CN114540388A - 一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用，所述方法包括：获得pIE2‑GFP‑N1载体并线性化，获得两端分别为EcoR I和BamH I粘性末端的线性化载体；将上游引物Insert‑FP和下游引物Insert‑RP扩增目的基因，获得带有与线性化载体重复序列的目的基因片段；所述上游引物Insert‑FP的序列为：5’‑AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACC+目的基因上游特异性引物‑3’；所述下游引物Insert‑RP的序列为5’‑GGTGGCGACCGGTGGATCAC CTCCGCCACCGCCTCC+目的基因上游特异性引物‑3’；将所述线性化载体和所述目的基因片段连接，获得昆虫细胞表达系统载体重组质粒。省时省力且阳性率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用。
背景技术
体外培养昆虫细胞作为一种重要的科学研究工具被广泛使用。Grace首次建立了天蚕蛾的卵巢细胞系，在之后的几十年里，全世界建立的昆虫细胞系有800株以上，分别来源于鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等8个目昆虫。昆虫细胞系的构建得到了迅猛的发展，因为昆虫杆状病毒表达系统可高效表达有生物活性的蛋白质，这一特点明显优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系，所以昆虫细胞系的构建也更加便利。昆虫细胞是一种应用范围非常广泛的表达系统，在遗传学、生物化学、细胞生物学等多个领域中都起着重要的作用。昆虫细胞系具有重要的科研和应用价值，近些年来昆虫细胞系被广泛应用，如：重组蛋白的表达、昆虫病毒的研究、疫苗的开发、病虫害的治理、生物制品的生产等。
同源重组无缝克隆是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。传统的构建载体的方式利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。利用双酶切构建载体的方法步骤繁琐、效率不高、连接效率低，克隆斑假阳性率高，影响载体构建效率。
因此，有必要开发一种快速高效的昆虫细胞表达系统载体重组质粒制备方法。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用，采用同源重组的方法构建载体步骤简单、载体线性化可以不用酶切，省时省力且阳性率高，同源重组无缝克隆技术对细胞或者昆虫进行精确的基因修饰在基础研究中具有很大的应用前景和实用性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，所述方法包括：
将pEGFP-N1载体中CMV启动子改为IE2启动子，获得pIE2-GFP-N1载体；
将pIE2-GFP-N1载体线性化，获得两端分别为EcoR I和BamH I粘性末端的线性化载体；
将上游引物Insert-FP和下游引物Insert-RP扩增目的基因，获得带有与线性化载体重复序列的目的基因片段；其中，所述上游引物Insert-FP的序列为：5’-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACC+目的基因上游特异性引物-3’；所述下游引物Insert-RP的序列为：5’-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCC+目的基因上游特异性引物-3’；
将所述线性化载体和所述目的基因片段按照同源重组无缝克隆试剂盒连接，获得昆虫细胞表达系统载体重组质粒。
进一步地，所述昆虫细胞表达系统载体pIE2-GFP-N1如图1所示,该载体将pEGFP-N1载体中CMV启动子改良为IE2启动子，改良的pIE2-GFP-N1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述技术方案中，所述线性化载体示意图如图2所示。
作为一种具体的实施方式，所述将pIE2-GFP-N1载体线性化，包括：
采用线性化载体扩增引物对pIE2-GFP-N1进行PCR扩增，获得线性化载体，其中，所述线性化载体扩增引物包括GFPFU-FP和GFPFU-RP，序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
作为一种具体的实施方式，所述将pIE2-GFP-N1载体线性化，包括：
采用EcoR I和BamH I对pIE2-GFP-N1载体进行双酶切。
上述技术方案中，所述目的基因一般为昆虫基因。
扩增目的基因上游引物Insert-FP，其特征主要包括：pIE2-GFP-N1重复序列1如SEQ ID NO.4所示，Cozak序列如SEQ ID NO.5所示和目的基因上游特性引物序列。因此，所述目的基因扩增上游引物为：“5’-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACC+目的基因上游特异性引物-3’”；所述Cozak序列用来增强真核基因翻译提高效率。
扩增目的基因下游引物Insert-RP，其特征主要包括：pIE2-GFP-N1重复序列2如SEQ ID NO.6所示，linker DNA序列如SEQ ID NO.7所示和目的基因下游特异性引物序列。
所述linker DNA是基因融合技术重要DNA，通过核酸序列将pIE2-GFP-N1载体和目的基因连接起来，融合蛋白中载体和目的基因形成正确的空间结构以及更好的发挥生物活性，取决于linker DNA的选择和设计。Linker DNA在昆虫细胞中表达成连接肽链，其设计的序列为:“5’-GGAGGCGGTGGCGGAGGT-3’”,翻译为6个甘氨酸残基。因此，目的基因扩增下游引物为“5’-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCC+目的基因上游特异性引物-3’”。目的基因的扩增示意图如图3所示。
作为一种具体的实施方式，所述目的基因为甜菜夜蛾SeA2，所述上游引物Insert-FP的序列如SEQ ID NO.8所示；所述下游引物Insert-RP的序列如SEQ ID NO.9所示。
作为一种具体的实施方式，所述目的基因为甜菜夜蛾SeCAD，所述上游引物Insert-FP的序列如SEQ ID NO.10所示；所述下游引物Insert-RP的序列如SEQ ID NO.11所示。
作为一种可选的实施方式，所述同源重组无缝克隆试剂盒具体步骤可以参照
Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物科技有限公司)或Minerva Super Fusion Cloning Kit(苏州宇恒生物科技有限公司)试剂盒步骤详情(或其他公司同源重组无缝克隆试剂盒)。获得重组蛋白SeA2-GFP测序验证成功后便可以亚细胞定位，也表明融合蛋白构建成功。
在本发明的第二方面，提供了采用所述的方法制备得到的昆虫细胞表达系统载体重组质粒。
在本发明的第三方面，提供了所述的昆虫细胞表达系统载体重组质粒在重组蛋白的表达、昆虫病毒的研究中的应用。所述应用还包括：所述昆虫细胞表达系统载体重组质粒利用鸡胚或细胞作为生物反应器所表达的蛋白制备成的亚单位疫苗。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用，通过改造昆虫细胞表达所需载体、设计专门针对昆虫细胞表达系统载体线性化特异性引物，设计目的基因扩增引物特异性引物，为高效快速构建昆虫目的基因融合蛋白提供一种可行途径。采用同源重组的方法构建载体步骤简单、载体线性化可以不用酶切，省时省力且阳性率高，同源重组无缝克隆技术对细胞或者昆虫进行精确的基因修饰在基础研究中具有很大的应用前景和实用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为pIE2-GFP-N1质粒图谱及重要元件；
图2为线性化载体示意图；
图3为目的基因扩增引物设计示意图；
图4为甜菜夜蛾SeA2-GFP融合蛋白亚细胞定位范例；
图5为甜菜夜蛾SeCAD-GFP融合蛋白亚细胞定位范例。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。如无特殊提及，以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法，可通过查询文献获得；用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。
实施例1、甜菜夜蛾SeA2目的基因的重组质粒
1、载体线性化：利用以下固定引物扩增载体，从而获得线性化载体
GFP-FP：5'-GATCCACCGGTCGCCACC-3'(SEQ ID NO.1)；
GFP-RP：5'-CGAAGCTTGAGCTCGAGATCT-3'(SEQ ID NO.2)；
扩增pIE2-GFP-N1质粒载体(全长4709bp)线性化载体获得4678bp片段。(退火温度为61℃)
或用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切的方式切开载体获得与上述引物扩增序列一致的线性化载体4678bp长度的片段。
将线性划载体利用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。
2、目的基因的扩增：设计甜菜夜蛾SeA2目的基因特异性引物如下：
SEA2-FUFP:5'-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACCATGGACAAATCGAATAAAAATACAG-3'(SEQ ID NO.8)；
SEA2-FURP:
5'-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCCAGCGGTTTTGGAATCACTTTC-3'(SEQID NO.9)；
扩增获得目的基因上游含有pIE2-GFP-N1质粒线性化载体重复序列、Cozak序列，扩增获得目的基因下游含有pIE2-GFP-N1质粒线性化载体重复序列、Linker序列。将扩增的目的基因利用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。
3、同源重组：将获得的线性化载体和带有线性化载体重复序列的目的基因纯化后按照同源重组无缝克隆试剂盒连接获得重组蛋白，具体步骤可以参照
Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物科技有限公司)或Minerva SuperFusion Cloning Kit(苏州宇恒生物科技有限公司)试剂盒步骤详情。获得重组蛋白SeA2-GFP测序验证成功后便可以亚细胞定位。
4、将重组蛋白SeA2-GFP质粒转染至昆虫细胞Hi5细胞
(1)取生长状态良好的Hi5细胞接种到洁净的48孔细胞板中，用含有8.0％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的Grace’s培养基在28.0℃恒温培养箱过夜培养，待密度为60％～80％便可用于细胞转染；
(2)用作转染的SeA2-GFP质粒需用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后其浓度建议在100ng/μL以上，且纯度(OD260/OD280)在1.75～1.85之间为宜；
(3)准备无血清Grace’s培养基，1000μL、200μL、10μL移液器和相应大小的替补头，1.5mL洁净的EP管，酒精灯和酒精棉置于生物安全柜中，紫外灭菌约30min；
(4)取25μL每孔无血清Grace’s培养基到无菌EP管中，加入1.0μL的FuGENE HD，同时混入0.25μg质粒(转染试剂体积与质粒质量比的范围建议在1.5：1.0～6.0：1.0之间为宜)；
(5)将加入到1.5mL的EP管中的混合液轻轻混匀，生物安全柜中静置20min，在上述25μL混合液体系中补入95μL无血清Grace’s，使得48孔板每孔总体积为120μL
(6)弃去48孔板中培养基，用无血清Grace’s培养基清洗三次，将步骤(5)中反应液加入到洗净的48孔板中混匀；
(7)转染的细胞板置于28.0℃细胞恒温培养箱孵育3～5h，弃去48孔板中反应液，加入120μL含有8.0％胎牛血清Grace’s Insect cell culture medium培养基(FBSG)；
(8)换液后，将48孔细胞培养板置于28.0℃细胞恒温培养箱培养24～48h；
(9)培养的细胞在倒置荧光显微镜下观察，SeA2-GFP蛋白细胞定位情况，如图4所示。
由图4可知，在激光共聚焦显微镜下荧光观察，SeA2-GFP融合蛋白主要定位在细胞膜上，表明SeA2-GFP融合蛋白在昆虫细胞上成功表达。
实施例2、甜菜夜蛾SeCAD目的基因的重组质粒
本发明的具体技术方案包括以下步骤：
1、载体线性化：利用以下固定引物扩增载体，从而获得线性化载体
GFP-FP：5'-GATCCACCGGTCGCCACC-3'(SEQ ID NO.1)；
GFP-RP：5'-CGAAGCTTGAGCTCGAGATCT-3'(SEQ ID NO.2)；
扩增pIE2-GFP-N1质粒载体(全长4709bp)线性化载体获得4678bp片段。(退火温度为61℃)
或用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切的方式切开载体获得与上述引物扩增序列一致的线性化载体4678bp长度的片段。
将线性划载体利用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。
2、目的基因的扩增：设计甜菜夜蛾SeCAD目的基因特异性引物如下：
SECAD-FUFP：
5'-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACCATGGCGGTCGACGTGCGAATACTG-3'(SEQ IDNO.10)；
SECAD-FURP：
5'-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCCTCTTCTAAACTGGGAGTTCGCG-3'(SEQID NO.11)；
扩增获得目的基因上游含有pIE2-GFP-N1质粒线性化载体重复序列、Cozak序列，扩增获得目的基因下游含有pIE2-GFP-N1质粒线性化载体重复序列、Linker序列。将扩增的目的基因利用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。
3、同源重组：将获得的线性化载体和带有线性化载体重复序列的目的基因纯化后按照同源重组无缝克隆试剂盒连接获得重组蛋白，具体步骤可以参照
Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物科技有限公司)或Minerva SuperFusion Cloning Kit(苏州宇恒生物科技有限公司)试剂盒步骤详情。获得重组蛋白SeA2-GFP测序验证成功后便可以亚细胞定位。
4、将重组蛋白SeCAD-GFP质粒转染至昆虫细胞Hi5细胞
(1)取生长状态良好的Hi5细胞接种到洁净的48孔细胞板中，用含有8.0％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的Grace’s培养基在28.0℃恒温培养箱过夜培养，待密度为60％～80％便可用于细胞转染；
(2)用作转染的SeCAD-GFP质粒需用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后其浓度建议在100ng/μL以上，且纯度(OD260/OD280)在1.75～1.85之间为宜；
(3)准备无血清Grace’s培养基，1000μL、200μL、10μL移液器和相应大小的替补头，1.5mL洁净的EP管，酒精灯和酒精棉置于生物安全柜中，紫外灭菌约30min；
(4)取25μL每孔无血清Grace’s培养基到无菌EP管中，加入1.0μL的FuGENE HD，同时混入0.25μg质粒(转染试剂体积与质粒质量比的范围建议在1.5：1.0～6.0：1.0之间为宜)；
(5)将加入到1.5mL的EP管中的混合液轻轻混匀，生物安全柜中静置20min，在上述25μL混合液体系中补入95μL无血清Grace’s，使得48孔板每孔总体积为120μL
(6)弃去48孔板中培养基，用无血清Grace’s培养基清洗三次，将步骤(5)中反应液加入到洗净的48孔板中混匀；
(7)转染的细胞板置于28.0℃细胞恒温培养箱孵育3～5h，弃去48孔板中反应液，加入120μL含有8.0％胎牛血清Grace’s Insect cell culture medium培养基(FBSG)；
(8)换液后，将48孔细胞培养板置于28.0℃细胞恒温培养箱培养24～48h；
(9)培养的细胞在倒置荧光显微镜下观察，观察SeCAD-GFP蛋白在细胞定位情况，如图5所示。
由图5可知，在激光共聚焦显微镜下荧光观察，SeA2-GFP融合蛋白主要定位在细胞膜上，少量定位在细胞质上，表明SeCAD-GFP融合蛋白在昆虫细胞上成功表达。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉生物工程学院
<120> 一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4709
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatggatcat gatgataaac aatgtatggt gctaatgttg cttcaacaac aattctgttg 60
aactgtgttt tcatgtttgc caacaagcac ctttatactc ggtggcctcc ccaccaccaa 120
cttttttgca ctgcaaaaaa acacgctttt gcacgcgggc ccatacatag tacaaactct 180
acgtttcgta gactatttta cataaatagt ctacaccgtt gtatacgctc caaatacact 240
accacacatt gaaccttttt gcagtgcaaa aaagtacgtg tcggcagtca cgtaggccgg 300
ccttatcggg tcgcgtcctg tcacgtacga atcacattat cggaccggac gagtgttgtc 360
ttatcgtgac aggacgccag cttcctgtgt tgctaaccgc agccggacgc aactccttat 420
cggaacagga cgcgcctcca tatcagccgc gcgttatctc atgcgcgtga ccggacacga 480
ggcgcccgtc ccgcttatcg cgcctataaa tacagcccgc aacgatctgg taaacacagt 540
tgaacagcat ctgttcgaat ttagccgcta gcgctaccgg actcagatct cgagctcaag 600
cttcgaattc tgcagtcgac ggtaccgcgg gcccgggatc caccggtcgc caccatggtg 660
agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 720
gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 780
ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 840
accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 900
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 960
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 1020
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 1080
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 1140
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 1200
taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 1260
agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 1320
gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc 1380
cgcgactcta gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 1440
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 1500
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 1560
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaag 1620
gcgtaaattg taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 1680
tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 1740
gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 1800
tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 1860
ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 1920
agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 1980
aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 2040
accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt caggtggcac ttttcgggga 2100
aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 2160
atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tcctgaggcg 2220
gaaagaacca gctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 2280
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 2340
caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 2400
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 2460
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc 2520
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa gatcgatcaa 2580
gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 2640
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 2700
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 2760
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 2820
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 2880
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 2940
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 3000
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 3060
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 3120
aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 3180
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 3240
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 3300
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 3360
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa 3420
tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct 3480
atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg 3540
gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ctagggggag gctaactgaa acacggaagg 3600
agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg 3660
gtgttgggtc gtttgttcat aaacgcgggg ttcggtccca gggctggcac tctgtcgata 3720
ccccaccgag accccattgg ggccaatacg cccgcgtttc ttccttttcc ccaccccacc 3780
ccccaagttc gggtgaaggc ccagggctcg cagccaacgt cggggcggca ggccctgcca 3840
tagcctcagg ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 3900
ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 3960
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 4020
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 4080
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 4140
taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 4200
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 4260
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 4320
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 4380
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 4440
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 4500
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 4560
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 4620
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 4680
ctgtggataa ccgtattacc gccatgcat 4709
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatccaccgg tcgccacc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaagcttga gctcgagatc t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatctcgag ctcaagcttc g 21
<210> 5
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccacc 6
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggcgacc ggtggatc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acctccgcca ccgcctcc 18
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatctcgag ctcaagcttc ggccaccatg gacaaatcga ataaaaatac ag 52
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtggcgacc ggtggatcac ctccgccacc gcctccagcg gttttggaat cactttc 57
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agatctcgag ctcaagcttc ggccaccatg gcggtcgacg tgcgaatact g 51
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtggcgacc ggtggatcac ctccgccacc gcctcctctt ctaaactggg agttcgcg 58
Claims (8)
1.一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将pEGFP-N1载体中CMV启动子改为IE2启动子，获得pIE2-GFP-N1载体；
将pIE2-GFP-N1载体线性化，获得两端分别为EcoR I和BamH I粘性末端的线性化载体；
将上游引物Insert-FP和下游引物Insert-RP扩增目的基因，获得带有与线性化载体重复序列的目的基因片段；其中，所述上游引物Insert-FP的序列为：
5’-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACC+目的基因上游特异性引物-3’；所述下游引物Insert-RP的序列为：5’-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCC+目的基因上游特异性引物-3’；
将所述线性化载体和所述目的基因片段按照同源重组无缝克隆试剂盒连接，获得昆虫细胞表达系统载体重组质粒。
2.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，其特征在于，所述pIE2-GFP-N1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，其特征在于，所述将pIE2-GFP-N1载体线性化，包括：
采用线性化载体扩增引物对pIE2-GFP-N1进行PCR扩增，获得线性化载体，其中，所述线性化载体扩增引物包括GFPFU-FP和GFPFU-RP，序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，其特征在于，所述将pIE2-GFP-N1载体线性化，包括：
采用EcoR I和BamH I对pIE2-GFP-N1载体进行双酶切。
5.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，其特征在于，所述目的基因为甜菜夜蛾SeA2，所述上游引物Insert-FP的序列如SEQ ID NO.8所示；所述下游引物Insert-RP的序列如SEQ ID NO.9所示。
6.根据权利要求1所述的一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒的制备方法，其特征在于，所述目的基因为甜菜夜蛾SeCAD，所述上游引物Insert-FP的序列如SEQ ID NO.10所示；所述下游引物Insert-RP的序列如SEQ ID NO.11所示。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的昆虫细胞表达系统载体重组质粒。
8.一种权利要求7所述的昆虫细胞表达系统载体重组质粒在重组蛋白的表达、昆虫病毒的研究中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210081904.6A CN114540388A (zh) | 2022-01-24 | 2022-01-24 | 一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210081904.6A CN114540388A (zh) | 2022-01-24 | 2022-01-24 | 一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114540388A true CN114540388A (zh) | 2022-05-27 |
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ID=81672325
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| CN202210081904.6A Pending CN114540388A (zh) | 2022-01-24 | 2022-01-24 | 一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114540388A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592139A (zh) * | 2019-09-26 | 2019-12-20 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用 |
-
2022
- 2022-01-24 CN CN202210081904.6A patent/CN114540388A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592139A (zh) * | 2019-09-26 | 2019-12-20 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用 |
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| Title |
|---|
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220527 |
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