CN102813919A - 重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗及制备方法，以犬瘟热病毒弱毒株（CDV-JP）为基础在P和M基因之间的非编码区额外加入血凝素基因，构建表达双血凝素（双H）的重组犬瘟热弱毒活疫苗（rCDV-JP-2H）。选用了犬瘟热病毒优势保护性抗原基因作为改造目标，以增强其免疫保护效果，构建和拯救的重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H在细胞水平上具有较好的细胞增殖活性，并且出现的CPE更加典型，在临床上与改造前母本病毒以同样病毒滴度免疫犬试验，表明改造后的弱毒株取得了更好的免疫效果，从而达到更好的预防动物犬瘟热的目的。

Description

重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗及制备方法

技术领域：

本发明提供一种重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗，同时还提供所述疫苗的制备方法，用于预防犬瘟热的发生和流行，属于动物传染病疫苗生产技术领域。

背景技术：

犬瘟热是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)引起多种动物的一种急性、热性、高度接触性病毒性传染病。CDV自然感染宿主在不断扩大，除犬科动物外，还可感染大熊猫、小熊猫、狮、虎和豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物病。

犬瘟热病毒基因组为非分节段的单股负链RNA。负链RNA病毒的主要特点是基因组RNA不具有感染性,而且裸露的基因组RNA本身也不能作为模板,只有在与核蛋白N/NP结合成核糖核蛋白（RNP）复合体后,才能作为模板起始复制和转录,并表达和包装出活病毒,关键是获得有功能的RNP。RNA病毒感染性克隆的构建,实现了从病毒整体与分子之间、病毒与宿主关系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置换、或构建嵌合病毒等方法对病毒基因功能进行研究。

CDV囊膜表面的纤突是由H和F两种糖蛋白组成。研究表明H、F蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原。二者在病毒的吸附和侵入宿主细胞过程中起作用，病毒通过H蛋白吸附到细胞表面的受体上，并协助F蛋白介导病毒囊膜与宿主细胞膜、感染细胞与非感染细胞的融合，使病毒在宿主体内扩散。H蛋白主要诱导了体液免疫，并且抗CDV H蛋白单克隆抗体(MoAb)具有中和病毒活性；F蛋白诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下抑制症状的发生。用相关或非相关病毒的糖蛋白基因取代自身糖蛋白基因后的重组病毒也已成功用于疫苗研制。在狂犬病毒（RV）研究中，RABV G 蛋白是唯一的膜蛋白并诱导VNA（中和抗体）的产生，额外的RABV G 蛋白（2 个或3 个）被克隆至RABV 基因组，并成功拯救出携带2-3个G蛋白基因的致弱RV，使得G蛋白表达量增加，其神经中枢的致病性进一步下降，免疫原性提高，由此可见，过表达G 蛋白可潜在的增强适应性免疫应答及提高免疫保护率。

发明内容：

本发明提供一种重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗，为一种新型的犬瘟热病毒疫苗，以预防犬瘟热的发生和流行。

本发明还公开了重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗制备方法，适用于工业化生产。

本发明的技术解决方案如下：以临床上所用的犬瘟热弱毒疫苗株为基础，通过反向遗传技术改造获得表达双血凝素的新型犬瘟热弱毒疫苗，用于犬瘟热新型疫苗的研制与生产。

首先在犬瘟热病毒反向遗传操作平台的基础上，通过RT-PCR方法获得CDV弱毒株的H基因，将H基因定向克隆到真核表达载体pCI-CDV-EGFP质粒中，构建带有双H基因的全长真核表达质粒pCI-CDV-JP-2H；将构建的全长质粒pCI-CDV-JP-H、和三个辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共转染BSR细胞，拯救包装获得重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H。最后用重组病毒进行免疫动物实验，评价改造后的犬瘟热病毒弱毒株的免疫效果。

本发明提供的重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗，其特征在于：

以犬瘟热病毒弱毒株（CDV-JP）为基础在P和M基因之间的非编码区额外加入血凝素基因，构建表达双血凝素（双H）的重组犬瘟热弱毒活疫苗（rCDV-JP-2H）。

本发明所述重复表达血凝素H重组犬瘟热疫苗株的生产方法，包括以下步骤：

1）用RNA提取试剂盒提取犬瘟热弱毒病毒基因组总RNA；

2）RT-PCR方法获得犬瘟热血凝素H基因，片段长度为1824bp；

上游引物：5’-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGC

CTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’

下游引物：5’-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3’

其中5’端分别引入的都为Pme I酶切位点；

3）将步骤2）中目的扩增片段连接到克隆载体pBluescript中，构建克隆测序质粒pBluescript-H；pBluescript-c1质粒和pBluescript-H经Pme I酶切后，将H基因片段定向克隆到pBluescript-c1质粒中，构建中间克隆载体pBluescript-c1-H；

4）pBluescript-c1-H质粒和pCI-CDV-EGFP质粒经Sal I和Mlu I双酶切后，将c1-H目的片段定向克隆到真核表达载体pCI-CDV-EGFP中构建带有双血凝素基因的全长真核表达质粒pCI-CDV-JP-2H；其中，额外的H蛋白插入的位点是P与M基因之间的非编码区；

5）双血凝素基因的全长真核表达质粒pCI-CDV-2H及三个真核表达辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共转染BSR细胞，拯救包装获得表达双血凝素血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H；

6）以重组病毒接种Vero细胞，经扩大培养增殖，并对增殖重组病毒进行病毒滴度测定，至病毒TCID₅₀达10⁵个TCID₅₀/mL，-70℃冰箱中保存备用。

本发明的积极效果在于：选用了犬瘟热病毒优势保护性抗原基因作为改造目标，以增强其免疫保护效果，构建和拯救的重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H在细胞水平上具有较好的细胞增殖活性，并且出现的CPE更加典型，在临床上与改造前母本病毒以同样病毒滴度免疫犬试验，表明改造后的弱毒株取得了更好的免疫效果，从而达到更好的预防动物犬瘟热的目的。

附图说明：

图1：本发明重复表达血凝素（H）的重组犬瘟热全长质粒的构建策略图；

图2：本发明重复表达血凝素（H）的重组犬瘟热全长质粒酶切鉴定结果；

pCI-CDV-JP-2H全长质粒酶切鉴定结果 1~8：pCI-CDV-JP-2H全长质粒分别用Pme I、Sal I和Mlu I、Sal I 和Not I、Pst I、Cpo I、Xho I、Nhe I、Sma I酶切结果； M:Marker 15000；

图3：本发明疫苗在BSR细胞上所引起的细胞病变（CPE）图（10×10）；

图4：本发明疫苗间接免疫荧光照片（10×10）；

图5：本发明疫苗电子显微镜观察图（40000）；

图6、图7：本发明疫苗与亲本疫苗株免疫犬的抗体效价。

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例（以双血凝素重组疫苗为例）描述本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1

1.犬瘟热弱毒株H基因的RT-PCR扩增

1）提取总RNA：

在反向遗传操作平台的基础上，用经典总RNA提取试剂盒提取犬瘟热弱毒病毒基因组总RNA，步骤如下；

1 吸取200ul样品，加入到EDPC水处理过的1.5ml EP管中，再加入200ul变性剂（solution I），轻轻混合均匀。

2 加入1.5ul β-巯基乙醇、20ul 醋酸钠、200ul 水饱和酚、40ul 异戊醇，震荡混匀，12000rpm,4℃离心10min。 

3 取出上清，加入到另一无Rnase的1.5mlEP管中，加入200ul 的异丙醇，混合均匀后，12000rpm, 4℃离心10min。

4 弃上清，加入1ml 75% DEPC 酒精溶液上下颠倒混匀，12000rpm, 4℃离心10min。之后重复洗涤一次。

5 弃净上清液，倒置10min,让酒精充分挥发。

2）反转录及PCR扩增：

以CDV基因组总RNA为模板，进行反转录。RT反应体系（总体系20ul）：

体系	剂量(ul)
		5×AMV Buffer	4ul
2.5mM dNTP	2.5ul
		Raderm Primer	0.5ul
Oligod(t)	0.5ul
		DEPC水	11ul
AMV	1ul
		Inhibiter	0.5
Tatol	20ul

RT反应条件为42℃、1.5h，-20℃备用。

根据CDV-JP株全基因序列，设计一对扩增完整H基因开放阅读框的引物，上游引物的5’端引入Pme I限制性酶切位点序列（斜体标出）和CDV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GE（ATTATAAAAAA）及转录起始序列GS（AGGACACAAGAGCCTAA），下游引物5’段引物Pme I限制性酶酶切位点序列（引物由TAKARA生物公司合成），预期扩增片段的基因长度为1878bp。

上游引物：5'-CAC GTTTAAAC ATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGT

CCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGTGC-3’

下游引物：5’-GG GTTTAAAC TCAAGGTTTTGAACGGTTACAT-3’

RT后产物（cDNA）为底物，用高保真酶Phusion DNA Polymerase对CDV H基因进行扩增。反应体系为:

体系	剂量(ul)
		5×Phusion Buffer	10
2.5mMdNTP	5
		上、下游引物	各1
cDNA	3
		无菌水	29.5
Phusion DNA Polymerase	0.5
		Tatol	50

扩增条件如下：预变性：98℃,30s；98℃,10s,52℃,20s,72℃,1.5min；共35个循环，延伸72℃ 10min。PCR产物取8ul加入2ul 6×loading buffer 经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后回收，放入2mlEP管中，根据凝胶的质量，按AXYGEN凝胶回收试剂盒说明书操作步骤回收目的片段。回收产物-20℃保存。

3）克隆载体pB-CDV-H的构建：

用EcoR V限制性内切酶对双螺旋的克隆载体（pBluescript II KS +）进行线性化处理，酶切体系用50ul：

体系	剂量(ul)
		10×NEB Buffer 2	5
pBluescript II KS + 质粒	43
		EcoR V	2
Tatol	50

酶切条件为37℃，4小时酶切，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，正确后回收线性化的克隆载体。

在PCR管中进行目的片段与载体的连接，按载体：目的基因片段为1：3的摩尔比进行连接，共5ul连接体系：

体系	剂量(ul)
		10×T4 DNA Ligase Buffer	0.5
H基因片段	3
		线性化pBluescript II KS +载体	1
T4 DNA Ligase	0.5
		Tatol	5

反应条件为16℃连接过夜。

从-70℃冰箱中取出E.coli DH5a感受态细胞，立即冰浴融化完全，加入5ul的连接产物，轻轻混匀，冰浴中孵育30min。42℃热休克90s，立即冰浴2min。每管中加入900ul的无抗性LB液体培养基，37℃、160r/min震荡培养1h。8000rpm 离心1min，弃去上清，最后留约200ul上清液，重悬沉淀后，均匀涂布于含氨苄抗性带有X-GAL和 IPTG的平板上（每板先用15ul的IPTG（100 mg/mL）和30ul 的X-GaL（20 mg/mL）避光涂匀），放置37℃恒温培养箱中避光培养12小时。

质粒的小量提取

1 提取白色单菌落接种到5mlLB/Amp抗性液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养12h。

2 用1.5ml离心管收集1-4ml菌液，12000xg离心1min,弃尽上清。

3 加入250ul Buffer S1充分重悬细菌沉淀，（Buffer S1中已加入Rnase A）

4 加入250ul Buffer S2，温和反复上下颠倒混匀4-6次使菌体充分裂解，至形成透亮的溶液，此步骤不易超过5min.

5 加入350ul Buffer S3，温和并充分地上下颠倒混匀6-8次，12000 xg离心10min。

6 将上清转移至制备管离心柱中，12000xg离心1min,弃滤液。

7 加500ul Buffer W1, 12000xg离心1min,弃滤液。

8 加700ul Buffer W2, 12000xg离心1min,弃滤液。以同样方法再洗涤一次。

9 将离心柱放置到制备管中，12000xg离心1min，甩干剩余与团体。

10将离心柱移入到新的1.5ml离心管中，在膜中央加入60-80ul Eluent或去离子水,室温静置1min. 12000xg离心1min，管底即为质粒DNA。

取3ul重组质粒（pB-CDV-H）进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后送宝生物（大连）生物公司测序，待测序结果正确后进行下一步操作。

4）重组质粒pB-CDV-H、pCI-c1-EGFP酶切及载体去磷酸化：

将重组质粒pB-CDV-H、pCI-c1-EGFP用Pme I限制性内切酶进行酶切， Pme I单酶切体系（50ul）如下：

体系	剂量(ul)
		10×NEB Buffer 4	5
质粒	43
		Pme I	2
Tatol	50

    酶切温度为37℃、作用5小时，加入终止液，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后分别回收H片段和pCI-c1载体（步骤按凝胶回收说明书操作）。

Pme I酶切后的载体为平末端，除去酶切载体5’末端的磷酸集团防止载体环化，反应体系为（50ul）如下：

体系	剂量(ul)
		10×BAP Buffer	5
Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP)	2.5
		载体	42.5
Tatol	50

混匀后，65℃水浴30min，加入50ul的灭菌蒸馏水，将终体积补到100ul,按凝胶回收试剂盒说明书操作回收去磷后的载体。

5）重组质粒pCI-c1-H质粒的构建：

将H基因片段连接到pCI-c1-载体中，连接仍用NEB公司的T4 DNA Ligase，连接体系为5ul,目的片段：载体（摩尔比）为3:1，16℃连接，次日转化E.coli DH5a感受态细胞，筛选正向连接的阳性克隆质粒（方法同上）。

带有重复血凝素血凝素（H）基因的全长质粒的构建、鉴定及中量提取

1）全长质粒pCI-CDV-JP-2H的构建：

将重组质粒pCI-c1-H和pCI-CDV-EGFP全长质粒分别用Sal I与Mlu I双酶切，酶切用50ul反应体系，如下：

体系	剂量(ul)
		10×NEB Buffer 3	5
质粒	41
		Sal I	2
Mlu I	2
		Tatol	50

反应程序同上2.2.4.1步，结果经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后回收c1-H片段和pCI-CDV载体，再将将c1-H片段连接到pCI-CDV载体中，构建全长质粒pCI-CDV-JP-2H，连接时目的片段：载体（摩尔比）为10:1，16℃连接，次日转化E.coli TO8感受态细胞，培养温度降低到30℃，筛选正确连接的阳性全长质粒（构建方案见图1）。

2）全长质粒pCI-CDV-JP-2H的鉴定：

PCR鉴定：

小量提取全长质粒后，用PCR方法鉴定，上游引物在H基因中，下游引物在M基因中的方法，扩增目的条带，引物 1如下：

上游引物：5’-GGCTTCCTTGTGTGTAGATG-3’   （全基因组中7954位）

下游引物：5’-TCGGCTTGAACAGACATCTC-3’  （全基因组中4043位）

退火温度为52度，目的片段为：1611bp，扩增方法同上。

酶切鉴定：

分别用Pme I、Sla I 和Mlu I双酶切、Sal I+Not I双酶切、Pst I、Noc I、Cpo I、Xho I、Nhe I、Sma I对全长质粒pCI-CDV-JP-2H进行酶切鉴定。酶切条件除Sma I为30℃酶切外，其它都为37℃酶切。方法同上，酶切结果经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定（图2）。

3）全长质粒及三种辅助质粒中量提取：

    酶切结果鉴定正确的全长质粒pCI-CDV-JP-2H和三个辅助质粒pCDV-N、pCDV-P、pCDV-L的菌液加入到进行200ml LB/Amp抗性液体培养基中，辅助质粒用37℃、200r/min震荡培养16h，全长质粒用30℃、200r/min震荡培养20h后富集菌液，进行质粒中量提取，步骤如下：

1 加入5ml Buffer P1，充分重悬细菌。

2 加入5mlBuffer P2，上下颠倒混匀4-6次，室温静置5min,（当颜色全变为蓝色时室温静置）。

3 加入5ml预冷的Buffer P3，立即混合均匀，上下颠倒6-8次，冰上静置20min.（颜色全变为白色絮状）

4 静置后，20000xg 4℃ 离心30min，小心的吸出上清，避免吸到白色絮状物。

5 20000xg 4℃再次离心15min，取出上清。

6 步骤5离心结束前， QBT(5ml)加入到QIAGEN-TIP100柱中，让其自然流下，不收集液体。

7 将步骤5中的上清加入到步骤6中的QIAGEN-TIP100柱中，让其自然流下，不收集液体。

8 加入10ml Buffer QC洗涤QIAGEN-TIP100柱，本次操作重复一次。

9 加入5ml Buffer QF，下方用无菌的离心管收集液体。

10加入8ml异丙醇（室温），混合均匀后，15000xg 4℃ 离心30min.小心的弃净上清。

11加入5ml新配制的70%的酒精溶液，轻轻摇晃离心管后，15000xg 4℃离心10min。可以在管底看到白色沉淀，小心吸出上清。

12自然风干5min后，用100ul 65℃预热的无菌水溶解沉淀，分装后另外取出1ul加入到99ul的无菌水中，100倍稀释后检测中提质粒浓度。

13 浓度鉴定：取2ul 100倍稀释的质粒，加到分光光度计上，测定浓度。

重复表达血凝素囊重组犬瘟热病毒的拯救及鉴定：

1）病毒拯救：

酶切和序列鉴定正确后，用无内毒素质粒中提试剂盒按照说明书提取重组全长质粒和三种辅助质粒质粒pCI-CDV-2H、pCI-N、pCI-P、pCI-L。用含5%胎牛血清的DMEM培养BSR细胞，转染前16小时铺6孔细胞板，BSR细胞在6孔细胞板上长至90-95%的细胞密度，以Lipofectamine ^TM 2000 Reagent转染，每孔转染总量为5.6ug的质粒。转染方法具体操作如下：

1 铺板：转染前12小时以每孔2×105个BSR细胞接种到6孔板上，至细胞密度达90~95%时用于转染。

2 向1.5ml无菌离心管中加入250ul OPTI-MEM培养液，加入以下几种质粒（每孔的剂量）：

体系	剂量ug/孔
		pCI-CDV-JP-2H	4
pCI-CDV-N	0.5
		pCI-CDV-P	0.1
pCI-CDV-L	0.5
		pCAGG-SLAM	0.5

3 稀释Lipofectamine TM 2000试剂转染试剂：1.5ml离心管中加入13ul 的Lipofectamine TM 2000，之后加入250ul 的OPTI-MEM培养液。室温静置5min。

4 将步骤2和3中的溶液进行混合，混合均匀后室温静置20min。

5 用OPTI-MEM培养液换洗细胞2~3遍。

6 向离心管中加入200ul OPTI-MEM培养液，混合均匀后将700ul混合液加入到待转染的BSR细胞上。

7 换液：共转染BSR细胞5h后，将转染液吸出，加入含成5%胎牛血清的DMEM培养液于5%CO2、37℃培养72h。

8 传代：用胰酶消化BSR细胞，以一孔传三孔的比例进行传代，5%CO2、37℃培养72h后进行病毒拯救情况观察鉴定（见图3）。

2）重组病毒rCDV-JP-2H的鉴定：

PCR方法鉴定

CDV H基因插入的位置为P与M基因之间的非编码区，从额外插入的H基因两端设计引物。拯救后第二代病毒提取总RNA，反转录后进行PCR扩增，引物2如下：

上游引物：5’-TCGGAAGGACAGCGGTATTTG-3’

下游引物：5’-TCGGCTTGAACAGACATCTC-3’

    PCR扩增体系及反应条件同上。

间接免疫荧光方法鉴定

1 弃掉细胞上清液，用PH值为7.4的PBST 3×3洗涤：即加入1ml PBS/孔（6孔板）室温静置3min，弃去PBST，再加入1mlPBST，静置3min，反复洗3次。

2 每孔加入1ml 80%的冷丙酮,4℃冰箱中固定1h或-20℃过夜。

3 弃去丙酮，挥发5min，再用PH值为7.4的PBST 3×3洗涤。

4 加入1ml一抗（为犬瘟热高免血清，100倍稀释后），37℃包被1h，弃去一抗液，PH值为7.4的PBST 3×3洗涤。

5 加入1ml兔抗犬FITC标记的IgG 荧光二抗（暗光线下用PBST将二抗稀释100倍，加入伊文思蓝，使其终浓度为0.3%的浓度），37℃避光感做1h.弃去二抗液，避光PBST 3×3洗涤，荧光显微镜下观察实验结果（见图4）。

电子显微镜检测

    将拯救出的重组病毒rCDV-JP-2H第三代细胞毒冻融后，1ml病毒液经3000rpm 离心10min，弃掉上清，剩下50~100ul重悬液体，用于电子显微镜镜检（见图5）。

重组病毒与亲本毒生长动力学比较

将拯救出的重组病毒rCDV-JP-2H和亲本株CDV-JP、rCDV-JP-EGFP分别按0.1个MOI接种于生长过夜、细胞密度为70～80％单层BSR、Vero、Vero-SLAM细胞，37 ℃感作1h后，弃掉上清，加入含2%胎牛血清的细胞维持培养液，5％ CO2、37 ℃ 培养，于感染后12h、24h、36h 、48h、60h、72h、84h分别收获上述感染病毒的细胞和上清；将上述不同时间段收获的重组病毒和亲本株病毒液冻融1次后，分别取100 μL以10为单位倍比稀释后，接种铺于96孔板、生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37 ℃感作1h后，PBS洗2次，加入含2%胎牛血清的细胞维持培养液，5％ CO2、37 ℃ 培养，每个稀释度做4个重复；感染后72h用间接免疫荧光方法鉴定病毒滴度，按Reed&Muench方法计算各时间点病毒的TCID50，评价三种病毒在三种细胞上的生长动力学特点，并绘制病毒一步生长曲线。 

免疫犬及攻毒保护实验

1）免疫犬实验：

将重组病毒rCDV-JP-2H和亲本株CDV-JP按三种不同的稀释度（10⁴、10³、10²个TCID50的剂量）进行免疫犬试验，共进行二次免疫接种，其间隔为2周，免疫方法、剂量和途径如下表1所示：

表1：重组病毒rCDV-JP-2H和亲本株CDV-JP及犬瘟热病毒小熊猫株免疫犬实验

Table 1:The immunization experiment with the three kinds CDV of rCDV-JP-2H、CDV-JP、CDV-LP

表注：1-1~1-11：为第一批免疫犬免疫剂量、途径及编号；2-1~2-12：为第二批免疫犬免疫剂量、途径及编号

免疫后中和抗体检测：于首次免疫前，第二次免疫前，第二次免疫后2周采血，分别从体液免疫及细胞免疫水平评价重组病毒免疫效果。采血（每次采血3ml）后实验的具体操作：

1 抗凝管分装（0.5ml）：4℃保存，用于血细胞常规分析等相关操作；

2 分离免疫犬血清（2.5ml）：分离血清后，-70℃保存，用于中和抗体效价分析及IFN-r等相关指标检测。

3 第二批免疫犬二免后21天后每四周进行一次采血，分离血清，用于免疫持续期中和抗体水平观察，观察至第二次免疫后第3月结果。

2）免疫犬血清抗CDV中和抗体的测定：

采用固定病毒—稀释血清的方法，在96孔细胞培养板上进行。操作如下：

1 血清样品处理：将血清样品至于56℃水浴中作用30min，灭活血清中非特异性抑制病毒成分，随后8000rpm 离心10min，去除可能的细菌污染物，吸取上清备用。

2 在96孔细胞培养板的每个孔中加入2%DMEM细胞培养液50ul，再加入待测血清样品50ul，做2倍连续倍比稀释（第一孔血清不做稀释，共7个稀释度）。随后分别加入等量含100TCID50的病毒悬液。37℃感做1h。

3 感做结束后，每孔加入50ulVero细胞悬液（2.5-3×106个/ml），放置于37℃、5%CO2培养箱中培养4天，同时设阴、阳性血清对照、病毒对照及正常Vero细胞对照。

4 判定结果 以每孔完全不出现绿色荧光为阳性血清标准，并以其最高稀释度为中和抗体滴度，记录抗体效价。

3）免疫结果：

从体液免疫水平对免疫犬结果进行评价分析。中和抗体效价上表明：重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒比亲本源犬瘟热弱毒呈现出更高的抗体效价（见图6），并且随着免疫剂量的降低，两种病毒的免疫效果差异显著增大，当以10²TCID50病毒量免疫犬时，重组毒平均较好于对照组四倍。

4）攻毒保护实验结果：

二免后两周分别用104 个TCID50的本实验保存的犬瘟热病毒强毒加以攻击，结果： 104个TCID50病毒量免疫犬后都能够产生坚强的保护；103TCID50免疫犬后强毒攻击时对照组死亡一只；以102个TCID50免疫犬时重组毒死亡一只，亲本毒死亡2只，结果表明：本发明中的重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒具有更好的免疫效率。

Claims (3)

1.一种重复表达血凝素囊膜糖蛋白重组犬瘟热疫苗，其特征在于：以犬瘟热弱毒株（CDV-JP）为基础在P和M基因之间的非编码区额外加入囊膜糖蛋白基因，构建表达双囊膜糖蛋白（双H）的重组犬瘟热弱毒活疫苗（rCDV-JP-2H）。

2. 根据权利要求1所述的重复表达血凝素囊膜糖蛋白重组犬瘟热疫苗，其特征在于含有以下引物：

上游引物：5’-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGC

CTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’

下游引物：5’-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3’ 。

3. 根据权利要求1所述复表达血凝素囊膜糖蛋白重组犬瘟热疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）用RNA提取试剂盒提取犬瘟热弱毒株（CDV-JP）基因组总RNA；

2）RT-PCR方法获得犬瘟热血凝素H基因，片段长度为1824bp；

上游引物：5’-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGC

CTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’

下游引物：5’-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3’

其中5’端分别引入的都为Pme I酶切位点；

3）将步骤2）中目的扩增片段连接到克隆载体pBluescript中，构建克隆测序质粒pBluescript-H；pBluescript-c1质粒和pBluescript-H经Pme I酶切后，将H基因片段定向克隆到pBluescript-c1质粒中，构建中间克隆载体pBluescript-c1-H；

4）pBluescript-c1-H质粒和pCI-CDV-EGFP质粒经Sal I和Mlu I双酶切后，将c1-H目的片段定向克隆到真核表达载体pCI-CDV-EGFP中构建带有双血凝素基因的全长真核表达质粒pCI-CDV-2H；其中，额外的H蛋白插入的位点是P与M基因之间的非编码区；

5）带有双血凝素基因的真核表达全长质粒pCI-CDV-2H及三个辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共转染BSR细胞，拯救包装获得表达双血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H；

6）以重组病毒接种Vero细胞，经扩大培养，并对增殖重组病毒进行病毒滴度测定，至病毒TCID₅₀达10⁵个TCID₅₀/mL，-70℃冰箱中保存备用。

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