV-infektion eläinmallissa on io todettu, kts. Epstein. Clin, Exp. Immunol. 63:485 (1986), odotetaan samanlaisia tuloksia, kun annetaan homogeenistä gp350-proteiini-koostumusta.

15

Kaikkien tässä identifioitujen julkaisujen sisältö sisällytetään nimenomaan tähän viitteinä. Edellä oleva yksityiskohtainen kuvaus esitetään pelkästään keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi eikä siitä tule ymmärtää tai tehdä tarpeettomia rajoituksia, koska alaan perehtyneille muunnokset keksinnön suoja-alaan ovat selviä.

* • · • 1 · ·2 • · ·1! • 1 · * · • · ·1· « •«· · I 1 · i · · ♦»1 *«· • « « I f · • • · It « 0 · «·· *·1 * # · • · · « • · · • M « « t • · 2 » tl • · t ·1 m * · 30 118224

Sekvenssiluettefo

(1) YLEISINFORMAATIO

(i) HAKIJA: Spaete, Richard ja Jackman, Winthrop, T.

5 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: gp350/220:n ei-silmukoivia muunnoksia (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 19 10 (iv) POSTIOSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum (B) KATUOSOITE: 5 Palo Alto Square (C) KAUPUNKI: Palo Alto (D) OSAVALTIO: California

15 (E) MAA: USA

(F) ZIP: 94306 (v) TIETOKONEEELLA LUETTAVA MUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: levyke

20 (B) TIETOKONE: IBM yhteensopiva PC

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patent in Release #1.0, Version #1.25 (vi) TÄMÄNHETKISET HAKEMUSTIEDOT: 25 (A) HAKEMUSNUMERO: 08/229,291 iV: (B) HAKEMUSPÄIVÄ: 18. huhtikuuta 1994 *:1·: (C) LUOKITUS: »1« 17: (viii) ASIAMIEST1EDOT: ,1r1. 30 (A) NIMT: Luann Cserr (B) REKISTERÖINTINUMERO: 31,822

(C) VIITE/AS1ANUMERO: AVIR-003/00US

• 1 · «1· »«1 7 5 (ix) TELEKOMMUNIKAATIO I II DO T: 711 35 (A) PUHELIN: 415-843-5163 *:·1: (B) TELEFAX: 415-857-0663

rl (C) TELEX: 380816 CooleyPA

» 1 · · 31 118224 (2) SEQ ID NO: 1:TÄ KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPT: oligomeeri-DNA

10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1: GGATCCTAGA CTGCGCCTTT AGGCGTA 27 (2) SEQ ID NO:2:TA KOSKEVAT TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPT: oligomeeri-DNA (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: 25 GACTGCGCCT TTAGGCGTA 19 ♦ · » f « * * * ·{**: (2) SEQ ID NO:3:A KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: , .·. (A) PITUUS: 6 aminohappoa j··*; 30 (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen • (ii) MOLEKYYLITYYPPT: proteiini Λ * · tl* * ' i\\ 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: « * *

Asp Cys Ala Phe Arg Arg f ·« 1 5 32 1 1 8224 (2) SEQ TD NO:4:Ä KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligomeeri-DNA

10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: GGATCCTCTG TTCCTTCTGC TCCAGTG 27 (2) SEQ ID NO:5:TÄ KOSKEVAT TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligomeeri-DNA (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: . :*: 25 TCTGTTCCTT CTGCTCCAGT G 21 ► * * t · • * * 12; (2) SEQ ID NO:6:TA KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: j**:. (A) PGUUS: 16 emäsparia 30 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) TOPOLOGIA: tuntematon *

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligomeeri-DNA

• · t · * « * 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: * * · TATAGACTAG TCTAGG 16 m · r *« t - ···· • · 33 Π 8224 (2) SEQ ID NO:7:ä KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon

(ii) MOLEKYYLITYYPPT: oligomeeri-DNA

10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: ATCTGATCAG ATCCTTAA 18 (2) SEQ ID NO:8:A KOSKEVAT TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPT: oligomeeri-DNA (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0.8 25 AACCTCTCCA TGCTAGTACT GGTCATGGCG GACTGCGCC 39 999 • * ^ » t f · · •i»: (2) SEQ ID NO:9:Ä KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: j*/. (A) PITUUS: 13 aminohappoa J*. 30 (B) TYYPPI, aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 9 (ii) MOLEKYYLITYYPPT: proteiini • · · *99 Λ.! 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:9: » f

AsnLeu Ser Met Leu Vai Leu Vai Met AlaAspCys Ala 1 5 10 • 9 34 1 1 8 2 2 4 (2) SEQ TD NO: 10:TÄ KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligomeeri-DNA

10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 10: AACCTCTCCA TGCTATAGAC TAGTTCTAGG 30 (2) SEQ ID NO: ILTA KOSKEVAT TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 5 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ TD NO:ll:

Asn Leu Ser Met Leu . 25 1 5 • * * • * * · (2) SEQ ID NO: 12:TA KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: . (A) PITUUS: 24 emäsparia 30 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen . (D) TOPOLOGIA: tuntematon • · · *··

: (ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligomeeri-DNA

35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 12: • · • * AACCTCTCCA TGCTAGACTG CGCC 24 • * 35 1 1 8224 (2) SEQ ID NO 13. A KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 8 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPT: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 13: 10

Asn Leu Ser Met Leu862 Asp882 Oys Ala • 1 5 (2) SEQ ID NO: 14:Ä KOSKEVAT TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 2° (ii) MOLEKYYLTTYYPPI: oligomeeri-DNA (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 14: 25 GGTCATGTCG GGGGCCTTTG ACTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42 • · * · · * · * • · ·"·: (2) SEQ ID NO: 15:TÄ KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: : (A) PITUUS: 42 emäsparia 30 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen . .·. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · * * * ·· • ·

*\ ‘ (ii) MOLEKYYLTTYYPPI: oligomeeri-DNA

:M 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 15: * * GGTCATGTCG GGGGCCTTAC TTTCTGTGCC GTTGTCCCAT GG 42 * · 36 1 1 8224 (2) SEQ ID N016 TA KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 42 emäsparia 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: oligomeeri-DNA

10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 16: CTGTGTTATA TTTTCACCTC CAGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42 15 (2) SEQ ID NO: 17:Ä KOSKEVAT TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLTTYYPPI: oligomeeri-DNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 17: • * 25 :X: CTGTGTTATA TTTTCACCAC CTGTTGGGTG AGCGGAGGTT AG 42 * • · (2) SEQ ID NO: 18:A KOSKEVAT TIEDOT: : (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: 30 (A) PITUUS: 3833 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . .·. (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon ♦ * · • m

V*: 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(ix) TUNNUSMERKIT:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

37 1 1 8224 (B) SIJAINTI: 1014..3734 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 18: GAATTCCATA aatgaaacac gctggtcagg TGTTAAAACT TCCTCCCAGA TTTTCGTGAG 60 GCTCCTGTGT ATAGCCATÄT agtcaaagaa aatactgtag cggggattac AGCTCTGTAC 120 AATGTTACCC ACGGAGCTCT GAACATACAA CCACTGGCGA TCCCCGGGGG TACATCGCGG 180 CAGCTTAAAG GTGCCGGCGG AAAAGGTCAC GTGACACCTA CGGCCACCTG TGCACCCAAG 240 TGTCGCCTGG AGATGTACGA ATGTGGGAGT CGTCTGGTGA TCGGTGTAGC TGTACATCCA 300 GCTGCTGTAT GCCTGGTAAC CCATAGGCCA TCCGGCGGCC AGGGTTTGCA GTCTCCATTT 380 GGCCTGATCT CTACGAGAAG CTGGATTTCT CCGACGATCT CTAATGGCCT GTCGAATGGC 420 CATGGCATAC ATTATGTACA TCTCGGTATT TGAAATCTGG ATCCGAAAAA CTGGTCTATG 480 GCTCGTGTGT CGATGCGCTG AAACCAACGG CAACAAATTA CTTACCTTGT TGTTGTGTGA 540 TGGGTAAAAA CACACATCAC ACACTTAGGC CATAGGGATG CTCACCGTAG CCGCGGCTCC 600 AATCGCTTGA AGAAGTGTTC TTAGATCTAG TGGAAACCTG CGGAGAATGG CTTCTCGCCC 660 AGGGAGATCC GGCTGGGGTG GGAGCATGGG TCGTGCTGGA GCTGACCCAC CGGCATCATG 720 ATCGACCCGC TTTCTCTTCG TACCCTTCTG GGCCGGCTCC AGGTGGGCAT CTTCTGCTTC 780 ·*; CTTXTCTGAG CTGCTATCTG ATAACTCTAT GAGGACATTT TCCCAATCTC CCGCCGATAC 840 *•1 • · "·. V CTGTTCCTGC ACAACCGAGG TAGATGGGAC TTCTTCTTCC ATGTTGTCAT CCAGGGCCGG 300 ....: , GGGACCCGGC CTGTCCTTGT CCATTTTGTC TGCAACAAAA GTGTGACTCA CCAACACCGC 960 • * * * · « · . ACCCCCCTTG TACCTATTAA AGAGGATGCT GCCTAGAAAT CGGTGCCGAG ACA ATG 1018 * · * : *** Mec * * * til i * GAG GCA GCC TTG CTT GTG TGT CAG TAC ACC ATC CAG AGC CTG ATC CAT 1064 : : Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gin Tyr Thr lie Gin Ser Leu lie Hie ·**. 5 10 15 ··· *·*.· • * * t · • · · ♦ * a ···«* • · * * * · ; a·*·.·· * ***··· • * 38 1 1 8 2 2 4 CTC ACG GOT GAA GAT CCT GGT TTT TTC AAT GTT GAG ATT CCG GAA TTC 1112

Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Vai Glu He Pro Glu Phe 20 25 30 CCA TTT TAC CCC ACA TGC AAT GTT TGC ACG GCA GAT GTC AAT GTA ACT 1160

Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Vai Cys Thr Ala Asp Vai Asn Val Thr 3S 40 45 ATC AAT TTC GAT GTC GGG GGC AAA AAG CAT CAA CTT GAT CTT GAC TIT 1208

He Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gin Leu Asp Leu Asp Phe 50 55 60 65 GGC CAG CTG ACA CCC CAT ACG AAG GCT GTC TAC CAA CCT CGA GGT GCA 1256

Gly Gin Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gin Pro Arg Gly Ala 70 75 80 TTT GGT GGC TCA GAA AAT GCC ACC AAT CTC TTT CTA CTG GAG CTC CTT 1304

Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu Leu 85 90 95 GGT GCA GGA GAA TTG GCT CTA ACT ATO CGG TCT AAG AAG CTT CCA ATT 1352

Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro He 100 105 110 AAC GTC ACC ACC GGA GAG GAG CAA CAA GTA AGC CTG GAA TCT GTA GAT 1400

Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gin Gin Val Ser Leu Glu Ser Val Asp 115 120 125 GTC TAC TTT CAA GAT GTG TIT GGA ACC ATG TGG TGC CAC CAT GCA GAA 1448 , Val Tyr Phe Gin Asp Val’Phe Gly Thr Met Trp Cys Hie His Ala Glu ·.·,· 130 135 140 145 • · • · · • · * ATG CAA AAC CCC GTG TAC CTG ATA CCA GAA ACA GTG CCA TAC ATA AAG 1496 ***** Met Gin Asn Pro Val Tyr Leu He Pro Glu Thr Val Pro Tyr He Lye .:. ISO 155 160 • ... ····..: f · TGG GAT AAC TGT AAT TCT ACC AAT ATA ACG GCA GTA GTG AGG GCA CAG 1544 • · · .

·;·. Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn lie Thr Ala Val Val Arg Ala Gin ·’ 165 170 175 • GGG CTG GAT GTC ACG CTA CCC TTA AGT TTG CCA ACG TCA GCT CAA GAC 1592 ♦ · · *·!·" Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gin Asp 180 185 190 • » * * * • * * » · * s' • · * » ···'· * * * 39 1 1 8224 TCG AAT TTC AGC GTA AAA ACA GAA ATG CTC GOT AAT GAG ATA GAT ATT 1640

Ser Αεη Phe Ser Val Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu lie Asp lie 195 200 205 GAG TGT 7"T ATG GAG GAT GGC GAA ATT TCA CAA GTT CTG CCC GGA GAC 1688

Glu Cys *_e Met Glu Asp Gly Glu lie Ser Gin Val Leu Pro Gly Asp 210 215 220 225 AAC AAA TTT AAC ATC ACC TGC AGT GGA TAC GAG AGC CAT GTT CCC AGC 1736

Asn Lys Phe Asn lie Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro Ser 230 235 240 GGC GGA ATT CTC ACA TCA ACG AGT CCC GTG GCC ACC CCA ATA CCT GGT 1784

Gly Gly lie Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro lie Pro Gly 245 250 255 ACA GGG TAT GCA TAC AGC CTG CGT CTG ACA CCA CGT CCA GTG TCA CGA 1832

Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser Arg 260 265 270 TTT CTT GGC AAT AAC AGT ATC CTG TAC GTG TTT TAC TCT GGG AAT GGA 1880

Phe Leu Gly Asn Asn Ser lie Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn Gly 275 280 285 CCG AAG GCG AGC GGG GGA GAT TAC TGC ATT CAG TCC AAC ATT GTG TTC 1928

Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gin Ser Asn He Val Phe 290 295 300 305 TCT GAT GAG ATT CCA GCT TCA CAG GAC ATG CCG ACA AAC ACC ACA GAC 1976 ,·. Ser Asp Glu He Pro Ala Ser Gin Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr Asp *·:·* 310 315 320 * · » · » • * * • ♦ ATC ACA TAT GTG GGT GAC AAT GCT ACC TAT TCA GTG CCA ATG GTC ACT 2024

He Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val Thr *i* 325 330 335 9 9*· e «e * '··** TCT GAG GAC GCA AAC TCG CCA AAT GTT ACA GTG ACT GCC TTT TGG GCC 2072 • e · t : Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp Ala 340 345 350 ; : Ϊ TGG CCA AAC AAC ACT GAA ACT GAC TTT AAG TGC AAA TGG ACT CTC ACC 2120 • · *

Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lye Cys Lys Trp Thr Leu Thr V 355 360 365 • a « e * e • · * e · 9 »·«»« * · 9 « 9 9 «99 9 9 9*199 • 9 40 1 1 8224 TCG GGG ACA CCT TCG GGT TGT GAA AAT ATT TCT GGT GCA TTT GCG AGC 2168

Ser Gly Thr Pro ser Gly Cys Glu Asn He Ser Gly Ala Phe Ala Ser 370 375 380 385 AAT CGG ACA TTT GAC ATT ACT GTC TCG GGT CTT GGC ACG GCC CCC AAG 2216

Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro Lye 330 335 400 ACA CTC ATT ATC ACA CGA ACG GCT ACC AAT GCC ACC ACA ACA ACC CAC 2264

Thr Leu He He Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr His 405 410 415 AAS GTT ATA TTC TCC AAG GCA CCC GAG AGC ACC ACC ACC TCC CCT ACC 2312

Lys Val He Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro Thr 420 425 430 TTG AAT ACA ACT GGA TTT GCT GAT CCC AAT ACA ACG ACA GGT CTA CCC 2360

Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu Pro 435 440 445 AGC TCT ACT CAC GTG CCT ACC AAC CTC ACC GCA CCT GCA AGC ACA GGC 2408

Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr Gly 450 455 460 465 CCC ACT GTA TCC ACC GCG GAT GTC ACC AGC CCA ACA CCA GCC GGC ACA 2456

Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly Thr 470 475 480 ACG TCA GGC GCA TCA CCG GTG ACA CCA AGT CCA TCT CCA TOG GAC AAC 2504

Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp Asp Asn . ί1ί 485 430 435 ft f 1 f · '**·1 GGC ACA GAA AGT AAG GCC CCC GAC ATG ACC AGC TCC ACC TCA CCA GTG 2552 ·;·1: Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser Pro Val . 500 505 510 «41 ft ft ft ft 1 • ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC 2600 ΐο Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr * 515 520 525 . CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC 2648 *,·,1 Pro Thr pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr Pro Thr .·1.·. 530 535 540 545 ft ft · ft • ft ft ft 1 • ft 1 • 1 ft - ft · ‘ « ft ft * ft ft ·1 * ft ♦ 41 1 1 8224 CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GOA AAA ACA AGT CCT ACC TCA GCA 2696

Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala 550 555 560 GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA 2744

Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr 565 570 575 AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC 2792

Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro 580 585 590 ACC TTG GGA AAA ACA AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA 2840

Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro 595 600 605 AAT GCC ACC GGC CCT ACT GTG GGA GAA ACA AGT CCA CAG GCA AAT GCC 2888

Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gin Ala Asn Ala 610 615 620 625 ACC AAC CAC ACC TTA GGA GGA ACA AGT CCC ACC CCA GTA GTT ACC AGC 2936

Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr Ser 630 635 640 CAA CCA AAA AAT GCA ACC ACT GCT GTT ACC ACA GGC CAA CAT AAC ATA 2984

Gin Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gin His Asn lie 645 650 655 ACT TCA AGT TCA ACC TCT TCC ATG TCA CTG AGA CCC AGT TCA AAC CCA 3032 , Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn Pro 660 665 670 • · ♦ · · ****, GAG ACA CTC AGC CCC TCC ACC AGT GAC AAT TCA ACG TCA CAT ATG CCT 3080 ***** Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His Met Pro .:. 675 680 685 «··· ♦ TTA CTA ACC TCC GCT CAC CCA ACA GGT GOT GAA AAT ATA ACA CAG GTG 3128 ···, Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn lie Thr Gin Val ·* 690 695 700 705 .·, ACA CCA GCC TCT ATC AGC ACA CAT CAT GTG TCC ACC AGT TCG CCA GAA 3176 **·· Thr Pro Ala Ser lie Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro Glu 710 715 720 • · • · · ·· *! ····« • · « · ··*♦· • · 42 118224 CCC CGC CCA GGC ACC ACC AGC CAA GCG TCA GGC CCT GGA AAC AGT TCC 3224

Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gin Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser Ser 725 730 735 ACA TCC ACA AAA CCG GGG GAG GTT AAT GTC ACC AAA GGC ACG CCC CCC 3272

Thr Ser Thr Lys Pro Gly Glu Vai Asn Vai Thr Lys Gly Thr Pro Pro 740 745 750 CAA AAT GCA ACG TCG CCC CAG GCC CCC AGT GGC CAA AAG ACG GCG GTT 3320

Gin Asn Ala Thr Ser Pro Gin Ala Pro Ser Gly Gin Lys Thr Ala Vai 755 760 765 CCC ACG GTC ACC TCA ACA GGT GGA AAG GCC AAT TCT ACC ACC GGT GGA 3368

Pro Thr vai Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly Gly .770 775 780 785 AAG CAC ACC ACA GGA CAT GGA GCC CGG ACA AGT ACA GAG CCC ACC ACA 3416

Lys His Thr Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr 790 795 800 GAT TAC GGC GGT GAT TCA ACT ACG CCA AGA CCG AGA TAC AAT GCG ACC 3464

Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Thr Pro Arg Pro Arg Tyr Asn Ala Thr 80S 810 815 ACC TAT CTA CCT CCC AGC ACT TCT AGC AAA CTG CGG CCC CGC TGG ACT 3512

Thr Tyr Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser Lys Leu Arg Pro Arg Trp Thr 820 825 830 . TTT ACG AGC CCA CCG GTT ACC ACA GCC CAA GCC ACC GTG CCA GTC CCG 3560

Phe Thr Ser Pro Pro Vai Thr Thr Ala Gin Ala Thr Vai Pro Vai Pro 835 840 845 * * · • · *i'*! CCA ACG TCC CAG CCC AGA TTC TCA AAC CTC TCC ATG CTA GTA CTG CAG 3608 .!. Pro Thr Ser Gin Pro Arg Phe Ser Asn Leu Ser Met Leu Vai Leu Gin ·"·, 850 8SS 860 865 « ♦ * • « · • · · TGG GCC TCT CTG G CT GTG CTG ACC CTT CTG CTG CTG CTG GTC ATG GCG 3656 • · · * Trp Ala Ser Leu Ala Vai Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Vai Met Ala , 870 875 880 • · · *···* GAC TGC GCC TTT AGO CGT AAC TTG TCT ACA TCC CAT ACC TAC ACC ACC 3704 *♦*.·· ti! Asp Cys Ala Phe Arg Arg Asn Leu Ser Thr Ser Kis Thr Tyr Thr Thr * 885 890 895 • · • * · « · · * CCA CCA TAT GAT GAC GCC GAG ACC TAT GTA TAAAGTCAAT AAAAATTTAT 3754 *’’ * Pro Pro Tyr Asp Asp Ala Glu Thr Tyr Vai

..* 900 90S

e ♦ • ·· TAATCAGAAA TTTGCACTTT CTTTGCTTCA CGTCCCCGGG AGCGGGAGCG GGCACGTCGG 3814 GTGGCGTTGG GGTCGTTTG 3833 43 1 1 8224 (2) SEQ ID NO: 19:Ä KOSKEVAT TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 907 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 19 10

Met Glu Ala Ala Leu Leu Vai Cys Gin Tyr Thr Ile Gin Ser Leu Ile 1 5 10 IS

His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Aan Vai Glu Ile Pro Glu 20 25 30

Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Vai Cys Thr Ala Asp Vai Asn Vai 35 40 45

Thr Ile Asn Phe Asp Vai Gly Gly Lys Lys Kis Gin Leu Asp Leu Asp 50 SS 60

Phe Gly Gin Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Vai Tyr Gin Pro Arg Gly 65 70 75 80

Ala Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu 85 90 95 ♦ * • * · «»· •t·, Leu Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro '*'** 100 10S 110 «M*· . Ile Asn Vai Thr Thr Gly Glu Glu Gin Gin Vai Ser Leu Glu Ser Vai « * * * ...t 115 120 125 * I * * % * · .

’V, Asp Vai Tyr Phe Gin Asp Vai Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala *.· * 130 135 140 , Glu Met Gin Asn Pro Vai Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Vai Pro Tyr Ile 1« 150 155 160 • · · » » * « I » *. Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Vai Vai Arg Ala .*·4· 165 170 175 • ♦ e **" · Gin Gly Leu Asp Vai Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gin 180 185 190 * * f ··

Asp Ser Asn Phe Ser Vai Lys Thr Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp 195 200 205 44 1 1 8224

Ile Glu Cys He Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gin Val Leu Pro Gly 210 215 220

Asp Asn Lye Phe Asn He Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro 225 230 235 240

Ser Gly Gly lie Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro He Pro 245 2S0 255 'l

Gly Thr Gly Tyr Ala lyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser 260 265 270

Arg Phe Leu Gly Asu Asn Ser He Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn 275 280 28S

Gly Pro Lye Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys He Gin Ser Asn He Val 290 295 300

Phe Ser Asp Glu He Pro Ala Ser Gin Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr 305 310 315 320

Asp He Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val 325 330 335

Thr Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp 340 345 350

Ala Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu 355 360 36S

Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn He Ser Gly Ala Phe Ala 370 375 380 · · u · • ^ « Ser Asn Arg Thr Phe Asp He Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro 385 390 39S 400 • «

Lys Thr Leu He He Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr , 40S 410 41S

1 : : His Lys Val He Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro 420 425 430 Ϊ Thr Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu «· * ··, 435 440 445 • ft t ft ft · * / . Pro Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr 450 455 460 -t · . Gly Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly 465 470 47S 480 ft • · ' 45 118224

Thr Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp Asp 485 490 495

Asn Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser Pro 500 505 510

Val Thr Thr Pro Thr Pro Ann Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr SIS 520 S2S

Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr Pro 530 535 540

Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lye Thr Ser Pro Thr Ser 545 550 555 560

Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lye 565 570 575

Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser 580 585 590

Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr 595 GOO 60S

Pro Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu Thr Ser Pro Gin Ala Asn 610 615 620

Ala Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr 625 630 635 640

Ser Gin Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Vai Thr Thr Gly Gin His Aan , 645 650 655 » · • t · <1·1 /.1, He Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn *·1'1 660 665 670 • · ,i. Pro Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His Met **· 675 680 685 < til . · ··1 j1J1. Pro Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn He Thr Gin ·' 1 690 695 700 % t1t Val Thr Pro Ala Ser He Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro *·ϊ·1 70S 710 715 720 9 4 · ' Glu Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gin Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser :\i 725 730 735 » » «

Ser Thr Ser Thr Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro ;·, 740 745 750 4 4· ♦ t ; · 1 · · • f 46 1 1 8224

Pre Gin Asn Ala Thr Ser Pro Gin Ala Pro Ser Gly Gin Lys Thr Ala 7S5 760 76S

Vai Pro Thr Vai Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly 770 775 780

Gly Lys His Thr Thr Gly Hie Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr 785 790 795 800

Thr Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Thr Pro Arg Pro Arg Tyr Asn Ala 805 810 815

Thr Thr Tyr Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser Lys Leu Arg Pro Arg Trp 820 825 830

Thr Phe Thr Ser Pro Pro Vai Thr Thr Ala Gin Ala Thr Vai Pro Vai 835 840 845

Pro Pro Thr Ser Gin Pro Arg Phe Ser Asn Leu Ser Met Leu Vai Leu 850 855 860

Gin Trp Ala Ser Leu Ala Vai Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Vai Met 865 870 875 880

Ala Asp Cys Ala Phe Arg Arg Asn Leu Ser Thr Ser Kis Thr Tyr Thr 885 890 895

Thr Pro Pro Tyr Asp Asp Ala Glu Thr Tyr Vai 900 90S

• « • e e * 1 1 * · • · · • · 1 »e * • · ·· · • · · · • · · ♦ · · • 1 e *· • « · * · · * · e • e e * 1 1 • 1 1 ♦ • · · • 1 1 * · ♦ • · • · • · • · ·

Claims (20)

118224

1. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa joko EBV gp350-proteiinia tai typistettyä muotoa EBV gp350:stä, josta typistetystä muodosta on poistettu osa tai 5 koko kalvovälialue, osa tai koko kalvovälialue ja osa tai koko jäljellä oleva karbok-syylipää ja/tai osa tai koko signaalisekvenssi, joka mainittu DNA-sekvenssi on muunnettu yhden tai useamman silmukointikohdan osalta siten, että gp220 mRNA:n transkriptin muodostuminen estetään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, jossa DNA koodaa EVB 10 gp350:n typistettyä muotoa, jonka kalvovälialueen aminohapoista vähintään 8 on poistettu.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, joka koodaa EBV gp350:n typistettyä muotoa, josta on poistettu aminohapot väliltä Met86i~Ala88i, kuten kuvassa 1 on esitetty (SEQ ID. NO 18).

4. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen DNA-sekvenssi, jossa mainit tu muunnos yhdessä tai useammassa silmukointikohdassa sisältää muunnoksen do-norin silmukointikohdassa.

• ;*· 5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen DNA-sekvenssi, jossa mainit- * · · . tu muunnos yhdessä tai useammassa silmukointikohdassa sisältää muunnoksen ak- * * 20 septorin silmukointikohdassa. • · ...T

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-sekvenssi, jossa vähintään yksi natiivi • _ nukleotidi joka koodaa SEQ E) NO 18:n kodonissa 501 sijaitsevaa seriiniä, on kor- : : vattu ei-natiivilla nukleotidilla ja jossa vähintään yksi natiivi nukleotidi, joka koo daa SEQ ID NO 18:n kodonissa 698 sijaitsevaa glysiiniä, on korvattu ei-natiivilla 25 nukleotidilla.

* * * * • * · • · ’·”* 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, jossa DNA koodaa samaa : aminohapposekvenssiä, joka on valittu ryhmästä: • · · . • · ·;· a) SEQ ID NO: 18:nkodonit 19-862 •‘.‘0 b) SEQ ID NO: 18:n kodonit 1-862 30 c) SEQ ID NO: 18:n kodonit 19-862 ja 882-907; ja d) SEQ ID NO: 18:n kodonit 1-862 ja 882-907 118224

8. Jonkin edeltävän vaatimuksen mukainen DNA-sekvenssi, jossa muunnos yhdessä tai useammassa silmikointikohdassa ei aiheuta muutosta DNA-sekvenssin koodaamaan aminohapposekvenssiin.

9. Jonkin vaatimuksista 1-7 mukainen DNA-sekvenssi, jossa muunnos yhdessä 5 tai useammassa silmikointikohdassa aiheuttaa muutoksen DNA-sekvenssin koodaamaan aminohapposekvenssiin.

10. Vaatimuksen 9 mukainen DNA-sekvenssi, jossa muutos aminohappo-sekvenssissä on konservatiivinen.

11. Vektori, joka sisältää jonkin edeltävän vaatimuksen mukaisen DNA-10 sekvenssin.

12. Isäntäsolu, joka on transformoitu jonkin vaatimuksen 1-10 mukaisella DNA- sekvenssillä ja joka on operatiivisesti liittynyt ilmentämistä säätelevään sekvenssiin, joka pystyy ohjaamaan mainitun DNA-sekvenssin replikoitumista ja ilmentymistä.

13. Vaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu on eukaryoottisolu.

14. Vaatimuksen 13 mukainen isäntäsolu on hyönteis-tai nisäkässolu.

15. Vaatimuksen 14 mukainen isäntäsolu on nisäkässolu.

# 16. Menetelmä, jossa jonkin vaatimuksista 12-15 mukaista isäntäsolua kasvatetaan Vl sopivassa viljelyalustassa ja mainittu proteiini gp350 eristetään mainitusta solusta • * · tai viljelyalustasta. • · ··· 20

17. Vaatimuksen 16 mukainen menetelmä, jossa lisäksi mainittu gp350-proteiini • ;*. sekoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan.

• * * * · · * · · *·* * 18. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää jonkin vaatimuksista 1-10 mukaisen homogeenisen, glykosyloidyn EBV gp350-proteiinin, josta proteiinista kalvoväli- : '·· alue on poistettu osin tai kokonaan, sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään • * * 25 kantajaan, joka koostumus ei olennaisesti sisällä proteiinia gp220.

* · * · · :·· ‘ 19. Vaatimuksen 18 mukainen koostumus, jossa myös EBV gp350-proteiinin jäl- jellä oleva karboksyylipää on osin tai kokonaan poistettu.

* · • * · **\ 20. Vaatimuksen 19 mukainen koostumus, jossa EBV gp350-proteiinista on pois tettu aminohapot 863-907 kuvion 1 osoittamalla tavalla (SEQ ID NO 18). 118224