CN115850397A - 一种ii型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于病毒样颗粒技术领域。本发明经昆虫密码子优化的VP3、VP4、VP6、VP7基因，通过多基因杆状病毒表达系统成功组装了GCRV‑VLPs。本发明提供的GCRV‑VLPs为制备防控出血病的疫苗奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于病毒样颗粒技术领域，具体涉及一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
草鱼呼肠孤病毒(grass(carp(reovirus，GCRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridoe)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus,(ARV)，是引起草鱼出血病的主要病原。出血病主要在草鱼育种阶段出现，能引起草鱼种苗的大量死亡，患病死亡率达到80％～100％，具有感染率高、致死率高、流行范围广、发病季节长等特点，被农业部公告第1125号列为二类动物疫病，该病毒也是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒。GCRV基因组由11个双链RNA节段(S1～S11)组成，无囊膜，呈20面体的球状颗粒。目前，已经报道的GCRV拥有40多个分离株，且不同分离株在致病性、细胞感染、蛋白电泳条带、基因组序列和特征等方面存在明显差异。根据现有的分离株序列对GCRV进行生物信息学分析，GCRV至少存在3种不同基因型，分别为I型(代表株GCRV-873)、Ⅱ型(代表株GCRV HZ08)和Ⅲ型(代表株GCRV104)。以II型致病性最强，流行性最广，检出率最高，致死率高。GCRV基因Ⅱ型(GCRV-Ⅱ)包含11个核酸片段(S1～S11)，共编码12种蛋白，包括5种非结构蛋白(NS80、NS38、NS31、NS26和(NS16)和7种结构蛋白(VP1-VP7)。其中VP1、VP2、VP3、VP4和VP6蛋白是病毒核衣壳和中间层蛋白组分。VP3是构成内层蛋白衣壳的基本骨架，VP4蛋白可能协同VP2参与mRNA的起始合成与延伸，VP6起着连接内外层衣壳蛋白的作用，具有稳定内衣壳骨架VP3蛋白的功能。GCRV基因Ⅱ型的外衣壳蛋白主要是VP5和VP7，二者以200个三聚体的形式出现，而形成外层衣壳，病毒的侵染与进入细胞方式可能与这两种蛋白相关。
病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是由病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而组成的高度结构化空心颗粒，形态类似真实的病毒粒子。VLPs具有类似于天然病毒的理化性质，但不包含病毒基因组，具有安全性高，并能被抗原提呈细胞摄取加工并递呈，可诱导动物机体产生针对该病毒的免疫应答。
昆虫-杆状病毒表达载体系统(Bac-to-Bac Expression System)是外源基因以杆状病毒为载体，基于在大肠杆菌中通过位点特异性转座而不是在昆虫细胞中通过同源重组产生重组杆状病毒，最终在昆虫细胞中表达包含许多亚单位的蛋白复合物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法，为VLPs疫苗研发奠定基础。
本发明提供了一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒，包括II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白；
VP3结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
VP4结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
VP6结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
VP7结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明提供了一种所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)编码II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白的基因进行昆虫密码子优化，将优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP，将优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM；
2)制备含步骤1)中所述重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP的感受态；
3)将步骤1)得到的重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM转化至步骤2)制备的感受态中，筛选，得到含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组穿梭质粒；
4)将步骤3)中所述含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组穿梭质粒转染昆虫细胞，分离纯化病毒样颗粒。
优选的，优化的VP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优化的VP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优化的VP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
优化的VP7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选的，步骤1)中优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体的方法，包括优化的VP3基因片段克隆pUC57中，将VP6基因克隆至pUCDM-XIGP中，得到的两重组质粒G-VP3-pUC57和G-VP6-pUCDM-XIGP分别进行sma I/xho I双酶切，得到的VP3片段与线性化G-VP6-pUCDM-XIGP连接，得到G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP。
优选的，步骤1)中所述优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体中的方法，包括将优化的VP4基因片段克隆至PUC57中，将优化后的VP4基因片段克隆至pYBDM-IM中，得到的两重组质粒G-VP4-pUC57和G-VP7-pYBDM-IM分别进行sma I/xho双酶切，得到的优化的VP7基因片段和线性化的G-VP7-pYBDM-IM连接，得到G-VP4-VP7-pYBDM-IM。
优选的，步骤2)中含所述重组转移载体的感受态的制备方法，包括将所述重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP转入Am MultiBacmid/SW106/asd-/inv+感受态中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定得到的阳性菌株为G36-pUCDM-Am。并制备感受态，得到感受态G36-pUCDM-Am。
优选的，步骤3)中所述筛选方法，将重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM转化至感受态G36-pUCDM-Am中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定，得到阳性菌株G3467-pYBDM-pUCDM-Am。
优选的，分子鉴定用引物包括VP3 F/VP3 R、VP4 F/VP4 R、VP6 F/VP6 R、VP7 F/VP7 R；
所述VP3 F/VP3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
所述VP4 F/VP4 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述VP6F/VP6 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
所述VP7 F/VP7 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
本发明提供了所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒或所述制备方法制备的II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒在制备防控出血病的疫苗中的应用。
本发明提供一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒，包括II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白；VP3结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；VP4结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；VP6结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；VP7结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。本发明基于II型草鱼呼肠孤病的VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白构建一种新型的病毒样颗粒，为后续制备防控出血病的疫苗奠定了基础。
本发明利用一种在昆虫细胞中快速、经济、高通量生产重组杆状病毒的方法进行VLPs组装。相较于传统杆状病毒表达系统，该系统做出如下改进：①利用零背景转座系统在大肠杆菌中生成100％的白色菌落或重组Bacmid，该系统由条件复制供体载体pBest和染色体attTn7位点阻塞的DAP营养缺陷型大肠杆菌宿主组成。②利用表达DAP营养不良型大肠杆菌的重组Bacmid的入侵因子直接侵染昆虫细胞，产生具有感染性的杆状病毒。这种无转染试剂的操作方法非常简便，可以快速高效地生成重组杆状病毒。该方法不需要重组Bacmid的制备和纯化，也不需要繁琐的转染程序。③利用拯救系统，通过破坏Bacmid中的ORF1629，生成功能杆状病毒，并将ORF1629表达盒引入供体载体pBest。杆状病毒不能在昆虫细胞中产生，除非将含有目的基因的pBest正确地转座到Bacmid中。④在Bacmid中引入了一个荧光表达基因(转移载体pYBDM-IM、pUCDM-XIGP分别加入红色荧光和绿色荧光标签)来跟踪病毒的产生和外源蛋白的表达。
附图说明
图1为本发明构建的重组菌株G3467-pYBDM-pUCDM-Am过程的示意图；
图2为重组菌株G3467-pYBDM-pUCDM-Am的PCR电泳图，其中M：DL5,000 DNAMarker；1：VP3扩增；2：VP4扩增；3：VP6扩增；4：VP7扩增；
图3为荧光显微镜观察重组杆状病毒感染Sf9细胞显色图；其中A：重组病毒感染Sf9细胞自然光源；B：重组病毒感染Sf9细胞红色光源；C：重组病毒感染Sf9细胞绿色光源；D：重组病毒感染Sf9细胞红色绿色叠加光源；
图4为重组病毒Ac MNPV-GCRVII3467的PCR电泳图；其中M：DL5,000 DNA Marker；1：VP3扩增；2：VP4扩增；3：VP6扩增；4：VP7扩增；
图5为重组杆状病毒Ac MNPV-GCRVII3467感染Sf9细胞表达免疫印迹，其中M：PageRulerTM Prestained Protein Ladder,10 to 180kDa；A：VP3蛋白；B：VP4蛋白；C：VP6蛋白；D：VP7蛋白；
图6为电镜观察Ac MNPV-GCRVII3467 VLPs，A：蔗糖梯度离心后病毒分层；B：电镜观察图；C：局部放大图；
具体实施方式
本发明提供了一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒，包括II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白；VP3结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；VP4结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；VP6结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；VP7结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明提供了一种所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)编码II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白的基因进行昆虫密码子优化，将优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体，将优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体；
2)制备含步骤1)中所述重组转移载体的感受态；
3)将步骤1)得到的重组转移载体转化至步骤2)制备的感受态中，筛选，得到含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌株；
4)将步骤3)中所述含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌液转染昆虫细胞，进行重组蛋白表达和病毒样颗粒组装；
5)分离纯化病毒样颗粒。
本发明将编码II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白的基因进行昆虫密码子优化，将优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体pUCDM-XIGP中，得到重组转移载体，将优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体pYBDM-IM中，得到重组转移载体。
在本发明中，优化的VP3基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。优化的VP4基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示；
优化的VP6基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3所示；
优化的VP7基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4所示。
在本发明中，为了便于后续病毒样颗粒的鉴定，在基因中添加标签，例如不同基因添加不同种类的标签：VP3(C-MYC)、VP4(StrepII)、VP6(Flag)、VP7(His)。
在本发明中，优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体的方法，优选包括优化的VP3基因片段克隆pUC57中，将VP6基因克隆至pUCDM-XIGP中，得到的两重组质粒G-VP3-pUC57和G-VP6-pUCDM-XIGP分别进行sma I/xho I双酶切，得到的VP3片段与线性化G-VP6-pUCDM-XIGP连接，得到G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP。G-VP3-pUC57由北京欧林格生物科技有限公司合成。优化的VP3基因片段克隆至pUC57的多克隆位点优选为SmaI/Hind III。pYBDMYBDM-IM转移载体是在pYBDM原始载体的在SphI位点和KpnI位点之间插入核糖体结合位点IRES和红色荧光蛋白基因Mecherry。pUCDM-XIGP转移载体是pUCDM原始载体在XbaI和PstI之间插入核糖体结合位点IRES和绿色荧光蛋白基因eGFP，其中，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；Mecherry基因表达产生红色荧光蛋白，GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用；IRES有助于Mecherry和GFP蛋白的表达。
YBDMVP6基因在pUCDM-XIGP的多克隆位点为BamHI/SalI。本发明对所述酶切和连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切连接方法即可。
在本发明中，所述优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体中的方法，优选包括将优化的VP4基因片段克隆至PUC57中，将优化后的VP7基因片段克隆至pYBDM-IM中，得到的两重组质粒G-VP4-pUC57和G-VP7-pYBDM-IM分别进行sma I/xho双酶切，得到的优化的VP7基因片段和线性化的G-VP7-pYBDM-IM连接，得到G-VP4-VP7-pYBDM-IM。优化的VP4基因片段克隆至pUC57的多克隆位点优选为SmaI/Hind III。VP7基因在pUCDM-XIGP的多克隆位点为BamHI/SalI。本发明对所述酶切和连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切连接方法即可。
得到重组转移载体后，本发明制备含所述重组转移载体的感受态。
在本发明中，含所述重组转移载体的感受态的制备方法，包括将所述重组转移载体转入Am MultiBacmid/SW106/asd-/inv+感受态中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定得到的阳性菌株制备感受态，得到感受态G36-pUCDM-Am。
所述培养的时间优选为5～7h，更优选为6h。所述分离优选在4000～6000rpm下离心2～4min，更优选为在5000rpm下离心3min。本发明对所述蓝白斑筛选的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的蓝白斑筛选即可。分子鉴定用引物包括VP3 F/VP3 R和VP6 F/VP6。所述VP3 F/VP3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。所述VP6 F/VP6 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
得到重组转移载体转化后，本发明将重组转移载体转化至感受态中，筛选，得到含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌株。
在本发明中，所述筛选方法，优选将重组转移载体转化至感受态中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定，得到阳性菌株G3467-pYBDM-pUCDM-Am。
所述分子鉴定用引物优选包括VP4 F/VP4 R和VP7 F/VP7 R。所述VP4 F/VP4 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。所述VP7 F/VP7 R的核苷酸序列如SEQID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
得到含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌株后，本发明将所述含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌液转染昆虫细胞，进行杆状病毒重组和外源蛋白的表达，分离纯化病毒样颗粒。
在本发明中，所述昆虫细胞优选为Sf9细胞。所述Sf9细胞的培养方法优选为用Sf-900 III SFM培养基培养Sf9细胞，28℃过夜培养，至细胞密度达到80％～90％。
在本发明中，所述转染的方法优选为将离心收集含有重组杆状病毒的阳性菌体，用无菌水反复清洗3～5次，充分洗去培养基中的DAP。加入1mL细胞培养基重悬，菌液稀释后接种培养的Sf9细胞中，在28℃培养箱中孵育4h，弃去上清，用无菌PBS清洗2～3次后每孔加入500μL Sf-900 III SFM培养基。
YBDM在本发明中，对得到的病毒样颗粒进行鉴定，包括PCR分子鉴定和Western-blotting检测蛋白表达鉴定。所述病毒样颗粒经过纯化后进行形态观察。所述纯化的方法优选为蔗糖梯度离心法。对得到的病毒样颗粒进行电镜观察，制备的病毒样颗粒为直径在80～100nm之间的二十面体对称，在形态和形状上与GCRV-VLPs相似。
本发明提供了所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒，应用于制备防控出血病的疫苗中。
下面结合实施例对本发明提供的一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒的制备方法
A.重组穿梭质粒G3467-pYBDM-pUCDM-Am的构建方法(见图1)
1、以GCRVII-VP3株的序列为基础(Genbank Accession NO：KC238678.1)，经过昆虫密码子优化，并添加Cmyc标签之后，得到G-VP3-pUC57质粒，基因序列如SEQ ID NO：1所示的GCRVII-VP3基因，送基因合成公司进行基因序列合成，并分别在5′端和3′端设置SmaI和Hind III酶切位点，得到插入片段。
2、针对GCRVII-VP4(Genbank Accession NO：KC238681.1)，经过昆虫密码子优化，并添加strepII标签之后，得到G-VP4-pUC57质粒，基因序列如SEQ ID NO：2所示的GCRVII-VP4基因，送基因合成公司进行基因序列合成，并分别在5’端和3’端设置SmaI和Hind III酶切位点，得到插入片段。
3、针对GCRVII-VP6(Genbank Accession NO：KC238684.1)，经过昆虫密码子优化，并添加FLAG标签之后，得到G-VP6-pUC57质粒，基因序列如SEQ ID NO：3所示的GCRVII-VP6基因，送基因合成公司进行基因序列合成，并分别在5′端和3′端设置BamHI和SalI酶切位点，得到插入片段。
4、针对GCRVII-VP7(Genbank Accession NO：KC238685.1)，经过昆虫密码子优化，并添加His标签之后，得到G-VP6-pUC57质粒，基因序列如SEQ ID NO：4所示的GCRVII-VP3基因，送基因合成公司进行基因序列合成，并分别在5′端和3′端设置BamHI和SalI酶切位点，得到插入片段。
5、构建转移载体G-VP6-pUCDM-XIGP
为了将VP6构建到转移载体pUCDM-XIGP polh启动子一侧，将合成质粒G-VP6-pUC57，在BamH I和Sal I两个限制性内切酶的作用下，37℃酶切1h，将目的基因VP6连接到pUCDM-XIG酶切后的BamH I/Sal I位点，命名为G-VP6-pUCDM-XIGP。
6、构建转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP
为了将VP3构建到载体G-VP6-pUCDM-XIGP p10启动子一侧，将合成质粒G-VP3-pUC57和G-VP6-pUCDM-XIGP，在Sma I和Xho I两个限制性内切酶的作用下，37℃酶切1h，将目的基因VP3连接到转移载体G-VP6-pUCDM-XIGP上，命名为G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP。
7、构建转移载体G-VP7-pYBDM-IM
为了将VP7构建到穿梭载体pYBDM-IM polh启动子一侧，使用BamH I/Sal I内切酶酶切质粒G-VP4-pUC57，将目的基因VP7连接到转移载体pYBDM-IM上，命名为G-VP7-pYBDM-IM。
8、构建转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM
为了将VP4构建到载体G-VP7-pYBDM-IM p10启动子一侧，使用sma I/xho I内切酶酶切质粒G-VP4-PUC57和G-VP7-pYBDM-IM，将目的基因VP4连接到转移载体G-VP7-pYBDM-IM上，命名为G-VP4-VP7-pYBDM-IM。
9、构建重组穿梭质粒G36-pUCDM-Am
将构建好的G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP转移载体转入Am MultiBacmid/SW106/asd-/inv+感受态中，转座过程中需加入DAP，培养6h。5000rpm离心3min后，将弃去部分上层培养基的菌体重悬后均匀涂布于含Cm/DAP/Kan/Tet/Spe抗生素的LB固体平板上，通过IPTG/X-Gal进行蓝白斑筛选，32℃避光培养48h后挑取蓝色单菌落，以VP3 F/R、VP6 F/R为特异性引物进行PCR鉴定，PCR反应体系为：6.5μL的taq酶，1μL的菌液，上下游引物各0.5μL；反应程序为：95℃下预变性3min；95℃下变性30s，57℃下退火30s，72℃下延伸30s，共进行30个循环；最后在72℃下延伸5min，于4℃下保存。反应结束后，取PCR扩增产物2μL，进行琼脂糖电泳检测。将鉴定正确的阳性菌株Bacmid命名为G36-pUCDM-Am。
10、构建重组穿梭质粒G3467-pYBDM-pUCDM-Am
将构建好的G36-pUCDM-Am制备成感受态，具体操作如下：Am MultiBacmid/SW106/asd-/inv+细菌是经过改造的DH10 Bac大肠杆菌，其细胞中含有微型attTn7靶位点的杆状病毒质粒和辅助质粒，可以通过蓝白斑筛选的方法初步挑选阳性重组质粒。
A.在含DAP/Kan/Tet/Spe/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上划线，32℃培养36～48h；
B.待菌落显色后，挑取一个蓝色单菌落于5mL LB培养基中，并加入DAP/Kan/Tet/Spe抗性，32℃、200rpm培养过夜；
C.将上述菌液按合适比例加入到含DAP的100mL LB培养基中，于32℃摇床上培养至OD600达到0.2；
D.向菌液中添加终浓度为0.1％的L-阿拉伯糖，继续培养至OD600＝0.4～0.6；
E.将菌液在冰上放置30min，4℃、3000rpm离心10min，弃去上清；
F.用预冷后的0.1mol/L的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上静置20～30min；
G.4℃、4000rpm离心10min，弃去上层CaCl2；
H.重复(6)、(7)两次后加入1mL 0.1M CaCl2和0.5mL 60％的甘油；
I.将制作好的感受态存放于-80℃保存。
将构建好的G-VP4-VP7-pYBDM-IM转移质粒转入G36-pUCDM-Am感受态中，转座过程中需加入DAP，培养6h。5000rpm离心3min后，将弃去部分上层培养基的菌体重悬后均匀涂布于含Cm/Gm/DAP/Kan/Tet/Spe抗生素的LB固体平板上，通过IPTG/X-Gal进行蓝白斑筛选，32℃避光培养48h后挑取白色单菌落，以VP3 F/R、VP4 F/R、VP6 F/R和VP7 F/R为特异性引物对其进行PCR鉴定，鉴定引物见表1，将鉴定正确的阳性菌株Bacmid命名为G3467-pYBDM-pUCDM-Am。
结果见图2。重组菌液转染Sf9细胞获得重组杆状病毒。
实施例2
重组杆状病毒的提取与鉴定方法
1、杆状病毒的重组
用Sf-900 III SFM培养基培养Sf9细胞于24孔板中，28℃过夜培养，至细胞密度达到80％～90％。离心收集鉴定正确的含有重组杆状病毒的阳性菌体，用无菌水反复清洗3～5次，充分洗去培养基中的DAP，防止后续割裂细胞。加入1mL细胞培养基重悬，菌液浓度记为100，按十倍梯度稀释法，依次稀释到1000倍。分别取500μL稀释后菌液，加到24孔板中，可按需求重复转染多个孔。在28℃培养箱中孵育4h，弃去上清，用无菌PBS清洗2～3次后每孔加入500μL Sf-900 III SFM培养基。在28℃培养箱中孵育72h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，以检测重组菌株是否感染成功。
结果见图3。由图3可知，重组菌株感染细胞成功。
2、收集200μL Sf9细胞培养基上清(重组病毒)
3、PCR鉴定
提取重组杆状病毒DNA，以重组杆状病毒DNA为模板，以VP3 F/R、VP4 F/R、VP6 F/R和VP7 F/R为特异性引物对其进行PCR鉴定，鉴定结果见图4。本发明制备的重组杆状病毒扩增得到预期基因片段。
4、Western-blotting检测蛋白表达
收集经重组杆状病毒Ac MNPV-GCRVII3467感染72～96h后的Sf9细胞，处理后经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上进行免疫印记实验。VP3、VP4、VP6和VP7蛋白实验条件一样。
其中VP3重组蛋白一抗使用C-MYC-Tag Antibody，二抗使用HRP-conjugatedAffinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)。结果如图5中A所示，在135kDa处观察到特异条带，与理论值一致。
VP4重组蛋白一抗使用StrepII-Tag Antibody，二抗使用HRP-conjugatedAffinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，结果如图5中B所示，在70kDa处观察到特异条带，与理论值一致。
VP6重组蛋白一抗使用flag-Tag Antibody，二抗HRP-conjugated AffinipureGoat Anti-Mouse IgG(H+L)，结果如图5中C所示，在47.3kDa处观察到特异条带，与理论值一致。
VP7重组蛋白一抗使用6*His-Tag Antibody，二抗HRP-conjugated AffinipureGoat Anti-Mouse IgG(H+L)，结果如图5中D所示，在35kDa处观察到特异条带，与理论值一致，说明重组蛋白在Sf9细胞中得到了特异性表达。
实施例3
14、VLPs的纯化和电镜观察
VLPs纯化及电镜鉴定
将大量感染Ac MNPV-GCRVII3467病毒的Sf9细胞按1000rpm，离心10min弃去培养基后，加适当PBS重悬后，反复冻融。收集上清，通过蔗糖梯度离心法纯化Ac MNPV-GCRVII3467 VLPs。
具体操作如下：
A.将细胞超声破碎后，经5000rpm、9000rpm差速离心30min，收集上清；
B.蔗糖溶液配制成20％、30％、45％、60％(W/V)四个浓度。然后按高浓度到低浓度缓慢加入离心管中，每个浓度各2.5mL。确保不同浓度之间界限清晰可见；
C.加入样品：吸取蔗糖溶液总体积的1/10病毒样品，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上；
D.将加入样品的离心管缓慢装入套管内，期间勿晃动离心管。将套管吊在水平转头上，置于超速离心机内，37000rpm，4℃离心1～2h；
E.离心结束后，样品中各种粒子按大小分离在相应的密度梯度层中，收集不同梯度界面的白色条带；
F.将收集的各层白色条带透析和浓缩，即得纯化的VLPs。
结果显示，在蔗糖浓度为30～45％界面处均观察到白色条带(图6中A)，通过PBS透析并浓缩后对纯化的VLPs进行透射电镜处理(见图6中B)。结果显示，通过保持直径在80～100nm之间的二十面体对称，在形态和形状上与GCRV-VLPs相似(图6中C)，结果表明AcMNPV-GCRVII3467-VLPs组装成功。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒，其特征在于，包括II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白；
VP3结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
VP4结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
VP6结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
VP7结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.一种权利要求1所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)编码II型草鱼呼肠孤病毒VP3、VP4、VP6、VP7结构蛋白的基因进行昆虫密码子优化，将优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP，将优化的VP4基因和VP7基因克隆至转移载体中，得到重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM；
2)制备含步骤1)中所述重组转移载体G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP的感受态；
3)将步骤1)得到的重组转移载体G-VP4-VP7-pYBDM-IM转化至步骤2)制备的感受态中，筛选，得到含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌株；
4)将步骤3)中所述含VP3、VP4、VP6、VP7基因的重组菌液转染昆虫细胞，进行重组蛋白表达和病毒样颗粒组装，分离纯化病毒样颗粒。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，
优化的VP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优化的VP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优化的VP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
优化的VP7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1)中优化的VP3基因和VP6基因克隆至转移载体的方法，包括优化的VP3基因片段克隆pUC57中，将VP6基因克隆至pUCDM-XIGP中，得到的两重组质粒G-VP3-pUC57和G-VP6-pUCDM-XIGP分别进行sma I/xho I双酶切，得到的VP3片段与线性化G-VP6-pUCDM-XIGP连接，得到G-VP3-VP6-pUCDM-XIGP。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1)中所述优化的VP4基因和VP7基因克隆至穿梭载体中的方法，包括将优化的VP4基因片段克隆至PUC57中，将优化后的VP7基因片段克隆至pYBDM-IM中，得到的两重组质粒G-VP4-pUC57和G-VP7-pYBDM-IM分别进行smaI/xho双酶切，得到的优化的VP4基因片段和线性化的G-VP7-pYBDM-IM连接，得到G-VP4-VP7-pYBDM-IM。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2)中含所述重组转移载体的感受态的制备方法，包括将所述重组转移载体转入Am MultiBacmid/SW106/asd-/inv+感受态中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定得到的阳性菌株制备感受态，得到感受态G36-pUCDM-Am。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选方法，将重组转移载体转化至感受态G36-pUCDM-Am中，在含DAP的条件下培养，培养液分离菌体经蓝白斑筛选，挑取蓝色单菌落，经过分子鉴定，得到阳性菌株G3467-pYBDM-pUCDM-Am。
8.根据权利要求6或7所述制备方法，其特征在于，分子鉴定用引物包括VP3 F/VP3 R、VP4 F/VP4 R、VP6 F/VP6 R、VP7 F/VP7 R；
所述VP3 F/VP3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
所述VP4 F/VP4 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述VP6 F/VP6R的核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
所述VP7 F/VP7 R的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
9.权利要求1所述II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒或权利要求2～8任意一项所述制备方法制备的II型草鱼呼肠孤病毒样颗粒在制备防控出血病的疫苗中的应用。
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