UA47403C2

UA47403C2 - Виділений фрагмент днк, що кодує білок gp350 ebv або усічений варіант gp350 ebv, вектор, клітина-хазяїн, трансформована вектором, спосіб одержання білка gp350, гомогенний білок gp350 ebv, фармацевтична композиція, спосіб профілактичного лікування пов'язаного з ebv захворювання або стану (варіанти), композиція, яка містить гомогенний gp350 ebv

Info

Publication number: UA47403C2
Application number: UA96114355A
Authority: UA
Inventors: Річард Спаєт; Вінтроп Т. Джекмен
Original assignee: Авірон
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2002-07-15
Also published as: CA2187908A1; FI118224B; JP3447743B2; NO964431D0; JP2004290199A; SK283446B6; US6054130A; EP0769056A1; CA2187908C; JP4317786B2; EP0769056B1; LV11803A; TW496897B; JP2005333990A; HU221647B1; RU2178807C2; JP2003230396A; CZ305496A3; CN1495262A; DE69524415D1

Abstract

Заявлений фрагмент ДНК, що кодує білок gp350 EBV або усічений варіант gp350 EBV, а також вектор і клітини, що містять цей фрагмент. Запропоновано також спосіб отримання гомогенного білка gp350 EBV, фармацевтична композиція, що містить цей білок і спосіб профілактичного лікування пов‘язаних з EBV захворювань і станів.

Description

Опис винаходу

Вирус Зпштейна-Барра (Ерзіеіп-Вагт - ЕВУМ), член группь! герпесвирусов, вьізьівает у людей инфекционньй 2 мононуклеоз. Зто заболеваниє поражаєт более чем 9095 населения. Аналитики здравоохранения оценивают потери, связаннье с зтим заболеванием в Соединенньїх Штатах, в 100 миллионов долларов ежегодно. Зтот вирус распространяется преимущественно капельньїм путем со слюной индивидуумов, распространяющих зтот вирус. Дети, инфицированнье ЕВМ, в большинстве случаев асимптотичньі или у них очень слабье симптомь, тогда как у подростков или у взросльх при инфицирований развиваются типичнье инфекционнье 70 мононуклеозьі, характеризующиеєся лихорадкой, фарингитами и аденопатией. У людей, которье бьли инфицированьії, анти-ЕВМ антитела сохраняются в течение всей остальной жизни, и позтому они имеют иммунитет к последующим инфекциям. В настоящее время не существует коммерчески доступньїх ЕВМ вакцин.

Помимо своих инфекционньїх характеристик, бьіло показано, что ЕВМ трансформирует лимфоцить в бьістро делящиеся клетки, и позтому косвенньім образом связан с различньіми лимфомами, включая лимфому Вигкіцв 19 или оральную волосистую лейкоплакию. ЕВМ бьли также обнаруженьі в образцах тканей от индивидуумов с назофарингеальньми опухолями. По всему миру насчитьівается порядка 80000 случаев рака носоглотки, и он превалирует у зтнических китайцев.

Разработка живой, ослабленной вакциньії для ЕВМ бьла и остаєтся серьезной проблемой. з-за потенциального онкогенного характера, связанного с ЕВМ, исследователи возражали против использования подходов, связанньїх с живьіми вакцинами. Зто изобретениє позволяєт преодолеть проблемь!, связаннье с живьіми вакцинами, за счет создания способов и композиций для субьединичньїх вакцин, которне не требуют использования потенциально онкогенньїх живьїх вирусов. Субьединичная вакцина представляет собой один или более из антигенньїх протеинов из вируса, которніе вьізовут иммунную реакцию и виіработают иммунитет.

Два из найболее важньїх антигенньх ЕВМ протеинов являются гликопротеинами др3і50/300 и др220/200, с 22 которне образуют часть оболочки вирусной мембраньй и позволяют вирусньмм частицам связьваться с Го) мишеневьми клетками человека и проникать в них за счет взаймодействия с протеином клеточньїх мембран,

СО21. См. Метегому, У). Мігоїоду 61 : 1416 (1987). Они бьіли давно отмеченьї как кандидать! для субьединичньх вакцин, но трудности в получениий антигенно активного протеина, вьіделенного из природньїх источников, и низкие вьїходьі гликопротеинов при получений их из рекомбинантньх источников затруднят и попьїтки о исследователей й разработку вакцин. В литературе указано, что зти протеиньї имеют различнье интерваль «3 молекулярньїх весов (350 или 300 килодальтон /кД/ для одного из протеинов и 220 или 200 килодальтон для другого протеина). Здесь протеин ор35О или 300 именуется как др35О, а протеин 220 или 200 здесь З обозначаєтся как протеин др220. В целом оба зти протеина здесь обозначают как ор350/220 протеин ча (протейнь)). 3о Альтернативно сплайсированньій, отдельньій ген кодирует д9р350/220 протеиньі и приводит к созданию З араБо и др220 мРНК транскриптов; причем неизвестньі природнье варианть! сайтов сплайсинга гена др350/200.

Геннье продуктьі двух продуктов зкспрессии представляют собой орЗзбБО и одр220 протеиньі. Открьтая считьявающая рамка для 9р350/220 ДНК последовательности составляет 2721 пару оснований (рр). Вся « считьявающая рамка кодирует 907 аминокислот др350. См. патент США Мо 4707358, вьіданньй Кіеї (1987). - 50 Сплайсированньій вариант считьівающей рамки охватьмвает 2130 оснований и транслирует в др220 протеин с последовательность 710 аминокислот. Теоретический молекулярньй вес др3і3Б5БО протеина и одр220 протеина

Із» составляет 95 кД и 70 кД, соответственно. Измереннье молекулярнье веса зкспрессированньїх др350 протеина и ар220 протеина варьируются, но составляют примерно 350 килодальтон и 220 килодальтон, соответственно.

Интенсивное гликозилирование протеийнов ответственно за различия между предсказанньм и реальньм молекулярньми весами. В каждой из отдельньх клеток оба протеина, 9р350 и др220, продуцируются в шк молярном отношений от около 6 : 1 до 1 : 1. Так, например, в клетках В95-8, которье устойчиво инфицировань -І ЕВМ, зто отношение, по-видимому, варьируется, но иногда достигает значений б : 1. См. МіПег, Ргос. Маї).

Асад. Зсі 69 : 383 (1972). е Аналогично, рекомбинантное получение зтих гликопротеинов позтому обьічно приводит к смеси орзбо и ав! 20 др220 протеинов. До сих пор др350/220 протеиньі зкспрессировали в клетки крьісиного гипофиза, в клетки яичников китайского хомяка МЕКО, почек африканской зеленой обезьяньі, а таюже в дрожжевье клетки. См. с» УУпапа, 9. Мігої. 61 : 1796 (1982), Мої7, Сепе 44 : 353 (1986) и Етіпі Мігоїюду 166 : 387 (1988). Система зкспрессии вируса бьічьей папилломь! бьіла использована для получения др350/220 протеийнов в мьІшиньмх фибробластньїх клетках. См. Маде), Массіпе 10 : 777 (1992). Лабораторнье и вакциннье штаммь!ї вакцинного 29 вируса также бьіли использованьі! для зкспрессии др350/220 протеинов. Модифицированнье рекомбинантнье

ГФ) варианть ЕВМ др350/220 ДНК и протеин известньі специалистам. Более конкретно, бьіли сконструировань рекомбинантнье усеченнье конструкциий оріЗБ50/220 гена, не содержащие соединяющих с мембраной о последовательностей. Такие конструкции все еще продуцируют смесь двух др350 и др220, но делеция участка связьувания с мембраной допускает секрецию протейина. См. Ріпепу, у. (зеп. Мігоїюсду 73 : 449 (1992) и Мавде| у. 60 Массіпе 10: 777 (1992). Кроме того, бьли таюке полученьії различнье рекомбинантно полученнье рестрикционнье фрагменть и протеиньі! слияния, содержащие различнье др3іб50/220 последовательности, и они бьіли зкспрессировань в Е. соїї. См. ЕР патентную публикацию 0173254, опубликованную 24 июля 1991 г.

Соответственно, исследования ЕВУ, касающиеся др350/220 до настоящего времени бьіли сфокусировань на получениий зффективной зкспрессии нативной одр350/220 последовательности или на модифицированной бо последовательности, не содержащей трансмембранного домена, что приводило к получению смеси двух альтернативно сплайсированньх вариантов нативного, или не содержащего трансмембранного домена протеина, или на получений последовательностей зпитопного фрагмента в р-галактозидазньх протеинах слияния.

Известньї частично очищеннье препаратьі одр350/220. См. Ріпепу, у. Сеп. Мігоіїсду 73 : 449 (1992) (рекомбинантно полученьї, частично очищень!). Что касается нативного др350/220 протейина, то в большинстве случаев процесс очистки протейнов приводит к инактивированию антигенности протеина, что делает неприемлемьм его использование в субьединичной вакцине. Однако, вьісокой степени очистки препарать антигенно активного 9р350 протеина из нативньїх (т. е. не рекомбинантньїх) источников, все-таки бьли 7/0 полученьі, как сообщалось в литературе. См. Юамід, У. Іттипо! Ме(йодз 108 : 231 (1988). Кроме того, вирус рекомбинантной вакцинь), зкспрессирующий одр350/220 протеин, бьл использован для вакцинации хлопчатникового тамарина против индуцированной ЕВМ лимфомь!. См. У. Меа. Мігоіоду 25 : 189 (1988), Маскей,

ЕМВО .). 4:3229 (1985) и МасКей, МАССІМЕЗ 86, рр 293 (ІГегпег КА, Спапоск КМ, Вгом/п Е Едз 1986, Соїа Зргіпд

Нарог І арогайогу). Однако, до сих пор не бьіла сконструирована вирусная др350/220 ДНК последовательность с 75 тем, чтобьі обеспечить зкспрессию отдельно одного или другого сплайсированного варианта гена, что обеспечило бь продуцирование чистого одр35О или др220 протеина. Не бьли также сконструировань рекомбинантнье или мутантнье вирусь, которьіе зкспрессировали бь! тот или иной из дрз35о и др220 протеинов.

Обьічно сплайсинговье сайть! облегчают процессинг пре-МРНК молекул в мРНК. В вирусе полиомь! сайть! сплайсинга необходимь! для зффективного накопления последующих мРНК. Изменение 3 и 5' сплайсинговьсх го сайтов в транскриптах вируса полиомьі снижаєт или полностью блокируеєет накопление мРНК. См. Тгеівтап

Маїцге 292 : 595 (1981). В вирусе 5М40 иссекаемье интроньі облегчают транспорт мРНК из ядер и мРНК стабилизацию в ядрах, и так как зти интрон/зкзон соединяющие последовательности облегчают связьівание мелких ядер, КМР частиц, считают, что пресплайсированная мРНК может оказаться не в состоянии нужньім образом включаться в схему процессинга. Бьіло показано, что точечнье мутации по сайтам сплайсинга с

Зкзон/интрон уменьшают расщепление зкзон/интрон и могут нарушить пре-мРНК про-цессинг, ядерньй транспорт и стабильность. См. Куй, у. Мігоїюду 63 : 4386 (1989) и ОСговзв, Майшге 286 : 634 (1960). Позтому до о настоящего изобретения влияние модификации сайтов сплайсинга на функциональную зкспрессию и антигенную активность протеийнов, кодируемьїх ЕВМ арзБ50/220 последовательностью, бьло совершенно неизвестно и непредсказуемо. со

Дополнительная известная по данному вопросу литература включаєет следующее. ЕВМ биология и заболевание в общем плане приведень! в обзоре 5ігацв, АппаїЇ ої Іпі. Меа. 118 : 45 (1993). Описание ЕВМ ВІЇ РІ - открьїтой считьвающей рамки приведено у Ваег, Маїшге 310 : 207 (1984). Описание ДНК и аминокислотньх -«ф последовательностей др350/220 вируса Зпштейн-Барра приведень! в статье Веїзеї, У). Мігоїсду 54 : 665 (1985) и

Віддіпй, ЕМВО 3. З : 1083 (1984) и в патентах США Мо 4707358, вьіданньїх Кіеїї ебаі (1987). Сравнение ДНК в последовательностей, кодирующих 9р350/220 в вирусах Зпштейн-Барра типов А и В раскрьто у ее, Мігосду «кг 195:578 (1993). Моноклональнье антитела, которне демонстрируют нейтрализующую активность против оарЗ350/220 гликопротеина ЕВМ, раскрьїтьі у Тпогіеу-Іамувоп, Ргос. Май. Асад. Зсі. 77 : 5307 (1980). И, наконец, сайть! сплайсинга для консенсусньїх последовательностей для донорньїх и акцепторньїх сайтов сплайсинга раскрьтть! у Мошпі, Мисіевїс Асідз Кез 10 : 459 (1982). «

В одном аспекте настоящего изобретения предложеньі! нонсплайсинговье вариантьі ЕВМ ар350/220 ДНК шщ с последовательности. ДНК последовательности настоящего изобретения могут включать вьіделенную ДНК й последовательность, которая кодирует зкспрессию гомогенного 90350 протеина. ДНК последовательность, "» кодирующая орЗБО протеин, характеризуется как последовательность, содержащая идентичную или практически идентичную нуклеотидной последовательности на фиг.1, где нативнье нуклеотиднье последовательности донорньїх и акцепторньїх сайтов сплайсинга замененьі на ненативнье нуклеотидь и их «їз» фрагменть. ДНК последовательность может включать 5 и 3 не кодирующие последовательности, фланкирующие кодирующую последовательность и далее включать аминотерминальную сигнальную і последовательность. Фиг.ї иллюстрирует некодирующие последовательности и указьивает конец ї» предполагаемой сигнальной последовательности звездочкой. Однако, очевидно, что ДНК последовательности 5р настоящего изобретения могут не содержать некоторне или все из зтих фланкирующих последовательностей о или сигнальньїх последовательностей. ДНК последовательности нон-сплайсинговьїх вариантов настоящего се» изобретения получают за счет введения мутаций в представленную на фиг.1 ДНК последовательность в донорньїх и акцепторньїх сплайсинговьїх сайтах гена, кодирующего др3Б50/ 220/. Зто исключаєет продуцирование одр220 протейина, так что продуцируется только др350 протеин.

Соответственно, другой аспект изобретения включает гомогеннье д9р350 протеиньі и способь! получения протеинов за счет зкспрессии нон-сплайсинговьїх вариантов ЕВМ др350/220 ДНК последовательности в клетках іФ) соответствующих прокариотньїх или зукариотньїх хозяев. Что касается терминов, используемьх в отношений ко Я9рЗ35О протеинов, гомогенность означает полное или практически полное отсутствие др220 протеина. Мь! отмечаєм, что гомогенньй орЗзБ5О протеин, рекомбинантно полученньй в клетках млекопитающих или бо насекомьїх, насколько нам известно, никогда не упоминался до сих пор в научной литературе.

В еще одном аспекте предложень! гомогеннье одрзбоО протеиньі, содержащие дополнительнье делеции, в секретируемом продукте. Такие делеции включают либо удаление трансмембранного участка, либо удаление трансмембранного участка и остального С-конца одр3З3б5О. Такие дополнительно модифицированнье ДНК последовательности и кодируемьсе ими протеинь! составляют еще один аспект изобретения. 65 Предложена также рекомбинантная ДНК молекула, содержащая векторную ДНК и ДНК последовательность, кодирующую гомогенньій др350 протеин. ДНК молекула обеспечиваєт др350 последовательность, оперативно связанную с подходящей регуляторной последовательностью, способной управлять репликацией и зкспрессией гомогенного Я9р35О в клетках вьібранного хозяина. Клетки хозяина, трансформированнье такими ДНК молекулами, для использования при зкспрессии рекомбинантньїх гомогенньїх др35О, также предоставлень! в

Зтом изобретении.

ДНК молекульі и трансформированнье клетки хозяев в настоящем изобретений используют в другом аспекте изобретения, в новом способе получения рекомбинантного гомогенного др350 протеина или его фрагментов. В зтом способе клеточную линию, трансформированную ДНК последовательностью, кодирующей гомогенньій др35о протейин или его фрагмент (или описанную вьіше рекомбинантную молекулу ДНК), оперативно 7/0 связанную с подходящей регуляторной или контролирующей зкспрессию последовательностью, способной контролировать зкспрессию протеина, культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих зкспрессию рекомбинантной ДНК. Затем зксо-прессированнье протеиньі собирают из клеток хозяина или культуральной средьі с помощью обьічньїх средств. В качестве клеток хозяина в зтом способе можно использовать ряд известньїх клеток; в настоящее время предпочтительньї клетки млекопитающих и клетки насекомьх.

ДНК последовательности и протеиньї настоящего изобретения можно использовать при получений терапевтических и иммуногенньїх соединений, содержащих ЕВМ антигеннье детерминанть!. Такие соединения находят применение в субьединичньхх вакцинах для профилактики, лечения и предотвращения таких заболеваний, связяанньїх с ЕВУ, как мононуклеоз, лимфома Буркетта и карцинома носоглотки. Соответственно, в еще одном аспекте настоящего изобретения представлень! такие терапевтические и / или иммуногеннье 2о фармацевтические композиции для предотвращения и лечения таких связанньїх с ЕВМ состояний и заболеваний у человека, как инфекционньій мононуклеоз, лимфома Буркетта и карцинома носоглотки. Такие терапевтические и/или иммуногеннье фармацевтические композиций включают иммуногенно индуцирующее зффективное количество одного или более из гомогенньїх 9р350 протеинов настоящего изобретения в смеси с фармацевтически приемлемьм носителем, таким, как гидроксид алюминия, физиологический раствор или с фосфатньій буферированньій физиологический раствор, как зто известно специалистам. Под "иммуногенно индуцирующим" подразумевают количество, которого достаточно для стимулирования у млекопитающего і) продуцирования антител к ЕВУ. В другом варианте, активньійй ингредиент можно вводить в форме содержащих липосомьі агрегатов. Для профилактического применения такие фармацевтические композиции могут бьть вьіполненьії в форме субьединичньїх вакцин для введения людям. Пациентов можно вакцинировать дозой, со зо достаточной для стимулирования образования у пациента антител; и повторно вакцинировать спустя шесть месяцев или год. о

В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения связанньіїх с ЕВМ заболеваний и состояний за «фр счет введения пациенту, в частности человеку, иммуногенно индуцирующего терапевтически зффективного количества гомогенного др35О0 протеина в подходящем фармацевтическом носителе. Еще одним способом - з5 Мзобретения является способ стимуляции иммунной реакции против ЕВМ за счет введения пациенту «г иммуногенно индуцирующего зффективного количества гомогенного орЗБО опротеина в подходящем фармацевтическом носителе.

Фиг.1 иллюстрирует ДНК и аминокислотную последовательность др350/220 (из Веїізеї, 9. Мігоюду 54 : 665 (1985)). Указаньі донорнье и акцепторнье сплайсинговье сайть. Трансмембранньй участок обозначен « горизонтальньми острелками, а звездочкой (") отмечен конец предположительной сигнальной (7-3) с последовательности. Нумерация нуклеотидов представлена слева; нумерация аминокислот - справа.

Й Фиг.2 иллюстрирует конструирование 90350 делеции и сайт-направленньїх мутантов. Плазмидньсе карть, и?» обозначеннье как рРМОТМ и рмМ5ТОР, представляют примерь нон-сплайсинговьіїх вариантов др350/220 настоящего изобретения. На фиг.2А линейная модель др350 протеина представлена примерно в масштабе с

Кодирующим клоном, ВІТ (изображен внизу) На опротеине указаньй М-терминальная сигнальная їх последовательность (55) и трансмембранньй домен (ТМ), а на диаграмме гена изображень! важнье рестрикционньсе сайтьї. др35оО ген бьіл клонирован в два сегмента, НіпаїП/Вта! ВІ НІ фрагмент и Вапт/Ніпант

Ш- ВІЗН2 фрагмент. 5СУТ создают, используя полимеразную цепную реакцию, начиная с указанного участка їх ВІЕ1. Фиг2В иллюстрирует схему клонирования для рОТМ, реТОР, РМОТМ и рмМ5ТОР (плазмидь! не в масштабе). Подробности схемь! клонирования приведень в примерах 1 и 2. На плазмидньх картах отмечень о соответствующие рестрикционнье сайть!, используемье векторьі клонирования и ор35О геннье фрагменти. 4) Мутации сайтов сплайсинга в РМОТМ и рМ5ТОоР отмечень звездочками.

Фиг.З3 иллюстрирует результатьї иммуноосаждения гомогенного др350 протеина из РМОТМ клонов в анализе

ЗОЗ-РАСЕ. Позитивнье контрольнье клетки (ЗНЗА19), секретирующие усеченную форму ар350/220 протеина, Негативнье контрольньсе клетки (рЕЕ 14) и некоторне РМОТМ клонь метаболически помечень 225 метионином в течение 5,5 часа; гомогенньйй д9р350 протеин бьіл иммуноосажден из надосадочньїх жидкостей тканевьїх культур.

ІФ) Для каждого типа клеток образцьі! надосадочньїх жидкостей тканевьїх культур (5) и осажденнье ар350/220 (Ір) іме) обрабатьвшали злектрофоретически на 595 5ЮО5-РАСЕ (злектрофорез в поли-акриламидном геле). Слева представлень! маркерь! молекулярньїх весов. 60 Фиг.4 представляет результать! Норзернблоттинга протеина из РМОТМ клонов, зкспрессированньїх в СНО клетках, как указано в примере 3, 4.

Раскрьїтьї композиции и способьї, включающие клонированнье ЕВМ ДНК последовательности, кодирующие нон-сплайсинговье вариантьї 9р35О протеина. Как бьіло указано, такие нон-сплайсинговьіе варианть! здесь обозначаются как гомогеннье одрЗБО протеиньі. Обьчно, если др350/220 ген зкспрессируется в клетках 65 млекопитающих, вьррабатьшаются два генньїх продукта, 9р35О0 и ор220, за счет РНК сплайсинга гена.

Настоящее изобретение дает возможность получать только один сгенньій продукт, др350. Настоящее изобретение включает удаление нескольких или всех РНК сплайсинговьїх сайтовьіїх сигналов в др35о гене и зкспрессию гена в клетки подходящего хозяина. Мутации одр350/220 гена вводят для предотвращения продуцирования 220 кД версии протеина, когда др350/220 зкспрессируют в клетках млекопитающих. В Дезультате получают МРНК транскриптьї, кодирующие только др350. Исключение др220 зкспрессии за счет использования др350/220 нон-сплайсингового варианта др350/220 гена приводит к усиленному продуцированию о9рЗБО по сравнению с др220. Продуцирование др220 не существенно для продуцирования зффективной анти-ЕВМ вакциньї, так как др350 содержит все потенциально антигенньсе сайтьї, находящиеся на др220.

Позтому в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает ДНК последовательность, кодирующую 7/0 полипептидную последовательность практически такую же, что и орЗ50, за исключением того, что кодон донорного сплайсингового сайта, кодирующий аминокислоту 501, и кодон акцепторного сплайсингового сайта, кодирующий аминокислоту 698, бьіли модифицированьі за счет заменьі нативньїх нуклеотидов ненативньми нуклеотидами. Предпочтительно, нативнье нуклеотидьі заменять ненативньмми нуклеотидами таким образом, чтобьї аминокислотнье последовательности оставались такими же. Так например, нативнье нуклеотидьї ААСТ 7/5 В донорном сплайсинговом сайте (нуклеотидь! 1500 - 1504) и нативнье нуклеотидьі! А и Т, фланкирующие СО акцепторньій сплайсинговьій сайт (нуклеотидьі 2091 и 2094), заменяют нуклеотидами ОТСА и т и А, соответственно. Соответственно, в результате такой заменьій в донорном сайте глутамин в положений аминокислоть! 500 и серии в положении 501 остаются теми же. Аналогично, в результате модификации в акцепторном сайте треонин в положений аминокислоть 697 и глицин в положений 698 остаются теми же.

Аналогично, замещения отличаются от тех, которье бьіли приведень в качестве примера, могут бьіть легко осуществленьі специалистами, как более подробно указано далее.

Позтому в одном из аспектов настоящее изобретение включает гомогенньіе др35О протеиньі. Гомогеннье орЗ5О протеинь! отличаются далее тем, что имеют аминокислотную последовательность, практически такую же, что представлена на фиг.1, с аминокислоть 1 до 907, с аминокислоть! 1 до 862 или с аминокислоть 1 до 907, сч об Мсключая аминокислотьі 863 - 881, причем каждая может содержать или не содержать М-терминальную сигнальную последовательность из 18 аминокислот. Кроме того, предложеньй аналоги гомогенньїх арзбБо і) протеийнов и они включают мутанть, в которьіх существуют вариации в аминокислотньїх последовательностях, которье сохраняют агтигенную активность, и, предпочтительно, гомологичньі на, по крайней мере, 80905, более предпочтительно 9095 и еще более предпочтительно на 9595 с соответствующим участком гомогенньїх др35о с зо протейнов. Примерьі включают протеиньі и полипептидьі с небольшими аминокислотньми вариациями в аминокислотной последовательности, представленной на фиг.1; в частности, с заменами консервативньх о аминокислот" Консервативньмми заменами являются те, которне имеют место внутри семейства аминокислот, «Е которье родственньі по своим боковьім цепям. Генетически кодируемье аминокислоть! обьічно делятся на 4 семейства: (1) кислотнье - аспартат, глутамат; (2) основньіе - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярнье - ї- з5 аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженнье полярньєе - «г глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоть. Так например, разумно предположить, что отдельная замена лейцина или аналогичное консервативное замещение аминокислот структурно родственньіми аминокислотами не окажет значительного влияния на антигенную активность или функциональность. «

Настоящее изобретение предлагаєт преимущество более простого вьіделения др350. Так какорЗ35О и др220 птв) с отличаются сходньмми биохимическими свойствами, др220 часто вьіделяется совместно с др350 при очистке препаратов. Клеточная зкспрессия только нон-сплайсингового варианта др350/220 гена упрощаєет вьіделение ;» протеина. Зто снижает стоимость получения 9др350. Настоящее изобретение также делаєт более прость!м получение биохимических характеристик исходного материала для вьіделения 9р350. Благодаря наличию

Только одного вида анализ содержания протейина и анализ аминокислотной последовательности можно ї5» осуществлять без учета присутствия второго вида.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает преимущество усиленного продуцирования др3б5о

Ш- протеина. Предотвращение сплайсинга др350 гена смещает продуцирование клеткой двух продуктов (адр350 и їх 9р220) на продуцированиє только д9р35О0. В некоторьх клетках, как бьло оценено, концентрации одр220 5р боставляют 30 - 10095 от 9рЗ50 концентрации. о При исключений сплайсинга гена продуцирование др35О0 повьішается за счет отсутствия продуцирования 4) арг22.

ДНК последовательность др350/220 гена описана Веїзвеї, У. Мігоюду 54 : 665 (1985) и Віддіп, ЕМВО У). З : 1083 (1984) и представлена на фиг.1. Ген представляет считьівающую рамку из 2721 оснований, кодирующую дв ЗО7 аминокислот и определяющий продукт первичной трансляции около 95 КД. Различие между предсказанньм и реальньмм значениями связано с интенсивньім гликозилированием протеина. 591 основание (кодируют 197 (Ф, аминокислот) удаленьі в результате сплайсинга для исключения продуцирования одр22. Кажущийся ка молекулярньій вес др350/220 генного продукта может также меняться в зависимости от типа используемой измерительной системь), утилизации сайтов гликозилирования и различньх типов клеток, различий в бо посттрансляционном процессинге или селективной генной мутации. Измеряемьсе величиньї варьируются для продуктов различньїх вариантов нон-сплайсинговьїх сайтов др350/220 гена, но термин "гомогенньій арз5о протеин или "протеинь" охватьшает сгеннье продуктьї нон-сплайсинговьїх вариантов, необязательно содержащих дополнительнье делеции или мутации, такие, как С-терминальнье делециий и / или трансмембраннье модификации, также описьіваемьсе здесь. Термин "др220 протеин" относится к альтернативно 65 сплайсированному др350/220 продукту с молекулярньім весом примерно 220 кДс Сайть! сплайсинга в др350/220 генном продукте бьіли определеньй за счет сравнения ор350/220 гена с консенсусньми донорньми и акцепторньми сплайсинговьіми последовательностями, основанньми на других генах, преимущественно из зука-риотньїх организмов. Консенсуснье последовательности вьіявленньюе Моипі, Мисіеіс Асідз Кев. 10:459 (1982) при изучений сайтов сплайсинга в других генах, имеют вид:

А А

Донор:--АС/схТх--АСТ с с т с

Акцептор:--Мі1--Ахох/С

Го Т

Звездочки у оснований сверху обозначают основания, которне появляются в 10095 всех сайтов сплайсинга (вьісоко консервативнь). Положения с двумя основаниями или одним основанием представляют консервативнье положения. Знак / указьівает реальньйй сайт сплайсинга.

В орЗ50/220 гене донорньй сайт сплайсинга расположен после нуклеотида 1051, а акцепторньій сайт сплайсинга после нуклеотида 2092, как видно из ДНК последовательности (Віддіп ЕМВО 4). З : 1083 (1984)) гена 72 др350/220. (Используемая здесь нумерация и нумерация на фиг.1 соответствует нумерации у Віддіп). Сайт сплайсинга расположен в соответствующем участке гена в штамме ЕВМ типа В (донорньйй сплайсинговьїй сайт после Азв5орії и акцепторньій сплайсинговьій сайт после 2029). Настоящее изобретение охватьввает композиции, полученнье с использованием сайтов сплайсинга либо А, либо В штаммов или других ЕВМ штаммов для получения отдельного вида мРНК из др350/220 гена. ДНК последовательность типа А из вируса из штамма

В895-8 била использована в примерах, хотя в той же степени можно использовать ДНК последовательность штамма типа В, так как транслированнье геннье продуктьь штаммов типа А и В идентичнь. В В штамме отсутствуют аминокислоть! 507 - 520 и 570 - 576. Штамм типа А используют благодаря тому, что он содержит все возможнье др350 антигеннье сайтьі. В другом варианте можно использовать ЕВМ ар350/220, содержащий штамм-специфические последовательности в соответствий с имеющимися здесь указаниями, что будут с продуцироваться ЕВМ штамм-специфические гомогеннье дрЗ3БО протеинь, обладающие иммуногенньми г) свойствами, специфичньіми для конкретного штамма, и позтому пригоднье для использования в иммуногенньїх и / или терапевтических композициях для предотвращения или лечения заболеваний, связанньїх со штамм-специфическими ЕВМ. В таблице 1 представленьй дикого типа нуклеотиднье и аминокислотнье последовательности для до-норного и акцепторного сайтов сплайсинга. і,

Чтобьї предотвратить РНК сплайсинг др350/220 гена, в последовательность нуклеийновьїх кислот др350/220 о гена вводят мутации для заменьї соответствующих пар оснований сайта сплайсинга РНК. Для придания нефункциональности сайту сплайсинга, предпочтительно, по крайней мере, одно из оснований, вьібранньх из - двух вьсоко консервативньх оснований, ограничивающих донорньй сайт или акцепторньй сайт, следует М. заменить неконсервативньми основаниями, более предпочтительно, по крайней мере, два вьісоко

Зо консервативньїх основания следуєт мутировать в неконсервативнье основания. Другие консервативнье - основания, на расстояний более двух оснований от сайта сплайсинга, также можно заменить неконсервативньми основаниями сайта сплайсинга для дальнейшего ухудшения распознавания сайта сплайсинга. Как донорньй, так и акцепторньй сайть! можно изменить, чтобьі нарушить механизм сплайсинга. «ф

Предпочтительно, чтобьі как донор, так и акцептор содержали, по крайней мере, по одному изменению в каждом, в одном из четьірех вьсоко консервативньхх положений оснований сайта сплайсинга, и более З с предпочтительно, по крайней мере, по два изменения в двух из четьірех вьісоко консервативньїх положений » оснований сайта сплайсинга. Если один из сайтов сплайсинга не может бьіть подвергнут мутации из-за желания сохранить дикого типа аминокислотную последовательность, тогда предпочтительно вводить, по крайней мере, две мутации в другой сайт сплайсинга.

Мутации по др350/220 сайтам сплайсинга могут вводить изменения в аминокислотную последовательность те зкспрессируемого впоследствий орЗіБ5БО протеина. Предпочтительно, чтобьі такие изменения бьли бь -І замещениями консервативньїх аминокислот. Консервативнье замещения в аминокислотной последовательности, в противоположность неконсервативньм оизменениям в аминокислотной о последовательности, помогут сохранить антигеннье сайть. Изменения консервативньїхх амнокислот можно о 20 осуществлять до тех пор, пока изменение основания (или изменения оснований) не приведут к подходящим изменениям в инвариантньїх донорньїх / акцепторньїх основаниях. Так например, СІу может заменить 5ег вої В с» донорном сплайсинговом сайте, используя любой СіІу-специфический кодон отличньій от ЗИ (использование

ОО сохраняет С нуклеотид и не приведет к желательной замене СТ в сигнале сплайсинга). Аналогично, в акцепторном сплайсинговом сайте замена СіуУдов на АІа будет консервативньм изменением, но так как все Аїа 59 Ккодонь начинаются с вьісоко консервативного С нуклеотида, зто не может привести к нужной замене. Хотя

Ф! пролин также может бьіть изменением консервативной аминокислотьі, пролин не следует использовать для замень! дикого типа аминокислоть!, так как зто приведет к модификации третичной структурь! протеина, и за о счет зтого замаскирует один или более из др350 антигенньїх сайтов. В таблице 1 представлень! пригмлемье консервативнье аминокислотнье замещения в дикого типа последовательностях. Внизу таблиць 1 представлен 60 пример мутации с консервативньмми изменениями аминокислот. б5

Таблица 1

Донор Акцептор

Дикого типа с последовательности

Сплайсинг Сплайсинг

САА А/СТ АСА с/стТ біч бегьои ТіК о біуєов і у Консервативнье изменения і і аминокислот

Азп Аа Аїа бек

Азр с1У біу Тіг

Сіп о ТЕК Зек ех.і: САС АСА тс тст

Азр о Твпгвої Бет Бегеов

Хотя один из аспектов настоящего изобретения включаєт неспецифический вариант др350/220, могут оказаться желательньми и дополнительнье мутации ор350/220 кодирующей последовательности. Для получения растворимьїх гомогенньїх др350/220 протеинов ("растворимье протеинь!" либо свободнь! в растворе, либо ассоциированьі с мембраной, но не интегрированьії с мембраной), например, чтобьї избежать проблем клеточной токсичности, возникающей при озкспрессии полной длиньй ор35О в качестве интегрального мембранного протеина, соединяющий с мембраной участок (известньій также как трансмембранньй участок) о9рЗБ5О модифицируют за счет делеции всей или части его кодирующей ДНК последовательности. Соединяющий с мембраной участок др350/220 включаєет аминокислоть! 861 (метионин) до 881 (аланин). См. Веїзеї, 9. Мігоїоду 54 : 665 (1985). Предпочтительно, чтобь, по крайней мере, 8 аминокислот трансмембранного участка біли ЄМ подвергнуть! делеции, более предпочтительно, чтобь! бьіли подвергнуть! делеции 12 аминокислот, и найболее о предпочтительно, чтобь! бьіли подвергнуть! делеции от 12 до 18 аминокислот. Соответственно, в другом аспекте в настоящем изобретений предложеньі! нон-сплайсинговьіе варианть! др350/220 ДНК и/или дрз35о0 гомогеннье протеиньі), которье дополнительно содержат, по крайней мере, одну делецию в трансмембранном участке арзЗ50/220 ДНК и/или др350 гомогенном протеине, что приводит к зкспрессии растворимого гомогенного др35о0 о протеийна. о

Помимо делеции всего или части трансмембранного домена нон-сплайсингового др350/220 варианта, можно также подвергнуть делеции целиком или частично, как здесь описано, С-терминальную последовательность, - следующую после трансмембранного домена, включающую аминокислотьі 881 - 907, в соответствии с М настоящим изобретением. Таким образом, в еще одном аспекте настоящее изобретение включает

Зо нон-сплайсинговне варианть! др350/220 ДНК и/или гомогенньій протейн, дополнительно модифицированньєе за « счет делеции всей или части кодирующей ДНК, и / или аминокислотной последовательности, содержащей трансмембранньій участок др350/220 и даже дополнительно модифицированной за счет делеции остальной

С-терминальной ДНК и/или аминокислотной последовательности др350/220. «

Соответственно, другой аспект настоящего изобретения включает нон-сплайсинговье варианть! ДНК последовательностей, кодирующих гомогеннье др35о0 протеиньі настоящего изобретения. З с Такие ДНК последовательности включают ДНК последовательность. представленную на фиг.1, "» кодирующую аминокислоть! 1 - 907, и далее включают нуклеотиднье замещения, о которьїх шла речь, для " удаления донорньх и акцепторньх сайтов сплайсинга. Такие ДНК последовательности необязательно включают усеченнье ДНК последовательности, в которьїх нуклеотидь, кодирующие целиком или часть трансмембранного домена и С-конца, включающие аминокислоть 861 - 907, подвергаются делеции, и варианть те делеции, в которьїх нуклеотидьї, кодирующие целиком или часть трансмембранного домена, включающего -І аминокислотьі 861 - 881, подвергаются делеции. ДНК последовательности настоящего изобретения, кодирующие гомогеннье др35О протеиньі, могут также включать ДНК, способнье к гибридизации в условиях о соответствующей жесткости, или которье могут бьіть способньі к гибридизации в таких условиях, но без о 20 разрушения генетического кода, для вьделения ДНК последовательности, представленной на фиг.1.

Соответственно, ДНК последовательности настоящего изобретения могут содержать модификации в не с» кодирующих последовательностях, сигнальньіе последовательности или кодирующие последовательности, на основе аллельньїх вариантов или преднамеренньїх модификаций.

Зти нон-сплайсинговье вариантьіь одрі35Б0/220 ДНК последовательностей, как здесь раскрьто, можно 5о сконструировать, используя хорошо известнье специалистам способь. Модифицированнье ДНК

Ф! последовательности настоящего изобретения можно зкспрессировать рекомбинантно, используя известнье способьі для получения гомогенньїх 90350 протеийнов настоящего изобретения. Такие рекомбинантнье о протеийньї можно вьіделить и включить в фармацевтические композиции для профилактического лечения и предотвращения заболеваний, связанньх с ЕВУ. 6о Нон-сплайсинговьіе вариантьь оріЗБ50/220 ДНК о настоящего изобретения можно зкспрессировать рекомбинантно в различнье типьі клеток, используя соответствующие системь! контроля за зкспрессией, которье известнь! специалистам. Подходящие клетки, известнье и доступнье специалистам, включают (но не ограничиваются ими) такие дрожжевне клетки, как Засспаготусез сегемізіае, такие бактериальньсе клетки, как Е. соїї и Васіїйив зибБійї5, и такие клетки млекопитающих, как ЗНЗ, СНО, МБО, МОСК и С-127 клетки. Векторь, бо которне используют с зтими типами клеток, вьбирают на основе их совместимости с типом клеток и используемой системой векторного контроля. Клетки и векторь, которье обеспечивают зкспрессию секретированньхх продуктов др3З50/220 гена, являются предпочтительньми. Так например, БЕ. сої трансформируют, используя производнье рВКЗ322, которая бьіла модифицирована с использованием обьічной

Методики так, чтобьі она содержала ДНК последовательности для зкспрессии целевого протейна, в зтом случає нон-сплайсинговье вариантнье последовательности ЕВМ ор3б5О, содержащие или не содержащие последовательности, кодирующие С-конць и / или участок, соединяющий с мембраной. рВК322 содержит гень устойчивости к ампициллину и тетрациклину, которье можно использовать в качестве маркеров. См. Воїмаг,

Сепе 2 : 95 (1977). Обьічно используемье последовательности контроля зкспрессии, то есть промоторь! для 7/0 Мнициирования транскрипции и необязательно оператор или знхансер, включают бета-лактамазную и Іас промоторнье системь! (см. Спапо, Майте 198 : 1056 (1977)), триптофано-вую промоторную систему (см.

Соедаеє!ї, Мисівїс Асідз Кев. 8 : 4057 (1980)) и лямбда-производньій РІ промотор и М-генньій рибосомньй сайт связьшвания (см. ЗПпітайаке, Майте 292 : 128 (1981)). Однако, можно использовать любую доступную промоторную систему или систему контроля за зкспрессией, если только она совместима с клетками 7/5 прокариотного хозяина. Другие примерь! клеток хозяев, плазмид и векторов зкспрессий раскрьтть! в патенте

США, вьіданном І(акига (1982) под Мо 4356270, 4431739 вьіданном Кідодз (1984) и 440859, вьіданном Кийбег (1984)

В качестве клеток-хозяев можно также использовать клетки насекомьїх, используя зкспрессию клеток насекомьх. В случае зкспрессии в клетках насекомьх, обьічно компоненть! системь! зкспрессиий включают 2о вектор переноса, обьічно бактериальную плазмиду, которая содержит и фрагмент бакуловирусного генома, и удобньій рестрикционньій сайт для встрайвания гетерологичньїх генов или сгенов, которье нужно зкспрессировать; дикого типа бакуловирусь! с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфичному фрагменту в векторе переноса (зто позволяет обеспечить гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусньй геном); и соответствующие клетки насекомого-хозяина и ростовую среду. с

В настоящее время найболее часто используемьм вектором переноса для встраивания чужеродньмх генов в

АсМРМ является рАс373. Бьіло также сконструировано множество других векторов ; известньїх специалистам. і)

Они включают, например, рмІ 985 (которьій изменяет полиздриновьй стартовьй кодон с АТО на АТТ, и которьй вводит ВатНі сайт клонирования на 32 парьї оснований в прямом направлений от АТТ; см. І иском/ апа

Зиттегв, МігоЇоду 17 : 31 (1989). с зо Плазмида обьічно содержит также полиздриновьій сигнал по-лиаденилирования (МіПег еї. а! (1988) Апп. Кеу.

Місгобіо!., 42 : 177) и прокариотньй ген устойчивости к ампициллину (атр) и источник репликации для отбора и о размножения в Е. сої. «г

Бакуловируснье векторьі! переноса обьічно содержат бакуло-вирусньій промотор. Бакуловирусньій промотор представляет собой любую ДНК последовательность, способную связьівать бакулови-русную РНК полимеразу и -

Зз5 Мнициировать в прямом направлений (5 до 3) транскрипцию кодирующей последовательности (то есть «Е структурного гена) в МРНК. Промотор должен содержать участок инициирования транскрипции, которьй обьічно расположен проксимально по отношению ок 5 концу кодирующей последовательности. Зтот участок инициирования транскрипции обьічно включает сайт связьівания с РНК полимеразой и сайт инициирования транскрипции. Бакуловирусньій вектор переноса может таюже содержать второй домен, назьваемьй « знхансером, которьй, если присутствует, обьічно расположен дистально по отношению к структурному гену. /-З с Зкспрессия может бьть либо регулируемой, либо конструктивной. Для технологии зкспрессии в клетках насекомьїх см. ЕР патентную публикацию 155476. ;» В качестве клеток-хозяев можно также использовать дрожжи, например, Засспаготусез сегмізіде. Можно при зтом использовать различнье штаммь!. Аналогично, известньі плазмиднье векторьі, пригоднье для зкспрессий

В дрожжи таюжке, как промоторь и системь! контроля за зкспрессией. См., например, Муапопага, Ргос. Маї!. Асад. їх Зсі, 80 : 1 (1983) (РНОБ5 промотор), ЕР патентную публикацию 012873 (лидернье последовательности), Кигіг,

Мої. Сей. Віої. б : 142 (1986), Мо, 9. Васіегіої. 153 : 163 (1983) и Ніппеп, Ргос. Май. Асай. сі. 75 :

Ш- 1929 (1979) (процедурь! трансформации и подходящие векторь)). ї5» Естественно, можно использовать зукариотнье клетки из многоклеточньїх организмов в качестве 5о клеток-хозяев для зкспрессии генов, кодирующих протеиньі и полипептидь, представляющие интерес. о Подходящие клеточнье линии хозяев включают МЕКО и Неї а клетки, клетки яичника китайского хомяка (СНО). сю Векторь! зкспрессии, совместимье с такими клетками, также доступньі, и обьчно включают промоторь! и последовательности контроля за зкспрессией,такие, как например, ранние и поздние промоторьі из ЗМ40 (см.

Ріегв, Маїиге 273 : 113 (1978)) и промоторьі из вируса полиомьї, аденовируса 2, вируса бьічьей папилломь! или ов Ввируса птичьей саркомь). Примерь! клеток-хозяев, промоторов, селектируемьх маркеров и методики также раскрьть в патентах США: 5122469, вьіданном Маїпег (1992), 4399216, вьіданном Ахе! (1983), 4634665, (Ф) вьіданном Ахе! (1987), 4713339, вьіданном Іеміпзоп (1987), 4656134, вьіданном Кіпдоїй (1987), 4822736, ка вьіданном Кеїетзвг (1989) и 4874702, вьіданном Ріегз (1989).

Трансформацию подходящих клеток-хозяев осуществляют, используя стандартнье методики, бо соответствующие конкретнь/м клеткам, такие, как СасСі» обработка для прокариотов, как указано в статье Сопеп

Ргос. Май. Асад. зсі 69:2110 (1972) и СаРО), осаждение для клеток млекопитающих, как раскрьто у Сгапат,

Мігоіоду 52 : 546 (1978). Трансформацию дрожжей можно осуществить, как описано у Нвзіао, Ргос. Маї). Асад. Зсі 76: 3829 (1979) или как описано у Кіере, Сепе 25: 333 (1983). Конструирование подходящих векторов, содержащих нон-сплайсинговье вариантьї др350 последовательности (с дополнительньми модификациями 65 (или без них), раскрьттьми здесь и приводящими к делеции С-конца и / или связьівающего с мембраной участка) осуществляют, используя обьчнье методики лигирования и рестрикции, хорошо теперь известнье специалистам. Сайт-спедцифическое ДНК расщепление осуществляют, обрабатьвая подходящим рестрикционньім знзимом (знзимами) в стандартньїх условиях, в частности в тех, которье обьічно указьіваются изготовителями рестрикционньїх знзимов с Для разделения по размерам расщепленньїх фрагментов можно

Мспользовать злектрофорез на полиакриламидном или агарозном геле, используя стандартнье методики и затуплять концьї фрагментов, за счет обработки фрагментом Кленова Е. соїї полимеразь! 1 в присутствий четьїрех деоксинуклеотидньїх трифосфатов. Обработка 51 нуклеазой гидро-лизует любье одноцепочечнье участки. Синтетические олиго-нуклеотидьії можно получить, используя, например, дизтилфосфо-амидитньй способ, известньй специалистам. См. патент США Мо 4415732 (1983). Лигирование можно осуществить, 7/0 используя Т4 ДНК лигазу в стандартньїх условиях и температурах, и правильность лигирования подтвердить, трансформируя ЕЕ. сої или СО5 клетки лигирующей смесью. Удачнье трансформантьі отбирают по устойчивости к ампициллину, тетрациклину или другим антибиотикам, или используя другие известнье специалистам маркерь!.

Такие рекомбинантнье ДНК методики полностью раскрьїтть! в соответствующей литературе. См.:

БЗатбьгоок, МОГ ГЕС АК СІГОМІМО: А ГАВОКАТОКУ МАМОАЇГ, 20 ЕО, (1989); ОМА СІГОМІМО, Мої! 1 апа 11 (ОМ Сіомег еа 1985); ОГІСВОМОСІ ЕОТІОЕ БУМТНЕЗІЗ (МО Саїї ей 1984); МОСІЕІС АСІЮ НУВКІОІ2АТІОМ (ВО

Натез еа 1984); ТКАМЗСКІРТІОМ АМО ТКАМ5І АТІОМ (ВО Натез 1984); АМІМАЇ СЕП СОГТОКЕ (КІ Егезппеу ей 1986); В. Реграї, А РКАСТІСАЇ ШОЕ ТО МОГЕСИГ АК СІ ОМІМО (1984); ЗОЕМЕ ТКАМЗРЕК МЕСТО ГОК

МАММАСІАМ СЕ 5 (УНН МШег ей 1987 Со Зргіпд Нагрог Іарогайгу); Зсорез РКОТЕЇМ РИКІРІСАТІОМ:

РЕІМСІРІЕЗ АМО РЕКАСТІСЕ, 2па ей, (1987 Зргіпоег-Мепад МУ) апа НАМОВООК ОРГ ЕХРЕКІМЕМТАЇ-

ІММОМОГ ОСТ Моїв 1-1М (ОМ УМеїгей 1986).

Все указаннье публикации включень! сюда со ссьілками.

Соответственно, в следующем аспекте изобретение включает векторьі, содержащие нон-сплайсинговье вариантьі о9р350/220 ДНК последовательностей и клетки-хозяев, и далее включаєт способ получения сч нон-сплайсингового варианта одр350/220 протеина за счет культивирования клеток указанного хозяина, содержащих вектор, которьій несет нон-сплайсинговьій вариант др350/220 ДНК последовательности оперативно і) связанньій с последовательностью, контролирующей зкспрессию в условиях культивирования, которье обеспечивают зкспрессию гомогенного дрзБ5о протеина.

Зкспрессированньій гомогенньій орзіБО вьделяют из клеток и составляющих культуральной средь,, со зо Мспользуя такие обьічнье методики очистки гликопротеинов, как ультрафильтрацию, злектрофорез в свободном потоке, гель-фильтрационную хроматографию, афинную хроматографию, 5О5-РАСЕ, дифференциальное о

МНАЗО, осаждение, лектиновье колонки, ионообменньсе колонки и гидрофобнье колонки (но не ограничиваясь -(«К ими!), хорошо известнье специалистам. Небольшие количества препаратов др350 наиболее легко вьіделять, используя 505-РАСЕ или лектиновье афиннье колонки и такие небольшие количества препаратов для ї-

Зз5 Мспользования в зкспериментах по вакцинации, или зкспериментах по иммунной реакции найболее легко «г очищать, используя жидкостную хроматографию. Для крупномасштабного производства коммерчески значимьсмх количеств др350 для использования в вакцинньїх композициях предпочтительнь!ї сочетания ультрафильтрации, гель-фильтрации, ионного обмена и хроматографийи гидрофобньїх взаймодействий.

Очищенньсе гомогеннье 9рз50 протеиньї настоящего изобретения можно использовать в терапевтических и / « йли иммуногенньїх композициях для предотвращения и лечения состояний, связанньхх с ЕВМ, и таких в с заболеваний, как инфекционньй мононуклеоз, лимфома Вигкей и карцинома носоглотки. Такие фармацевтические композиции включают иммуногенно-индуцирующее количество одного или более из ;» гомогенньїх др3а5О протейнов настоящего изобретения в смеси с фармацевтически приемлемьм носителем, например, такой системой, представляющей адьювант / антиген, как квасць. Можно использовать и такие другие системьі, представляющие адьювант / антиген, как МЕ59 (Спігоп Согр), 05-21 (Сатбгідде Віоїесп Согр), їх 3-ОМР'Г. (3-Деацил-монофосфорил липид А 3-ЮОеасуІ-Мопорпозрпогуї! Гіріа А) (Ківі - Іттипе - Спет Кезеагсі,

Іпс.), клинической степени чистотьі адьювант Фреунда (ІРА), фузогеннье липосомьі, водорастворимье ш- полимерь! или Ізсотв (иммуно-стимулирующие комплексь!). Другие примерьї фармацевтически приемлемьх ї5» носителей или растворов включают гидроксид алюминия, физиологический раствор или фосфатньй буферированньй физиологический раствор. Зти композиции можно вводить системно, предпочтительно, о подкожно или внутримьшечно в форме приемлемьїх растворов для подкожного или внутримьшечного сю введения. Инокуляцию можно также осуществить за счет нанесения царапин на поверхность или за счет инокуляции в полости тела. Приготовление таких растворов, обладающих за счет подбора рН изотоничностью, стабильностью и т. д., известно специалистам. Дозовьій режим определяют лечащие врачи с учетом таких ов факторов, как физическое состояние, вес, пол, питание, серьезность состояния, время введения и других клинических факторов, которне могут повлиять на зффект лекарства. Примерь! доз составляют интервал от (Ф) около мкг до около 100Омкг протеина. ка В практике способа лечения настоящего изобретения имму-нологически-индуцирующее зффективное количество гомогенного о9рЗБО опротеина вводят пациенту, нуждающемуся в терапевтическом или бо профилактическом лечении. Иммуногенно-индуцирующее зффективное количество композиции настоящего изобретения составляет величину в интервале от около 1мкг до около їмг на вводимую дозу. Количество вводимьїх доз может варьироваться в зависимости от вьшеуказанньїх факторов. Далее изобретение описьівается в следующих примерах без ограничения его обьема.

Пример 1 65 Делеция др350/220 трансмембранного участка и трансмембранного участка до С-конца для создания РОТМ и рРТОР

Ген ар350/220 из ЕВМ 895-8штамма (МіШег еї. аіЇ, 1972) доступен в ВатНі библиотеке, как открьїтая считьівающая рамка под названием ВІ Е1 (Ваеєг, Маїшиге, 310:207, 1984). Для создания нужной конструкции (см. представленную на фиг.28 диаграмму) 9р350/220 ген клонируют в две части: 1) ВІ НІ, 2.3КЬ Ніпаїп/Вта! з' фрагмент и 2) ВІ БН2, 337рр Вапі/ Ніпа 5 фрагмент (фиг.2А), Зти фрагменть! клонируют в 5іадіпд векторь! с тем, чтобьі можно бьло осуществить делеции С-терминальньх цитоплазмических и 1/2 лшили трансмембрано-кодирующих доменов. Так как Віа! сайт находится у 5 конца участка, кодирующего дрзізбБо трансмембранньй (ТМ) домен, его используют для конструирования делеции ТМ домена и делеции ТМ домена со вместно с делециями прилегающего С-конца. Используя Віа), оказьвается возможньм осуществлять /о делеции, оставляя только две аминокислоть! ТМ участка (таблица 2). 1. Конструирование РОТМ из ретТО1 и реТО3.

Плазмида роОТМ состоит из последовательности др350/220 нуклеийновьїх кислот, в которой отсутствует весь

ТМ кодирующий участок. Зту конструкцию создают, используя два Зіадіпд вектора реїо1 и рзТО3. РСК продукт из 450Бр, УСТ, которьій вводит ВіаІ сайт в 3 конец ТМ участка, получают, используя ВІЇ Е1 клона /5 Ммишеневую последовательность (фиг.2).

В качестве РСК праймеров используют следующее: вгаїт

Праймер 1: 00 АТС СТА САС ОТОоС ОС ТТТ АОС СОТ А віБг1: -.. БАС ТОС бос ТТТ АСо ССТ А...

А.А.: -.. Авр Сув А1а РнНе Ага Ака ...

Її Конец ТМ участка

Праймер 2: СА ТОС ТСТ СТтТ ССТ ТСТ ОСТ ССА сто с

ВІШЕ1: о... ... ТСТ СтІТ ССТ ТСТ ОСТ ССА ото і)

В'ТаІ сайт праймера 1 используют для клонирования Віа! / Хта! фрагмента 5СМУТ в рзТО1. Праймер 2 соответствует участку вне др350/220 открьїтой считьвающей рамки с 3 стороньі гена. ЗХСУТ РСК фрагмент внірезают за счет Віа! и Хтаї для получения фрагмента в 136 пар оснований, которьій клонируют в рМТІЇ вектор о (Зравїе апа Мосагїг»кі, 1985) наряду со вторьім фрагментом, ВІ ЗНІ1 НіпаїП/Вга! фрагментом, для создания ретТо1. о

Секвенирование по Віа! сайту показьівает, что бьіл делетирован весь ТМ аминокислотньй кодирующий участок за исключением аминов кислот Меї и Геи (см. табл. 2). Третий ВІ Е1 фрагмент, ВІ ЗН2, клонируют в рРМТ11 для « создания рОТО3. Вапі/Хвра! олигонуклеотидньій линкер из 16 пар оснований вне др350/220 гена, кодирующей М последовательности, используют для клонирования ВІ ЗН2 Вапі/Ніпа!й фрагмента в ре5ТО3. 2,4 Ніпап/Хтаї

Зо рт фрагмент клонируют в рЕЕ14 вектор (СеШесп, Еподіапа) вместе с 0,3 Хвраї/Ніпай!! ретТО3 фрагментом для « завершения РОТМ конструкции. 2. Конструирование реТОР, используя векторьі рето2 и рето3.

Плазмида рЗТОР содержит ор3іЗ50/220 ген, в котором отсутствует ТМ участок и С-терминальньй « цитоплазмический участок, соседствующий с ТМ участком. Для создания зтой конструкции создают Вга/Есокі олигонуклеотидньй линкер из 16 пар оснований со стоп кодонами (подчеркнуть!) в трех рамках, следующих за З с Вга! липким концом, как показано далее: з» ТАТ АСА СТА стС ТАС б

А ТСТ САТ САС АТС СТІ АА

5 свисающий конец (ТА) верхней последовательности является липким концом для Віа! рестрикционного їх сайта, а 5 свисающий конец (ТТАА) нижней последовательности является ЕсокК!І липким концом. Зтот 16бр линкер используют для клонирования фрагмента ВІ ЗН1 НіпапПШ/Вга! в рМТИ, для создания роТ2. 2,3 КБ ретТо2

Ш- Ніпап/ЕсокіІ фрагмент и ретоз 0,3 КЬ Хваї/НіпаїІї фрагмент клонируют в рЕЕ14 для создания реТоР. їх 3. Сравнение дикого типа, РОТМ и ретТоОР последовательностей на ТМ участке.

Олигонуклеотидная последовательность и транслированная аминокислотная последовательность дикого о типа, РОТОР и рОТМ 3 концьї 94р350 ДНК и аминокислотнье последовательности представлень! далее в 4) таблице 2. Стрелками указаньь начало и конец дикого типа трансмембранного домена (ТМ). Только две аминокислоть! из трансмембранного домена сохраняются в РОТМ и ретТОР Меї дві и І ейдво (см. также фиг.1).

Следует отметить, что стоп кодон следует непосредственно за І ейявво в РЗТОР. В рОТМ прежнее положение ов делетированного мембранного участка отмечено как "ТМ". (В таблице указаньі! нативньіе аминокислотьї).

Ф) іме) 60 б5

Таблица 2

З' конеп др350 дикого типа последовательности -««ААС ОСТ ТОС АТО СТА СТА стТс...СТС АТС ССС сдс тоб осо ««зАвп оБПем бек Меє Тецеєю Уа1 Печ...Ма1! Меє діа Азргг: Сув А1Та ' ' ю ТМ старт ТМ конец

З' конец ротор -..АСС СТО ТОС АТО СТА ТАС АСТ дСТ ТСтТ досос.с.с «-«Авп оПеч бек Меє Гейвє» Стоп

З' конец ром -..АСС СТО ТоС АТО СТА САС тосС ОСС... -.Авп Сей Бег Мебє Пецеє» Азреєз Суз Аа...

А атм

Пример 2

Удаление ар350/220 гена донорного и акцепторного сплайсинговьїх сайтов для создания РМОТМ и РрМЗ5ТОР с

Для получения гомогенного продуцирования 9різ5О протеина заменяют вьісоко консервативнье и о консервативнье основания сплайсингового сайта др350/220 гена. Четьіре основания заменяют в донорном сплайсинговом сайте, включая вьісоко консервативную СТ пару, которая находится в 10095 всех сплайсинговьсмх сайтов. Два консервативньїх основания донорного сайта, АА, заменяют на СТ. Два вьісоко консервативньх (инвариантньїх) основания донорного сплайсингового сайта заменяют с СТ на СА. У акцепторного о сплайсингового сайта, только вьсоко консервативнье основания сплайсингового сайта заменяют для о сохранения аминокислотной последовательности. Вторье консервативнье основания акцепторного сплайсингового сайта заменяют, как указано в таблице 3. В таблице З суммировань! изменения оснований в - донорном и акцепторном сплайсинговьїх сайтах др350/220 гена. М

Таблица З «

Изменения сайта сплайсинга ЕВУ др350/220 гена

Донорньй сплайсинговьй сайт: «

Донор Донор о) с п . Дикий тип: САА АФ ст мутант: сдох теСждх и?

Сіц Зегзої Сі Зегьопї ї» Акцепторньй сплайсинговьй сайт: -і Акцептор Акцептор ве й

Дикий тип: АСА бьст мутант;: СТ Од («в) сю Тк б1уєов Тиг б1увєов

МИзменения оснований за счет мутагенеза на основе олиго-нуклеотидов отмечень в мутантньх последовательностях звездочками. Реальнье сайть! сплайсинга указаньй стрелками, и представлень кКодируемье аминокислоть. Ни одна из зтих аминокислотньїх последовательностей не изменяется в результате о нуклеотидньїх замещений.

Нуклеотиднье замещения в дикого типа 9р350/220 ДНК последовательностях донорного сплайсингового іме) сайта и акцепторного сплайсингового сайта осуществляют, используя мутагенез, опосредствованньй олигонуклеотидами. Для осуществления мутаций используют модифицированньій фаговьій вектор МІЗТАС по 60 способу 720Пег, М. Б. апа Зтіфй, М. (1983) Меїйоаз ої Епгутої. 100 : 468. ВатНі/Хно! фрагменть! др350/220 нуклеотидной последовательности клонируют в полилинкер плазмидь! МІЗТАС, используя Азр718 и Ватні рестрикционнье сайтьї на полилинкере, обьеединенном с 19 рр олигонуклеотидньім линкером, содержащим

Авр718 и Хпої! липкие концьї. Для мутагенеза используют МІЗОТМ и М1З35ТОР примера 1 (фиг.28).

Для использования в мутагенезе создают два 42-мерньїх олигонуклеотида, РгіДонор!1 и РгАкцептор1. Каждьй 65 из них конструируют таким образом, чтобь! он бьіл комплементарен др350/220 генньім последовательностям центрированно либо по донорному, либо по акцепторному сайтам. Единственньім участком олигонуклеотидов,

которье не бьіли комплементарньї дрі50/220 гену, біли основания, представляющие целевье мутации.

Олиго-нуклеотидь! после мутагенеза имеют следующий вид:

РеіДонорі 2 Праймер: бст САТ СТС боб сос стт то А СТО ТстТ осо стТтТ сто ОСА тоб ж ни ж

ЕВУ: БСТ САТ СТО соб о сосС стТтТ АС ІТ ТТ ТстТ бос стТтТ сто ССА тоб

РІАкцепторі

Праймер: СТС ТСТ ТАТ АТТ ТТС АСС ТС ІС АСТ тоб СТ АбС бсА ост ТАС

Ж Н Ж

ЕВУ: СТС ТСТ ТАТ АТР ОТТС АСС АС ІС ТСТ ОТос сто АбС о ббА сст ТАС

Последовательность олигонуклеотидов после мутагенеза помечена как "праймер", тогда как ДНК последовательность, связьівающая сплайсинговье сайть! др350/220 гена, помечена как "ЕВМ". Основания, которье измененьі в результате мутагенеза, отмечень! звездочками. Штриховая линия указьівает положение сплайсинга.

Олигонуклеотиднье РгіДонор!1 и РгАкцептор1 гидролизуют до получения одноцепочечньїх клонов М13-ОТМ и М13-ЗТОР. Голознзим ТА4ДНК полимеразьі используют для получения двухцепочечной ДНК и зтой двухцепочечной ДНК трансформируют Е. соїї. Используя вектор МІЗТАС, любой из клонов, которьій содержит целевую мутацию, можно идентифицировать по изменению цвета с белого на синий в присутствии Х-даї и изотиопропилгалактата. Синие бляшки отбирают и вьіращивают, и ДНК последовательности за соединениями сплайсинга используют для окончательной идентификации мутантньїх клонов, помеченньїх как М13-МОТМ и сч дв М13-М5ТОР.

После идентификации клонов, содержащих целевье мутации, фрагментьь ВатНі/Хпо! вьрезают из і)

М13-МОТМ и М13-М5ТОР и лиги-руют обратно в РОТМ и рзТОР основнье цепи для создания конструкций

РМОТМ и рМ5ТОР, соответственно. Зти конструкциийи переносят в СНО оклетки для зкспрессий нон-сплайсинговьїх вариантов др350/220 ДНК последовательностей, как указано в примере 3. с зо Пример З

Зкспрессия др350 в СНО клетки о 1. Трансфекция др350/220 генной конструкции «г

Один из способов получения с вьісокими вніходами гомогенного дрі5о протеина настоящего изобретения из клеток млекопитающих включает конструирование клеток, содержащих множественнье копии гетерологичной - одрЗ50 последовательности. Гетерологичная ДНК последовательность оперативно связана с амплифицируемьм «Е маркером, в зтом примере геном глутаминсинтетазьі, для которого клетки можно амплифицировать, используя метионинсульфоксимин. Вектори РМОТМ и рМ5ТОР, полученнье в примере 2, трансфектируют в СНО клетки, как будет указано далее по способу СгосКей, Віо/Гесппоїсду 8 : 662 (1990) и как указано в СеїШесп

Іпзігисіоп Мапиаї! для системь! амплификации гена глутаминсинтетазь (1992). «

СНО-КІ клетки (АТСС ССКбІ1) поддерживают в не содержащей глутамина ЕМЕМ (Еадієх минимальная з с поддерживающая среда), дополненной 1095 сьівороткой плода теленка, 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, МЕМ (модифицированная среда Еадіез) несущественньмми аминокислотами, и 1 мМ пируватом ;» натрия (все полученьі от КН Віозсіепсез). Среду дополняют также 60 мг/мл глутаминовой кислоть, 60 мг/мл аспарагина, 7 мг/мл аденозина, 7 мг/мл гуанозина, 7 мг/мл цитидина, 7 мг/мл уридина и 2,4 мг/мл тимидина ( все от Сигмь). Зтот препарат средьії используют для трансфекции (причем, в случає отклонений от зтого їх рецепта имеют место указания).

За день до трансфекции 10-см чашки засевают З х 105 СНО-КІ клетками. В день трансфекции клетки 7 промьівают 10 мл средьі, не содержащей сьіворотки (для каждой чашки). Плазмидную ДНК (из РМОТМ и «г» рРМЗТОР плазмид) вносят за счет СаРО ) осаждения, используя обьічнье методики. 10 мкг осадка каждой плазмидной ДНК инкубируют с СНО-КІ клетками плюс 2 мл не содержащей сьіворотки средьії при 37"С в о течение 4,5 часа. Осуществляют тройной зксперимент для каждой из четьірех плазмид-ньїх трансфекции. Затем с» клетки встряхивают в течение 1,5 минут с 1595 глицерином в физиологическом растворе; буферированном

НЕРЕЗ. После промьівания не содержащей сьіворотки средой, ее заменяют на содержащую сьіворотку среду, и клетки инкубируют в течение 24 часов.

На следующий день зту среду заменяют на среду, содержащую 1095 диализованную бьічью сьіворотку КН

Віозсіепсев) и амплифицируют, добавляя 25 мкМ метионинсульфоксимина (Сигма). Среду, содержащую о метионинсульфоксимин обновляют каждье З - 5 дней до тех пор, пока амплифицированнье клонь! не ко оказьіваются достаточно большими для того, чтобь! их можно бьіло собрать, то есть примерно спустя 13 - 14 дней. Клоньі! собирают, соскребая колоний с чашек стерильньім устройством для пипеттирования на 200 мкл, и бр переносят в одну из ячеек пластинь! с 96 ячейками в среду без метионинсульфоксимина. Через 1 - 2 дня зту среду заменяют на среду с добавлением 25 мкМ метионинсульфоксимина, Спустя 4 дня собирают надосадочнье жидкости и анализируют на содержание целевьїх протеинов в ЕЇГ ІЗА анализе. СНО клетки также трансфектируют рЕЕ14 контрольньім вектором отдельно (которьій не содержит ЕВМ последовательностей) и 24 клона СНО-рЕЕТ14 таюке собирают и опереносят на пластиньь для контролен. (Контрольнье клонь 65 идентифицируют на оснований вьїживания в метионинсульфоксимине). 2. БГІБА анализ

После трансфекции 241 клон СНО-РМОТМ и 158 клонов СНО-РМе5ТОР собирают и виьращивают.

Надосадочнье жидкости зтих клонов тестируют на предмет получения др350 протеина. 96-ячеичнье пластинь покрьівают афинно-очищенньми кроличьими анти-др350/220 антителами (антитела МОРІ, подарок от Апагем

Могадагп), разбавленньми 1 : 2000 в 50 мМ натрийборатном буфере, рН 9. Пластиньі инкубируют в течение 3 - 4 часов и триждьі промьшают РВ5 ж- 0,0595 Твин 20, используя Мипс Іттипо УУазпег. После того, как блоть вьісушивают, пластинь! блокируют, инкубируя с 295 ВЗА в РВЗ5 ж 0,0195 Тпітеговзаї! при 37"С в течение получаса, и снова промьівают. Надосадочнье жидкости с трансфектированньїх клеток и контрольньїх клеток помещают в ячейки и инкубируют в течение 2 часов при 37"С. Затем пластиньь инкубируют с определенньм ранее /0 антителом, мьішиньм моноклональньм антителом против орЗ50/220 (антитело Мо С65221М; Віодевзідп

ІпФіегпайопаї) при 1 мг/мл разбавлений в РВ5 промьівочном буфере при 37"С в течение 1 часа. После промьівки пластиньії инкубируют с вторьім антителом, фрагментами козьего Е(аб)», коньюгированньми с пероксидазой хрена, направленньми против мьішиньх иммуноглобулинов (адсорбированньй Ід человека; Віозоцйгсе

Іпіегпайіопаї), 0,7 мкг/мл в РВ5 ж 0,0595 ВЗА и 0,0195 Тпітегоза! при 37"С в течение 1 часа. Пластиньі промьівают /5 М проявляют, используя АВТЗ (Ріегсе Спетісаї!в), растворенньій в Зіаріеє Регохіде Зи!ибрзігаїе Вийег (Ріегсе

Спетісаів) в течение 0,5 часа при комнатной температуре. Реакцию останавливают 195 ЗОЗ и пластинь считьівают на 405 и 650 нм, используя считьівающее устройство МоіІесшаг ЮОемісез Мтах ЕГІ5А. 24 РМОТМ и 18 рРМЗТОР колоний биьіли тестированьї как положительнье в отношений секретирования одр350. Колонии, которье давали найболее интенсивнье ЕГІЗА сигнальі, перенесли на пластиньі! с 24 ячейками для размножения и Ддополнительного анализа за счет Вестернблоттинга и анализа радисиммуноосаждения. 3. Вестернблоттинг и анализ радисиммуноосаждения

В начальном скринирований надосадочнье жидкости тканевьїх культур из РМОТМ трансфекций анализируют на активность в Ве-стернблоттинге. Надосадочнье жидкости СНО клеток очищают на 595 5О5-РАСЕ гелях, переносят на нитроцеллюлозу после ночи и зондируют анти-др3а5О антителами. Семь рРМОТМ клонов сч ов оказьвваются позитивньми для орз5о в Вестернблоттинг-анализе.

РМОТМ клонь, которье оказьваются положительньми в Ве-сшернблоттинге, далее тестируют с помощью і) радисиммуноосажде-ния на предмет присутствия др220. Вьібраннье трансформированнье рРМОТМ клетки, рЕЕ14 контрольнье и СНЗА19 контрольнье клетки (описаннье далее) вьиіращивают в течение ночи в пластинах с б ячейками так, чтобьї они бьіли примерно на три четверти конфлюзнтньі на день зксперимента. Каждая со зо ячейка содержит приблизительно 5 х 105 клеток. Для введения метки среду из каждой ячейки удаляют й о заменяют 0,7 мл МЕМ, не содержащей метионина (1095 сьшворотки плода теленка) ж- 100 мкКюри2535-метиони-на.Клетки инкубируют в течение 5,5 часа при 37"С, а затем обрабатьвают в Ж микроцентрифуге при скорости 4000 об/мин в течение 5 минут. Гомогенньій др35О0 протеийн в надосадочной М жидкости иммуноосаждают, добавляя 10 мкл Берпагозе-Ргоїеіп А (Сигма) в 50956 суспензий и 20 мкл моноклональньїх анти-др350/220 (антитела Мо С65221М, 100 мкг/мл, Віодевзідп Іпіегпайопа!) в течение ночи при Ж встряхивании при 4"С. Затем смесь осаждают при 2000 об/мин 2 минуть при комнатной температуре в микроцентрифуге, промьвшвают четьіре раза небольшими обьемами буферированного фосфатом физиологического раствора. После последней промьівки всю жидкость удаляют из осадка и заменяют 50 мкл « протеинового гель-образцового буфера. Образцьї, содержащие осажденньій иммунокомплекс кипятят в течение 5 минут и обрабатьшвшают на 595 505-РАСЕ. Иммуноосадки сравнивают с образцами геля надосадочньх - с жидкостей тканевьїх культур, смешанньх 1 : 1 с протейновьім образцовьм буфером. Гель вьісушивают и ч авто-радиографируют на Нурепіїт р-Мах (Атегепат). ни На фиг.3З представленьї результатьї авторадиографического исследования результатов БО5-РАСЕ анализа радисиммуноосажден-ньїх образцов. В качестве контроля используют клеточную линию (НЗ л19 (подарок ЕЦіої Кеїйї; УУнапо еї а!., 1987). ве Клетки СНЗА1Т9 секретируют усеченную форму протеина др350/220, не содержащую трансмембранного и -і С-терминального цитоплазмического домена. Для негативного контроля клетки СНО трансфектируют только одним вектором рЕЕї14 и селектируют с помощью метионинсульфоксимина параллельно с рМОТМ т- трансфекци-ей. На фиг.3 надосадочнье жидкости ("5") представлень в нечетньїх полосах, чередующихся с о 20 иммуноосажденньми ("Ір"), представленньми в четньх полосах. В контрольной полосе 2, осаждение из ЗНЗЛ19 контрольньїх клеток приводит к получению двух интенсивньїх протеиновьїх полос на примерно 220 и 350 кД, что с» демонстрирует продуцирование усеченньїх сплайсинговьїх вариантов др350 и др220 протеинов в соотношений около 1:1. Как и ожидалось, зти иммуноосажденнье полосьі! концентрированьі по сравнению с надосадочньіми жидкостями радиомеченьїх тканевьїх культур (не подвергавшиеся иммуноосаждению образцьі) в полосе 1.

Кроме того, как и ожидалось не наблюдается полос в негативном контроле (полоса 4), так как вектор рЕЕ14 не

ГФ) содержит ни одной из др350/220 конструкций.

ЗО5-РАСЕ анализ иммуноосаждений из надосадочньїх жидкостей рРМОТМ клонов в полосах 6, 8 и 10 по приводит Кк появлению отдельной )интенсивной полосьї примерно на 350 кД, аналогичной более внісокомолекулярньім образцам в СНЗА19 контрольной полосе 2. бо Однако, в противоположность ЗНЗА1Т9 контрольной полосе дополнительная интенсивная полоса примерно на 220 кД отсутствует в полосах 6, 8 и 10, хотя в полосе 8 наблюдается очень слабая полоска, смещенная в область несколько более низких молекулярньїх весов. Зто может представлять продукт разложения, совместно осажденньій клеточньй продукт или незначительное количество др220 протеина, образующегося из-за неправильной трансляции или актов мутаций, которнше возвращают исключеннье донорньій и акцепторньй 65 сплайсинговье сайть! в нативньій нуклеотид или аминокислотнье последовательности. Интенсивнье отдельнье полосьії на примерно 350 кД бьіли обнаруженьі в пяти других тестированньх МОТМ репликатах (даннье не представлень).

Непохоже, что полное отсутствие полось на 220 кД в полосах 6 и 10 связано с незффективньім осаждением из МОТМ надосадочньїх жидкостей, так как в 355-меченой СНЗА19 контрольной полосе (2) полоса на 220 кД отчетливо визуализируется. Кроме того, дополнительньйй анализ с использованием рРОТМ конструкций примера 1, которне содержат дикого типа сайть! сплайсинга, приводит к получению двух интенсивньїх полос на 350 и 220

КД. Позтому, зти результатьь демонстрируют тот факт, что делеция сайтов сплайсинга приводит к продуцированию адрз350 протеина без одновременного продуцирования др220 протеина. 70 Зтот гомогенньїй др350 протеин, зкспрессированньій в СНО клеточнье линии, или в другие клеточнье линий млекопитающих, можно получить в еще более крупньїх масштабах, и гомогенньій дрі35О протеийн можно вьіделить и очистить от кондиционной средь из клеточной линии, используя способьї, известнье специалистам, включая такие методики, как лектин-афинная хроматография, ВЗЖХ с обращенной фазой, скоростная ВЗЖХ, гель-фильтрация и т. д.. См. Юаміа, У. Іттипо Меїпод3з 108 : 231 (1988) и Мааде), Массіпе 10 : 777 (1992). 4. Нозернблоттинг РМОТМ протеина

В зтом зксперименте с помощью Нозернблоттинга показано, что клетки МОТМ-1 продуцируют др350 РНК, но не др220 РНК, подтверждая, тем самьїм, на другом уровне, что мутации сплайсингового сайта предотвращают продуцирование др220.

ДНК зондь), комплементарнье орЗ5О,бьли полученьь из рРОТМ, см. пример 1. Матрицу зонда др350/220, ХРАб4, вьіделяют в виде 464 рр ХпоІ/Рзії рОТМ фрагмента. ХР464 распознает как др35О, так и др220. Для получения дрЗ5О-специфического зонда АМ537, рОТМ разрезают за счет МсоЇ и Маеї, вьіделяют два перекрьивающихся фрагмента 580 рр, и полученную смесь разрезают Хтпі для исключения одного примесного фрагмента, и за счет АЇшШІ до получения 537 рр АІш/Має!ї фрагмента внутри др350/220 сплайсингового сайта.

АМ537 специфичен для участка, сплайсированно-го из др220 и, таким образом, специфичного для др35о Ге

Ммесседжа. ДНК зондь! метят З2Р-4СТР ник-трансляцией (Атегзпат), используя ДНК фрагменть! ХРАб4 и АМ537. о

Целую клеточную РНК получают практически в соответствии со способом Спотсгуицпекі апа Засснпі, Апаї.

Віоспет., 162 : 156 - 59 (1987). Среду из двух Т-250 склянок каждой СНО-рРЕЕ14 (в качестве негативной контрольной линии, см. пример 1), СНО-МОТМ и СНО-ОТМ-7 клеток, 9095 конфлюзнтньх, отсасьввают и клетки подвергают лизису и соскабливают в денатурирующий буфер (10 мл гуанидинтиоцианата, 25 мМ цитрата «(о натрия, рН 7,05 саркозила, 100 мМ 2-меркаптозтанола). Каждье 10 мл лизата дополняют 1 мл 2М ацетата о натрия, рН 4, 10 мл насьшщенного фенола, рН 4,5 и 2 мл смеси хлороформ / изоаминоловьй спирт; полученньй лизат инкубируют на льду 15 минут, вращают при 10000 д в течение 20 минут при 4"С и верхнюю водную фазу Ж удаляют. РНК осаждают из водной фазьі, добавляя один обьем изопропанола при 207С в течение 1 часа, М осаждают при 4"С, снова суспендируют в денатурирующем буфере и снова осаждают. РНК осадок промьівают 1Х в 7095 зтаноле, сушат в Зреед-Мас и снова суспендируют в ОЕРС-обработанной воде. «І

ОТМ-7 и МОТМ-1 полньсе клеточнье РНК денатурируют при 65"7С в течение 15 минут в 1595 формамиде и 690 формальдегиде, обрабатьввают на 195 агароза / 6,695 формальдегидньїх гелях и переносят на нитроцеллюлозу за счет капиллярньїх взаймодействий, затем зондируют меченьми ХР464 и АМ537. ДНК зонь!ї денатурируют за « счет кипячения в течение 5 минут, гибридизуют в 5Х 5ЗРЕ при 65"С в течение ночи и нитроцеллюлозу промьівают в условиях вьісокой жесткости. Авторадиографию осуществляют, используя Віо-Кай - с фосфоимеджер. ч Нозернблоттинг полньїх клеточньїх РНК из СНО-МОТМ клеток демонстрирует зффективность сплайсинговьсх -» мутаций по предотвращению продуцирования др220-специфических РНК. др350О-специ-фический зонд, АМ537, связан только с одним из видов РНК в МОТМ-1 и ЮТМ-7 клетках (фиг.4, полось 1 и 2), как и ожидалось для др-350-специфического зонда. Зонд ХР464, которьій специфичен как для ор3З5О, так и для одр220 РНК, т. распознаєт два вида в ОТМ-7 и отдельную более вьісокомолекулярную полосу в МОТМ-1 (фиг.4, полось 4 и 3), -1 как и ожидалось, если сплайсинговье мутации предотвращают продуцирование др220 месседжа в МОТМ-1.

Даже если МОТМ-1 полосьї перегруженьії для др350-специфической РНК, не наблюдаєтся видимой др220 РНК. т. Причина для различий в кажущейся подвижности др350 месседжа в МОТМ-1 по сравнению с ЮОТМ-7 полосой о 50 неизвестна. Видьї МОТМ-1 перегружень! по сравнению с ЮОТМ-7, что может повлиять на миграцию в геле. Кроме того, др35О месседж вьіїходит вблизи к интенсивной рибосомной РНК полосе на геле, что может нарушить с» кажущийся молекулярньй вес. В любом случає наличие отдельньїх видов, комплементарньх одр35о ДНК последовательностям, дает возможность предположить, что зтот сигнал представляет 90350 мРНК. Таким образом, мутации в донорном и акцепторном сайтах сплайсинга зффективньії для предотвращения продуцирования др220 мРНК по данньім Нозернблоттинга. Зтот результат в дальнейшем подтвержден за счет о радисиммуноосаждения, используя моноклональнье антитела специфичнье для др350/220, а также за счет

Вестернблоттинга МОТМ-1 и ЮОТМ-7 надосадочньїх жидкостей. ко Пример 4

Тестирование гомогенньїх 94р350 протеинов на иммуногенную активность бо Очищенньсе гомогеннье дрзібо протеинь! вводят в соответствующие носители для введения и вводят мьішам следующим образом. 2х адьювант-носитель концентрат приготавливают, смешивая Рішгопіс І 121 и сквалан в 0,495 (обьем/обьем)

Твин 80 в буферированном фосфатом физиологическом растворе с (Тиг") МОР в соответствии со способом

Бамід, 9. Іттипої. Мейодз 108 : 231 (1988) и АЇїїгоп, 9. Іттипої!. Меїйодз 95 : 157 (1986). бо Состав для введения приготавливают, добавляя равнье обьемь! протеина и адьюванта-носителя в день введения. Содержание протеина должно бьїть в интервале от 5 мкг до 50 мкг на дозу.

Мьішей штамма ВАЇ В/с иммунизуют тремя по 0,1 мл внутримьішечньїми иньекциями в 0, 21 и 42 день. Кровь от пре-иммунизованньїх последовательно на 10 день после каждой иньекции отбирают из ретроорбитального синуса.

Уровни антител в сьіворотке определяют в анализе ЕГІЗА по способу примера 3. ЕВМ нейтрализующие антитела в сьіворотке подсчитьвают по их способности ингибировать трансформацию лимфоцитов крови спинного мозга плода у ЕВМ ин витро по способу Мозв, у. Мігоії. 17 : 233 (1972) и Ое Зспгумег, Іпі. У. Сапсег 13 : 353 (1974).

Соответственно Новозеландским бельм кроликам инокулируют внутримьшечно пять доз протеийна, 7/0 Ззмульгированного в указанном ранее адьюванте в 0, 21, 42, 63 и 84 дни. Дозьі должнь! бьіть в интервале от около 5 мкг до 50 мкг на инокуляцию. Сьіворотку получают через две недели после последней дозь и тестируют по титрам антител к антигену, для перекрестно-реактивного антитела к вирусному др350/220 из В95-8 клеток и для ин витро ЕВМ-нейтрализующей активности по способам Етіпі, Мігоїоду 166 : 387 (1988).

Так как способности ЕВМ др350/220 протеина индуцировать защитньй иммунитет против ЕВМ инфекции на /5 Модели животньх уже бьіли установлень, см. Ерзіеїп, Сііп. Ехр. Іттипої! 63 : 485 (1986), окидаются аналогичнье позитивнье результать! от введения композиции гомогенного драбо протеина.

Раскрьїтия всех приводимьїх здесь публикаций включеньі сюда по ссьілкам, Подробное описание приведено только для большей ясности и понимания и никоим образом не является ограничивающим обьем изобретения, в которьій входят все модификации, которье будут очевиднь! специалистам.

Описание последовательностей (1) Общая информация (І) Заявитель: Зраевїе. Кіспага апа дасКтап, УМіпіпгор, Т. (ї) Название изобретения: Нон-сплайсинговне вариантьї др350/220 (ії) Количество последовательностей: 19 сч (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 1: () Характеристика последовательности: і) (А) Длинна: 27 пар оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная с зо (Ю) Топология: неизвестна (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК о (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 1: «Е

СОПАТССТАбА СТОСОССТТІТ АВБОСОТА їм (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮО МО: 2: «г () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 19 пар оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная « (Ю) Топология: неизвестна з с (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 2: ;» САСТОСОССТ ТТАСОССТА (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮО МО: 3: () Характеристика последовательности: т» (А) Длинна: 6 аминокислот - (В) Тип: аминокислота (С) Топология: линейная

Її (ії) Тип молекуль!: протеин о 50 (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 3:

Авр о Сув діа Рпе АгУ АхЯ сб» 1 є (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 4: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 27 пар оснований

Ф) (В) Тип: нуклеиновая кислота ка (С) Вид цепочки: одинарная (Ю) Топология: неизвестна во (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 4: содтостсто ттсСстТтстТосСс тТесСАСТО (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮО МО: 5: () Характеристика последовательности: бо (А) Длинна: 21 пар оснований

(В) Тип'нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная (Ю) Топология: неизвестна (ії) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 5: тостотТтостт СстОСтТосСАСТ о (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 6: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 16 пар оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная (Ю) Топология: неизвестна (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 6:

ТАТАСАСТАЯ ТСТАСО

(2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 7: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 18 пар оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная (Ю) Топология: неизвестна (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК с (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 7: о

АТСТаАТСАВ АТОСТТАА (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮО МО: 8: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: ЗОпар оснований о (В) Тип: нуклеиновая кислота о (С) Вид цепочки: одинарная (Ю) Топология: неизвестна « (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК М (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 8:

АДАССТСТОСА ТОСТАСТАСТ ОСТСАТОССО САСТОСОСС - (2) Информация для последовательности ЕС ІЮ МО: 9: (Ї) Характеристика последовательности: (А) Длинна: 13 аминокислот « (В) Тип: аминокислота з с (С) Топология: линейная . (ії) Тип молекуль!: протеин и?» (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 9:

Авзп теп бЗеї Мес цем Маі Пец Чаї Мес Аїа Азр Сув Аіїа 1 5 10 о (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 10: -І () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 30 пар оснований ве (В) Тип: нуклеиновая кислота с ШІ (С) Вид цепочки: одинарная (Юр) Топология: линейная с» (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 10:

ААССТСТОСА ТОСТАТАВАС ТАСТІСТАВНО

(2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 11:

Ф) () Характеристика последовательности: ка (А) Длинна: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота во (С) Топология: линейная (ії) Тип молекуль!: протеин (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 11:

Авзп о бем о бет Мебї Ге) 1 5 бо (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 12:

() Характеристика последовательности: (А) Длинна: 24 парьії оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 12:

КАССТСТОСА ТОСТАСАСТО СОСС

(2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 13: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 8 аминокислот (В) Тип: аминокислота (С) Топология: линейная (ї) Тип молекуль!: протеин (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 13: дяп о це о бет о Месє Бем Азря Суз Аа 1 5 (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 14: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 24 парьії оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная сч (Юр) Топология: линейная о (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: БЕС ІЮ МО: 14:

СОТСАТОТОО СОСОССТТТО АСТСТОТОСС ОТІСТСССАТ 00 с (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 15: о () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 24 парьії оснований « (В) Тип: нуклеиновая кислота М (С) Вид цепочки: одинарная

Зо (0) Топология: линейная « (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 15:

ОСТСАТОТСО ООбОССТТАС ТІТСТоТоСС ОТІСТОССАТ Сб « (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 16: - с () Характеристика последовательности: а (А) Длинна: 42 пар оснований "» (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная (Юр) Топология: линейная т» (ї) Тип молекуль!: олигомерная ДНК -1 (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 16:

СТСТСТТАТА ТТТТСАССТС САСТТОСОсТО АССОСАССТІ до ь (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 17: (ав) 20 (Ї) Характеристика последовательности: (А) Длинна: 42 пар оснований сю» (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: одинарная (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: олигомерная ДНК

ГФ) (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 17: ко СТСТСТТАТА ТТТТСАССАС СТОТТСОСТО АОСОаАОСТТ до (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 18: 6о () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 3833 пар оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Вид цепочки: двойная (Ю) Топология: неизвестна бо (ї) Тип молекуль!: кКДНК

(їх) Характеристика: (А) Имя/ключ: СОЗ (В) Локализация: 1014..3734 (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 18:

САЛТТССАТА ААТОАААСАС ОСТОСТСАСО ТОТТАЛААСТ ТОСТОСеваА ТІТТССТОдо бо

ССТОССІСТСТ АТАОССАТАТ АСТСАААПАА ААТАСТОТАС СбОСОАТТАС дОСТОТОТАС 120

ААТСТТАССС АССаАОСТСТ СААСАТАСЛА ССАСТООСЧА ТОСССООООО ТАСАТСОСОЗ 180

САОСТТААДО СТОССбОСОС ААААСОТСАС ОТОАСАССТА СООССАССТО ТОСАСССАЛО 240

ТСТОпССТОб ДОСАТОТАСОА АтТатТосадосТ СОТСТООТОА ТОСОТОСТАОС ТОТАСАТССА 300

ССТОСІСТАТ ОССТОСТААС ССАТАСЗССА ТССООСОбСС АООЗтТІТасА СТСТОСАТТТ 36О

ССССТОАтТСТ СТАСОАПАДО СТОСОАТТТСТ СССлЛСПАТСТ СТААТОСССТ стосАдтТоос 420 с

САТОССАТАС АТТАТСТАСА ТСТССОТАТТ ТОАААТСТОС АТССПААДАА СТОСТСТАТе 480 Ге)

ССТОСТаТОТ СОАТОСОСТО АААССАДСОО СААСАААТТА СТТАССТІсТ ТОТТОТаТОд 540 со

ТОСОТАДАЛА САСАСАТСАС АСАСТТАВОС САТАСОСАТа СТСАССОТАБ ССбСаостТоеС оо о «

ААТСОСТТОА АСАЛОТСТТС ТТАСАТСТА ТОЗАААССТО СОЗАпАдтТОсС СстТтІСсТеСССС Ст) - «

АдОоСОАСАТСС сОсСТОсстТо ССАОСАТОСО ТОСТОСТОаА ОСТаАСССАС СООСАТСАТО 720 «

АтТСаАсСссосС ТТІСТСТІТСо ТАСССТТСТо СОССоОсСтТоС АбоТОопосСАТ СТІСТОоСстТтТо 780 З за с "з СТІТІСТОАС СТОСТАТСТО АТААСТСТАТ БАОСАСАТТТ ТСССААТСТО ССОСССАТАС 240 СТОТТССТОС АСЛАСССАСО ТАПАТОЗаАС ТІСТІСТТСС АТОТІОТСАТ ССАОСОСОССО з00 г»

Ше сасдоесссос СІСТОСТТОТ ССАТТТТОТС ТОСААСЛАДА СТОТОАСТСА ССЛАСАССпС 560 г»

ОО 020 дАесосостто ТАССТАТТАА АСЛОСАТОСТ ОССТАСАЛАТ ССОТОССаЛО АСА АТО 1016 сб» Несє 1 о бАс ссСА ОСС ТТОо СТІ СТО ІСТ САС ТАС АСС АТС сло АБС СТО АТС САТ 1064 юю ббіш Аїя Ліда Гви пе) Ма1ї Сув біп Тух Тк І16 біп Бек Газ І1е Нів 5 10 15 бо б5

СТО АСО ОТ бАА САТ СТ ОТ ТТТ ОТТО ААТ СТТ бЗАб дТТ ССО СААд ТТ 1112

Геч ТЬтг о біу біз Авр Рго сб1іу Ре Рпе Азп Уа1ї 01 ІзЗе Рго біч Ре 20 25 30

ССА ТТТ ТАС ССС АСА ТОС ААТ СТТ ТОС АС ОСА САТ СТО ДАТ ОсТА дет 1160

Рго Ре Тут Рго Тпг Суб АвпоУаї Сун ТНІі Азія Авр оуаї Авп о Ууаї Тох й 35 40 145

АТС АДТ ТІС САТ ОТО ббо СОС АДАА ЛАС САТ САД СТТ САТ СТТ САС ТТ 1208

І1е Авп Ре Азр Уа1 біу біу Ббуз Цув Нів біп Пец Авр Газ Авр Ре " 50 55 бо 65

Сас САС СТО АСА ССС САТ АСО АдО ОСТ ОТС ТАС САА ССТ СОд Ост СА 1256 б1у біп Пес ТВтг Рто Ні ТІ Цуз А1їа Уві Тут біп Рго Агу біу А1а 70 75 80

ТТТ ОСТ бос о ТСА САЛА ААТ ОСС АСС ААТ СТО ТТТ СТА сто сло сте стт 1304 СМ Вде біу біу бег біч Авп А1іа Тк Авп цеч Рае Цей Ццец біц цей тез о 85 20 35 со зо СОТ ОСА ОСА БА ТО ОСТ СТА АСТ АТО СОС ТСТ ДАб ААС СТТ ССА дІТ 13152 о

Сіу Аза б1у бій Бцеч Аїа без ТпПх Меє Агту беї Бук Був цей рРго І1їе 100 105 110 М ї- ААС СТО АСС АСС ОСА САФ САС САЛО САА СТА АБС СТО САД ОТСТ СТА САТ моб З

АзпоУаї Тпу Тік обіу січ б1 біп біп Маї бек Гед біч Зех Уаї Двр 115 17270 125 « 8 с ОТО ТАС ТІТ СДА ОАТ сто ТІТ ОООА АСС АТО ТОб ТОоС САС САТ ОСА ПСдА 1448 їз» Уаї Тух Рпе біп Ар Уаї Рпе біу ТНх Мес Ттр Сув Нів Нів А1а Сі) 130 135 140 145 ь АТО САА ААС ССС СТО ТАС СТО АТА ССА САЛА АСА СТО ССА ТАС АТА лАб 1496 їв. Мет біп Авп о Рто Уаї Тут цеч І1е Рго Сіш Тв Ууаї Рго Тут І1в Був т» 150 155 150 о се» ТОО САТ ААС ОТОТ ААТ ТСТ АСС ААТ АТА ДСО ОСА СТА ста лоб о ссСА сдо 1544

Ттр Авр Авп о Суб Азп бек ТІ А5пої11є ТБг Азія Уаї Уаї Агу дія біп 165 170 175

Ф) г) а СТО бАТ ОТ АСО СТА СОС ТТА дат ота ССА АС ТСА ОСТ САД ПАС 1532

Ф1іу їв АБр оМаї ТЕ Бей Рго Ццеч 5еї Гец Рго Тіг бек діа біп Авр бо 180 185 190 б5

ТС ААТ ТТС АбС СТА ААА АСА САА АТО СТО СОТ ААТ САС АТА САТ АТТ 1640 бек Авп Рпе Бек УМаї ПЦує Трпг Сі Меє пем О1у АБп бій І16 Азр Т1е 195 200 205

САС ТОТОССт АТО САС САТ ОС САА АТТ ТСА САА СТТ СТО ССС соло САС 1688 біз Суз --е Мес бій Азр Сіу біц І16 Бех біп Уаії Те рго біу дар 0 а210 215 220 225

ААС АЛЛА ТТТ ААС АТС АСС ТОС АСТ ОСА ТАС САС ДОС САТ стІТ Сес дос 1716 18 Авпомув Ре Ап о І1е Тіт Суб бек біу Тут й1ч бат Нія Чаї рРко бег 230 2135 240

СОС ббА АТТ СТО АСА ТСА АСОСАСТ ССС СТО ОСС АСС ССА АТА ССтТ сстТ 1784 а1ї1у О01у Ії Пес ТБг бет ТІ бБет Рго Уаї А1їа Так Рго Ії Рхо 1у 245 250 255

АСА Об ТАТ ОСА ТАС АОС СТО СОТ СТО АСА ССА СОТ ССА СТО ТСА сСоА 1832 с з ТпІ біу Тут А1Та Тут Зет їю Аку Це ТпІ Рко Аг Рко Уаї беї Ах і) 260 265 270 (зе) зо ТтТтТ СТтТ СОС ДАТ ААС АСТ АТО СТО ТАС ОТО ТІТОТАС ТСТ ОО ААТ ОСА 1880 о бе цей 01у Авп Авп о бек Ііе Пец Тут Уаії Рпе Тут БбБет п1у Авп біу « 275 280 285 їм Ссб АДС боб АСС соб СсА САТ ТАС ТОС АТТ САС ТОС ААС АТТ сто ТС іага

Рго Шуз А1їа беї біу б1у Авр Тут СувБ Ії ббіп бетгї Абп І1еє Уаї Рре 290 295 300 305 « о, с ТСТ ОАТ ОодО АТТ ССА ОСТ ТСА САС САС АТО ССб ДСА ААС АС АсСА Од 1976 з бег Авр бій ІЇ12е Рго Аіа Бек б1іп Ар Мес рРто ТБх Азп о Тит ТНІ Авр 310 315 320 їх -1 АТС АСА ТАТ сто пт САС АдТ ОСТ АСС ТАТ ТСА СТО ССА АТО СТО АСТ 2174 їч І1їе тік Тук Уа1ї сб1іу д5Бр Авп Ала Тк Тут бет чаї Рго Мес чаї ТЕ 325 339 335 (ав) с» ТСТ СдО ПАС ОСА дДАС ТСО ССА ААТ ОбТТ АСА ОТО АСТ о оСсС Тіт тоб ОСС 2072

Зехт біз дар Аіа Авзп бек Рго Аяп Уа) ТІ Уаї Тих Аза Ріе Тер Аїа 29 340 345 350

Ф) о ТСО ССА АДС ААС АСТ САА АСТ САС ТТТ АЛЛО ТС АВА ТО СТ ОСТ дес 2120 во Тір Рго АзЗпоАвБп о Тлг біЗч Так Азр Рбе Був Сув Ппув Ткр Тйг цеч ТНг 355 360 365 65

ТС соб АСА ССТ о ТСОа ост ТСТ САА ААТ АТТ ОТСТ СОТ СА ТТтТ бо дос 2168 бак біу Тіг Рко бек біу Сув 010 Абзп І1е Зег біу А1із Ре д3я сег 379 175 380 185

ААТ ССС АСА ТТТ САС АТТ АСТ СТО ТСО Ост о сСтт СОС доб ссС ССС до 2216 деп Аг Так Ре Азр о ї16 Тіт Уаї Зек біу її с1у ТБг Аза рРко Гув 390 395 400

ДСА СТО АТТ АТС АСА ССА АСС ОСТ АСС ААТ ОСС АСС АСА АСА ДСС САС 2264 /5 Ті їеч І16 Ізїе Тіг АгЯ Тіт Аза ТЕ Авп АТа Ту Тпг о Тих Тнг Нів 405 410 415

Ада ОТТО АТА ТІС ТОС АД ОСА ССС СА АС АСС дАСС дос ТОС ССТ СС 2312

Був Маї І1їе Рре Бех Ітув Аіа Рго бі бек ТНІ ТІ Тк бЗег Рго Тих 420 425 430 зв ТТ ААТ АСА АСТ ОСА ТТТ ОСТ САТ ССС ААТ АСА АСО ДСА СОТ СТА СОС 2360 см

Тїец Азп Тих ТВг біу Рбе Аїа Ар Рго Авп Тк Тк Тіт б1у пе рго і) 435 440 445 со дес тТстТ АСТ САС ста ССТ АСС ААС СТО АСС ОСА ССтТ ОСА АБС АСА ОС 2408 о бЗег 5етї Тік Нів Чаї Рто Тік Абп це ТІ Аза Рко Аіїіа бек ТБг біу « 450 455 450 465 м «

ССС АСТ СТА ТС АСС ССО САТ ОТС АСС лЛОС ОСА АСА ССА ОСС ОС АСА 2456

Бко ТЕ Маї бехт Тпх діа Авр Уаї ТБт бек Рго ТЕ Рго діа б1у ТНг 470 475 480 «

І ші с АС ТСсА БОС ОСА ТСА ССО сто АСА ССА АСТ ССА ТСТ ССА тоб ПАС ААС 2504 :» Типг бег Сіу діа бекг Рго Уаії ТІ Рко Зег Рго Зех Рко Тер Авр Ап 485 430 495 їх -1 СОС АСА САА АСТ дл ССС ССС САС АТО АСС АОС ТОС АСС ТСА ССА сто 2552 ї» сіу ТЕ біз бег Був А1тїа Рго Авр Мес ТІ бек бег Тіт бек Ркго Уаї1 о БО 505 510 бе»

АСТ АСС ССА АСС ССА ААТ СС АСС АОС ССС АСС ССА ОСА СТО АСТ дес 26500

Тит Тв рРко ТЕ Рго Ап Аза ТВі бег Рго Ту Рго діа Чаї ТНІ ТБг 7 515 520 525

Ф) й ССА ДСС ССА ААТ ССС дос АОС ССС АСС ССА ОСА СТО АСТ АС ССА ОС 2548 во ВКко Тих Рко Ап Аза Тах Бег Рго ТІ Рго Аіл Уві ТЕ ТІ Рко ТІ 530 535 540 545 65

ССА ААТ ОСС дес дос ССС АСС ТТО ОА АДАА АСА АДБТ ССТ АСС ТСА ССА 2596

Рго Ап о Аіа Тг обеїх Рго ТБх Пей б1іу Був ТІ Зах Рго їТйс Зек Аза 550 555 50

СТО АСТ АСС ССА АС ССА ААТ ОСС АС дос ССС АСС ТО ссДд АдДА ДСА 2744

Чаї ТБІ ТвВІ Рго Тпг Рко АбБпоАзїа ТпІ бех РКО Таг Гу біу уз Так 70 5е5 570 575

АОС ССС АСС ТСА ОСА СТО АСТ АСС ССА деСС ССА ААТ ОСС АСС дос ССС 2792 бег Рго ТК бЗеї Аїа Уаї ТЕ ТЕ Рко ТІ Рко Авбп о діа Тк бег Рго " ВО 585 5З0

АСС ТТО бОА ДАд АСА АОС ССССАСС ТСА ОСА ОТС АСТ АС ССА АС СсА 285840 тіж це біу цув Тіг бек рго Тпг бек А1їа Уаї Тпх ТІ Рго ТК рРго 535 вод 05

ДАТ СС СС СОС ССТ АСТ СТО сспА САД АСА АТ ССА СА ОСА АдІ со 2388 с 75 Авп Аїа Тік біу Рго ТБу Уаї біу біц ТЕ бег Рго біп Аза Авп діа (6) 510 615 520 625 со зо ВАСС ААС САС АОС ТТА ОСА СОА АСА дОТ ССС АС ССА СТА ст АС АОС 2936 о

ТЕ АБп о Нів Тк Без 01у біу ТІ бет Рто ТЕ Рго Уа1ї Уа! Тиг бБег 630 535 640 З м-

САД ССА ААд ЛАТ СА АСС дСТ ОСТ СТТ АСС АСА СОС САА САТ ДАЄ АТА 2984. біп Рго руб АБп о Діа ТІ бек А1їа Уаї Тапг тт біу біп Ніб деп Іїе 645 65О 655 « ші с АСТ ОТСА дОТ о ТСА АСС ТСТ о ТОС АТО ТСА СТО АСА ССС АСТ ТСА ААС СсСА 3032

Із» ТЕ Зеї бек бЗек ТІ Зек бек Мес бет Гей Агу Рго 5еї Бек А5п Рго бе 665 570 чї»

СА АСА СТО дос ССС ТС АСС АСТ САС ААТ ТСА АСО ТСА САТ дтТОо ССТ 3080

В. Сі Тбт Ге бех Рго бет ТВг бег АБр Авг беї Тіт Заг Нів Мес Рго ь 675 во ва5 о с» ТІА СТА дес о ТСС ОСТ САС ССА АСА бот ОСТ бАА ААТ АТА АСА САС СТО 3128 пе Ббец ТІ Бет А1їа Нів Рго Тйг с01у С1іу біч АбЗп ї1еє ТІ біп Маї аЗзо 695 то 705

Ф) ко) АСА ССА ССС ТСТ АТО АБС АСА САТ САТ СТО ТОС АСС о АсТ тоб ССА сЬА 3176

Тах рго Аіа бек І12е бЗеї ТЕ Ні Нів Уаї беї ТпІ бек бек Рхко січ щ 110 715 720 65

ССС СОС ССА СОС АСС АСС АОС САД Со ТСА СОС ССТ ОСА ДАС дот ТСС 3224

Рго Ат Рто 01у ТПх ТІ Зет біп АТа Бек біу Рго біу А5п бек бег 725 710 715

АСА ТСС АСА ААА ССО ббо САС СТІ ААТ СТО АСС АЛА сос де сес сес 3272

Твк бек ТК цу Рго Сіу біч Уаї Азп Уаї Тк Був біу Так Ртго РІО 749 1745 759

СААЛ ЛАТ ССА АОС ТО СОС СА ОСС ССС АБШТ СОС САЛА ДА доб сса ст 3320 18 Сіп Азп Аза Тпт о Зехк Рто біп Аїа Рхо бег біу 01п Цуз ТБг діа Уа) 755 760 765

ССС дАСО ОТС АСС ТСА АСА ОПТ ОСА ААб ОСС ААТ ТСТ АСС АС ОСТ сад 3368 ВБто ТБг Уа! Тит бек Тих біу біу Гув А1а Авп бет Тк Тнк б1у С1у 770 715 780 таб р; АМО САС АСС АСА ОСА САТ ОСА СОС СО АСА АСТ АСА САС ССС АСС АСА 3416

Гув Ні Тк о ТвВх З1іу Нів 51у Аїа Аг ТБт Бех Тг біз Рго Тх тТаг о 790 735 800 со зо адт ТАС (С бот АТ ТСА АСТ АСО ССА АПА ССО АПА ТАС ДАТ осо дес 3464 о

Авр тут с1і1у біу Азр бЗех ТНг ТВі Рго Ат РКО Агд Тут Аязп о Аїа Тпг « во5 810 815 Кк «

АСС ТАТ СТА ССТ ССС АБС АСТ ТСТ АБС ААА ос ТО соб сСес о сосС топ дСтТ 3512

Тпт Тут Гез Рго Рго бег ТІ бек Зек Цув Пйеч Ага Рко Аку ТІр ТЕ а20 825 830 « ші с ТТ АСОо АОС сСА ССО ОТ АСС АСА ОСС СА ОСС АСС ОТО СссА Сто сс 3560 ;» Рне тпг бег Рго Рго уаї Тйх Тнг АБа б1іп Аїа Тк ува) Рто Маї рко 835 840 845 їх -1 ССА АСО ТСС САС ССС АСА ТІС ТСА ААСОСТО ТОС АТО СТА СТА СТО САС з6о8 1» Рго ТБт бек біп Рго АхЯ Ра бег Ап Без бек Меб Пен Уаї Івч сій о 850 855 во вЕ5 бе» тоз'всс тост сто ост сота сто АС ст осто сто ста сто ото АТО осо 3656

Ттр Аїа бет Тем Аза Уаї Тжиа ТІ ви цеч Це Без Бец Уаї Меє діа 5 870 875 аво

Ф) з ФАС ТОС ОСС ТІТ АБО СОТ ААС ОТТО ТСТ АСА ТОС САТ АСС ТАС АСС СС 3704 во Аво Сув діа Ре Аг Аг Авп о Пцеч Беї ТІ Зех Нів СПЕ Тут ТЕ Тіх ва5 830 625 65

ССА ССА ТАТ САТ САС ССС САС АСС ТАТ СТА ТААЛОТСАЛТ АААААТТТАТ 3754

Рто Рго Тут Авр Авр Аїа Січ ТБг Тук Уві 900 905

ТТТОСАСТТТ СТІТОСТТСА

ТРАТСАВАКА СоТоСссСсоо АССОССАССО СОСАССТССЯ 3814 о стоссоттоо сотостттє 3833 (2) Информация для последовательности ЗЕО ІЮ МО: 19: () Характеристика последовательности: (А) Длинна: 907 аминокислот 19 (В) Тип аминокислота (С) Топология: линейная (ії) Тип молекуль!: протеин (хі) Описание последовательности: ЗЕО ІЮО МО: 19:

Claims

Формула винаходу

1. Вьіделенньій фрагмент ДНК, кодирующий белок ор35О ЕВМ или усеченньй вариант ор350 ЕВМУ, претерпевший делецию в трансмембранной области, что приводит к образованию секретируємого продукта, /-ЄМ 29 или делецию трансмембранной области и остального С-конца и/или делецию сигнального фрагмента, причем г) указанньій фрагмент ДНК содержит мутацию одного или нескольких участков сплайсинга, что предотвращает образование мРНК-транскрипта др220.

2. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию донорного участка сплайсинга. Ше

З. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков о сплайсинга представляет собой мутацию акцепторного участка сплайсинга.

4. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков - сплайсинга представляет собой мутацию и донорного, и акцепторного участков сплайсинга. М

5. Фрагмент ДНК по п. 4, отличающийся тем, что в нем, по крайней мере, один нативньїй нуклеотид, 32 кодирующий серин в кодоне 501 последовательности, кодирующей белок д9р350 ЕВМ, заменен ненативньм - нуклеотидом, и в котором, по крайней мере, один нативньій нуклеотид, кодирующий глицин в кодоне 698 указанной последовательности, заменен ненативнь!м нуклеотидом.

б. Фрагмент ДНК по п. 71, отличающийся тем, что ДНК кодирует усеченньй вариант ор35О ЕВУ, « претерпевший делецию, по крайней мере, 8 аминокислот в трансмембранной области, что приводит к образованию секретируемого продукта. в с

7. Фрагмент ДНК по п. б, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков "» сплайсинга представляет собой мутацию донорного участка сплайсинга.

"

8. Фрагмент ДНК по п. б, отличающийся тем, что указанная мутация одного или нескольких участков сплайсинга представляет собой мутацию акцепторного участка сплайсинга.

9. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что указанньій фрагмент кодирует фрагмент белка др350 ЕВУ, те состТоЯящий из: -і (а) кодонов 19-862 аминокислот, (в) кодонов 1-862 аминокислот, о (с) кодонов 19-862 и 882-907 аминокислот и с ШІ (4) кодонов 1-862 и 882-907 аминокислот.

10. Вектор, содержащий фрагмент ДНК, охарактеризованньй в любом из пунктов 1, 3, 5, 6, 7, 8 или 9. с»

11. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 10.

12. Способ получения белка ор3З35О, предусматривающий культивирование клетки-хозяйина, охарактеризованной в п. 11, в подходящей культуральной среде и вьіделение указанного белка др350 из 59 указанной клетки. ГФ)

13. Гомогенньй белок др350 ЕВМ, кодируемьй фрагментом ДНК, претерпевшим делецию в участке, кодирующем трансмембранньй домен, или в участках, кодирующих трансмембранньй домен и остальной ді С-конец, и содержащий нефункциональньй сайт сплайсинга таким образом, что 9р350 ЕВМ зкспрессируется в растворимой форме и в отсутствие др220 ЕВУ. 60

14. Белок 90350 ЕВМ по п. 13, отличающийся тем, что в указанном белке делеция в трансмембранной области включает делецию от Зегвбо до АІдадві последовательности, представленной в п. 5.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая гомогенньій белок др35о0 ЕВУ, охарактеризованньй в п. 13, в смеси с фармацевтически приемлемь!м носителем.

16. Способ профилактического лечения связанного с ЕВМ заболевания или состояния, предусматривающий бо введение пациенту фармацевтической композиции, охарактеризованной в п. 15, в количестве, достаточном для стимуляции иммунного ответа у указанного пациента.

17. Композиция, содержащая гомогенньій д9р350 ЕВУ, вьіделенньїйй из культуральной средь! клетки-хозяина, которая зкспрессирует и секретирует в культуральную среду белок др350 ЕВУМ, кодируемьй фрагментом ДНК, претерпевшим делецию в участке, кодирующем трансмембранньй домен, или в участках, кодирующих трансмембранньй домен и остальной С-конец, и содержащий нефункциональньй сайт сплайсинга таким образом, что одр35О ЕВМ зкспрессируется в растворимой форме и в отсутствие 9др220 ЕВМ, в смеси с фармацевтически приемлемь!м носителем.

18. Способ профилактического лечения связанного с ЕВМ заболевания или состояния, предусматривающий /о введение пациенту фармацевтической композиции, охарактеризованной в п. 17, в количестве, достаточном для стимуляции иммунного ответа у указанного пациента. с щі 6) (зе) «в) « ї- « -

с . и? щ» -І щ» («в) сю» іме) 60 б5