CN112592410A - 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 - Google Patents

犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112592410A
CN112592410A CN202110237485.6A CN202110237485A CN112592410A CN 112592410 A CN112592410 A CN 112592410A CN 202110237485 A CN202110237485 A CN 202110237485A CN 112592410 A CN112592410 A CN 112592410A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
gene
recombinant
cav
canine adenovirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110237485.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112592410B (zh
Inventor
曹文龙
孔迪
滕小锘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Womei Biology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110237485.6A priority Critical patent/CN112592410B/zh
Publication of CN112592410A publication Critical patent/CN112592410A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112592410B publication Critical patent/CN112592410B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
    • C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/075—Adenoviridae

Abstract

本发明公开了一种犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗包含融合蛋白以及医药学上可接受的载剂，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示序列。本发明提供的所述疫苗安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，并且还可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。

Description

犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，属于动物免疫药物技术领域。
背景技术
犬腺病毒（Canine Adenovirus，CAV）感染引起的传染性疾病称为犬腺病毒病（Canine Adeno，CA）。CA是对包括犬在内的多种哺乳动物的一种致病性强、感染范围广、高度接触性传染病。CAV常与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）等混合感染，增加了临床症状的复杂性。根据血凝抑制作用和中和作用的不同，CAV分为犬I型腺病毒（Canine adenovirus type l，CAV-1）和犬II型腺病毒（Canine adenovirus type 2，CAV-2）两个血清型。CAV-1能引起以传染性犬肝炎和狐狸脑炎为特征的全身性感染，且能导致眼睛损伤，能感染犬、狐、狼、貉、黑熊、负鼠和臭鼬等动物，临床表现为嗜睡、体重减轻、肠炎、肝炎、肺炎、弥漫性血管内凝血及猝死等。CAV-2的感染与传染性喉气管炎、肠炎都有关，可感染犬、猫和猪等多种哺乳动物，临床表现为持续高热、流鼻涕、眼角出现眼屎、咳嗽、扁桃体炎、肺炎和喉气管炎等。在我国CAV感染十分普遍，其中犬不分品种、年龄和性别均可发生，大大增加了人类感染动物源性疾病的潜在风险。
CAV属腺病毒科哺乳动物腺病毒属，为双股线状DNA病毒。CAV-1基因组全长约为31kb左右，CAV-2基因组全长约为32.2kb左右，两者同源性约为70％左右，基因水平仅约有56.6％的相关性。CAV基因组包含E1～E4基因和L1～L5基因，共编码15种多肽，其中占总蛋白量90％以上的最主要的结构性蛋白包括五邻体、六邻体、纤突和核衣壳蛋白。六邻体是CAV的主要抗原蛋白，含有型特异性抗原表位和中和抗原表位，能刺激机体产生中和抗体以及组合型特异性抗体。纤突的远端部分为腺病毒型特异性抗原，纤突的基部为亚群特异性抗原。纤突顶端为一个4nm直径的球形物（又叫knob），这是病毒感染细胞时结合于细胞受体的部分，血凝素也在球部，CAV-1和CAV-2在血凝方面的差别和纤突结构有关，在和红细胞发生凝集时，两者可能使用不同的或不完全相同的RBC表面受体。纤突蛋白和某些非结构蛋白均系糖基化蛋白。另外纤突蛋白可阻断腺病毒大分子合成，抑制毒增殖。
疫苗免疫是控制CAV传播的有效措施之一。近几年我国新研制并批准了多个不同毒株生产的CAV相关兽用弱毒活疫苗。其中，CAV-1弱毒苗的使用大大减少了犬传染性肝炎的发病数量，但该疫苗免疫后会引起犬的蓝眼病，并且犬的排泄物中依旧带毒，该弱毒经犬传代后有返强的可能，因此存在一定局限性。而CAV-2弱毒苗虽然能够对CAV-1提供交叉保护，但疫苗中所含毒株均为弱毒株，免疫动物后存在散毒的风险，且免疫后需要一段时间才能产生抗体，不能快速建立对病毒的抵抗能力。
鉴于此，业界亟需发展出一种高效安全的CAV基因工程亚单位疫苗。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种融合蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ IDNO:2的全长序列95％以上相同的序列。即，本发明实施例提供的融合蛋白的氨基酸序列可以是原始序列，增加或截短的序列。
本发明实施例还提供了用于编码所述融合蛋白的编码基因。
在一些实施方式中，所述的编码基因具有SEQ ID NO:1所示序列或者与SEQ IDNO:1的全长序列95％以上相同的序列。
本发明实施例还提供了一种重组基因载体，其包含所述融合蛋白的编码基因。
在一些实施方式中，所述重组载体包括但不限于pFastBac 1、pVL1393、pFastBacdual等，并优选采用pFastBac 1。
本发明实施例还提供了一种重组杆状病毒，其包含所述融合蛋白的编码基因。
本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其包含所述融合蛋白的编码基因。
在一些实施方式中，所述宿主细胞选自昆虫细胞，例如Sf9细胞系，优选的，所述Sf9细胞系包括但不限于Sf9、High Five或 Sf21细胞，更优选为Sf9细胞。
本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其特征在于包括：所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。
在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、MONTANIDE ISA 15 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素之中的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 201 VG。
本发明实施例还提供了一种融合蛋白的制备方法，其包括：
将所述融合蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；
将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；
以所述重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并获得重组杆状病毒；
将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离获得所述融合蛋白。
在一些实施方式中，所述穿梭载体包括但不限于pFastBac 1、pVL1393、pFastBacdual等，优选为pFastBac1。
在一些实施方式中，所述昆虫细胞可以选自Sf9细胞系，例如Sf9、High Five或Sf21细胞等，优选为Sf9细胞，但不限于此。
本发明实施例还提供了一种犬腺病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备融合蛋白，并将所述融合蛋白与医药学上可接受的载剂混合。
本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备犬腺病毒检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对犬腺病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受犬腺病毒感染的药剂中的用途。
本发明实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备犬腺病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。
本发明实施例提供了一种犬腺病毒基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。
本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受犬腺病毒感染的试剂的用途。
本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对犬腺病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。
本发明实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受犬腺病毒感染的药剂的用途。
本发明实施例还提供了一种诱导针对犬腺病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用所述犬腺病毒基因工程亚单位疫苗。
本发明实施例还提供了一种保护受试动物免受犬腺病毒感染的方法，所述方法包括向受试动物施用所述犬腺病毒基因工程亚单位疫苗。
本发明实施例还提供了一种适用于在受试动物中产生针对犬腺病毒感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的融合蛋白以及佐剂分子。
如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。进一步的，所述佐剂可以优选采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。
较之现有技术，本发明实施例通过对1型和2型犬腺病毒F蛋白进行优化，包括使1型和2型犬腺病毒F蛋白中Knob区域的部分位点突变，再将两者串联，且引入鸡IgY抗体重链恒定区片段，从而获得融合蛋白（命名为CAV-Fu蛋白），并显著增强了融合蛋白的免疫原性，大幅增加了其表达量，能够提供对两个血清型的病毒的综合保护，而且前述融合蛋白可以采用杆状病毒昆虫细胞表达系统，使用悬浮培养Sf9细胞等进行表达和大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本，同时所获产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对动物没有致病性，适于作为犬腺病毒基因工程亚单位疫苗广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是实施例1中密码子优化后的CAV-Fu基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp附近位置出现目的条带。
图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp附近位置出现目的条带。
图3是实施例1中转移载体pF-CAV-Fu的结构示意图。
图4-图6是实施例4中各组细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱。
图7是实施例5中各组SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测结果图。
图8是实施例6中间接免疫荧光检测结果图。
图9是实施例8所获纯化后CAV-Fu蛋白的灰度扫描图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明实施例针对犬腺病毒设计了一种融合蛋白（CAV-Fu蛋白），其主要特点包括：
I、将1型犬腺病毒F蛋白Knob区域481位C突变成A，2型犬腺病毒F蛋白Knob区域480位C突变成A，可以避免二硫键的错配形成不溶性沉淀。
II、将1型和2型犬腺病毒F蛋白Knob区域串联，再添加鸡IgY抗体重链恒定区片段构建出一个新的抗原。其中，表达的是截短的F蛋白，表达量显著提高。而且，通过将1型和2型犬腺病毒F蛋白的Knob区域串联，不仅能够提供对两个血清型的病毒的综合保护，而且其免疫原性较其中任意一个单独的Knob区域都大大提高，只需非常少量的抗原就能产生高滴度的中和抗体和HI抗体。同时，通过添加鸡IgY抗体重链恒定区片段，能够形成链间的二硫键，形成二聚体，还能够进一步提高抗原的免疫原性。
进一步的，前述融合蛋白可以基于杆状病毒昆虫细胞表达系统，使用悬浮培养Sf9细胞进行表达，其不仅表达水平较高，而且蛋白免疫原性好。
进一步的，前述融合蛋白可以用于制备犬腺病毒基因工程亚单位疫苗。
例如，在本发明实施例的一个具体实施方案中，一种犬腺病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法具体可以包括：
（1）制备用于编码所述融合蛋白（CAV-Fu蛋白）的核酸分子；
（2）将步骤（1）中制备的编码融合蛋白的核酸分子克隆到穿梭载体中，得到含有目的基因的重组穿梭载体；
（3）将步骤（2）获得的重组穿梭载体转化DH10Bac菌，挑选重组菌，抽提基因组转染Sf9细胞（或前述的其它昆虫细胞），获得重组杆状病毒；
（4）培育所述Sf9细胞（或前述的其它昆虫细胞）进而重组表达产生融合蛋白；
（5）将所述融合蛋白混合加入到佐剂中，得到所述疫苗。
本发明实施例的该具体实施方案中，使用Sf9细胞表达融合蛋白（CAV-Fu蛋白），产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。
本发明实施例提供的犬腺病毒基因工程亚单位疫苗安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，对动物没有致病性，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，且还具有可以大规模批量生产、质控容易、批次间稳定、生产成本低等一系列优点。
本发明实施例提供的犬腺病毒基因工程亚单位疫苗在应用时，只需将有效量接种于犬、狐、狼、貉、黑熊、负鼠、臭鼬、猫和猪等动物。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1 转移载体pF-CAV-Fu构建与鉴定
1．CAV-Fu基因扩增与纯化
在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的CAV-Fu基因（SEQ ID NO:1）并克隆到pUC17载体上，得到pUC-CAV-Fu质粒载体。以pUC-CAV-Fu质粒作为模板，CAV-Fu-F、CAV-Fu-R作为上、下游引物进行PCR扩增（CAV-Fu-F、CAV-Fu-R的基因序列如SEQ ID NO:3、4所示），扩增体系见表1。
表1 CAV-Fu基因扩增体系
Figure 662287DEST_PATH_IMAGE001
反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行凝胶电泳，以验证目的基因大小，如图1所示，在1.6kbp附近位置出现目的条带，说明目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
2．酶切与纯化
将pFastBac 1质粒和CAV-Fu基因PCR扩增产物使用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。
将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac 1质粒以及CAV-Fu基因片段。
表2 CAV-Fu基因酶切反应体系
Figure 338118DEST_PATH_IMAGE002
表3 pFastBac 1质粒酶切反应体系
Figure 654830DEST_PATH_IMAGE003
3．连接
将酶切过的pFastBac 1质粒和CAV-Fu基因酶切产物使用T4 DNA连接酶在16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。
表4 CAV-Fu基因与pFastBac 1质粒连接体系
Figure 48903DEST_PATH_IMAGE004
4．转化
取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0 mL菌液离心浓缩成100 μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
5．菌落PCR和测序鉴定
挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，CAV-Fu-F、CAV-Fu-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，在1.6kbp附近出现条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-CAV-Fu，其示意图如图3。
实施例2 重组杆状病毒基因组Bac-CAV-Fu构建
1．DH10Bac菌转化
取实施例1中1μl pF-CAV-Fu质粒加入100μl的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。取100μl菌液稀释81倍后，取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。
2．挑选单克隆
使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。获得重组质粒Bacmid-CAV-Fu。
实施例3 重组杆状病毒转染
六孔板中每个孔接种0.8×106个Sf9细胞，细胞汇合度为50~70%。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基T1稀释4μl的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；用100μl转染培养T1基稀释3μg实施例2中的重组Bacmid-CAV-Fu质粒，分别将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2mLSF-SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。其中对照组2收获上清和沉淀。获得重组杆状病毒rBac-CAV-Fu，对收获的P1代重组杆状病毒按结合了免疫荧光的梯度稀释放测定病毒含量，rBac-CAV-Fu种毒病毒含量为3.2×108.0TCID50/ml。扩增重组杆状病毒rBac-CAV-Fu作为种毒备用。
另外按照以上实施例的方法构建表达如下对照组的重组杆状病毒（表5）：
表5 对照组构建
Figure 476473DEST_PATH_IMAGE005
注：I为突变后1型犬腺病毒F蛋白Knob区域；II为突变后2型犬腺病毒F蛋白Knob区域；I*为未突变前1型犬腺病毒F蛋白Knob区域；II*为未突变前2型犬腺病毒F蛋白Knob区域；F1为1型犬腺病毒全长F蛋白；F2为2型犬腺病毒全长F蛋白。
实施例4 SDS-PAGE检测
将实施例3中收获的rBac-CAV-Fu、对照组1、对照组2及对照组4培养物上清以及对照组2培养物沉淀分别进行非还原性SDS-PAGE检测，同时设置将rBac-CAV-Fu细胞培养物上清进行还原性SDS-PAGE检测，并使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：
取40μl收获的细胞培养物，加入10 μl的5×上样缓冲液，取1mol/l Tris-HCI(pH6.8)1.25 mL，溴酚蓝25mg，甘油2.5ml，SDS 0.5g溶于ddH2O中，定容至5mL，0.5mL/管分装，室温保存，（还原性检测使用前每管需加入25μl β-巯基乙醇混匀），沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。
在非还原性SDS-PAGE检测中，rBac-CAV-Fu培养物上清在分子量约57kDa附近出现目的条带，对照组1培养物上清在分子量20kDa和37kDa附近出现目的条带，对照组4培养物上清在分子量约19kDa和20kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有出现条带（见图4）；对照组2培养物上清检测在目的条带的对应位置没有出现条带，培养物沉淀检测在分子量约20kDa和37kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有出现条带（见图5）；在还原性SDS-PAGE检测中，rBac-CAV-Fu组在分子量约37kDa和20kDa附近出现目的条带；阴性对照在对应位置没有出现条带（见图6）。
实施例5 Western Blot检测
将实施例4中SDS-PAGE电泳后的rBac-CAV-Fu组产物转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，犬源抗CAV-1阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗犬多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。同时使用犬源抗CAV-2阳性血清进行Western Blot检测。结果如图7所示，重组杆状病毒表达样品都有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。
实施例6 间接免疫荧光检测
向96孔细胞培养板中加入转染过rBac-CAV-Fu的Sf9细胞悬液，100µl/孔（细胞浓度为2.5×105～4.0×105个/ml），接种4孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10µl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72~96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮（1:1）固定。首先与犬源抗CAV-1多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗犬IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。同时使用犬源抗CAV-2多抗血清进行间接免疫荧光检测。结果如图8所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。
实施例7 昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养
在1000mL摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×106cell/mL，活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×105cell/mL。当细胞浓度达到3-55×106cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-55×106cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-85×106cell/mL时，接种rBac-CAV-Fu，反应器培养条件为pH值6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50%、搅拌速度100-180 rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48 h后，加千分之二终浓度Na2S2O3终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存CAV-Fu蛋白原液。同时以同样的方法制备表达各对照组的蛋白原液。
实施例8蛋白纯化
1．将收获的原液使用阳离子交换层析法进行纯化
使用强阳粒子层析填料POROS 50HS进行粒子交换层析，填料使用前使用0.5MNaOH溶液进行消毒。然后用微滤缓冲液在室温平衡，然后将疫苗原液以125 mL/min的速率上柱，然后用漂洗buffer A（0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，0.5M NaCl）洗脱8个柱体积。然后线性梯度进行洗脱，从100% buffer A到100% buffer B(0.05 M MOPS(钠盐)，pH=7.0，1.5MNaCl)，其中线性洗脱一共洗脱了10个柱体积，然后平均分别收获这10个柱体积的洗脱物。线性洗脱完后，再用buffer B洗脱2个柱体积，并分别收集。将收集的样品放在2 L的无菌的塑料瓶中放置在4℃。然后将最后一个洗脱峰（A280）下收集的组分无菌过滤储存在4℃。
2．羟基磷灰石疏水层析
使用预装羟基磷灰石柱（CHT™ Ceramic Hydroxyapatite Type II Media），首先使用50 mM MOPS(钠盐)，pH值=7.0、1.25M NaCl进行平衡，然后将上面初步纯化的样品以90cm3/h进行上样，上完样后使用8体积的平衡液进行洗脱直至UV值为零。然后使用洗脱液（0.2 M 磷酸盐，pH=7.0，1.25 M NaCl）进行梯度洗脱，洗脱液浓度从0%到100%，速度仍然是90 cm3/h，洗脱体积是4个柱体积。纯化得到目的蛋白。
将纯化的目的蛋白使用BCA总蛋白定量，然后结合灰度扫描确定目的蛋白纯度，纯化后的蛋白如图9所示，CAV-Fu蛋白浓度为2.1g/L，纯度为95%。
实施例9 疫苗制备
将实施例8中所收获的适量CAV-Fu重组蛋白原液加入到MONTANIDE ISA 201 VG佐剂中（体积比为46：54），使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为100µg/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存。以相同的方法将各对照组制备成疫苗并保存。
实施例10 免疫实验
试验一：安全检验
取2月龄幼犬18只，检测CAV-1、CAV-2抗原抗体均为阴性健康犬只。随机分为6组，每组3只。免疫组5组，每组分别颈部肌肉注射4ml专利组、对照1-4组疫苗；阴性对照组1组，颈部肌肉注射4ml灭菌生理盐水。每天观察犬只食欲、精神、并测量体温，观察两周。结果显示，免疫组和对照组的犬只在整个观察期间食欲、精神、体温均正常，个别犬只精神稍有不振或体温略有升高或食欲略微下降，均在第二日恢复正常。
试验二：效力实验
HI效价检测：
取2月龄幼犬35只，检测CAV-1、CAV-2抗原抗体均为阴性。随机分为7组，每组5只。前6组每组分别颈部肌肉注射专利组和各对照组疫苗，1ml/只/次，免疫两次，间隔21天。第7组设置为阴性对照组，以相同的免疫方式和间隔时间注射等体积生理盐水。分别于免疫前和免疫后7、21和42d采血制备血清。用HI方法（将CAV-1 Utrecht株、CAV-2 Toronto A26/61株用人“O”型红细胞进行红细胞凝集试验即HA试验，根据结果制备8单位抗原，之后将分离出的血清样品进行红细胞凝集抑制试验即HI效价检测，试验步骤均按《中国兽药典》进行）进行检测。具体结果见表6。
表6 HI效价检测结果
Figure 732443DEST_PATH_IMAGE006
中和效价检测：
取2月龄幼犬35只，检测CAV-1、CAV-2抗原抗体均为阴性。随机分为7组，每组5只。前6组每组分别颈部肌肉注射专利组和各对照组疫苗，1ml/只/次，免疫两次，间隔21天。第7组设置为阴性对照组，以相同的免疫方式和间隔时间注射等体积生理盐水。分别于免疫前和免疫后7、21和42d采血制备血清。按固定病毒稀释血清法测定中和抗体效价，具体步骤如下：将CAV-1 Utrecht株、CAV-2 Toronto A26/61株病毒液（含104.5TCID50）病毒液等比混合稀释成200个TCID50的病毒悬液，将血清作10倍倍比稀释后，于EP管内各加等量（500µl）病毒液，混匀。同时设置阳性血清对照，待检测血清毒性对照，病毒对照和正常细胞对照，将血清病毒混合液放入37℃ 5％CO2培养箱中作用45-60min。感作完成后每个稀释度分别加至96孔细胞板中，每孔100µl，继续置37℃ 5％CO2培养箱中作用1.5h，洗涤（D-Hanks）洗一遍，换维持液，置温箱中培养，逐日观察并记录结果。按Reed-Muench法计算结果。具体结果见表7。
表7 中和效价检测结果
Figure 423319DEST_PATH_IMAGE007
应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 苏州世诺生物技术有限公司
<120> 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
<130> 20210102
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1563
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgggcgcga ttgaagcggt ggcgccgcag ccgagcttta ccccggtgac cctgtggacc 60
ggcccggatc cgaacgtgaa caccagcatt aacggcaccc cggtgattcg cagctttatt 120
agcctgaccc gcgatagcaa cctggtgacc gtgaacgcga gctttaccgg cgaaggcagc 180
tatcagagcg tgagcccgac ccagagccag tttagcctga ttctggaatt taaccagttt 240
ggccagctga tgagcaccgg caacctgaac agcaccacca cctggggcga aaaaccgtgg 300
ggcaacaaca ccgtgcaggt gcagccgagc catacctgga aactgtgcat gccgaaccgc 360
gaagtgtata gcaccccggc ggcgaccctg accagcgcgg gcctgaacag cattgcgcat 420
gatggcgcgc cgaaccgcag cattgattgc atgctgatta ttaacaaact ggcgggcgcg 480
gcgacctata ccctgacctt tcgctttggc gcgattgaag cgacccagcc gccgaccgcg 540
ccgattaccc tgtggaccgg cccggatccg agcattaacg gctttattaa cgataccccg 600
gtgattcgct gctttatttg cctgacccgc gatagcaacc tggtgaccgt gaacgcgagc 660
tttgtgggcg aaggcggcta tcgcattgtg agcccgaccc agagccagtt tagcctgatt 720
atggaatttg atcagtttgg ccagctgatg agcaccggca acattaacag caccaccacc 780
tggggcgaaa aaccgtgggg caacaacacc gtgcagccgc gcccgagcca tacctggaaa 840
ctgtgcatgc cgaaccgcga agtgtatagc accccggcgg cgaccattag ccgcgcgggc 900
ctggatagca ttgcggtgga tggcgcgccg agccgcagca ttgattgcat gctgattatt 960
aacaaaccga aaggcgtggc gacctatacc ctgacctttc gctttccgac cagcccgccg 1020
cgcctgtatc cgctgagcgc gtgctgcagc gatagcgcgg tgccgccggc ggtgggctgc 1080
ctgctgagcc cgagcagcgc gggcggcatt agctgggaag gcagcggcgg caccgcggtg 1140
gcgggccgcg tgagcggcac cccggtgaaa ctgagctttg tgcgcctgag cccgggcgaa 1200
aaacgcaaaa gctttgtgtg cagcgcggcg ccgggcggcg cgctgctgaa aaaagaagtg 1260
caggtgtgcc gcgtggatcc ggtgccgccg gtggcgccgg aagtgcaggt gctgcatccg 1320
agcagctgca ccccgagcca gagcgaaagc gtggaactgc tgtgcctggt gaccggcttt 1380
agcccggcga gcgcggaagt ggaatggctg gtggatggcg tgggcggcct gctggtggcg 1440
agccagagcc cggcggtgcg cagcggcagc acctatagcc tgagcagccg cgtgaacgtg 1500
agcggcaccg attggcgcga aggcaaaagc tatagctgcc gcgtgcgcca tccggcgacc 1560
taa 1563
<210> 2
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Met Gly Ala Ile Glu Ala Val Ala Pro Gln Pro Ser Phe Thr Pro Val
1 5 10 15
Thr Leu Trp Thr Gly Pro Asp Pro Asn Val Asn Thr Ser Ile Asn Gly
20 25 30
Thr Pro Val Ile Arg Ser Phe Ile Ser Leu Thr Arg Asp Ser Asn Leu
35 40 45
Val Thr Val Asn Ala Ser Phe Thr Gly Glu Gly Ser Tyr Gln Ser Val
50 55 60
Ser Pro Thr Gln Ser Gln Phe Ser Leu Ile Leu Glu Phe Asn Gln Phe
65 70 75 80
Gly Gln Leu Met Ser Thr Gly Asn Leu Asn Ser Thr Thr Thr Trp Gly
85 90 95
Glu Lys Pro Trp Gly Asn Asn Thr Val Gln Val Gln Pro Ser His Thr
100 105 110
Trp Lys Leu Cys Met Pro Asn Arg Glu Val Tyr Ser Thr Pro Ala Ala
115 120 125
Thr Leu Thr Ser Ala Gly Leu Asn Ser Ile Ala His Asp Gly Ala Pro
130 135 140
Asn Arg Ser Ile Asp Cys Met Leu Ile Ile Asn Lys Leu Ala Gly Ala
145 150 155 160
Ala Thr Tyr Thr Leu Thr Phe Arg Phe Gly Ala Ile Glu Ala Thr Gln
165 170 175
Pro Pro Thr Ala Pro Ile Thr Leu Trp Thr Gly Pro Asp Pro Ser Ile
180 185 190
Asn Gly Phe Ile Asn Asp Thr Pro Val Ile Arg Cys Phe Ile Cys Leu
195 200 205
Thr Arg Asp Ser Asn Leu Val Thr Val Asn Ala Ser Phe Val Gly Glu
210 215 220
Gly Gly Tyr Arg Ile Val Ser Pro Thr Gln Ser Gln Phe Ser Leu Ile
225 230 235 240
Met Glu Phe Asp Gln Phe Gly Gln Leu Met Ser Thr Gly Asn Ile Asn
245 250 255
Ser Thr Thr Thr Trp Gly Glu Lys Pro Trp Gly Asn Asn Thr Val Gln
260 265 270
Pro Arg Pro Ser His Thr Trp Lys Leu Cys Met Pro Asn Arg Glu Val
275 280 285
Tyr Ser Thr Pro Ala Ala Thr Ile Ser Arg Ala Gly Leu Asp Ser Ile
290 295 300
Ala Val Asp Gly Ala Pro Ser Arg Ser Ile Asp Cys Met Leu Ile Ile
305 310 315 320
Asn Lys Pro Lys Gly Val Ala Thr Tyr Thr Leu Thr Phe Arg Phe Pro
325 330 335
Thr Ser Pro Pro Arg Leu Tyr Pro Leu Ser Ala Cys Cys Ser Asp Ser
340 345 350
Ala Val Pro Pro Ala Val Gly Cys Leu Leu Ser Pro Ser Ser Ala Gly
355 360 365
Gly Ile Ser Trp Glu Gly Ser Gly Gly Thr Ala Val Ala Gly Arg Val
370 375 380
Ser Gly Thr Pro Val Lys Leu Ser Phe Val Arg Leu Ser Pro Gly Glu
385 390 395 400
Lys Arg Lys Ser Phe Val Cys Ser Ala Ala Pro Gly Gly Ala Leu Leu
405 410 415
Lys Lys Glu Val Gln Val Cys Arg Val Asp Pro Val Pro Pro Val Ala
420 425 430
Pro Glu Val Gln Val Leu His Pro Ser Ser Cys Thr Pro Ser Gln Ser
435 440 445
Glu Ser Val Glu Leu Leu Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Ser
450 455 460
Ala Glu Val Glu Trp Leu Val Asp Gly Val Gly Gly Leu Leu Val Ala
465 470 475 480
Ser Gln Ser Pro Ala Val Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
485 490 495
Arg Val Asn Val Ser Gly Thr Asp Trp Arg Glu Gly Lys Ser Tyr Ser
500 505 510
Cys Arg Val Arg His Pro Ala Thr
515 520
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ataggatcca tgggcgcgat tgaagcggtg gcgc 34
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ataaagcttt taggtcgccg gatggcgcac gcggcag 37
<210> 5
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
atgggcgcga ttgaagcggt ggcgccgcag ccgagcttta ccccggtgac cctgtggacc 60
ggcccggatc cgaacgtgaa caccagcatt aacggcaccc cggtgattcg cagctttatt 120
agcctgaccc gcgatagcaa cctggtgacc gtgaacgcga gctttaccgg cgaaggcagc 180
tatcagagcg tgagcccgac ccagagccag tttagcctga ttctggaatt taaccagttt 240
ggccagctga tgagcaccgg caacctgaac agcaccacca cctggggcga aaaaccgtgg 300
ggcaacaaca ccgtgcaggt gcagccgagc catacctgga aactgtgcat gccgaaccgc 360
gaagtgtata gcaccccggc ggcgaccctg accagcgcgg gcctgaacag cattgcgcat 420
gatggcgcgc cgaaccgcag cattgattgc atgctgatta ttaacaaact ggcgggcgcg 480
gcgacctata ccctgacctt tcgctttggc gcgattgaag cgacccagcc gccgaccgcg 540
ccgattaccc tgtggaccgg cccggatccg agcattaacg gctttattaa cgataccccg 600
gtgattcgct gctttatttg cctgacccgc gatagcaacc tggtgaccgt gaacgcgagc 660
tttgtgggcg aaggcggcta tcgcattgtg agcccgaccc agagccagtt tagcctgatt 720
atggaatttg atcagtttgg ccagctgatg agcaccggca acattaacag caccaccacc 780
tggggcgaaa aaccgtgggg caacaacacc gtgcagccgc gcccgagcca tacctggaaa 840
ctgtgcatgc cgaaccgcga agtgtatagc accccggcgg cgaccattag ccgcgcgggc 900
ctggatagca ttgcggtgga tggcgcgccg agccgcagca ttgattgcat gctgattatt 960
aacaaaccga aaggcgtggc gacctatacc ctgacctttc gcttt 1005
<210> 6
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
atgggcgcga ttgaagcggt ggcgccgcag ccgagcttta ccccggtgac cctgtggacc 60
ggcccggatc cgaacgtgaa caccagcatt aacggcaccc cggtgattcg cagctttatt 120
agcctgaccc gcgatagcaa cctggtgacc gtgaacgcga gctttaccgg cgaaggcagc 180
tatcagagcg tgagcccgac ccagagccag tttagcctga ttctggaatt taaccagttt 240
ggccagctga tgagcaccgg caacctgaac agcaccacca cctggggcga aaaaccgtgg 300
ggcaacaaca ccgtgcaggt gcagccgagc catacctgga aactgtgcat gccgaaccgc 360
gaagtgtata gcaccccggc ggcgaccctg accagctgcg gcctgaacag cattgcgcat 420
gatggcgcgc cgaaccgcag cattgattgc atgctgatta ttaacaaact ggcgggcgcg 480
gcgacctata ccctgacctt tcgctttggc gcgattgaag cgacccagcc gccgaccgcg 540
ccgattaccc tgtggaccgg cccggatccg agcattaacg gctttattaa cgataccccg 600
gtgattcgct gctttatttg cctgacccgc gatagcaacc tggtgaccgt gaacgcgagc 660
tttgtgggcg aaggcggcta tcgcattgtg agcccgaccc agagccagtt tagcctgatt 720
atggaatttg atcagtttgg ccagctgatg agcaccggca acattaacag caccaccacc 780
tggggcgaaa aaccgtgggg caacaacacc gtgcagccgc gcccgagcca tacctggaaa 840
ctgtgcatgc cgaaccgcga agtgtatagc accccggcgg cgaccattag ccgctgcggc 900
ctggatagca ttgcggtgga tggcgcgccg agccgcagca ttgattgcat gctgattatt 960
aacaaaccga aaggcgtggc gacctatacc ctgacctttc gcttt 1005
<210> 7
<211> 3255
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
atgaaacgca cccgcagcgc gctgccggcg aactttgatc cggtgtatcc gtatgatgcg 60
ccgaaaccga gcacccagcc gccgtttttt aacgatcgca aaggcctgac cgaaagcagc 120
ccgggcaccc tggcggtgaa cattagcccg ccgctgacct ttagcaacct gggcgcgatt 180
aaactgagca ccggcgcggg cctgattctg aaagaaggca aactggaagc gaacattggc 240
ccgggcctga ccaccaacca ggaaggccag attaccgtgg aaaaagatag cgatggcctg 300
acctttacca gcccgctgca taaaattgaa aacaccgtga gcctgagcat tggcgaaggc 360
ctggaagatg aaagcggcac cctgaaagtg aactttccga gcccgccgcc gccgctgctg 420
tttagcccgc cgctggcgga agcgggcggc accgtgagcc tgccgctgca ggaaagcatg 480
caggtgaccg aaggcaaact gggcgtgaaa ccgaccacct atagcccgcc gctgcagaaa 540
accgatcagc aggtgagcct gcgcgtgggc ccgggcctga ccgtgctgaa cggccagctg 600
caggcggtgc agccgccggc gaccacctat aaagaaccgc tgctggaaac cgaaaacagc 660
gtgagcctga aagtgggcgc gggcctggcg gtgcaggatg gcgcgctggt ggcgaccccg 720
ccgaacgtga cctttagcgc gccgctggaa aaaaacggca acgcggtgag cgtgcgcgtg 780
ggcgcgggcc tgagcattca gggcaacgcg ctggtggcga ccaccagccc gaccctgacc 840
tttgcgtatc cgctgattaa aaacaacaac catattaccc tgagcgcggg cagcggcctg 900
cgcgtgagcg gcggcagcct gaccgtggcg accggcccgg gcctgagcca tattaacggc 960
accattgcgg cggtgattgg cgcgggcctg aaatttgaaa acaacgcgat tctggcgaaa 1020
ctgggcaacg gcctgaccat tcgcgatggc gcgattgaag cggtggcgcc gcagccgagc 1080
tttaccccgg tgaccctgtg gaccggcccg gatccgaacg tgaacaccag cattaacggc 1140
accccggtga ttcgcagctt tattagcctg acccgcgata gcaacctggt gaccgtgaac 1200
gcgagcttta ccggcgaagg cagctatcag agcgtgagcc cgacccagag ccagtttagc 1260
ctgattctgg aatttaacca gtttggccag ctgatgagca ccggcaacct gaacagcacc 1320
accacctggg gcgaaaaacc gtggggcaac aacaccgtgc aggtgcagcc gagccatacc 1380
tggaaactgt gcatgccgaa ccgcgaagtg tatagcaccc cggcggcgac cctgaccagc 1440
tgcggcctga acagcattgc gcatgatggc gcgccgaacc gcagcattga ttgcatgctg 1500
attattaaca aactggcggg cgcggcgacc tataccctga cctttcgctt tctgaacttt 1560
aacaaactga gcagcagcac cgtgtttaaa accgatgtgc tgacctttac ctatgtgggc 1620
gaaaaccaga tgaaacgcac ccgccgcgcg ctgccggcga actatgatcc ggtgtatccg 1680
tatgatgcgc cgggcagcag cgcgcagccg ccgtttttta acaacaaaca gggcctgacc 1740
gaaagcccgc cgggcaccct ggcggtgaac gtgagcccgc cgctgacctt tagcaccctg 1800
ggcgcgatta aactgagcac cggcccgggc ctgaccctga acgaaggcaa actgcaggcg 1860
agcctgggcc cgggcctgat taccaacacc gaaggccaga ttaccgtgga aaacgtgaac 1920
aaagtgctga gctttaccag cccgctgcat aaaaccgaaa acaccgtgag cctggcgctg 1980
ggcgatggcc tggaagatga aaacggcacc ctgaaagtga cctttccgac cccgccgccg 2040
ccgctgcagt ttagcccgcc gctgaccgaa accggcggca ccattagcct gccgctgcag 2100
gatagcatgc aggtgaccaa cggcaaactg ggcgtgaaac cgaccaccta tgcgccgccg 2160
ctgaaaaaaa ccgatcagca ggtgagcctg caggtgggca gcggcctgac cgtgattaac 2220
gaacagctgc aggcggtgca gccgccggcg accacctata acgaaccgct gagcaaaacc 2280
gataacagcg tgagcctgca ggtgggcgcg ggcctggcgg tgcagagcgg cgcgctggtg 2340
gcgaccccgc cgccgccgct gacctttacc agcccgctgg aaaaaaacga aaacaccgtg 2400
agcctgcagg tgggcgcggg cctgagcgtg cagaacaacg cgctggtggc gaccccgccg 2460
ccgccgctga cctttgcgta tccgctggtg aaaaacgata accatgtggc gctgagcgcg 2520
ggcagcggcc tgcgcattag cggcggcagc ctgaccgtgg cgaccggccc gggcctgagc 2580
catcagaacg gcaccattgg cgcggtggtg ggcgcgggcc tgaaatttga aaacaacgcg 2640
attctggcga aactgggcaa cggcctgacc attcgcgatg gcgcgattga agcgacccag 2700
ccgccgaccg cgccgattac cctgtggacc ggcccggatc cgagcattaa cggctttatt 2760
aacgataccc cggtgattcg ctgctttatt tgcctgaccc gcgatagcaa cctggtgacc 2820
gtgaacgcga gctttgtggg cgaaggcggc tatcgcattg tgagcccgac ccagagccag 2880
tttagcctga ttatggaatt tgatcagttt ggccagctga tgagcaccgg caacattaac 2940
agcaccacca cctggggcga aaaaccgtgg ggcaacaaca ccgtgcagcc gcgcccgagc 3000
catacctgga aactgtgcat gccgaaccgc gaagtgtata gcaccccggc ggcgaccatt 3060
agccgctgcg gcctggatag cattgcggtg gatggcgcgc cgagccgcag cattgattgc 3120
atgctgatta ttaacaaacc gaaaggcgtg gcgacctata ccctgacctt tcgctttctg 3180
aactttaacc gcctgagcgg cggcaccctg tttaaaaccg atgtgctgac ctttacctat 3240
gtgggcgaaa accag 3255
<210> 8
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
atgggcgcga ttgaagcggt ggcgccgcag ccgagcttta ccccggtgac cctgtggacc 60
ggcccggatc cgaacgtgaa caccagcatt aacggcaccc cggtgattcg cagctttatt 120
agcctgaccc gcgatagcaa cctggtgacc gtgaacgcga gctttaccgg cgaaggcagc 180
tatcagagcg tgagcccgac ccagagccag tttagcctga ttctggaatt taaccagttt 240
ggccagctga tgagcaccgg caacctgaac agcaccacca cctggggcga aaaaccgtgg 300
ggcaacaaca ccgtgcaggt gcagccgagc catacctgga aactgtgcat gccgaaccgc 360
gaagtgtata gcaccccggc ggcgaccctg accagcgcgg gcctgaacag cattgcgcat 420
gatggcgcgc cgaaccgcag cattgattgc atgctgatta ttaacaaact ggcgggcgcg 480
gcgacctata ccctgacctt tcgcttt 507
<210> 9
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ggcgcgattg aagcgaccca gccgccgacc gcgccgatta ccctgtggac cggcccggat 60
ccgagcatta acggctttat taacgatacc ccggtgattc gctgctttat ttgcctgacc 120
cgcgatagca acctggtgac cgtgaacgcg agctttgtgg gcgaaggcgg ctatcgcatt 180
gtgagcccga cccagagcca gtttagcctg attatggaat ttgatcagtt tggccagctg 240
atgagcaccg gcaacattaa cagcaccacc acctggggcg aaaaaccgtg gggcaacaac 300
accgtgcagc cgcgcccgag ccatacctgg aaactgtgca tgccgaaccg cgaagtgtat 360
agcaccccgg cggcgaccat tagccgcgcg ggcctggata gcattgcggt ggatggcgcg 420
ccgagccgca gcattgattg catgctgatt attaacaaac cgaaaggcgt ggcgacctat 480
accctgacct ttcgcttt 498

Claims (12)

1.融合蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示序列。
2.用于编码权利要求1所述融合蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：它具有SEQ ID NO:1所示序列。
4.包含权利要求2或3所述编码基因的重组基因载体、重组杆状病毒或宿主细胞。
5.一种重组基因载体，其特征在于：所述重组基因载体包含权利要求2或3所述的编码基因，并且所述重组基因载体包括pFastBac 1、pVL1393或pFastBac dual。
6.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含权利要求1所述融合蛋白的编码基因，并且所述宿主细胞为昆虫细胞，所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。
7.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。
8.如权利要求7所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载剂包括MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、MONTANIDE ISA 15 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素中的任意一种或者两种以上的组合。
9.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：
将权利要求1所述融合蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；
将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；
以所述重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并获得重组杆状病毒；
将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离获得所述融合蛋白。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述穿梭载体包括pFastBac 1、pVL1393或pFastBac dual；和/或，所述昆虫细胞包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。
11.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求7或8所述免疫组合物在制备犬腺病毒检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对犬腺病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受犬腺病毒感染的药剂中的用途。
12.如权利要求1所述融合蛋白或权利要求7或8所述免疫组合物在制备犬腺病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。
CN202110237485.6A 2021-03-04 2021-03-04 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 Active CN112592410B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110237485.6A CN112592410B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110237485.6A CN112592410B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112592410A true CN112592410A (zh) 2021-04-02
CN112592410B CN112592410B (zh) 2021-05-11

Family

ID=75210239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110237485.6A Active CN112592410B (zh) 2021-03-04 2021-03-04 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112592410B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101116750A (zh) * 2007-05-10 2008-02-06 河北医科大学 一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop
CN110841064A (zh) * 2019-11-07 2020-02-28 衡阳师范学院 一种犬腺病毒ⅰ型灭活疫苗及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101116750A (zh) * 2007-05-10 2008-02-06 河北医科大学 一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop
CN110841064A (zh) * 2019-11-07 2020-02-28 衡阳师范学院 一种犬腺病毒ⅰ型灭活疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范泉水: "犬腺病毒纤突蛋白基因功能区的比较分析", 《中国预防兽医学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112592410B (zh) 2021-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112076315A (zh) 新冠病毒s蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用
CN110279855B (zh) 猪塞内卡病毒新型基因工程疫苗，其制备方法与应用
CN110317278B (zh) Svv和fmdv的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用
KR20190110605A (ko) 돼지 코로나바이러스 백신
CN110256539B (zh) O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗
CN110327461B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用
CN113201507B (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
CN110845604B (zh) 非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用
WO2023051850A1 (zh) 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
CN113845576B (zh) 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用
CN113461788B (zh) 猫冠状病毒重组抗原、其基因工程亚单位疫苗及应用
CN111304253B (zh) 非洲猪瘟病毒疫苗、其制备方法与应用
CN111349179B (zh) 禽呼肠孤病毒基因工程疫苗
CN111647087A (zh) 一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN112592410B (zh) 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN112094354B (zh) 副鸡禽杆菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN111718400B (zh) 猪瘟病毒重组抗原及其制备方法和应用
CN106397602B (zh) 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗
CN111925424B (zh) 日本乙型脑炎病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN116549627A (zh) 基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用
CN112442131B (zh) 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的传染性法氏囊病疫苗和应用
CN110066827B (zh) 含猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及制备方法和应用
CN111729078B (zh) 鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗
CN109851678A (zh) 一种改良的亚稳定态牛呼吸道合胞病毒融合前体f蛋白质及编码的dna分子和其应用
CN111732667B (zh) 小反刍兽疫病毒基因工程亚单位疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230914

Address after: No.23 Fenghuang Avenue, Fenghuang Town, Zhangjiagang City, Suzhou City, Jiangsu Province, 215600

Patentee after: Suzhou womei biology Co.,Ltd.

Address before: Room 506, block D, 388 Ruoshui Road, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province 215000

Patentee before: SUZHOU SHINUO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.