CN111647087A - 一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，具体涉及一种猪塞尼卡谷病毒、圆环病毒2型嵌合病毒样颗粒疫苗。本发明将VP0、VP3、VP1序列串联表达，其中部分VP3序列替换为猪圆环病毒2型ORF2基因C端抗原表位序列形成重组序列，将重组序列构建于重组杆粒上后转染sf9细胞，进一步表达得到猪塞尼卡谷病毒、圆环病毒2型嵌合病毒样颗粒。本发明利用该嵌合病毒样颗粒首次开发了猪塞尼卡谷病毒、圆环病毒2型嵌合病毒样颗粒疫苗，对猪塞内卡谷病毒和猪圆环病毒2型均能起到较好的免疫保护效果。本发明的疫苗经济实用，能够有效降低疾病防疫成本，为国内养殖企业同时预防两种疾病的发生提供了一种新的方法。

Description

一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)又称A型塞内卡病毒，它是单股正链RNA病毒，是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员。不同年龄及不同品种的猪均易感，母猪发病率高，可达70％-90％，但是感染猪的死亡率很低。对于新生仔猪，其发病率可达70％，死亡率在15％-30％之间。因此，SVV对养猪业的生产和经济效益具有较大的威胁。疫苗免疫接种被认为是防控塞内卡谷病毒流行的有效手段，当前还没有市售的SVV商品化疫苗。

杆状病毒表达系统是真核细胞表达系统，由于其具有独特的生物学特性，因此日益受到人们的重视。其中Bac-Bac杆状病毒表达系统通过Tn7转座子作用将外源基因导入到杆状病毒基因组上，由于其操作方便快捷，成为目前使用最广泛的杆状病毒表达系统。昆虫细胞大规模悬浮培养及操作技术简便，成本低，因此被广泛用于生产基因工程产品。病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，因其保留了天然病毒颗粒的空间构象，表现出与天然病毒更相似的构象表位，同时其不含病毒核酸而无法复制，不具有感染性，因此具有更强的免疫原性和生物学活性，能够有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，是潜在的安全的候选疫苗。疫苗生产厂家为保证疫苗的有效性，需要根据野毒株流行情况对疫苗毒株进行变更，需要花费大量人力物力。随着分子生物学技术的飞速发展，利用杆状病毒表达系统构建基因工程亚单位疫苗可以根据疫情及时更新疫苗抗原。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种嵌合病毒样疫苗及其制备方法和应用，具体涉及一种可以同时预防或治疗猪塞尼卡谷病毒和猪圆环病毒2型感染的嵌合病毒样颗粒疫苗。

为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种嵌合蛋白质，其特征在于，所述嵌合蛋白质通过将猪塞尼卡谷病毒P1基因的VP0、VP3、VP1的氨基酸序列依次串联后得到；

其中，所述VP3的序列的第58位和第68位之间的氨基酸序列替换为猪圆环病毒2型ORF2基因C端多肽序列，所述猪圆环病毒2型ORF2基因C端多肽序列如SEQ ID NO.1所示。

在现有技术中，猪塞尼卡谷病毒的常用抗原表位为其VP3的氨基酸序列，猪圆环病毒2型的常用抗原成分为其Cap蛋白，本申请通过软件预测圆环病毒2型Cap蛋白优势B细胞表位，尽量使预测的表位均匀的分布在SVV病毒VP3表面，易于被B细胞识别，设计了所述嵌合蛋白，可以显著提高蛋白的免疫原性，此外，单独使用本发明猪圆环病毒2型ORF2基因C端多肽序列进行相同方式的表达无法得到病毒样颗粒。

而本发明依次连接猪塞尼卡谷病毒P1基因的VP0、VP3、VP1的氨基酸序列，将VP3序列的第58位和第68位之间的氨基酸序列替换为猪圆环病毒2型ORF2基因C端多肽序列翻译得到的嵌合蛋白制备成的疫苗可以同时进行猪塞尼卡谷病毒和猪圆环病毒2型的免疫。

本发明进一步提供所述嵌合蛋白质的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

本发明进一步提供含有所述编码基因的生物产品，所述生物产品为重组载体、试剂盒或重组菌。

第二方面，本发明提供由所述嵌合蛋白质聚集得到的嵌合病毒样颗粒。

第三方面，本发明提供制备所述嵌合病毒样颗粒的方法，包括：

将所述编码基因的核苷酸序列连接至载体上，通过同源重组构建重组杆粒，转染细胞，回收并纯化所述细胞的培养液。

进一步地，所述载体为pFBDM，所述细胞为sf9昆虫细胞。

作为一种优选的实施方式，本发明提供一种嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括：

1、提取SVV毒株的RNA，反转录得到相应的cDNA。

2、设计引物，扩增SVV毒株P1基因的VP0基因片段，连接于pFBDM载体，得到pFB-VP0质粒；扩增VP1基因片段，连接于pFB-VP0质粒，得到pFB-VP0/VP1质粒；扩增VP3基因片段，连接于pFBDM载体，得到pFB-VP3质粒；酶切pFB-VP0/VP1质粒回收VP0/VP1片段连接于pFB-VP3质粒，经筛选得到含有猪塞尼卡谷病毒P1基因完整编码区的序列阳性质粒pFB-P1。

3、通过基因序列合成技术将SVV P1基因部分VP3序列替换为猪圆环病毒2型ORF2基因C端部分多肽序列(如SEQ ID NO.1所示)，将替换后序列连接到pFBDM载体上，经筛选获得具有替换后序列的阳性质粒pFB-VP3-PCV2。

4、设计同源序列，用PCR方法以pFB-VP3-PCV2为模板扩增目的片段VP3-PCV2，XhoI和NheI双酶切法线性化pFB-P1载体，将目的片段和线性化载体用同源重组酶进行连接，转化入DH5α感受态细胞，经筛选获得含pFB-P1-PCV2质粒的阳性克隆。

5、将pFB-P1-PCV2质粒转化入DH10Bac感受态细胞中，经筛选获得rFB-P1-PCV2重组杆粒。

6、将rFB-P1-PCV2转染sf9细胞，待产生细胞病变后，收获培养物上清，并以此感染空白sf9细胞，依照该方法，将重组杆状病毒传至F4代。

本发明进一步提供一种免疫原性组合物，包括所述嵌合病毒样颗粒以及药学上可接受的载体。

第四方面，本发明提供一种嵌合病毒样颗粒疫苗，所述嵌合病毒样颗粒疫苗包含所述免疫原性组合物和佐剂。

进一步地，所述佐剂为兽医学可接受的佐剂，优选为Montanide系列佐剂、免疫刺激复合物或细胞因子类佐剂中的一种或多种，优选为Montanide 206佐剂。

本发明进一步提供所述嵌合蛋白质或其编码基因、所述嵌合病毒样颗粒或述嵌合病毒样颗粒疫苗在治疗或预防猪塞尼卡谷病毒和圆环病毒2型病毒感染中的应用。

本发明进一步提供所述嵌合蛋白质或其编码基因、所述嵌合病毒样颗粒或述嵌合病毒样颗粒疫苗在制备治疗或预防猪圆环病毒2型感染所引起的猪皮炎、呼吸障碍、繁殖障碍疾病和治疗或预防猪塞尼卡谷病毒感染所引起的水疱病的药物中的应用。

本发明具备以下有益效果：

本发明采用的杆状病毒表达系统高效、安全、无害，所表达嵌合病毒样颗粒的空间结构和功能与天然病毒粒子十分接近，从而最大程度地保留其免疫原性；制备方法简单，蛋白产量和纯度高，制备疫苗的抗原免疫原性强，安全性高；同时，相较于单价疫苗或全病毒疫苗，嵌合病毒样颗粒疫苗在设计时保留有效抗原部分，删除无效或不利部分，成分明确，含量高，减少无益蛋白免疫引起的副反应；一次生产获得两种抗原，与传统联苗生产过程及工艺完全不同，减少生产成本，及生产耗时；嵌合苗减少免疫次数，减少人工成本，降低猪免疫过程中的应激反应。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的猪塞内卡病毒蛋白的Pymol预测图：其中，1为猪塞内卡谷病毒核衣壳表面预测的Loop环，2和3分别为猪塞内卡谷病毒VP3蛋白58-68位氨基酸替换圆环病毒2抗原表位前后的Loop环；

图2为本发明实施例3提供的重组杆状病毒荧光检测结果；其中1为空白sf9细胞白光观察结果，2为F1代杆状病毒白光观察结果，3为F3代杆状病毒白光观察结果，4为空白sf9细胞荧光检测结果，5为F1代杆状病毒荧光观察结果，6为F3代杆状病毒荧光观察结果；

图3为本发明实施例3提供的嵌合病毒样颗的粒Western blot检测结果；其中，A图中1为蛋白标准分子质量，2，3分别为杆状病毒实验组，4为杆状病毒感染细胞对照；B图中1，2分别为杆状病毒实验组，3为杆状病毒感染细胞对照，4为空杆状病毒感染对照；

图4为本发明实施例3提供的嵌合病毒样颗粒的SDS-PAGE检测结果；其中M为蛋白标准分子质量，1为阴性对照，2为杆状病毒感染细胞对照，3为纯化后杆状病毒；

图5为本发明实施例3提供的一种猪塞尼卡谷病毒、圆环病毒2型嵌合病毒样颗粒电镜图；其中1为野生型猪塞内卡谷病毒电镜图，2为嵌合病毒样颗粒电镜图，放大倍率为100000X；

图6为本发明实施例4提供的ELISA方法检测PCV2特异性IgG抗体水平结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1猪塞尼卡谷病毒、圆环病毒2型嵌合质粒的构建

(1)猪塞尼卡谷病毒P1基因克隆

参照已发表的猪塞尼卡谷病毒基因序列(Genbank：KY747510.1)设计引物：

Primer1：5’-GGTAATGTTCAGACAACC-3’，

Primer2：5’-CTGTTCCTCGTCCGTCCC-3’，

Primer3：5’-TCCACCGACAACGCCGAG-3’，

Primer4：5’-TTGCATCAGCATCTTCTG-3’，

Primer5：5’-GGGCCTATTCCCACAGCA-3’，

Primer6：5’-GTGGAACACGTAGGAAGG-3’。

提取猪塞尼卡谷病毒总RNA为模板，经MLV-反转录酶合成cDNA第一链后，以Primer1、Primer 2为引物，PCR扩增VP0片段，PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，16℃10min。

将PCR产物连接于pFBDM载体，为pFB-VP0质粒；

以Primer 3、Primer 4为引物，PCR扩增VP1片段，PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，16℃10min。

分别双酶切(XhoI/NheI)PCR产物和质粒pFB-VP0，用T4连接酶连接后为pFB-VP0/VP1；

以Primer5、Primer6为引物，PCR扩增VP3片段，PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，16℃10min。连接于pFBDM载体，为pFB-VP3质粒；

最后双酶切(XhoI/XbaI)pFB-VP0/VP1质粒回收小片段，与酶切pFB-VP3质粒大片段连接，经筛选获得含有猪塞尼卡谷病毒P1基因完整编码区的序列阳性质粒pFB-P1。

(2)猪塞尼卡谷病毒VP3、圆环病毒2抗原表位嵌合基因克隆

利用替换的方法将圆环病毒2抗原表位序列替代猪塞尼卡谷病毒VP3序列中的58-68位氨基酸。通过基因序列合成SVV实现部分VP3序列替换为猪圆环病毒2型CAP基因C端部分抗原表位序列，序列如SEQ ID NO.1所示，将替换后序列连接到pFBDM载体上，经筛选、测序，获得具有替换后序列的阳性质粒pFB-VP3-PCV2。

(3)猪塞尼卡谷病毒、圆环病毒2抗原表位嵌合基因克隆

Primer7：5’-GTTGGGTTGAATTAAAGGTCCGTATACTAGTGAACAAACGACCCAACACCCGTGCG-3’，

Primer8：5’-TGATCTATTAATATTCCGGAGTAGGTCGCGAGATCCAGACATGATAAGATACATTG-3’，

设计同源序列Primer 7、Primer 8，用PCR方法以pFB-VP3-PCV2为模板扩增目的片段VP3-PCV2，PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃2min30sec，30cycles，72℃10min，16℃10min。XhoI和NheI双酶切法线性化pFB-P1载体，同源重组酶连接目的片段和线性化载体，转化入DH5α感受态细胞，获得pFB-P1-PCV2阳性质粒。

图1为本实施例提供的猪塞内卡病毒蛋白的Pymol预测图：其中，1为猪塞内卡谷病毒核衣壳表面预测的Loop环，2和3分别为猪塞内卡谷病毒VP3蛋白58-68位氨基酸替换圆环病毒2抗原表位前后的Loop环。

实施例2 rFB-P1-PCV2重组杆粒构建与提取

将rFB-P1-PCV2重组杆粒转化入DH10Bac感受态细胞中，37℃负壮4h后涂布于含卡那霉素(50μl/mL)、四环素(10μ1/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、X-Gal(100μl/mL)、IPTG(40μl/mL)的LB蓝白斑筛选平板上，经培养，挑取白色菌落进行PCR鉴定，获得rFB-P1-PCV2重组载体，扩大培养，采用异丙醇沉淀法抽提重组杆粒，立即使用或置于-20℃保存备用。

实施例3嵌合重组杆状病毒的获得及鉴定

(1)获得嵌合重组杆状病毒

利用脂质体转染法将rFB-P1-PCV2转染sf9细胞，放置于28℃培养，48-72h后细胞变圆，变大，内部出现大量颗粒体，随即细胞大量死亡；阴性对照组细胞正常生长，说明重组杆状病毒组装成功。收获培养物，1500g离心5-10min收取上清，即为F1代病毒液；再用F1代病毒液感染空白sf9细胞，待产生细胞病变达到80％以上时，收获培养物上清，即为F2代病毒液。依照该方法，将重组杆状病毒传至F4代，所有收获的重组杆状病毒置于-80℃保存备用。转染方法参照脂质体转染试剂说明书(Cellfectin II Reagent,Invitrogen)。

图2为本实施例提供的重组杆状病毒荧光检测结果；其中1为空白sf9细胞白光观察结果，2为F1代杆状病毒白光观察结果，3为F3代杆状病毒白光观察结果，4为空白sf9细胞荧光检测结果，5为F1代杆状病毒荧光观察结果，6为F3代杆状病毒荧光观察结果。

(2)嵌合病毒样颗粒的表达纯化与鉴定

将收获的嵌合重组杆状病毒F3代毒种接种于悬浮培养的sf9细胞中，接毒72h后收获细胞培养上清。利用分子筛纯化后采用SDS-PAGE方法检测纯化效果，然后分别用SVV高免血清和PCV2单克隆抗体进行Western blot检测，结果显示在实验组目的大小处可以观察到特异性条带，而阴性对照均无对应条带(如图3、图4)，嵌合病毒样颗粒抗原蛋白大小约为70kDa。说明本发明所获得的嵌合病毒样颗粒中所展示的SVV、PCV2抗原蛋白具有良好免疫原性，能够被抗体特异性识别。

(3)嵌合病毒样颗粒的电镜观察

将纯化后嵌合重组蛋白经过负染后，在透射电镜下观察结构，得到如图5所示结果。SVV病毒颗粒大小为27-30nm，预估改造后病毒样颗粒大小为30nm。经电镜观察，证明嵌合重组蛋白形成了病毒样颗粒结构。

实施例4

(1)嵌合病毒样颗粒疫苗的制备

纯化得到的上述嵌合重组病毒样颗粒测定浓度后过滤，将它与Montanide ISA206双相油佐剂按照质量比1：1混匀后制成嵌合病毒样颗粒疫苗，使每毫升疫苗中抗原含量为100μg，置于4℃保存待用。

(2)嵌合病毒样颗粒疫苗在猪体内安全性评价

为了评价上述疫苗在本体动物猪上的安全性，购买5-6月龄中大猪8只，经猪口蹄疫、猪水泡口炎病、猪水泡炎、猪塞尼卡谷病毒抗体检测均为阴性，试验猪随机分为两组，每组4只。一组每只肌肉注射2ml VLPs疫苗(200μg/只)，另一组为PBS免疫对照组。在免疫前后观察每只猪只体温变化，观察是否有发热、厌食等现象，检测结果见表1。试验结果表明，观察期内免疫猪和对照猪的健康状况良好，未出现因疫苗注射引起的发热反应或其他不良反应，此结果表明该疫苗对本体动物是安全的。

表1疫苗免疫后猪只体温情况

(3)嵌合病毒样颗粒疫苗在猪体内免疫原性评价

为了进一步评价上述疫苗对本体动物猪的免疫效力，分别于首次免疫后7、21、28、35天进行前腔静脉采血，分离血清后利用中和试验测定SVV的中和抗体，检测结果见表2，结果表明，该疫苗具有良好的免疫原性，能够激发机体产生高水平的中和抗体；与此同时，利用ELISA方法进行PCV2特异性IgG抗体检测，检测结果见图6和表3，结果表明，和对照组相比，该疫苗能刺激机体产生较高水平的PCV2血清抗体。

表2疫苗免疫后猪只SVV抗体情况

表3疫苗免疫后猪只PCV2抗体情况

试验例1

本试验例将本发明的嵌合病毒样颗粒疫苗与猪塞尼卡病毒和猪圆环病毒灭活苗在猪体内免疫原性评价。实验组1为猪塞尼卡谷病毒灭活疫苗，实验组2为猪圆环病毒灭活疫苗，实验组3为本发明实施例4得到的嵌合病毒样颗粒疫苗。分别在免疫后28天测定SVV抗体和PCV2抗体。实验组1和2的灭活疫苗均可市售购得。结果表明，本发明的嵌合病毒样颗粒疫苗在免疫后28天，无论是SVV还是PCV2，都显示出更好的抗体水平。

表4实验组1-3疫苗免疫后猪只SVV抗体和PCV2抗体情况

注：“—”未进行测定

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

<130> KHP201111476.3

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggcctattc ccacagcacc cagagaaaat tcgcttatgt ttctctcaac catccccgac 60

gacactgtcc ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct ccctggtgaa 120

ataaccgacc tcttacaact ggcccgtata cccactctca tggcgttcgg gaccatgtac 180

gtccaattca gggagttcaa cttgaaagat ccaccactga atcctaagaa gtatgtgccc 240

tacgttgccg ttcctgccca gttcaacgac aagcctctca tctccttccc gatcaccctt 300

tcagatccag tctaccagaa caccctggta ggcgccatca gttcgaactt cgccaactac 360

cgggggtgtg tccaaatcac cctgacattt tgtggaccca tgatggcaag agggaaattc 420

ctgctctcgt attctccccc aaatggagca caaccacaga ccctttctga agctatgcag 480

tgcacatact ctatttggga tataggtttg aactctagtt ggacctttgt catcccctac 540

atctcgccca gtgattaccg tgaaactcgg gctattacca actcagttta ttctgctgat 600

ggttggttta gcttacacaa gctgaccaaa atcactctac cacctgactg cccacagagt 660

ccctgtattc tctttttcgc ttctgctggt gaggattaca ccctccgtct ccctgttgat 720

tgtaatcctt cctacgtgtt ccac 744

<210> 2

<211> 2601

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaatgttc agacaacctc aaagaatgat tttgattccc gcggcaacaa tggtaacatg 60

accttcaatt actacgcaaa cacttaccag aattcagtgg acttctcgac ctcctcgtcg 120

gcgtcaggcg ccggacccgg gaactcccgg ggcggattag cgggtctcct cacaaatttt 180

agtggaatct tgaaccctct tggctacctc aaagatcaca ataccgaaga aatggaaaac 240

tctgctgatc gagtcataac gcaaacggcg ggcaacactg ccataaacac gcaatcatca 300

ctgggtgtgt tgtgtgccta cgttgaagac ccgaccaaat ctgaccctcc gtccagcagc 360

acagatcaac ctactaccac ttttactgcc atcgacaggt ggtacactgg acgcctcaat 420

tcttggacaa aagctgtaaa aaccttctct ttccaggccg tcccgctccc tggagccttc 480

ctgtctaggc agggaggcct caacggaggg gccttcacgg ctaccctaca tagacatttc 540

ttaatgaagt gcgggtggca agtgcaggtc caatgcaatt tgacacaatt ccaccagggc 600

gctcttcttg ttgccatggt ccccgaaacc acccttgatg tcaaacctga cggcaaggct 660

aagagcttac aagagctgaa cgaagagcag tgggtggaaa tgtctgacga ttaccggacc 720

gggaaaaaca tgccttttca gtctcttggc acttactatc ggccccctaa ctggacttgg 780

ggccccaatt tcattaaccc ctatcaagta acagttttcc cacaccaaat tctgaacgcg 840

agaacctcta cctcggtaga cataagtgtc ccatacatcg gggagactcc tacgcaatcc 900

tcagagacac agaactcctg gaccctcctc gttatggtgc ttgtccccct ggactacaag 960

gagggagcca caactgaccc agaaattaca ttttctgtaa ggcctacaag tccttacttc 1020

aatgggcttc gtaaccgttt cacgaccggg acggacgagg aacaggggcc tattcccaca 1080

gcacccagag aaaattcgct tatgtttctc tcaaccatcc ccgacgacac tgtccctgct 1140

tacgggaatg tgcgtacccc tcccgtcaat tacctccctg gtgaaataac cgacctctta 1200

caactggccc gtatacccac tctcatggcg ttcgggacca tgtacgtcca attcagggag 1260

ttcaacttga aagatccacc actgaatcct aagaagtatg tgccctacgt tgccgttcct 1320

gcccagttca acgacaagcc tctcatctcc ttcccgatca ccctttcaga tccagtctac 1380

cagaacaccc tggtaggcgc catcagttcg aacttcgcca actaccgggg gtgtgtccaa 1440

atcaccctga cattttgtgg acccatgatg gcaagaggga aattcctgct ctcgtattct 1500

cccccaaatg gagcacaacc acagaccctt tctgaagcta tgcagtgcac atactctatt 1560

tgggatatag gtttgaactc tagttggacc tttgtcatcc cctacatctc gcccagtgat 1620

taccgtgaaa ctcgggctat taccaactca gtttattctg ctgatggttg gtttagctta 1680

cacaagctga ccaaaatcac tctaccacct gactgcccac agagtccctg tattctcttt 1740

ttcgcttctg ctggtgagga ttacaccctc cgtctccctg ttgattgtaa tccttcctac 1800

gtgttccact ccaccgacaa cgccgagact ggggttattg aggcaggtaa cactgacacc 1860

gatttctctg gtgaactggc ggctcctggc tctaaccata ctaatgtcaa attcctgttt 1920

gatcgatccc gactactgaa tgtaattaag gtgctggaga aggacgccgt cttcccccgt 1980

cctttcccca cagcaacagg tgcacagcag gacgatggtt acttttgtct cctaacaccc 2040

cgcccaacag tcgcttcccg acccgccact cgtttcggcc tgtacgccaa cccgtctgac 2100

agtggcgttc tcgccaacac ttcactggat ttcaattttt acagtttggc ctgtttcact 2160

tactttagat cagaccttga agtcacggtg gtctcactag agccagattt ggaattcgcc 2220

gtggggtggt tcccctctgg cagtgagtat caggcttcta gctttgtcta cgaccaactg 2280

catgtaccct accacttcac tgggcgcact ccccgcgctt tcaccagcaa gggtggaaag 2340

gtatctttcg tgctcccttg gaactctgtc tcttccgtgc ttcccgtgcg ctgggggggc 2400

gcttccaagc tttcttctgc cacgcggggt ctgccggctc atgctgactg ggggaccatt 2460

tacgccttta tcccccgccc taacgagaag aaaagcaccg ctgtaaaaca cgtggcggtg 2520

tacgttcggt acaagaacgc gcgtgcctgg tgccccagca tgcttccctt tcgcagctac 2580

aagcagaaga tgctgatgca a 2601

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaatgttc agacaacc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgttcctcg tccgtccc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccaccgaca acgccgag 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgcatcagc atcttctg 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggcctattc ccacagca 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtggaacacg taggaagg 18

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttgggttga attaaaggtc cgtatactag tgaacaaacg acccaacacc cgtgcg 56

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgatctatta atattccgga gtaggtcgcg agatccagac atgataagat acattg 56

Claims (10)

1.一种嵌合蛋白质，其特征在于，所述嵌合蛋白质通过将猪塞尼卡谷病毒P1基因的VP0、VP3、VP1的氨基酸序列依次串联后得到；

其中，所述VP3的序列的第58位和第68位之间的氨基酸序列替换为猪圆环病毒2型ORF2基因C端多肽序列，所述猪圆环病毒2型ORF2基因C端多肽序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因用于编码权利要求1所述嵌合蛋白质，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种生物产品，其特征在于，所述生物产品含有权利要求2所述编码基因，所述生物产品为重组载体、试剂盒或重组菌。

4.一种嵌合病毒样颗粒，其特征在于，所述嵌合病毒样颗粒由权利要求1所述嵌合蛋白质自组装得到。

5.权利要求4所述嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

将权利要求2所述编码基因的核苷酸序列连接至载体上，通过同源重组构建重组杆粒，转染细胞，回收并纯化所述细胞的培养液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pFBDM，和/或，所述细胞为sf9昆虫细胞。

7.一种嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，包括权利要求4所述嵌合病毒样颗粒和佐剂。

8.根据权利要求7所述的嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述佐剂为兽医学可接受的佐剂，优选为Montanide系列佐剂、免疫刺激复合物或细胞因子类佐剂中的一种或多种，更优选为Montanide 206佐剂。

9.权利要求1所述嵌合蛋白质或其编码基因或权利要求4所述嵌合病毒样颗粒或权利要求7或8所述嵌合病毒样颗粒疫苗在治疗或预防猪塞尼卡谷病毒，和/或，圆环病毒2型病毒感染中的应用。

10.权利要求1所述嵌合蛋白质或其编码基因或权利要求4所述嵌合病毒样颗粒或权利要求7或8所述嵌合病毒样颗粒疫苗在制备用于治疗或预防猪塞尼卡谷病毒，和/或，圆环病毒2型病毒感染的药物中的应用。

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