CN110592139B - 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用，属于生物技术领域。本发明利用细菌人工染色体克隆载体构建一个包括含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段、AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和上游基因部分序列DNA片段、及多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列DNA片段的转移载体，将线性化转移载体质粒DNA与线性化的AnpeNPV基因组DNA共转染Tn‑High Five细胞，得到重组AnpeNPV。将该重组AnpeNPV基因组DNA转化至大肠杆菌中，获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV‑bacmid。它既可以在大肠杆菌中以质粒DNA方式复制，亦可在Tn‑High Five昆虫细胞以及柞蚕蛹体内以病毒DNA方式复制，具有感染性。

Description

一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用。
背景技术
杆状病毒(Baculoviruses)亦称为核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPVs)，是一种可在昆虫细胞核中形成包涵体的昆虫病毒。目前已报道能够感染各种不同种类昆虫的杆状病毒超过了1000种，其中大多数感染的是鳞翅目昆虫。杆状病毒在害虫防控、病毒表达载体系统(The Baculovirus Expression Vector System,BEVS)建立和应用、病毒基因功能分析、病毒-昆虫宿主的相互作用等方面已成为重要的研究工具。
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcNPV)于1983年最先被用于建立杆状病毒表达载体系统。1993年，Luckow等人[Luckow et al.Journal of Virology,1993,67:4566-4579]将细菌F质粒DNA的复制子(mini-F replicon)整合到野生型AcNPV基因组中，构建了第一个杆状病毒穿梭载体(baculovirus shuttle vector,Bacmid)。在构建过程中，含有mini-F复制子、卡那霉素抗性标记基因(Kanr)、细菌转座子Tn7转座靶点(mini-attTn7)及lacZα报告基因的DNA片段被克隆构建成一个AcNPV转移载体pMON14272；将pMON14272质粒DNA与野生型AcNPV基因组DNA共转染昆虫细胞Sf9，利用DNA同源重组原理(homologous recombination)，将mini-F复制子等上述元件插入到AcNPV基因组多角体蛋白基因(polyhedrin,polh)位点处，产生含有mini-F复制子等上述元件的重组AcNPV；重组AcNPV通过病毒噬斑筛选得到分离，再经过病毒扩繁，提取重组AcNPV基因组DNA；将重组AcNPV基因组DNA转化至大肠杆菌DH10B中，筛选阳性克隆，完成AcNPV-Bacmid构建。AcNPV-Bacmid基因组中包含AcNPV基因组DNA、细菌质粒mini-F复制子、卡那霉素抗性标记基因(Kanr)、细菌转座子Tn7转座靶点(mini-attTn7)及lacZα报告基因。AcNPV-Bacmid既能在细菌中以质粒DNA的方式复制，又能在昆虫细胞Sf9(Sf21或Tn-High Five)中以杆状病毒DNA的方式复制。利用AcNPV-Bacmid构建重组AcNPV的过程是在细菌中完成的：将克隆有目的基因的、并具有Tn7转座臂(the left and rightarms of Tn7)的转移表达载体质粒DNA转化至含有AcNPV-Bacmid和表达转座酶的辅助质粒的宿主菌中，目的基因的表达框在转座酶的作用下，通过转座重组(the site-specifictransposition)方式插入到AcNPV-Bacmid基因组mini-attTn7位点中，获得重组的AcNPV-Bacmid；提取重组AcNPV-Bacmid DNA直接用于转染昆虫细胞，即可获得重组AcNPV。这一方法省去了早期研究方法中需要在昆虫细胞中进行基因同源重组、经多轮病毒噬斑筛选获得重组病毒的过程，简化了实验流程，产生重组病毒的效率由早期的0.1～1％提高至近100％，获得重组病毒的周期由过去的4～6周缩短至7-10天。Invitrogen公司据此项技术为基础开发的AcNPV Bac-to-Bac表达系统不仅在重组蛋白表达、疫苗制备等研究和开发方面得到广泛应用，也为AcNPV基因组进行基因敲除、开展基因功能的深入研究提供了重要的研究工具。
柞蚕(Antheraea pernyi)是我国特有的经济昆虫之一，柞蚕茧年产量可达7万吨左右。柞蚕产业是北方蚕区农民经济收入的主要来源。柞蚕以蛹期滞育，柞蚕蛹体型较大，被认为是理想的昆虫生物反应器。柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyimultinucleocapsid nucleopolyhedrovirus,AnpeNPV)是柞蚕核型多角体病(俗称柞蚕脓病)的病原，专一性感染柞蚕，不感染昆虫细胞Sf9(Sf21)及家蚕，与AcNPV一样同属于昆虫杆状病毒，已被用做病毒表达载体得到深入研究。建立AnpeNPV-柞蚕蛹表达系统应用于表达重组蛋白、构建基因治疗载体、制备类病毒样颗粒体疫苗等的研究和开发，可使我国丰富的柞蚕蛹资源得到有效利用，为柞蚕产业的创新发展注入新的动能，同时也为我国生物制品的研究和开发提供有用的技术平台。近年来，围绕AnpeNPV-柞蚕蛹表达系统研究取得了一定的进展，在柞蚕蛹中已成功地表达了绿色荧光蛋白、人生长激素等基因。在AnpeNPV-柞蚕蛹表达系统中，目前仍是利用野生型AnpeNPV基因组DNA与转移表达载体质粒DNA共转染昆虫细胞Tn-High Five来产生重组病毒，重组病毒的筛选分离需要经过昆虫细胞-柞蚕蛹的循环感染来完成，不仅重组病毒比率低，筛选周期更长(6-8周)，技术要求高，严重阻碍了AnpeNPV-柞蚕蛹表达系统的推广应用。为了突破这一技术障碍，在前期的研究中，我们也曾参照AcNPV-bacmid构建的技术路线，尝试建立AnpeNPV穿梭载体，但发现其产生的重组AnpeNPV中mini-F复制子等元件有部分DNA序列缺失，转化至大肠杆菌中不能产生正确的菌落，AnpeNPV穿梭载体的构建未能实现。影响正确重组病毒产生的因素除重组效率外，也包括插入片段(如mini-F复制子等元件)在病毒DNA重组复制过程中的稳定性，由于不同的核型多角体病毒基因组大小不同、DNA序列差异较大，病毒宿主具有专一性。因此，每种杆状病毒穿梭载体的构建都需依据各自病毒的特点采用不同的方法来实现。目前，尚未有构建AnpeNPV穿梭载体的技术方法公开。
发明内容
鉴于上述AnpeNPV研究中存在的技术难点，本发明提供了一种AnpeNPV穿梭载体的构建方法，可应用于AnpeNPV基因的敲除或目的基因的插入、快速构建AnpeNPV表达载体，进行基因工程产品研发及基础科学研究等。
本发明的首要目的是，提供一种AnpeNPV穿梭载体的构建方法。具体的，包含如下步骤：首先利用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosomes，BACs)克隆载体构建一个包括含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段(lacZα:mini-attTn7:lacZα)、AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和上游基因部分序列DNA片段、及多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列DNA片段的转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN。然后制备线性化转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA，与线性化的AnpeNPV基因组DNA共转染Tn-High Five细胞，得到重组AnpeNPV。制备重组AnpeNPV基因组DNA，并将重组AnpeNPV基因组DNA转化至大肠杆菌中，获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid。
具体的，上述技术方案中，所述细菌人工染色体克隆载体指包括任意一个含有大肠杆菌F质粒复制源(replication origin)及抗生素抗性标记基因的克隆载体，如pEZBAC、CopyControl pCC1BAC、pSMART BAC等。优选的，选用pSMART BAC(Lucigen,42030-1)，该载体含有氯霉素抗性基因(Chloramphenicol resistance gene,Cmr)、大肠杆菌F质粒单拷贝复制源(ori2,repE,IncC-single-copy replication origin)以及可诱导的中等拷贝复制源(oriV-inducible medium-copy replication origin)，具有产生的重组质粒稳定、不易发生克隆偏差等特点。
具体的，上述技术方案中，所述利用细菌人工染色体克隆载体构建一个包括含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段(lacZα:mini-attTn7:lacZα)、AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和上游基因部分序列DNA片段、及多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列DNA片段的转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN，具体包括如下步骤：通过克隆载体pSMART BAC构建新的具有BamH I、Avr II(Bln I)、Hind III和EcoR I等单一克隆位点的衍生克隆载体pSMART BAC-N1；将含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段(lacZα:mini-attTn7:lacZα)克隆至载体pSMART BAC-N1的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点处，得到中间载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα。将含有AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和上游基因部分序列的DNA片段、及含有多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列的DNA片段依次克隆至中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα相应克隆位点处，构建转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN。
上述技术方案中，通过克隆载体pSMART BAC构建新的具有BamH I、Avr II(BlnI)、Hind III和EcoR I等单一克隆位点的衍生克隆载体pSMART BAC-N1，具体为：以克隆载体pSMART BAC质粒DNA为模板，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增，得到片段1；用引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4进行PCR扩增，得到片段2。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，将片段1和片段2混合后作为模板，并用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4进行重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)，获得单一的大片段PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳回收大片段DNA，用限制性内切酶BamH I酶解大片段DNA，并经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀回收大片段DNA，利用T4 DNA连接酶使大片段DNA自身连接环化，并转化至大肠杆菌DH5α，在含有氯霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，得到衍生克隆载体pSMART BAC-N1。上述引物序列如下：
SEQ ID NO:1：5’-gcatctgaaGGATCCCCTAGGAAGCTTGGAATTCACGTGACTTG-3’；
SEQ ID NO:2：
Figure BDA0002217111410000051
SEQ ID NO:3：
Figure BDA0002217111410000052
SEQ ID NO:4：
5’-gcatctgaaGGATCCGCGGCCGCTTCTATAGTGTCACCTAAATAC-3’；
其中引物SEQ ID NO:1带有限制性内切酶BamH I、Avr II(Bln I)、Hind III和EcoR I等酶切位点序列(下划线部分)；引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中下划线部分为碱基互补序列，其中包含限制性内切酶Avr II(Bln I)酶切位点序列CCTAGG突变为CCTAAG(斜体加粗部分)；引物SEQ ID NO:4带有BamH I酶切位点序列(下划线部分)。所有引物序列中小写字母部分均为保护碱基序列。
上述技术方案中，所述将片段lacZα:mini-attTn7:lacZα克隆至载体pSMART BAC-N1的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点上构建中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα，具体为：以AcNPV穿梭载体(bacmid,bMON14272)DNA为模板，用引物SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6进行PCR扩增，得到约400bp片段。将该片段克隆到pMD18-T载体上得到质粒，经过测序确认后，用限制性内切酶Bgl II和Avr II(Bln I)双酶解质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收约400bp DNA片段，再将该片段克隆至衍生载体pSMART BAC-N1的BamH I和AvrII(Bln I)克隆位点处，产生中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα。所述引物序列为：
SEQ ID NO:5：5’-cgAGATCTCCCGGGCTGCAGGAATTCACATAAC-3’；
SEQ ID NO:6：5’-atCCTAGGGATCCGCTAGCGTCTTCGAAGCGCGTAACC-3’；
其中引物SEQ ID NO:5带有Bgl II酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQ ID NO:6带有Avr II(Bln I)和BamH I酶切位点序列(下划线部分)。所有引物序列中小写字母部分均为保护碱基序列。
上述技术方案中，所述将含有AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和上游基因部分序列的DNA片段、及含有多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列的DNA片段依次克隆至中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα相应克隆位点处，构建转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN，具体为：以AnpeNPV基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增，得到长度为1286bp的DNA片段1(124957nt-126242nt)；用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10进行PCR扩增，得到长度为1139bp的DNA片段2(254nt-1394nt)。将两个片段分别克隆至pMD18-T载体上，通过测序确认序列正确后，先将片段1克隆至中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的AvrII(Bln I)和Hind III克隆位点处，转化细菌后获得阳性克隆载体质粒；再将片段2克隆至上述阳性克隆载体BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点处，构建转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN。所述引物序列为：
SEQ ID NO:7：5’-gaCCTAGGGCTGCGACGCGAACTAAATAGC-3’；
SEQ ID NO:8：5’-ggAAGCTTATAGGAAATTTTACTACAAAG-3’；
SEQ ID NO:9：5’-acGGATCCTTATTGTCAACTGGAGCGG-3’；
SEQ ID NO:10：5’-ccCCTAGGCGGCGACTTGTTAAACCAG-3’；
其中引物SEQ ID NO:7带有Avr II(Bln I)酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQID NO:8带有限制性内切酶Hind III酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQ ID NO:9带有BamH I酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQ ID NO:10带有Avr II(Bln I)酶切位点序列(下划线部分)。所有引物序列中小写字母部分均为保护碱基序列。
具体的，上述技术方案中，所述制备线性化转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA，具体为：提取转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA，并用Avr II(Bln I)酶切，获得线性化的pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA，无菌处理后用紫外分光光度计定量。
具体的，上述技术方案中，所述得到重组AnpeNPV，具体为：将线性化转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA与AnpeNPV基因组DNA，优选的，与经Avr II(Bln I)酶切处理的线性化AnpeNPV基因组DNA[可线性化的AnpeNPV基因组DNA(ApNPV-Δph/Avr II+/egfp+基因组DNA)的制备方法参照专利：201910517434.1.]适量比例混合，再与转染试剂Cellfectin混合，共转染Tn-High Five昆虫细胞，将转染后的细胞培养液注射感染柞蚕蛹，置20～22℃培养10～12天，得到重组AnpeNPV。
具体的，上述技术方案中，所述制备重组AnpeNPV基因组DNA，并将重组AnpeNPV基因组DNA转化至大肠杆菌中，获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid。具体为：首先将重组AnpeNPV批量感染柞蚕蛹，取感染发病柞蚕蛹体液，用超速离心方法分离重组AnpeNPV游离态病毒(BV)，再经蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提得到重组AnpeNPV基因组DNA。将重组AnpeNPV基因组DNA用电转化方法转至大肠杆菌(BAC-Optimized Replicator v2.0)(Lucigen,60210-1)中，在含有氯霉素、X-Gal和IPTG的细菌培养板上进行蓝、白菌落筛选。挑取蓝色菌落进行液体培养，提取质粒DNA进行PCR鉴定、细胞转染实验检验，获得AnpeNPV-bacmid(AnpeNPV:phΔN-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)穿梭载体。该穿梭载体含有缺失多角体蛋白N端部分编码序列的AnpeNPV基因组DNA、氯霉素抗性标记基因(Cmr)、大肠杆菌F质粒单拷贝复制源(ori2,repE,IncC-single-copy replication origin)和可诱导的中等拷贝复制源(oriV-inducible medium-copy replication origin)、lacZα报告基因以及细菌转座子mini-attTn7基因转座靶点序列等。它既可以在大肠杆菌中以质粒DNA方式复制，亦可在Tn-High Five昆虫细胞以及柞蚕蛹(幼虫)体内以病毒DNA方式复制，均具有感染性。
具体的，上述技术方案中，所述AnpeNPV穿梭载体的获得亦可使用衍生载体pSMARTBAC-N1，或者中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα体外克隆线性化的AnpeNPV基因组DNA[专利申请号：201910517434.1.]。具体为：提取中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα质粒DNA，并用Avr II(Bln I)酶切，然后利用碱性磷酸酶对酶解后的质粒DNA粘性末端做去磷酸化处理。将酶切处理后的质粒DNA与经Avr II(Bln I)酶切处理的线性化AnpeNPV基因组DNA适量比例混合，利用T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化至大肠杆菌(BAC-Optimized Replicator v2.0)中，再涂布于含有氯霉素的LB固体培养板上筛选阳性克隆。如果使用载体pSMART BAC-N1体外克隆线性化的AnpeNPV基因组DNA，则方法同上。
本发明的另一目的是提供AnpeNPV-bacmid穿梭载体的应用。具体的，包括：用于体外制备AnpeNPV基因组DNA，用于AnpeNPV基因的敲除或目的基因的插入，或用于外源基因的表达，开展基础科学研究以及基因工程产品研发等。
具体的，上述方案中所述AnpeNPV-bacmid穿梭载体用于体外制备AnpeNPV基因组DNA，具体为：将AnpeNPV-bacmid DNA转化至大肠杆菌(BAC-Optimized Replicator v2.0)中，并涂布于含有氯霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养板上，37℃培养过夜。挑取单一蓝色菌落接种至5mL含有12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取1～2mL菌液，用常规质粒DNA提取方法制备AnpeNPV-bacmid DNA。AnpeNPV-bacmid DNA经无菌处理，定量备用。可直接用于昆虫细胞转染实验或AnpeNPV基因组DNA图谱分析。
具体的，上述方案中所述AnpeNPV-bacmid穿梭载体用于AnpeNPV基因的敲除或目的基因的插入，具体包括：一方面将AnpeNPV-bacmid DNA转化至大肠杆菌DH10B中，继而在DH10B/AnpeNPV-bacmid的菌中转入同源重组辅助性质粒pKD46，产生DH10B/AnpeNPV-bacmid/pKD46宿主菌。另一方面，构建含有博来霉素(Zeocin，Zeo)抗性基因的打靶载体，进而将博来霉素抗性基因表达盒导入到DH10B/AnpeNPV-bacmid/pKD46宿主菌中，实现AnpeNPV-bacmid上目的基因的敲除，并进一步去除博来霉素抗性基因。博来霉素抗性基因表达盒可以通过基因合成方法获得，所述基因序列如下：
SEQ ID NO:11：
Figure BDA0002217111410000091
Figure BDA0002217111410000101
其中包括：从基因5’端起依次为限制性内切酶Sph I、Pst I、Sac I和EcoR I酶切位点序列(下划线、大写字母部分)、FRT序列(黑框、大写字母部分)、EM7启动子(EM7promoter)序列(小写字母部分)、博来霉素抗性基因编码区序列(斜体加粗、大写字母部分)、FRT序列(黑框、大写字母部分)及限制性内切酶Sal I、Hind III、BamH I和Kpn I酶切位点序列(下划线、大写字母部分)。合成的基因克隆至载体pUC57，构成载体pUC57/FRT-Zeo-FRT，在FRT-Zeo-FRT两侧分别有多克隆位点，便于打靶基因两侧同源臂的克隆，构建打靶载体。
上述技术方案中，所述打靶基因两侧同源臂的克隆及打靶载体的构建，具体为：以敲除AnpeNPV基因组中cathepsin(vcath,orf31)和chitinase(chiA，orf32)基因部分DNA片段为例，设计两对引物，所述引物序列如下：
SEQ ID NO:12：5’-gtCTGCAGGAATACACCAAGTTTGGCG-3’
SEQ ID NO:13：5’-gaGAATTCTGAATTACCATCAAGCGCGG-3’
SEQ ID NO:14：5’-aaGTCGACGAACTTGCAACCTTAGCAAC-3’
SEQ ID NO:15：5’-gaGGATCCGCTCAAACGGCAGCATGCTC-3’
其中引物SEQ ID NO:12带有限制性内切酶Pst I酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQ ID NO:13带有EcoR I酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQ ID NO:14带有Sal I酶切位点序列(下划线部分)，引物SEQ ID NO:15带有BamH I酶切位点序列(下划线部分)。所有引物序列中小写字母部分均为保护碱基序列。以AnpeNPV基因组DNA为模板，用引物SEQID NO:12和SEQ ID NO:13进行PCR扩增，得到长度为233bp的DNA片段1(28464nt-28738nt)；用引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15进行PCR扩增，得到长度为275bp的DNA片段2(31410nt-31642nt)。将两个片段分别克隆到pMD18-T载体上，并经测序确认序列正确后，再将两个片段分先后克隆至载体pUC57/FRT-Zeo-FRT上。其中，片段1克隆至pUC57/FRT-Zeo-FRT载体Pst I和EcoR I位点处，片段2克隆至pUC57/FRT-Zeo-FRT载体Sal I和BamH I位点处，得到打靶载体pUC57/FRT-Zeo-FRT/Δvcath/ΔchiA。
上述技术方案中，所述将博来霉素抗性基因表达盒导入到DH10B/AnpeNPV-bacmid/pKD46宿主菌中，实现AnpeNPV基因组中cathepsin和chitinase基因部分DNA片段敲除，并进一步去除博来霉素抗性基因，具体为：以打靶载体pUC57/FRT-Zeo-FRT/Δvcath/ΔchiA质粒DNA为模板，用引物SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15进行PCR扩增，获得约1.1kb的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化，溶于无菌水中。采用电转化方法，取0.2μg(<2μL)纯化的PCR片段加入到20μL事先处理好的DH10B/AnpeNPV-bacmid/pKD46宿主菌中，混合后冰浴10分钟，转入预冷的0.1cm电转杯中。电转化条件：1.8KV、25μF、200ohms。电转化后加入1mL SOC液体培养基，在30℃低速振荡培养1小时。取培养液涂布于含有博来霉素和氯霉素的LB固体培养板上，37℃培养48小时。筛选阳性克隆，确定获得目的基因片段被敲除的穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor(AnpeNPV:phΔN:Δvcath:ΔchiA-Zeor-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)。进一步，为去除穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor基因组中的博来霉素抗性基因，将一个含有翻转酶重组酶(flipaserecombination enzyme,FLP)基因的pCP20质粒DNA转化至DH10B/AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor菌中。挑选转化子接种至含有氯霉素的LB液体培养基中，置30℃振荡培养8小时，再转至42℃继续振荡培养20小时。将培养的菌液以1:1000接种新的含有氯霉素的LB液体培养基中，重复前述的培养过程。如此循环，重复三次，将最终培养液涂布于含有氯霉素的LB固体培养板上，37℃培养48小时。筛选阳性克隆，获得无博来霉素抗性基因的AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA(AnpeNPV:phΔN:Δvcath:ΔchiA-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)穿梭载体。
具体的，上述技术方案中，所述AnpeNPV-bacmid穿梭载体用于外源基因的表达，具体包括：一方面将AnpeNPV-bacmid DNA转化至大肠杆菌DH10B中，继而在DH10B/AnpeNPV-bacmid的菌中转入可表达转座酶的辅助质粒pMON7124，产生DH10B/AnpeNPV-bacmid/pMON7124宿主菌。另一方面，构建以AnpeNPV多角体蛋白基因启动子和/或P10蛋白基因(p10)启动子调控外源基因表达的、并具有Tn7转座臂的的外源基因转移表达载体。将带有外源基因的转移表达载体质粒DNA转化至DH10B/AnpeNPV-bacmid/pMON7124宿主菌中，在含有氯霉素、庆大霉素(Gentamicin,Gen)、四环素(Tetracycline,Tet)、X-Gal和IPTG的细菌培养板上进行蓝、白菌落筛选。挑取白色菌落进行液体培养，提取质粒DNA进行PCR鉴定。阳性克隆的质粒DNA可直接用于转染昆虫细胞Tn-High Five，细胞转染液用于继续感染柞蚕蛹，进而检测外源基因的表达。
上述技术方案中，所述构建以AnpeNPV多角体蛋白基因启动子和/或P10蛋白基因启动子调控外源基因表达的、并具有Tn7转座臂的外源基因转移表达载体，具体为：一种AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和P10蛋白基因启动子调控序列如下：
SEQ ID NO:16：
Figure BDA0002217111410000121
其中包括：从基因5’端起依次为限制性内切酶Nco I酶切位点序列(小写字母部分)、AnpeNPV P10蛋白基因启动子调控序列(黑框大写字母部分，为反向互补序列)、AnpeNPV多角体蛋白基因启动子调控序列(下划线、大写字母部分)、限制性内切酶BamH I、Sal I、Kpn I、Sma I、EcoR I、Xho I、Avr II(Bln I)和Xba I酶切位点序列(小写字母部分)。所述启动子调控序列DNA片段可以利用重叠延伸PCR方法获得，也可通过基因合成方法获得。优选的，通过基因合成方法获得，并进一步将该DNA片段克隆至转移表达载体pFastBacTM Dual(Invitrogen,10712-024)Nco I和Xba I克隆位点处，构建pApBacDual-N1转移表达载体。该载体具有AnpeNPV多角体蛋白基因启动子调控序列和P10蛋白基因启动子调控序列，Tn7转座左、右臂以及庆大霉素抗性标记基因，在新生的重组AnpeNPV中可以利用AnpeNPV多角体蛋白基因启动子或P10蛋白基因启动子、或同时调控两种外源基因的表达。
进一步，为提高外源基因在细胞外分泌表达的水平以及便于重组蛋白的纯化，一段特定的DNA片段经过基因合成，并用于转移表达载体构建。所述DNA片段的碱基序列如下：
SEQ ID NO:17：
Figure BDA0002217111410000131
其中包括：从基因5’端起依次为Bgl II酶切位点序列(小写字母部分)、一段蛋白质翻译增强子DNA序列(a lobster L21 sequence，斜体加粗、大写字母部分)、编码柞蚕30KD蛋白(GenBank号:KM926620)信号肽(Microvitellogenin signal peptide，Ap30KSP)DNA序列(加粗、大写字母部分)、基因多克隆位点序列(小写字母部分，包括：BamH I、Sal I、Kpn I、Sma I、EcoR I和Xho I)、编码TEV蛋白酶(Tobacco Etch Virus Protease)酶解识别位点氨基酸的DNA序列(黑框、大写字母部分)、编码8个组氨酸标签的DNA序列(8xHis，下划线、大写字母部分)、编码一个Strep标签的DNA序列(加粗、黑框、大写字母部分)、编码6个组氨酸标签的DNA序列(6xHis，黑框、大写字母部分)，TAG为终止子，基因3’端为Avr II(BlnI)和Xba I酶切位点序列(小写字母部分)。三段DNA序列(斜体、小写字母部分)则分别编码三个不同的连接短肽。合成的DNA片段克隆至pApBacDual-N1转移表达载体BamH I和Xba I克隆位点处，构建转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30KSPTEVH8STREPH6。
上述技术方案中，所述的一段特定的DNA片段不仅限于用于基于转座原理进行基因重组的转移表达载体的构建，也适用于基于同源重组原理进行基因重组的转移表达载体的构建。
本发明的优点在于：
1.本发明首次公开了一种AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid(AnpeNPV:phΔN-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)的构建方法。AnpeNPV-bacmid基因组中含有缺失多角体蛋白N端部分编码序列的AnpeNPV基因组DNA、氯霉素抗性标记基因(Cmr)、大肠杆菌F质粒单拷贝复制源(ori2,repE,IncC-single-copy replication origin)和可诱导的中等拷贝复制源(oriV-inducible medium-copy replication origin)、lacZα报告基因以及细菌转座子mini-attTn7基因转座靶点序列等。AnpeNPV-bacmid在细菌中以质粒DNA方式稳定复制，并可根据需要通过诱导方式获得多拷贝的质粒DNA。同时，AnpeNPV-bacmid亦可在Tn-High Five昆虫细胞以及柞蚕蛹(幼虫)体内以病毒DNA方式复制，具有感染性。
2.本发明公开的AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid的构建方法显著区别于已公开的AcNPV-bacmid构建方法，主要包括：一是使用细菌人工染色体载体pSMART BAC为构建AnpeNPV-bacmid的基础载体，以及使用相应的转化宿主菌BAC-Optimized Replicatorv2.0。大多数单拷贝载体产生少量的DNA，容易发生转录错误，且不稳定。pSMART BAC载体具有产生的重组质粒稳定、拷贝数高、不易出现克隆偏差等优点，这一点在本专利实施例中得到验证。以pSMART BAC为基础载体构建的AnpeNPV-bacmid不论是在细菌中，还是在昆虫细胞Tn-High Five或者在柞蚕蛹中均有稳定复制，克服了早期工作中使用AcNPV-bacmid来源的mini-F复制子等元件构建AnpeNPV穿梭载体时出现的基因或DNA片段缺失的问题。二是使用线性化的AnpeNPV基因组DNA和线性化的转移载体质粒DNA共转染昆虫细胞Tn-HighFive，大大提高了AnpeNPV穿梭载体在细胞中的重组效率(>99％)，解决了使用野生型病毒DNA在细胞中产生重组病毒效率低下的问题。
3.本发明还首次提供了AnpeNPV-bacmid应用的技术方法及其组成。主要包括：AnpeNPV-bacmid DNA的提取及昆虫细胞的转染，AnpeNPV-bacmid基因组中某一基因的敲除，以及AnpeNPV-bacmid用于快速构建重组病毒、进行外源基因的表达纯化和利用柞蚕蛹生产重组蛋白等。为AnpeNPV的研究及柞蚕资源的利用提供了技术支持，在生物技术领域的产品研发、科学基础研究等方面具有实用价值。
4.本发明还首次提供了将一个编码柞蚕30KD蛋白的信号肽用于AnpeNPV-柞蚕蛹表达系统进行重组蛋白的分泌表达的方法，使表达的重组蛋白能够直接分泌到柞蚕蛹血淋巴中，便于重组蛋白的分离制备。
附图说明
图1是本发明实施例1所述衍生克隆载体pSMART BAC-N1构建示意图。
图2是本发明实施例1所述细菌人工染色体中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的构建示意图。
图3是本发明实施例1所述细菌人工染色体转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN的构建示意图。
图4是本发明实施例2所述的AnpeNPV穿梭载体构建示意图。
图5是本发明实施例2所述使用引物SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7/SEQID NO:8对含有细菌人工染色体载体pSMART BAC的重组AnpeNPV进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果；图中1、2、3、4分别表示被检测的不同柞蚕蛹个体。
图6是本发明实施例2所述使用引物SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7/SEQID NO:8、SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10对AnpeNPV-bacmid转化菌株DNA进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果；图中1、2、3别表示被检测的不同转化菌株。
图7是本发明实施例2所述使用限制性内切酶Xho I酶解AnpeNPV-bacmid DNA的琼脂糖凝胶电泳结果；图中1为Xho I酶解AnpeNPV-bacmid DNA；2为Xho I酶解野生型AnpeNPVDNA。
图8是本发明实施例3所述vcath和chiA基因打靶载体pUC57/FRT-Zeo-FRT/Δvcath/ΔchiA的构建示意图。
图9是本发明实施例3所述敲除vcath和chiA基因部分DNA片段的穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor(AnpeNPV:phΔN:Δvcath:ΔchiA-Zeor-pSMARTBAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)的构建示意图。
图10是本发明实施例3所述敲除vcath和chiA基因部分DNA片段，并去除博来霉素抗性基因的穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA(AnpeNPV:phΔN:Δvcath:ΔchiA-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)的构建示意图。
图11是本发明实施例4所述AnpeNPV-bacmid转移表达载体的构建示意图；图11-a为转移表达载体pApBacDual-N1，图11-b为转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30KSPTEVH8STREPH6。
图12是本发明实施例4所述AnpeNPV-bacmid用于基因转座方法构建重组病毒表达绿色荧光蛋白检测结果；图12-a为重组病毒感染的Tn-High Five细胞(可见光和荧光)，图12-b为重组病毒感染的Tn-High Five细胞(荧光)，图12-c为重组病毒感染的柞蚕蛹组织细胞(荧光)。
图13是本发明实施例4所述AnpeNPV-bacmid用于基因转座方法构建重组病毒表达犬类α-干扰素的蛋白质免疫印迹方法检测结果；图13-a为带有信号肽Ap30KSP的重组AnpeNPV-bacmid感染的柞蚕蛹，图13-b为不带有信号肽的重组AnpeNPV-bacmid感染的柞蚕蛹对照。
图14是本发明实施例4所述利用Ni-NTA Agarose凝胶纯化带有信号肽Ap30KSP的重组AnpeNPV-bacmid感染柞蚕蛹后的表达产物，15％SDS-PAGE电泳结果。图中1、2、3表示不同洗脱管中的样品。
图15是本发明实施例5所述AnpeNPV-bacmid用于同源重组方法产生重组病毒表达绿色荧光蛋白检测结果；图15-a为重组病毒感染的Tn-High Five细胞(可见光和荧光)，图15-b为重组病毒感染的Tn-High Five细胞(荧光)，图15-c为重组病毒感染的柞蚕蛹组织细胞(荧光)。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步说明，可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实例中所涉及的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或制造商所建议方法；所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
野生型AnpeNPV病毒株为本实验室分离、并通过感染柞蚕蛹保存于-80℃[Fan Q,et al.,Virology,2007,366(2):304-315]。本领域的研究人员也可以从自然感染AnpeNPV的柞蚕蛹中分离获得该病毒。可线性化的AnpeNPV基因组DNA(ApNPV-Δph/Avr II+/egfp+基因组DNA)可参照专利方法获得[专利申请号：201910517434.1.]。柞蚕蛹可从市场上购得。实验中所用各种限制性内切酶、Taq酶、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司。细菌人工染色体克隆载体pSMART BAC(42030-1)及大肠杆菌(BAC-Optimized Replicator v2.0)(60210-1)为Lucigen公司产品(Lucigen,USA)。High FiveTM细胞(B855-02)、转染试剂Cellfectin(10362-010)、无血清细胞培养基SF-900TM II SFM(10902-088)可从Invitrogen公司购买，完全TNM-FH培养基由昆虫培养基Grace’s Insect Medium,Supplemented(11605-094，Invitrogen)补加10％FBS配制而成，FBS(35-010-CV)为Corning公司出品。AcNPV穿梭载体(bacmid,bMON14272)和可表达转座酶的辅助质粒pMON7124分离自DH10Bac，DH10Bac(Cat.no.10361-012)、DH10B(Cat.No.18290-015)及载体pFastBacTM Dual(Cat.no.10712-024)为Invitrogen公司产品(Invitrogen,USA)。质粒pKD46和pCP20购自武汉淼灵生物科技有限公司。质粒DNA提取试剂盒(PD1211-03)为BIOMIGA公司产品，各种抗生素、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、等购自北京拜尔迪生物技术有限公司。基因合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成。Ni-NTA Agarose凝胶为Novagen公司产品。
实施例1细菌人工染色体转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN的构建
(1)细菌人工染色体克隆载体pSMART BAC的修饰
市售的细菌人工染色体克隆载体pSMART BAC(42030-1)基因克隆位点两侧分别具有BamH I、Hind III、EcoR I、Not I等酶切位点，同时在氯霉素抗性基因的3’端还有一个Avr II(Bln I)酶切位点序列(CCTAGG)(图1-a)，不适合直接用于构建转移载体。根据pSMART BAC载体序列(GenBank号:EU101022.1)设计了两对引物：SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4。以pSMART BAC载体质粒DNA为模板，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别进行PCR扩增，其中：SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2引物，使用ExTaq酶，反应条件为：95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个循环；72℃延伸5min。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4引物，使用Taq酶为Prime STARGXL(R050A,TaKaRa)，反应条件为：98℃10sec，68℃5min，共30个循环。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，分别得到片段1，长度为923bp(图1-b(1))；片段2，长度为6699bp(图1-b(2))。再混合片段1和片段2产物用作模板，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4进行重叠延伸PCR扩增，使用Taq酶为Prime STAR GXL，反应条件为：98℃10sec，68℃5min，共30个循环。琼脂糖凝胶电泳回收得到一个约7.5kb的大片段(图1-b(3))。7.5kb的大片段首先经BamH I酶解，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀回收，然后用T4 DNA连接酶进行连接，并转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有氯霉素(12.5μg/mL)的LB固体培养板上，筛选阳性克隆，获得pSMART BAC衍生的克隆载体pSMART BAC-N1(图1-c)。其中pSMART BAC载体原有的Avr II(Bln I)酶切位点序列CCTAGG突变为CCTAAG，同时保留单一的BamH I、Hind III和EcoR I等酶切位点序列，并在BamH I和Hind III酶切位点序列之间重新插入一个Avr II(Bln I)酶切位点序列CCTAGG。
(2)细菌人工染色体中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的构建
含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段(lacZα:mini-attTn7:lacZα)来自于AcNPV穿梭载体(bacmid,bMON14272)DNA，AcNPV穿梭载体DNA从大肠杆菌DH10Bac(Cat.no.10361-012，Invitrogen)中提取获得。设计一对引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，以AcNPV穿梭载体DNA为模板，使用ExTaq酶，进行常规PCR扩增，反应条件为：95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个循环；72℃5min。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，得到约400bp的片段。将该片段克隆至pMD18-T载体，并经测序确认备用。片段的一端具有Bgl II酶切位点序列，另一端具有Avr II(Bln I)酶切位点序列。用Bgl II和Avr II(Bln I)双酶解制备该片段(图2-a)，并与经BamH I和Avr II(Bln I)双酶解的衍生克隆载体pSMART BAC-N1(图2-b)质粒DNA进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有12.5μg/mL氯霉素、100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的LB固体培养板上，37℃培养过夜。挑取蓝色菌落接种至含有氯霉素(12.5μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒DNA，用限制性内切酶Not I酶切质粒DNA，确定克隆质粒中含有插入的400bp DNA片段，获得中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα(图2-c)。该载体具有BamHI、Avr II(Bln I)和Hind III单一克隆位点。
(3)细菌人工染色体转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN的构建。
根据AnpeNPV基因组DNA序列(GenBank号:EF207986.1)，选取多角体蛋白基因编码区上游124957nt至126242nt区段，以及多角体蛋白基因编码区254nt至下游1394nt区段设计两对引物SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10。以AnpeNPV基因组DNA为模板，分别用两对引物进行常规PCR扩增，使用ExTaq酶，反应条件为：95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30sec，共35个循环；72℃延伸8min。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，分别得到约1.286kb和1.139kb的DNA片段。将两个片段分别克隆至pMD18-T载体，并经测序确认备用。
用Avr II(Bln I)和Hind III双酶解制备124957nt-126242nt区段DNA片段(图3-a(1))，并与经Avr II(Bln I)和Hind III双酶解的中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα(图3-b)质粒DNA进行连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选获得阳性克隆载体质粒。用Avr II(Bln I)和BamH I双酶解制备254nt-1394nt区段DNA片段(图3-a(2))，并与经Avr II(Bln I)和BamH I双酶解的上述阳性克隆载体质粒DNA进行连接，再经转化筛选，获得转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN(图3-c)。
实施例2 AnpeNPV穿梭载体的获得
(1)具有细菌人工染色体载体pSMART BAC的重组AnpeNPV的获得
1)线性化的转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA的制备：用Avr II(Bln I)酶解转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收制备一定量的线性化的转移载体质粒DNA(图4-a、b)，无菌处理后用紫外分光光度计定量，备用。
2)转染用AnpeNPV基因组DNA准备：使用可线性化的AnpeNPV突变株(ApNPV-Δph/Avr II+/egfp+)[专利申请号：201910517434.1.]基因组DNA(图4-a)。用Avr II(Bln I)酶解AnpeNPV突变株(ApNPV-Δph/Avr II+/egfp+)基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳回收制备一定量的线性化的AnpeNPV基因组DNA(图4-b)，无菌处理后用紫外分光光度计定量，备用。
3)细胞转染及重组病毒的分离
Tn-High Five细胞用完全TNM-FH培养基进行传代培养。将对数生长期的Tn-HighFive贴壁细胞用吸管轻轻吹打，制成约0.5～1×106/mL细胞悬液，加入到6孔细胞培养板中，使每孔细胞密度在80％左右，置27℃培养箱中1小时，备用。
参照Cellfectin试剂使用说明，将100μL含有1μg上述线性化的转移载体质粒DNA和0.5μg线性化的AnpeNPV基因组DNA的无血清细胞培养基SF-900TM II SFM与100μL含有8μL转染试剂Cellfectin的无血清细胞培养基SF-900TM II SFM混合，置室温40～50分钟后，再向该混合液中添加～800μL的无血清细胞培养基SF-900TM II SFM，然后滴加到准备好的Tn-High Five细胞中，27℃培养箱中培养4～5小时。更换1～2mL完全TNM-FH培养基，置27℃培养箱中5～6天。
取上述转染的细胞培养液，注射感染柞蚕蛹，每粒蛹50～100μL，置22℃培养10～12天。提取感染发病的柞蚕蛹组织基因组DNA，使用引物SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7/SEQ ID NO:8进行PCR检测(图5)，确认获得具有细菌人工染色体载体pSMART BAC的重组AnpeNPV。
(2)含有细菌人工染色体载体pSMART BAC的重组AnpeNPV基因组DNA的细菌转化
1)重组AnpeNPV基因组DNA制备
将得到的上述重组AnpeNPV批量感染柞蚕蛹，置22℃培养10～12天。用超速离心方法分离游离病毒：取感染发病的柞蚕蛹体液，4℃下，5000rpm离心20分钟。取上清，4℃下，25,000rpm离心30分钟。弃上清，沉淀悬浮在3～4mL 0.1X TE(pH＝8.0)缓冲液中，再进行蔗糖密度梯度离心(25％:55％)，4℃下，25,000rpm离心90分钟。取25％:55％界面分离的病毒样品，用0.1X TE(pH＝8.0)缓冲液稀释，在4℃下，25,000rpm离心30分钟。弃上清，沉淀为游离病毒。将游离病毒悬浮在少量裂解缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH＝8.0；0.12M EDTA-2Na，0.2M KCl)中，加入蛋白酶K至终浓度为40μg/mL，50℃温浴1小时后，再加入10％的十二烷基肌氨酸钠至终浓度为1％，50℃温浴2～4小时。经酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，离心后的上清用无水乙醇沉淀。DNA样品最终溶于无菌TE缓冲液中，定量备用。
2)重组AnpeNPV基因组DNA的细菌转化
将上述重组AnpeNPV基因组DNA用电转化方法转至大肠杆菌(BAC-OptimizedReplicator v2.0)中。取0.2μg(<2μL)重组AnpeNPV基因组DNA加入到20μL BAC-OptimizedReplicator v2.0 Electrocompetent Cells(Lucigen,60210-1)中，混合后冰浴10分钟，转入预冷的0.1cm电转杯中。电转化条件：1.8KV、25μF、200ohms。电转化后加入1mL SOC培养基，在37℃下振荡(250rpm)培养1小时。将培养物涂布在含有12.5μg/mL氯霉素、100μg/mLX-Gal和40μg/mL IPTG的LB固体培养板上，37℃培养24～48小时。
挑取蓝色菌落接种至含有12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA。使用引物SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9/SEQ ID NO:10进行PCR鉴定(图6)，或者用限制性内切酶Xho I酶解质粒DNA进行鉴定(图7)。最终获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid(AnpeNPV:phΔN-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)(图4-c)。
本实施例提供了AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid产生的过程，并表明AnpeNPV-bacmid DNA能够在细菌中得到复制扩增。
实施例3 AnpeNPV-bacmid用于AnpeNPV基因组某一基因的敲除
(1)打靶基因克隆载体pUC57/FRT-Zeo-FRT的构建
本实施例选用博来霉素(Zeocin，Zeo)抗性基因为选择标记基因构建基因打靶载体。同时，为了方便表达基因的插入以及在基因敲除或插入后能进一步去除选择标记基因，在博来霉素抗性基因的两侧增加翻转酶结合位点(flipase recognition target,FRT)序列和多克隆位点序列。DNA序列如SEQ ID NO:11所示，该DNA片段由北京赛百盛基因技术有限公司合成，并克隆至载体pUC57中，构建一个通用的打靶基因克隆载体pUC57/FRT-Zeo-FRT(图8-a)。
(2)AnpeNPV-bacmid基因组中cathepsin和chitinase基因打靶载体的构建
本实施例以敲除AnpeNPV基因组中cathepsin(vcath,orf31)和chitinase(chiA，orf32)基因部分DNA片段为例，来说明构建打靶载体以及基因敲除的方法。
根据基因vcath和chiA序列设计两对引物，SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14/SEQ ID NO:15。以AnpeNPV基因组DNA为模板，分别用上述两对引物进行常规PCR扩增，使用ExTaq酶，反应条件为：95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共35个循环；72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，分别得到233bp和275bp的DNA片段(图8-b)。将两个片段分别克隆至pMD18-T载体，并经测序确认。再将两个片段分先后克隆至载体pUC57/FRT-Zeo-FRT上。其中，片段1克隆至载体Pst I和EcoR I位点处，片段2克隆至载体Sal I和BamH I位点处，得到vcath和chiA基因打靶载体pUC57/FRT-Zeo-FRT/Δvcath/ΔchiA(图8-c)。
(3)AnpeNPV-bacmid基因组中cathepsin和chitinase基因的敲除
1)打靶基因片段的制备
以打靶载体pUC57/FRT-Zeo-FRT/Δvcath/ΔchiA质粒DNA为模板，用引物SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:15进行常规PCR扩增。反应条件：ExTaq酶，95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30sec，共35个循环；72℃8min。琼脂糖凝胶电泳回收约1.1kb的DNA片段。溶于无菌水中，定量备用(图9-a)。
2)DH10B/AnpeNPV-bacmid/pKD46感受态细胞准备
首先将AnpeNPV-bacmid DNA转化至大肠杆菌DH10B中，再转化质粒pKD46，产生DH10B/AnpeNPV-bacmid/pKD46宿主菌(图9-b)，并保存于含有12.5μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB(LB/Cm/Amp)固体培养板上。
挑取单菌落接种至4mL的LB/Cm/Amp液体培养基中，30℃振荡培养约20个小时。转接1mL培养物至10mL无抗生素的LB培养基中，30℃振荡培养2.5小时，加入阿拉伯糖(终浓度10mM)继续培养1小时。将培养物冰浴10分钟，5000rpm离心5分钟，弃上清。用850μL冰的无菌水重新悬浮细胞，并转移至预冷的1.5mL离心管中(置于冰上)。12000rpm，离心20秒，用850μL预冷无菌水清洗细胞。重复3次。最后用80μL冷水悬浮细胞。感受态细胞可直接用于电转化，或分装后保存在-80℃中备用。
3)转化及阳性转化子鉴定
0.2μg(<2μL)纯化的PCR片段与20μL上述的感受态细胞混合，冰浴10min后，转入预冷的0.1cm电转杯中。电转化条件：1.8KV，200Ω，25μF。电转化后立刻加入1mL SOC培养基，在30℃低速振荡培养1小时。将培养液涂布于含有12.5μg/mL氯霉素和50μg/mL博来霉素(Zeo)的LB(LB/Cm/Zeo)固体培养板上，37℃培养48h。
挑取转化菌落接种至LB/Zeo液体培养基中，37℃振荡培养过夜，参照质粒DNA提取试剂盒(BIOMIGA,PD1211-03)的方法提取质粒DNA。用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15进行PCR扩增鉴定，PCR产物大小应为约1.1kb(图9-c1)。确定获得vcath和chiA基因部分DNA片段缺失的穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor(AnpeNPV:phΔN:Δvcath:ΔchiA-Zeor-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)(图9-c2)。
4)AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor基因组中博来霉素抗性基因的去除
提取穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor DNA，并转化至大肠杆菌DH10B中，继而转化一个含有翻转酶重组酶(flipase recombination enzyme,FLP)基因的pCP20质粒，产生DH10B/AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA-Zeor/pCP20宿主菌(图10-a)，保存在LB/Cm/Amp固体培养板上。
挑选转化菌落接种至含有12.5μg/mL氯霉素的LB(LB/Cm)液体培养基中，30℃振荡培养8小时后，转入42℃继续振荡培养20小时。将培养的菌液以1:1000的接种量转接至新的LB/Cm液体培养基中，30℃振荡培养8小时后，转入42℃继续振荡培养20小时。如此循环培养，重复三次，将最终培养液涂布于LB/Cm固体培养板上，37℃培养24～48小时。
挑取菌落接种至LB/Cm液体培养基中，37℃振荡培养过夜，参照质粒DNA提取试剂盒(BIOMIGA,PD1211-03)的方法提取质粒DNA。用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15进行PCR扩增鉴定，PCR产物大小应为约0.5kb(图10-b1)。确定获得无博来霉素抗性基因的穿梭载体AnpeNPV-bacmid/Δvcath:ΔchiA(AnpeNPV:phΔN:Δvcath:ΔchiA-pSMART BAC-lacZα:mini-attTn7:lacZα)(图10-b2)。
本实施例提供了利用AnpeNPV-bacmid进行AnpeNPV基因敲除或在AnpeNPV基因组中插入基因的方案，以及相应的AnpeNPV-bacmid宿主菌、打靶载体和配套使用的各种表达转座酶、翻转酶重组酶的质粒。AnpeNPV-bacmid除本实施例中用于vcath和chiA基因的敲除外，亦可采用类似的方案进行AnpeNPV基因组中其他任一基因的敲除，或在AnpeNPV基因组任一位点上插入目标基因的表达框，进行基因功能分析。
实施例4 AnpeNPV-bacmid用于基因转座技术(transposition-based bacmidtechnology)构建重组病毒及重组蛋白的表达纯化。
(1)AnpeNPV-bacmid转移表达载体的构建
根据AnpeNPV多角体蛋白基因启动子和P10蛋白基因启动子的序列，设计一个可双向调控外源基因表达的DNA片段，其序列如SEQ ID NO:16所示。通过基因合成方式获得该片段，并克隆至pUC57载体中。进一步，用Nco I和Xba I双酶解制备该片段，并与经相同双酶解的载体pFastBacTM Dual(Invitrogen,10712-024)连接，构建pApBacDual-N1转移表达载体(图11-a)。该载体具有AnpeNPV多角体蛋白基因启动子调控序列和P10蛋白基因启动子调控序列，两侧为Tn7转座左、右臂，并带有庆大霉素抗性标记基因，可以在新生的重组AnpeNPV中利用AnpeNPV多角体蛋白基因启动子或P10蛋白基因启动子、或同时调控两种外源基因的表达。将绿色荧光蛋白基因(egfp)克隆至该载体中，产生质粒pApBacDual-N1/ph-egfp，由多角体蛋白基因启动子调控egfp表达。提取重组质粒DNA用于后续的转化工作。
为提高外源基因的分泌表达水平，并方便重组蛋白的纯化，本实施例中还设计了一段特定的DNA片段，序列如SEQ ID NO:17所示。其中包括：一段蛋白质翻译增强子DNA序列(a lobster L21 sequence,L21)、编码柞蚕30KD蛋白信号肽DNA序列(Microvitellogeninsignal peptide，Ap30KSP)、基因多克隆位点序列(包括BamH I、Sal I、Kpn I、Sma I、EcoRI和Xho I)、编码TEV蛋白酶(Tobacco Etch Virus Protease,TEV)酶解识别位点氨基酸的DNA序列、编码8个组氨酸标签的DNA序列(H8)、编码一个Strep标签的DNA序列(STREP)以及编码6个组氨酸标签的DNA序列(H6)。通过基因合成方式获得该片段，并克隆至pUC57载体中。进一步，用Bgl II和Xba I双酶解制备该片段，并与经BamH I和Xba I双酶解的载体pApBacDual-N1连接，构建转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30KSPTEVH8STREPH6(图11-b)。将编码一种犬类α-干扰素(CaIFNα)成熟肽段的DNA片段克隆至该载体BamH I和Xho I克隆位点处，产生质粒pApBacDual-N1/L21Ap30KSP-CaIFNα-TEVH8STREPH6，由多角体蛋白基因启动子调控基因表达，Ap30KSP为重组蛋白分泌表达的信号肽，TEVH8STREPH6与CaIFNα融合表达，并用于重组蛋白的纯化。提取重组质粒DNA用于后续的转化工作。
(2)细菌转化、重组AnpeNPV-bacmid DNA制备及昆虫细胞转染
1)宿主菌准备。首先利用大肠杆菌DH10Bac(Cat.no.10361-012)提取可表达转座酶的辅助质粒pMON7124 DNA，质粒DNA提取方法参照质粒DNA提取试剂盒(BIOMIGA,PD1211-03)的方法。同时制备感受态细胞：将DH10B/AnpeNPV-bacmid宿主菌接种至LB/Cm液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养物转接至5mL LB/Cm液体培养基中，37℃振荡培养至OD值约0.4，取4mL菌液，5000rpm离心3分钟，收集菌体。加入2mL无菌的0.1M CaCl2，悬浮菌体，冰浴30分钟。5000rpm离心3分钟，收集菌体。加入0.6mL无菌的0.1M CaCl2，悬浮菌体，制备成感受态细胞冰浴备用。采用常规细菌转化方法将pMON7124质粒DNA转化至上述制备好的DH10B/AnpeNPV-bacmid细胞中，涂布于含有12.5μg/mL氯霉素和10μg/mL四环素的LB(LB/Cm/Tet)固体培养板上，产生DH10B/AnpeNPV-bacmid/pMON7124宿主菌。
2)感受态细胞制备。将DH10B/AnpeNPV-bacmid/pMON7124宿主菌接种至LB/Cm/Tet液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养物转接至5mL LB/Cm/Tet液体培养基中，参照上述方法制备DH10B/AnpeNPV-bacmid/pMON712感受态细胞。
3)质粒DNA转化。取少量上述pApBacDual-N1/ph-egfp或pApBacDual-N1/L21Ap30KSP-CaIFNα-TEVH8STREPH6重组质粒DNA，加入到100μL上述步骤2)准备好的感受态细胞中，冰浴30分钟，转至42℃水浴45秒，再迅速转至冰浴2分钟。加入0.9mL SOC培养基，至37℃振荡(225rpm)培养4小时。取少量培养液，用SOC培养基梯度稀释成10-1、10-2、10-3，涂布于含有氯霉素(12.5μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、四环素(10μg/mL)、X-Gal(100μg/mL)和IPTG(40μg/mL)的LB固体培养板上，37℃培养24～48小时。
4)重组AnpeNPV-bacmid DNA制备。挑取白色菌落接种至含有氯霉素(12.5μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)和四环素(10μg/mL)的LB(LB/Cm/Gen/Tet)液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌液提取质粒DNA。DNA提取方法参照质粒DNA提取试剂盒(BIOMIGA,PD1211-03)的方法，并有改动：1mL菌液经离心收集菌体，加入250μL缓冲液A1，悬浮菌体，室温5分钟；加入250μL缓冲液B1，混匀后室温5分钟；再加入350μL缓冲液N1，混匀后室温5分钟。12,000rpm离心10分钟，将上清液转至一新的1.5mL离心管中，加入适量RNase A酶，50℃水浴30分钟。酚/氯仿抽提一次。乙醇沉淀。DNA溶于无菌的0.1xTE缓冲液(pH8.0)中，定量备用。
5)细胞转染。Tn-High Five细胞用完全TNM-FH培养基进行传代培养。将对数生长期的Tn-High Five贴壁细胞用吸管轻轻吹打，制成约0.5～1×106/mL细胞悬液，加入到12孔细胞培养板中，使每孔细胞密度在80％左右，置27℃培养箱中1小时，备用。
参照Cellfectin试剂使用说明，将100μL含有2μg上述重组AnpeNPV-bacmid DNA的无血清细胞培养基SF-900TM II SFM与100μL含有8μL转染试剂Cellfectin的无血清细胞培养基SF-900TM II SFM混合，置室温40～50分钟后，再加入～600μL无血清细胞培养基SF-900TM II SFM，然后滴加到准备好的Tn-High Five细胞中，27℃培养箱中培养4～5小时。更换1mL完全TNM-FH培养基，置27℃培养箱中5～6天。细胞在转染带有egfp基因的重组AnpeNPV-bacmid DNA后4～5天，可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号(图12-a、b)。收集转染的细胞培养液，用于注射感染柞蚕蛹。
(3)重组AnpeNPV-bacmid感染柞蚕蛹及重组蛋白的表达检测
1)重组AnpeNPV-bacmid表达绿色荧光蛋白的检测。
将转染带有egfp基因的重组AnpeNPV-bacmid DNA的细胞培养液，注射感染柞蚕蛹。每粒蛹50～100μL，置22℃培养10～12天。穿刺抽取感染病毒的柞蚕蛹体液，置荧光显微镜下观察，可见柞蚕蛹组织细胞中有荧光蛋白信号(图12-c)，表明重组AnpeNPV-bacmid已成功感染柞蚕蛹，并在蛹组织细胞中表达绿色荧光蛋白。
2)重组AnpeNPV-bacmid表达犬类α-干扰素的检测。
将转染带有犬类α-干扰素基因的重组AnpeNPV-bacmid DNA的细胞培养液，注射感染柞蚕蛹。每粒蛹50～100μL，置22℃培养10～12天。取病毒蛹体液进行蛋白质凝胶电泳，用蛋白质免疫印迹方法，使用抗His标签单克隆抗体检测重组蛋白的表达。结果显示：具有信号肽Ap30KSP的重组AnpeNPV-bacmid在感染柞蚕蛹的第6天，即可在柞蚕蛹体液中检测到犬类α-干扰素的表达(图13-a)；而没有信号肽Ap30KSP的重组AnpeNPV-bacmid在感染柞蚕蛹的第8天才可在柞蚕蛹体液中检测到犬类α-干扰素的表达(图13-b)。表明信号肽Ap30KSP可有效地将表达的重组蛋白分泌至蛹体液中。
3)柞蚕蛹体中重组蛋白的纯化。
将可分泌表达犬类α-干扰素的重组病毒感染柞蚕蛹，置22℃培养6～8天。冰浴条件下取柞蚕蛹血淋巴。将蛹血淋巴置于高速冷冻离心机中，5000rpm离心10min，收集蛹血上清约5mL。取500μL Ni-NTA Agarose凝胶(Novagen)，用3～5倍体积的1X Ni-NTA BindBuffer(300mM NaCl,50mM sodium phosphate buffer,10mM imidazole,pH 8.0)平衡凝胶，清洗3～5次。将收集的蛹血上清用2X Ni-NTA Bind Buffer(pH 8.0)稀释(1:1)，然后加入到经缓冲液平衡后的Ni-NTA Agarose凝胶中，冰浴条件下摇摆混合作用1小时。将样品混合液和凝胶分离，弃去样品混合液，在凝胶中加入3～5倍体积的1X Ni-NTA Wash Buffer(300mM NaCl,50mM sodium phosphate buffer,20mM imidazole,pH 8.0)清洗凝胶，重复清洗3～5次。然后加入洗脱缓冲液1X Ni-NTA Elute Buffer(300mM NaCl,250mMimidazole,50mM sodium phosphate buffer,pH 8.0)进行蛋白洗脱，每次约500μL，4次洗脱，分别收集洗脱样品(Elution 1-4)，-20℃保存备用，用于SDS-PAGE、Western blot或蛋白活性分析等。图14结果显示，利用Ni-NTA Agarose凝胶可以从感染重组病毒的柞蚕蛹体液中分离出重组蛋白犬类α-干扰素。
本实施例表明AnpeNPV-bacmid能够用于基于基因转座原理产生重组病毒，产生的重组病毒不需要经过感染细胞进行分离筛选，可以直接用于感染柞蚕蛹进行重组蛋白的表达，只需2-3周即可完成重组AnpeNPV构建及重组蛋白表达鉴定。并提供了AnpeNPV-bacmid转移表达载体构建、重组AnpeNPV-bacmid的筛选、细胞转染、重组病毒的获得、重组蛋白的分离纯化方案以及AnpeNPV-bacmid表达系统的组成。本实施例结果也说明了AnpeNPV-bacmid如同野生型AnpeNPV一样，都能够感染Tn-High Five胞和柞蚕蛹(幼虫)。
实施例5 AnpeNPV-bacmid用于同源重组方法(homologous recombination)产生重组病毒
AnpeNPV-bacmid DNA制备及昆虫细胞准备参照实施例4(2)方法进行。转染参照Cellfectin试剂使用说明，将100μL含有0.5μg AnpeNPV-bacmid DNA和1μg带有外源基因的柞蚕病毒转移表达载体质粒(如pApM748BE/egfp)DNA无血清细胞培养基SF-900TM II SFM与100μL含有8μL转染试剂Cellfectin的无血清细胞培养基SF-900TM II SFM混合，室温30～50分钟后，再加入～600μL无血清细胞培养基SF-900TM II SFM，然后滴加到准备好的Tn-HighFive细胞中，27℃培养箱中培养4小时。更换1～2mL完全TNM-FH培养基置27℃培养箱中5～6天。转染后4～5天，可在荧光显微镜下观察到转染细胞中有绿色荧光信号(图15-a、b)。收集转染的细胞培养液，用于注射感染柞蚕蛹。置22℃培养10～12天。穿刺抽取感染病毒的柞蚕蛹体液，置荧光显微镜下观察，可见柞蚕蛹组织细胞中有荧光蛋白信号(图15-c)，表明产生新的重组病毒，并能够感染柞蚕蛹。
本实施例表明AnpeNPV-bacmid与野生型AnpeNPV一样能够用于基于同源重组原理产生重组病毒，产生的重组病毒将不携带细菌人工染色体载体pSMART BAC及lacZα:mini-attTn7:lacZαDNA片段。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁省海洋水产科学研究院
<120> 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用
<130> 2019
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatctgaag gatcccctag gaagcttgga attcacgtga cttg 44
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacttctgtc acttaggtta cgccccgccc tgccac 36
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtaaccta agtgacagaa gtcaaaagcc tccg 34
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatctgaag gatccgcggc cgcttctata gtgtcaccta aatac 45
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagatctcc cgggctgcag gaattcacat aac 33
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcctaggga tccgctagcg tcttcgaagc gcgtaacc 38
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacctagggc tgcgacgcga actaaatagc 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaagcttat aggaaatttt actacaaag 29
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acggatcctt attgtcaact ggagcgg 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccctaggcg gcgacttgtt aaaccag 27
<210> 11
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcatgcctgc aggagctcga attcgaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag 60
tataggaact tctacctgtg acggaagatc agttgacaat taatcatcgg catagtatat 120
cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg gccaagttga ccagtgccgt 180
tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg agcggtcgag ttctggaccg accggctcgg 240
gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt cgccggtgtg gtccgggacg acgtgaccct 300
gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt gccggacaac accctggcct gggtgtgggt 360
gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg gtcggaggtc gtgtccacga acttccggga 420
cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg cgagcagccg tgggggcggg agttcgccct 480
gcgcgacccg gccggcaact gcgtgcactt cgtggccgag gagcaggact gaggcgcgcc 540
atttaaatga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcgtcg 600
acaagcttgg atccggtacc 620
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtctgcagga atacaccaag tttggcg 27
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagaattctg aattaccatc aagcgcgg 28
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagtcgacga acttgcaacc ttagcaac 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaggatccgc tcaaacggca gcatgctc 28
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<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccatggtaaa atattataac tatttcaatg atataataat aaattgtcaa taatgcttat 60
ttaacgctgt ggcaacaaaa ggccccggca atcgccagtg catcaattca aaactgcctt 120
tgttaaaagt aatgcgcact tcagagtcat tgtaccgcat ctacaaactg caactgcggc 180
aggaccgttt gctaaaaatt aaaaaatgaa ataaaaaacg tttttgattt acatgtttta 240
tttaccttta aatagataat aagtacattg ctgttattgt agcaactttg tagtaaaatt 300
tcctataact attccagagg atccgtcgac ggtaccccgg gaattcctcg agcctaggat 360
tctaga 366
<210> 17
<211> 263
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agatctaact cctaaaaaac cgccaccatg ggcctgtcgc ctttcgtcct agcgctatct 60
ctgagcgtgc tagcgtccgc catcgcactg gatggatccg tcgacggtac ccgggaattc 120
ctcgaggaaa acctgtactt ccagggaagc tccagccacc accatcacca tcatcatcac 180
ggaggcggtt ccgcatggag ccacccgcag ttcgaaaaga gctccagcca tcaccatcac 240
catcactagc ctaggattct aga 263

Claims (7)

1.一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以克隆载体pSMART BAC质粒DNA为模板，用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增，得到片段1，长度为923bp；以克隆载体pSMART BAC质粒DNA为模板，用引物SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，得到片段2，长度为6699bp；琼脂糖凝胶电泳回收片段1和片段2，将片段1和片段2混合后作为模板，用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，得到长度为7.5kb的DNA片段，即得具有BamH I、Avr II(Bln I)、Hind III和EcoR I单一克隆位点的衍生克隆载体pSMARTBAC-N1；
（2）将含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段lacZα:mini-attTn7:lacZα克隆至载体pSMARTBAC-N1的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点上，构建得到中间载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα；所述lacZα:mini-attTn7:lacZα的具体构建方法为：以AcNPV穿梭载体DNA为模板，用引物SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6进行PCR扩增，得到400bp片段；将上述片段克隆到pMD18-T载体上得到质粒，并经测序确认后，用限制性内切酶Bgl II和Avr II(Bln I)双酶解质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收400bp DNA片段，即得；
（3）将含有AnpeNPV多角体蛋白基因polh启动子序列和上游基因部分序列的DNA片段、及含有多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列的DNA片段依次克隆至中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的相应克隆位点处，构建转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN；具体方法为：
（a）以AnpeNPV基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增，得到长度为1286bp的DNA片段；
（b）以AnpeNPV基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10进行PCR扩增，得到长度为1139bp的DNA片段；
（c）将步骤（a）得到的片段先克隆至中间载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的Avr II(Bln I)和Hind III克隆位点处，得到阳性克隆载体，再将步骤（b）得到的片段克隆至上述阳性克隆载体的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点处，即得转移载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN；
（4）将步骤（3）制得的转移载体质粒DNA线性化，与线性化的AnpeNPV基因组DNA共转染Tn-High Five细胞，得到重组AnpeNPV；所述线性化的AnpeNPV基因组DNA为利用Avr II(BlnI) 酶解ApNPV-Δph/Avr II + /egfp + 基因组DNA得到；
（5）将步骤（4）所得重组AnpeNPV的基因组DNA进行分离制备，并转化至大肠杆菌中，在含有氯霉素、X-Gal和IPTG的细菌培养板上进行蓝、白菌落筛选，挑取蓝色菌落进行液体培养，获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中得到长度为7.5kb的DNA片段后，通过琼脂糖凝胶电泳回收所得DNA片段，用限制性内切酶BamH I酶解所述片段，并经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀回收片段，利用T4 DNA连接酶使片段自身连接环化，并转化至大肠杆菌DH5α，在含有12.5μg/mL氯霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，即得衍生克隆载体pSMARTBAC-N1。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）的中间载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的具体构建方法为：将片段lacZα:mini-attTn7:lacZα克隆至步骤（1）所得衍生克隆载体pSMARTBAC-N1的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点上，转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含有12.5 μg/mL氯霉素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG的LB固体培养板上，37℃培养过夜，获得蓝色菌落，即得。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）的重组AnpeNPV获得方法为；
（1）提取转移载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA，并用限制性内切酶Avr II (Bln I) 酶切，获得线性化的转移载体pSMARTBAC-N1/lacZα: mini-attTn7:lacZα/phΔN质粒DNA；
（2）利用Avr II(Bln I) 酶解ApNPV-Δph/Avr II + /egfp + 基因组DNA，再经琼脂糖凝胶电泳回收，得到线性化的AnpeNPV基因组DNA；
（3）将0.5~1.2μg线性化的转移载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα /phΔN质粒DNA和0.2~0.6 μg 线性化的AnpeNPV基因组DNA混合于80~120μL的无血清细胞培养基中，再与80~120 μL含有体积比为8%的转染试剂的无血清细胞培养基混合，共转染Tn-HighFive昆虫细胞，将转染后的细胞培养液注射感染柞蚕蛹，置20~22℃培养10~12天，即得。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（5）的AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid获得方法为：
（1）重组AnpeNPV批量感染柞蚕蛹，取感染发病柞蚕蛹体液，用超速离心方法分离重组AnpeNPV游离态病毒，再经蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提，得到重组AnpeNPV基因组DNA；
（2）采用电转化方法将重组AnpeNPV基因组DNA转化至大肠杆菌中，电转化条件为：1.8KV、25μF、200 ohms；电转化后加入1mL SOC液体培养基，在37℃下250 rpm振荡培养1小时，将培养物涂布在含有12.5μg/ml氯霉素、100μg/mL X-Gal和40μg/mL IPTG的LB固体培养板上，37℃培养24~48小时，获得蓝色菌落，即得。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建的柞蚕核型多角体病毒穿梭载体。
7.根据权利要求6所述柞蚕核型多角体病毒穿梭载体在体外制备AnpeNPV基因组DNA、用于AnpeNPV病毒基因的敲除或目的基因的插入，或用于外源基因的表达中的应用。
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